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Developmental Biology

राउंडवार्म Caenorhabditis elegans से विशिष्ट न्यूरोन आबादी का अलगाव

Published: August 6, 2019 doi: 10.3791/60145
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3,4
1Department of Biochemistry, University of Nebraska, 2Nebraska Redox Biology Center, University of Nebraska, 3Nebraska Center for Integrated Biomolecular Communication, University of Nebraska, 4Fred & Pamela Buffett Cancer Center, University of Nebraska Medical Center

Summary

यहाँ, हम लाइव न्यूरोनल कोशिकाओं के विशिष्ट समूहों के सरल अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसमें ट्रांसजेनिक कैनोरहैब्डाइटिस एलिगन्स लाइनों से ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त किया जाता है। इस विधि विशिष्ट न्यूरॉन्स पर ध्यान केंद्रित पूर्व vivo अध्ययन की एक किस्म सक्षम बनाता है और आगे अल्पकालिक culturing के लिए कोशिकाओं को अलग करने की क्षमता है.

Abstract

उम्र बढ़ने की प्रक्रिया के दौरान, कई कोशिकाओं सेलुलर रोग के लिए अग्रणी नुकसान के उच्च स्तर जमा, जो कई बुढ़ापे और रोग की स्थिति underlies. पोस्ट-माइटोटिक न्यूरॉन्स उम्र बढ़ने से प्रभावित एक प्रमुख सेल प्रकार का प्रतिनिधित्व करते हैं। हालांकि न्यूरोनल उम्र बढ़ने के कई स्तनधारी मॉडल मौजूद हैं, वे चुनौतीपूर्ण और स्थापित करने के लिए महंगा कर रहे हैं. राउंडवार्म Caenorhabditis elegans न्यूरोनल उम्र बढ़ने का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल है, के रूप में इन जानवरों को कम उम्र है, एक उपलब्ध मजबूत आनुवंशिक उपकरण बॉक्स, और अच्छी तरह से सूचीबद्ध तंत्रिका तंत्र. विधि यहाँ प्रस्तुत एक ट्रांसजेनिक हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) की अभिव्यक्ति के आधार पर विशिष्ट कोशिकाओं के निर्बाध अलगाव के लिए अनुमति देता है. अलग के तहत GFP व्यक्त ट्रांसजेनिक पशु लाइनों, सेल प्रकार-विशिष्ट प्रमोटरों बाहरी क्यूटिकल को दूर करने के लिए पचा रहे हैं और धीरे यंत्रवत् विभिन्न प्रकार के सेल युक्त घोल का उत्पादन करने के लिए बाधित। ब्याज की कोशिकाओं तो फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई के माध्यम से गैर-लक्ष्य कोशिकाओं से अलग कर रहे हैं, या विरोधी GFP-युग्मित चुंबकीय मोती द्वारा. अलग कोशिकाओं तो एक सीमित समय के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है या तुरंत इस तरह के वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर द्वारा प्रतिलेखनात्मक विश्लेषण के रूप में सेल-विशिष्ट पूर्व vivo विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया. इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल सी elegansमें विभिन्न न्यूरॉन आबादी के भीतर सेल विशेष प्रतिक्रियाओं के तेजी से और मजबूत विश्लेषण के लिए अनुमति देता है.

Introduction

पिछले कई दशकों में, metazoan मॉडल जीव Caenorhabditis elegans न्यूरॉन्स के अध्ययन में एक जबरदस्त संपत्ति रहा है, न्यूरॉन circuitry और शारीरिक और व्यवहार प्रतिक्रियाओं में अपनी भूमिका, और उम्र बढ़ने से जुड़े neurodegenerative रोगों. सी elegans की एक अनूठी विशेषता यह है कि जानवरों पारदर्शी हैं, सभी वयस्क कायिक कोशिकाओं के वंश के लिए अनुमति 1मैपकिया जा करने के लिए. C. elegans भी न्यूरॉन्स के प्रबंधनीय मात्रा बंदरगाह, आकृति विज्ञान और तंत्रिका तंत्र की कनेक्टिविटी के लिए अग्रणी अच्छी तरह से समझा जा रहा है2. निश्चर कोशिका वंश, कम उम्र, और उच्च throughput आनुवंशिक सी elegans के लिए उपलब्ध उपकरणों की बहुतायत यह अलग न्यूरॉन आबादी के भीतर उम्र बढ़ने के अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल जीव बनाते हैं.

न्यूरॉन्स और neurodegenerative विकारों की उम्र बढ़ने जटिल हैं, और प्रत्येक विकार इसके साथ जुड़े अद्वितीय रोग हस्ताक्षर है. हालांकि, पार्किंसंस और अल्जाइमर रोग जैसे कई विकारों के लिए, एक आम विशेषता गलत तरीके से प्रोटीन3,4,5का प्रगतिशील भार है। इन दोनों रोगों में प्रोटीन गलत गुना और कोशिका के भीतर मिलाकर विषाक्तता पैदा करते हैं, जिससे अंततः कोशिका मृत्यु4,5हो जाती है। न्यूरॉन्स की उचित उम्र बढ़ने के लिए, mitochondria के homeostasis, अधिक विशेष रूप से प्रोटीन homeostasis, महत्वपूर्ण है, के रूप में क्षोभ और dyshomeostasis neurodegeneration के लिए नेतृत्व कर सकते हैं6,7,8. कोशिकाओं प्रोटीन homeostasis बनाए रखने के लिए विभिन्न तंत्र से लैस कर रहे हैं, एक सामने आया प्रोटीन प्रतिक्रिया जा रहा है (UPR)-एक शास्त्रीय मार्ग जहां endoplasmic reticulum से संकेत (ईआर) intracellular संकेत cascades सक्रिय, एक प्रतिलिपि बनाने के लिए अग्रणी प्रतिक्रिया9| इस UPRईआरके समान , मेटाज़ोअनमाइटोकिनल प्रोटीन होमोस्टेसिस के नुकसान के लिए इसी तरह की प्रतिक्रिया प्रदर्शित करते हैं , तथाकथित माइटोकोंड्रियाल यूपीआर (यूपीआरएमटी)7,8. C. elegans सबसे बेसल जीव के लिए एक पुष्टि की और अच्छी तरह से परिभाषित UPRमीटर मार्ग7है प्रतीत होता है.

एक बड़े नेटवर्क के भीतर विशिष्ट न्यूरोनल आबादी के कार्य/रोग का आकलन उनकी आंतरिक कनेक्टिविटी और जटिलता3के कारण करना मुश्किल हो सकता है. हालांकि, अक्सर जटिल रोगों के साथ सेल प्रकार-विशिष्ट रोगों के कारण अलग न्यूरोनल आबादी का अध्ययन करने की आवश्यकता होती है, जैसे कि बिगड़ा सेलुलर प्रोटीन होमियोस्टेसिस से जुड़े लोग। सी elegansमें, विशिष्ट न्यूरॉन आबादी आनुवंशिक रूप से विवो में सुगम अवलोकन के लिए अनुमति देने के लिए हेरफेर किया जा सकता है. सी elegans के तंत्रिका तंत्र मुख्य रूप से न्यूरॉन्स के होते हैं, glial कोशिकाओं का एक छोटा सा प्रतिशत के साथ. वयस्क हर्मोफ्रोडाइट कीड़े में लगभग 302 न्यूरॉन्स होते हैं, जो 100 से अधिक विभिन्न वर्गों2,10में विभाजित होते हैं . कोलीनर्जिक न्यूरॉन्स जैसे न्यूरोन न्यूरोमस्क्युलर जंक्शनों में प्रबल होते हैं, जबकि डोपामाइनर्जिक न्यूरॉन्स मुख्य रूप से सनसनी10,11में शामिल होते हैं। के रूप में दोनों मोटर गतिविधि और संवेदी क्षमताओं उम्र के साथ गिरावट, यह इन व्यक्तिगत न्यूरॉन्स11,12में दोषों के बारे में मशीनी अंतर्दृष्टि विस्तार करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस तरह के रूप में, बाद में पूर्व vivo अध्ययन के लिए ब्याज की बरकरार कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक सरल और मजबूत विधि के लिए एक की जरूरत है.

यहाँ, हम सी elegans से हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त विशिष्ट न्यूरॉन कोशिकाओं के तेजी से अलगाव के लिए एक अनुकूलित प्रभावी विधि का वर्णन. इस अलगाव विधि लार्वा, किशोर या वयस्क कीड़े पर किया जा सकता है। लार्वा कीड़े से कोशिकाओं के अलगाव पहले झांग एट अल13 द्वारा प्रकाशित किया गया था और यहाँ चर्चा नहीं की जाएगी. यहाँ एक महत्वपूर्ण ध्यान दें कि सभी कीड़े एक ही जीवन के स्तर पर होने की जरूरत है पशु या विभिन्न जीवन चरणों में जानवरों से संदूषण के अधिक पाचन को रोकने के लिए. सूत्रकृमक क्यूटिकल के एंजाइमी और यांत्रिक विघटन, कोलेजन और अन्य संरचनात्मक प्रोटीनों में उच्च एक एक्सोस्केलेटन के माध्यम से विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं कोअलगकिया जा सकता है 13,14. कोशिकाओं तो प्रवाह साइटोमेट्री या एंटीबॉडी लेबल चुंबकीय मोती के माध्यम से अलग किया जा सकता है. आमतौर पर, आरएनए वांछित सेल जनसंख्या15के संवर्धन को सुनिश्चित करने के लिए एक फीनॉल और ग्वानिडीन आइसोथियोसाइनेट विधि के माध्यम से अलग किया जाता है। बहुत सावधानी के साथ इन अलग कोशिकाओं को एक संस्कृति फ्लास्क या बहु अच्छी तरह से पकवान में बनाए रखा जा सकता है. इस विधि विशिष्ट न्यूरॉन्स के अध्ययन में एक अद्वितीय और शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है और आगे culturing के लिए रहते हैं और कार्यात्मक कोशिकाओं को अलग करने की क्षमता है.

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Protocol

1. सेल अलगाव के लिए वृद्ध कीड़े की तैयारी और संग्रह

नोट: नीचे समझाया ट्रांसजेनिक unc-17से कोलीनर्जिक न्यूरॉन्स के अलगाव है ::GFP तनाव (OH13083) मिनेसोटा विश्वविद्यालय में Caenorhabditis जेनेटिक्स सेंटर (CGC) तनाव भंडार से प्राप्त. कवक या बैक्टीरिया से संदूषण को रोकने के लिए बाँझ स्थितियों को बनाए रखना आवश्यक है।

  1. टी Stiernagle16द्वारा वर्णित के रूप में विरंजन विधि के माध्यम से कीड़े सिंक्रनाइज़ और सिंक्रनाइज़ . उम्र बढ़ने के प्रयोगों के लिए, अंडे के उत्पादन को कम करने और अंडे से निकलने की गिरफ्तारी के लिए फ्लोरोडोऑक्सीयूरीडीन (FuDR) के 25 डिग्री सेल्सियस पानी के समाधान वाले सूत्रकृमि विकास माध्यम (एनजीएम) प्लेटों पर प्लेट कीड़े। संदूषण या अंडे से निकलने को रोकने के लिए नियमित रूप से आगर प्लेटों का निरीक्षण करें क्योंकि इससे अविश्वसनीय परिणाम होंगे।
    नोट: unc-17 केलिए ::GFP कोशिकाओं, आम तौर पर तीन 100 मिमी x 15 मिमी NGM प्लेटें ब्याज की कोशिकाओं की एक पर्याप्त मात्रा को अलग करने के लिए उपयोग किया जाता है16.
  2. कीड़े ले लीजिए और सेल अलगाव के लिए बफ़र्स तैयार करते हैं।
    1. एक 15 एमएल शंकु ट्यूब में कीड़े ले लीजिए. प्लेट से 1.5 एमएल M9 बफर (1 m M MgSO4, 85 MM NaCl, 42 MM Na2HPO4$7H2O, 22 MM KH2PO, pH 7.0) और सेंट्रीफ्यूज के साथ प्लेट से धो लें 1,600 x g. M9 बफर के 1 एमएल के साथ supernatant और धोने कीड़े छोड़ दें। centrifugation दोहराएँ और संभव के रूप में ज्यादा ई कोलाई संदूषण को दूर करने के लिए पांच बार की कुल के लिए धोने.
      नोट: एंटीबायोटिक्स (50 डिग्री/
    2. दो नमूनों के लिए, सोडियम dodecyl सल्फेट-dithiothreitol (एसडीएस-डीटी) lysis बफर तैयार: 200 एम एम डीटी, 0.25% (w/v) एसडीएस, 20 एम एम HEPES (पीएच 8.0), और 3% (w/v) रसीला।
    3. 15 एमएल एअलगाव बफर (118 एम एम एन एनसीएल, 48 एमएम केसीएल, 2 एमएम केसीएल 2, 2 एमएम एमजीसीएल2, 25 एम एम एचईएस [पीएच 7.3]) तैयार करें और इसे बर्फ पर स्टोर करें।
      नोट: दोनों SDS-DTT lysis बफर और अलगाव बफर प्रत्येक प्रयोग से पहले ताजा किया जाना चाहिए.
  3. क्यूटिकल व्यवधान और एकल सेल अलगाव
    1. सेंट्रीफ्यूज जानवरों 1.2.1 के लिए कदम 1.2.1 में एकत्र 5 मिनट पर 1,600 x g. सभी supernatant निकालें और M9 मीडिया के 1 एमएल में कीड़े निलंबित और 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब को स्थानांतरित.
    2. 5 मिनट के लिए 1,600 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूगेशन के साथ गोली कीड़े।
    3. कीड़े और कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने के लिए एसडीएस-डीटीटी lysis बफर के 200 $L जोड़ें। कीड़े एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के नीचे देखा अगर शरीर के साथ "विंकल" होना चाहिए.
      नोट: एसडीएस-डीटीटी lysis बफर के लिए लंबे समय तक जोखिम कीड़े की मौत में परिणाम हो सकता है, जो कीड़े देख द्वारा नजर रखी जा सकती है. कीड़े कि मर रहे हैं लंबा हो जाएगा और कर्ल नहीं होगा.
    4. बर्फ ठंडा अलगाव बफर के 800 डिग्री एल जोड़ें और धीरे flicking ट्यूब द्वारा मिश्रण.
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 13,000 x ग्राम पर 1 मिनट के लिए गोली कीड़े, supernatant को हटाने और अलगाव बफर के 1 एमएल के साथ धो लो।
    6. पांच बार की कुल के लिए चरण 1.3.5 दोहराएँ, ध्यान से अलगाव बफर हर बार हटाने.
    7. स्ट्रेप्टोमाइस ग्रिसियस (15 मिलीग्राम/एमएल) (सामग्रीकीतालिका) से प्रोटीज़ मिश्रण का 100 डिग्री सेल्सियस जोड़ें , जो एलटी में 10 डिग्री 15 मिनट के लिए गोली और इन्क्यूबेट में अलगाव बफर में घुल गया है।
      नोट: एसडीएस-डीटीटी lysis बफर के साथ के रूप में, विस्तारित protease पाचन प्लाज्मा झिल्ली के साथ प्रोटीन की अत्यधिक दरार में परिणाम हो सकता है, चुंबकीय मोती के माध्यम से सतह उजागर GFP के अलगाव को रोकने.
    8. प्रोटीज़ मिश्रण के साथ ऊष्मायन के दौरान, $ 60 के लिए एक 200 डिग्री माइक्रोपिपेट टिप के साथ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के नीचे के खिलाफ पाइपिंग नमूनों द्वारा यांत्रिक व्यवधान लागू करें। कोशिकाओं को ठीक से असंबद्ध करने के लिए लगातार दबाव के साथ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब की दीवार के खिलाफ पिपेट टिप रखें।
    9. पाचन की अवस्था का निर्धारण करने के लिए, पाचन मिश्रण की एक छोटी मात्रा ($1 डिग्री 5 डिग्री सेल्सियस) को हटा दें, इसे कांच की स्लाइड पर छोड़ दें और ऊतक संस्कृति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके इसका निरीक्षण करें। 5-7 मिनट के ऊष्मायन के बाद, कृमि के टुकड़े को स्पष्ट रूप से कम क्यूटिकल होना चाहिए था और कोशिकाओं का घोल आसानी से दिखाई देगा।
    10. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ठंड Leibovitz के एल-15 मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (अंतिम एकाग्रता पर 50 U/mL पेनिसिलिन और 50 डिग्री/
    11. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10,000 x g पर 5 मिनट के लिए centrifugation द्वारा पृथक टुकड़े और कोशिकाओं को गोली। अतिरिक्त मलबे और क्यूटिकल को हटा दिया जाता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए ठंड एल 15-पूरक मीडिया के 1 एमएल के साथ गोली मार दी कोशिकाओं को दो बार और अधिक धो लें।
    12. एल-15-पूरक मीडिया के 1 एमएल में गोली मार दी कोशिकाओं को पुन: निलंबित और 30 मिनट के लिए बर्फ पर छोड़ दें। शीर्ष परत, लगभग 700 डिग्री 800 डिग्री सेल्सियस, एक microcentrifuge ट्यूब के लिए ले लो. इस परत सेल मलबे के बिना कोशिकाओं को शामिल है और ब्याज की कोशिकाओं के बाद अलगाव में इस्तेमाल किया जाएगा.
    13. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए, अलग-अलग कोशिकाओं के 10 डिग्री 25 डिग्री सेल्सियस के सेल घनत्व को मापने के लिए एक स्वचालित सेल काउंटर या हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करें।

2. प्रवाह साइटोमेट्री या विरोधी GFP चुंबकीय मोती के माध्यम से GFP सकारात्मक कोशिकाओं के अलगाव

नोट: विशिष्ट कक्ष प्रकार को अलग करने के लिए लागू किया जा सकता जो दो विधियाँ हैं। पहली विधि फ्लोरोसेंट-सक्रिय सेल छँटाई (FACS) का उपयोग करने के लिए है, जबकि दूसरी विधि अलग प्लाज्मा झिल्ली-स्थानीयकृत प्रोटीन व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को पूल करने के लिए एंटीबॉडी-संयुग्मी चुंबकीय मोती का उपयोग करती है। उत्तरार्द्ध विधि प्लाज्मा झिल्ली के लिए GFP के स्थानीयकरण की आवश्यकता है, इस प्रकार एंटीबॉडी-युग्मित चुंबकीय मनका के साथ बातचीत के लिए उपलब्ध किया जा रहा है.

  1. प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा GFP-सकारात्मक कोशिकाओं का अलगाव
    1. चरण 1.3.12 में एकत्र किए गए पृथक सेल निलंबन से, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10,000 x g पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र कोशिकाओं। प्रवाह साइटोमीटर को ओवरलोड िंग से बचने के लिए सुपरनेंट को छोड़ दें और एल-15-पूरक माध्यम में 6 x 106 कोशिकाओं/एमएल से अधिक की कोशिका घनत्व के लिए छेडने वाली कोशिकाओं को निलंबित करें।
    2. नमूने छँटाई करने में सक्षम एक प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग कर GFP-सकारात्मक अभिव्यक्ति द्वारा कोशिकाओं को सॉर्ट करें। GFP-ऋणात्मक कोशिकाओं गैर-सेल प्रकार विशिष्ट विश्लेषण के लिए एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
      नोट: जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, GFP-सकारात्मक कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण इस्तेमाल किया जा सकता है अगर ब्याज की GFP टैग प्रोटीन कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली के लिए स्थानीयकृत है. इस स्थिति में, अनुभाग 2.2 में वर्णित प्रोटोकॉल नियोजित किया जा सकता है।
  2. विरोधी GFP चुंबकीय मोती के माध्यम से GFP सकारात्मक कोशिकाओं के अलगाव
    1. चरण 1.3.12 में एकत्र किए गए पृथक सेल निलंबन से, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10,000 x g पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र कोशिकाओं। सुपरनेंट को त्यागें और एल-15-पूरक माध्यम के 485 डिग्री एल में कोशिकाओं को निलंबित करें। 15 डिग्री सेल्सियस डीडीएच2हे पूर्व-धावित जेड-जीएफपी एंटीबॉडी-युग्मित चुंबकीय मोतियों को विलयन में जोड़ें।
    2. बहुत कोमल मोड़ के साथ 1 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर चुंबकीय मनका घोल के साथ इनक्यूबेट कोशिकाओं। अत्यधिक मोड़ कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाएगा।
    3. ऊष्मायन के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10,000 x g पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र नमूना, फिर GFP-नकारात्मक कोशिकाओं को हटाने के लिए एल-15-पूरक माध्यम के 1 एमएल के साथ गोली 2x धोएं।
  3. पृथक कोशिकाओं की गणना
    1. एक बाँझ 6-अच्छी तरह से बहु अच्छी तरह से थाली में अलग कोशिकाओं प्लेट.
      नोट: इन प्लेटों को सेल लगाव बढ़ाने के लिए मूंगफली लैक्टिन के साथ लेपित किया जा सकता है; हालांकि, यदि कोशिकाओं को तुरंत इस्तेमाल किया जा करने के लिए कर रहे हैं, इस कदम की उपेक्षा की जा सकती है।
    2. कोशिकाओं में नमी जोड़ने के लिए प्लेट को एक प्लास्टिक के कंटेनर में रखें और 20 डिग्री सेल्सियस पर एक नम पोंछे या नरम ऊतक पेपर के साथ इनक्यूबेट कोशिकाओं को रखें (डीएच2ओ में 50 डिग्री ग्राम/एमएल एम्पिसिलिन जोड़ें) ताकि कोशिकाओं में नमी न हो। सीओ2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट न करें, क्योंकि ऊंचा सीओ2 स्तर कोशिकाओं को नुकसान पहुंचा सकता है।

3. अलग GFP सकारात्मक कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट इमेजिंग

  1. फ्लोरोसेंट लगाव के साथ एक उलटा माइक्रोस्कोप के फ्लोरोसेंट बल्ब चालू करें और यह के बारे में 10 मिनट के लिए गर्म करने के लिए अनुमति देते हैं।
  2. इनक्यूबेटर से सेल संस्कृति निकालें और पुष्पन लगाव के साथ उल्टे माइक्रोस्कोप के मंच पर सेट करें। माइक्रोस्कोप के चरण के नीचे खांचे में GFP फिल्टर स्लाइड.
  3. 50x के आवर्धन के साथ कक्षों को देखें. सफलतापूर्वक अलग GFP सकारात्मक कोशिकाओं को आसानी से दिखाई जाएगी. माइक्रोस्कोप पर कैमरा लगाव का उपयोग कर तस्वीरें ले लो.

4. अलग कोशिकाओं से आरएनए का निष्कर्षण

नोट: आरएनए का निष्कर्षण सामग्री की उच्च गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए सेल अलगाव के तुरंत बाद किया जाना चाहिए। पृथक आरएनए का उपयोग मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर) द्वारा प्रतिलिपि स्तरों के सीडीएनए और बाद में माप का उत्पादन करने के लिए किया जा सकता है। सभी ट्यूबों, सुझावों, और अभिकर्मकों RNase मुक्त होना चाहिए, और कार्यक्षेत्र इथेनॉल होना चाहिए आरएनए निष्कर्षण से पहले धोया.

  1. चरण 2.1.2 पर एकत्र अलग कोशिकाओं से, एक 1.5 एमएल बाँझ में अपकेंद्रित्र कोशिकाओं, RNase मुक्त microcentrifuge ट्यूब के लिए 5 मिनट पर 10,000 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस. यदि कोशिकाओं चुंबकीय मोती के माध्यम से अलग कर रहे हैं, ऊपर कहा गया है के रूप में सेल संग्रह का पालन करें.
  2. एक micropipette का उपयोग करना, centrifuged microcentrifuge ट्यूब से supernatant निकालें और L-15-पूरक माध्यम को धोने के लिए M9 माध्यम के 100 $L जोड़ें। सेंट्रीफ्यूज कोशिकाओं 5 मिनट पर 10,000 x g 4 डिग्री सेल्सियस पर और supernatant हटा दें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी मीडिया हटा दिए जाते हैं, हर बार सावधानी से supernatant को हटाने के तीन washes की कुल के लिए दोहराएँ।
  3. कोशिकाओं में 1 एमएल फीनॉल और ग्वानिडाइन आइसोथियोसाइनेट घोल (सामग्रीकीसारणी) जोड़ें और निलंबन को सावधानी से ऊपर और नीचे पिपेट करें। 5 मिनट के लिए आरटी पर मिश्रण इनक्यूबेट करें।
  4. ऊष्मायन के बाद, 250 फीनोल और ग्वानिडाइन आइसोथियोसाइनेट समाधान जोड़ें
  5. 25 डिग्री सेल्सियस पर 10,000 x g पर 5 मिनट के लिए समाधान को सेंट्रीफ्यूज करें।
  6. ध्यान से संभव के रूप में एक micropipette के साथ शीर्ष जलीय परत के रूप में ज्यादा हटाने के लिए, नीचे कार्बनिक परतों परेशान बिना, और एक नया 1.5 एमएल RNase मुक्त microcentrifuge ट्यूब के लिए नीचे की परत हस्तांतरण. नई ट्यूब के लिए, आइसोप्रोपेनोल के 500 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और ट्यूब उलटा द्वारा मिश्रण। 5 मिनट के लिए आरटी पर इस समाधान इनक्यूबेट करें।
  7. 25 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 14,000 x ग्राम पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें।
  8. बर्फ पर नमूने रखते हुए, एक micropipette के साथ संभव के रूप में ज्यादा isopropanol को दूर, और धीरे से जोड़ने के 1 एमएल 70% (v/v) RNase मुक्त डीडीएच2ओ में ट्यूब के लिए इथेनॉल. समाधान को सीधे ट्यूब के नीचे से बाहर न करना सुनिश्चित करें; ट्यूब के पक्ष में इथेनॉल/पानी के मिश्रण को लागू करें।
  9. 25 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
  10. इथेनॉल के अधिकांश निकालें और बर्फ पर सूखी हवा 3 "5 मिनट के लिए.
    नोट: इथेनॉल इस कदम के बाद हटाया जाना चाहिए; हालांकि, ट्यूब के नीचे की सावधान निरीक्षण कोई इथेनॉल छोड़ दिया है यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है।
  11. ट्यूब के सूख जाने के बाद, आरएनएसए-मुक्त डीडीएच2हे के 15 डिग्री सेल्सियस को जोड़ें और 260 एनएम तरंगदैर्ध्य पर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके आरएनए एकाग्रता और शुद्धता को मापें। नमूने की शुद्धता को 260 एनएम/280 एनएम अनुपात के रूप में मापा जाना चाहिए। यह अनुपात लगभग और 2 होना चाहिए।
    नोट: पृथक आरएनए जमे हुए और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। तथापि, उच्च गुणवत्ता वाले सीडीएएन उत्पादन को सुनिश्चित करने के लिए जितनी जल्दी हो सके सीडीएएनए संश्लेषण किट का उपयोग करना अत्यधिक अधिमानी है। मात्रात्मक पीसीआर प्रयोगशाला में इस्तेमाल किए गए थर्मोसाइकिलर के निर्माता द्वारा प्रदान किए गए निर्देशों का उपयोग करके पालन कर सकती है।

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Representative Results

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल unc-17के विशिष्ट अलगाव के लिए अनुमति देता है ::GFP सकारात्मक कोलीनर्जिक न्यूरॉन्स राउंडवार्म सी से इस तरह के सेल प्रकार-विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति रूपरेखा और अंतिम रूप के रूप में बाद के पूर्व vivo अध्ययन के लिए elegans पैच-क्लैम्प इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी माप के लिए अल्पकालिक culturing.

चित्रा 1 unc-17से पता चलता है ::GFP सकारात्मक कोलीनर्जिक न्यूरॉन्स उनके सामान्य सेटिंग में. अन-17 जीन को सी एलिगन ्स्ड एंड कोड के लिए एक वेसिकुलर एसिटाइलकोलीन ट्रांसमेम्ब्रेन ट्रेंब्रेनर17में व्यक्त किया जाता है . इस जीन की अभिव्यक्ति सिर में देखा जा सकता है, midbody, और पूंछ न्यूरॉन्स और न्यूरॉन अनुमानों.

चित्र ााााः ााााा ः वद्यं विधेते वववववववववथाविधे षु एक कदम सिंक्रनाइज़ और कीड़े संस्कृति है. इसके अतिरिक्त, चित्रा 2B unc-17के प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट micrographs से पता चलता है ::GFP सकारात्मक न्यूरॉन्स अलगाव के बाद के रूप में अच्छी तरह से unmodified N2 जंगली प्रकार जानवरों से संबंधित नकारात्मक नियंत्रण. अलग कोशिकाओं को जीवित रहने के लिए कर सकते हैं 3 दिन, जब Leibovitz एल-15 मध्यम और 10% FBS के साथ पूरक.

चित्रा 3 GFP से QPCR के प्रतिनिधि डेटा से पता चलता है कोलीनर्जिक न्यूरॉन्स व्यक्त करने के साथ ही GFP-expressing मांसपेशी कोशिकाओं. किसी भी विधि द्वारा कोशिकाओं के सफल छँटाई के बाद, आरएनए एक फीनॉल और ग्वानिडाइन आइसोथियोसाइनेट विधि के माध्यम से अलग किया गया था जिसके बाद सीडीएनए एक संश्लेषण किट का उपयोग करके उत्पादन किया गया था। कोलीनर्जिक न्यूरॉन-विशिष्ट जीन, टीएफ-1 और एसएनबी-1की अभिव्यक्ति, एक ट्रिप्टोफान हाइड्रॉक्सीलेस और सिनैप्टिक आशय ट्रांसपोर्टर, क्रमशः, unc-17में ऊंचा है:: GFP अलग कोशिकाओं लेकिन मायो-3में मौजूद नहीं है:: GFP अलग कोशिकाओं. व्युत्क्रम मायो-2की मांसपेशी-विशिष्ट मायोसिन भारी श्रृंखला प्रतिलिपि की अभिव्यक्ति के साथ सच है। बाद जीन की अभिव्यक्ति अलग मांसपेशियों की कोशिकाओं लेकिन नहीं अलग कोलीनर्जिक कोशिकाओं तक सीमित है.

Figure 1
चित्र 1: एक दिन पुराने जंगली प्रकार ट्रांसजेनिक जानवरों में कोलीनर्जिक न्यूरॉन्स के पुनर्निर्माण छवि unc-17व्यक्त ::GFP रिपोर्टर. छवि पूरे जानवर की लंबाई को कवर, एक ही कीड़ा के चार अलग confocal फ्लोरोसेंट छवियों से इकट्ठा किया गया था. प्रत्येक व्यक्ति की छवि का स्केल बार 50 डिग्री उ है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: कक्ष अलगाव और प्रतिनिधि GFP-expressing कोशिकाओं unc-17से अलग की वर्कफ़्लो:: GFP तनाव. (क) विशिष्ट कोशिका जनसंख्या के अलगाव के लिए Schematic कार्यप्रवाह चित्रण unc-17में समृद्ध ::GFP-एक्सप्रेसिंग कोलीनर्जिक न्यूरॉन्स संबंधित सी elegans ट्रांसजेनिक उपभेदों से. (बी) अलग unc-17में GFP संकेत की उपस्थिति दिखा प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट छवियों ::GFP सकारात्मक कोशिकाओं. ध्यान दीजिए कि प्रतिबिंब एकल फोकस समतल को दर्शाता है। स्केल बार ] 10 डिग्री मी. चित्र 2ख को जर्नल ऑफ सेल साइंस की अनुमति से पुनरुत्पादित किया गया है और इसे जर्मनी एट अल12द्वारा प्रकाशित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: unc-17-neuron विशिष्ट मार्करों के प्रतिनिधि QPCR विश्लेषण (tph-1, unc-47 और snb-1) पूरे पशु बनाम unc-17में ::GFP रिपोर्टर सेल कोलीनर्जिक के विशिष्ट संवर्धन की पुष्टि ब्याज की न्यूरॉन्स. अतिरिक्त नकारात्मक नियंत्रण यहाँ इस्तेमाल किया मायो-3थे ::GFP रिपोर्टर-एक ही प्रोटोकॉल के बाद अलग किया गया था जो मांसपेशियों की कोशिकाओं को व्यक्त. डेटा शो माध्य मान - SD (द र् 3 जैविक प्रतिकृतियां)। *p और 0.05; * *पी एंड एलटी; 0.01; p;lt; 0.001 युग्मित टी परीक्षण द्वारा। यह आंकड़ा जर्मनी एट अल12से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

राउंडवार्म सी एलिगन न्यूरोनल स्वास्थ्य और रोग2का अध्ययन करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित और शक्तिशाली मॉडल है। पर्याप्त आनुवंशिक उपकरण ों में हेरफेर करने के लिए इन जानवरों और ठीक मैप विभिन्न न्यूरॉन प्रकार के प्रबंधनीय मात्रा के साथ, डेटा का एक बड़ा सौदा सामग्री की एक अपेक्षाकृत छोटी मात्रा के साथ एकत्र किया जा सकता है. यहाँ, हम पूरे जानवरों से अलग न्यूरॉन्स को अलग करने के लिए एक अनुकूलित विधि रूपरेखा. कीड़ा के बाहरी क्यूटिकल प्रोटीन को बाधित करके, विभिन्न कोशिका ओंटा को अलग किया जा सकता है, जिसमें न्यूरॉन्स और मांसपेशियों की कोशिकाएं5शामिल हैं। इन अलग कोशिकाओं अद्वितीय प्रयोगों की एक भीड़ में इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रवाह साइटोमेट्री या एंटीबॉडी लेबल चुंबकीय मोती के माध्यम से या तो सेल छँटाई का उपयोग करने की क्षमता विशिष्ट प्रयोग के मापदंडों पर निर्भर एक अनुकूली तकनीक के लिए अनुमति देता है. एक विशिष्ट सी elegans सेल प्रकार से आरएनए निकालने भी एक और अधिक गहन परीक्षा और विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं की एक मशीनी समझ के लिए अनुमति देता है.

यहां महत्वपूर्ण कदम उठाए गए हैं जिनका बारीकी से पालन किया जाना चाहिए: 1) उम्र बढ़ने और 25 डिग्री एम फ्यूडर प्लेटों से अच्छी तरह से खिलाया कीड़े कटाई; 2) एसडीएस-डीटीटी ऊष्मायन या प्रोटीज़ मिश्रण के साथ उपचार में समय; 3) GFP सकारात्मक कोशिकाओं का चयन। सबसे पहले, कीड़े की उम्र बढ़ने के दौरान, यह सुनिश्चित करने के लिए मेहनती होना जरूरी है कि किसी भी अंडे रखी हैच नहीं है, क्योंकि यह एकत्र कीड़े में उम्र विषमता का कारण होगा, डेटा में महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता के कारण. धोने कदम जब अलगाव के लिए कीड़े कटाई भी सुनिश्चित करने के लिए कि किसी भी मृत या अपरिपक्व जानवरों एकत्र नहीं कर रहे हैं आवश्यक हैं. दूसरा, एसडीएस-डीटीटी बफर में कीड़े की अत्यधिक ऊष्मायन महत्वपूर्ण सेलुलर घटकों और कीड़े के लिए विषाक्तता के अवांछित टूटने का कारण बन सकता है, लक्ष्य सेल प्रकार के अलगाव को रोकने. सेल व्यवहार्यता बनाए रखने से या आगे अलग कोशिकाओं के आगे अल्पकालिक culturing से सफल आरएनए निष्कर्षण के लिए आवश्यक है. क्योंकि न्यूरॉन कोशिकाओं के बहुमत नाजुक हैं, या तो एसडीएस-डीटीटी बफर या protease मिश्रण उपचार के दौरान अति कठोर उपचार इन कोशिकाओं को भारी नुकसान में परिणाम कर सकते हैं. यदि एक तनाव प्रतिक्रिया मार्ग प्रयोग का लक्ष्य है, ऊष्मायन की शर्तों थोड़ा बदल सकता है के रूप में DTT की अत्यधिक रिडक्टिव शक्ति कुछ तनाव प्रतिक्रिया जीन की बढ़ाया अभिव्यक्ति का कारण बन सकता है. इस मामले में, यह सफलतापूर्वक एल-15-पूरक माध्यम के साथ सेल छर्रों धोने के लिए प्रतिक्रिया को रोकने के लिए और जल्दी से फिर से पोषक तत्वों के साथ कोशिकाओं की आपूर्ति करने के लिए महत्वपूर्ण है. अंत में, ध्यान से चुनने जो चयन कदम ब्याज की सेल प्रकार के लिए सबसे उपयुक्त है इन कोशिकाओं की अधिकतम वसूली के लिए अनुमति देगा. इसी तरह, सेल प्रकार-विशिष्ट मार्करों के सेलुलर स्थानीयकरण पर विचार शोधकर्ताओं सबसे इष्टतम सेल संवर्धन दृष्टिकोण का चयन करने में मदद कर सकते हैं. प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग एक अधिक समरूप और व्यवहार्य सेल संस्कृति उपज, जबकि विरोधी GFP चुंबकीय मोती का उपयोग कम समय लेने और श्रम गहन है.

यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि यहाँ वर्णित विधि की कुछ सीमाएँ हैं. सबसे पहले, वांछित सेल प्रकार में GFP की मजबूत अभिव्यक्ति FACS या एंटीबॉडी-युग्मित चुंबकीय मोती द्वारा उपयुक्त अलगाव सुनिश्चित करने के लिए सत्यापित किया जाना चाहिए. दूसरा, यहां तक कि कोमल क्यूटिकल व्यवधान एक गरीब उपज या कुछ शरीर की दीवार कोशिकाओं के भी नुकसान, या अन्य कम बहुतायत सेल आबादी जैसे dat-1 डोपामाइनर्जिक न्यूरॉन्स के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। सेल प्रकार चुनते समय, अधिक प्रचुर मात्रा में सेल प्रकार आमतौर पर अधिक सफल उपज प्रदान कर सकते हैं। बहरहाल, इस विधि के रूप में अच्छी तरह से कम प्रचुर मात्रा में सेल प्रकार की आबादी के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

संक्षेप में, इस आलेख में चर्चा की गई प्रक्रिया राउंडवार्म सी एलिगनसे अलग-अलग सेल प्रकारों की निकासी और अलगाव की एक प्रभावी विधि प्रस्तुत करती है। विधि आरएनए की निकासी के लिए अनुमति देने के लिए काफी मजबूत है, और बाद में जीन रूपरेखा, और काफी संवेदनशील अलग कोशिकाओं की खेती के लिए अनुमति देने के लिए. यद्यपि कक्षों के विशिष्ट समूहों को अलग-अलग करने के लिए उपयोग की गई सटीक पद्धति विभिन्न कक्ष प्रकारों के बीच भिन्न हो सकती है, फिर भी इस रिपोर्ट में वर्णित वर्कफ़्लो सामान्यतः प्रभावी होता है और लगभग सभी प्रकार के वर्म कक्षों पर लागू किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम डॉ जेनिफर फॉक्स और व्यावहारिक टिप्पणी के लिए Khalimonchuk प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद. हम स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (R01 GM108975 से O.K. और T32 GM107001-01A1 से ई.एम.जी.) से समर्थन स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well plate Fisher Scientific 12-556-004
Agar, Molecular Biology Grade VWR A0930
CaCl2 Sigma C5670
Chloroform Sigma 496189
Contess Automated Cell Counter Invitrogen Z359629
DTT USBiological D8070
Ethanol Decon Labs 2701
FBS Omega Scientific FB-02
Fluorodeoxyuridine Sigma F0503
HEPES Sigma H3375
Isopropanol VWR BDH1133
KCl Amresco O395
KH2PO4 USBiological P5110
Kimwipes Kimberly-Clark Professionals 7552
Leibovitz's L-15 Medium Gibco 21083027
MgCl2 Sigma M8266
MgSO4 USBiological M2090
Na2HPO4·7H2O USBiological S5199
NaCl VWR X190
NaOCl (Bleach) Clorox
NaOH Amresco O583
Penicillin-Streptomicen Fisher Scientific 15140122
Peptone Y USBiological P3306
Pronase E Sigma 7433 protease mixture from Streptomyces griseus
SDS Amresco O227
SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope Tritech Research
Sucrose USBiological S8010
SuperScript IV One-Step synthesis kit ThermoFisher 12594025
TRIzol Invitrogen 15596026 phenol and guanidine isothiocyanate solution
Trypan Blue Stain Invitrogen T10Z82
α-GFP magnetic beads MBL D153-11

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 150 सी elegans,सेल अलगाव न्यूरॉन्स उम्र बढ़ने न्यूरॉन मार्करों हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन
राउंडवार्म <em>Caenorhabditis elegans</em> से विशिष्ट न्यूरोन आबादी का अलगाव
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Germany, E. M., Zahayko, N., Khalimonchuk, O. Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (150), e60145, doi:10.3791/60145 (2019).

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