Isolamento di popolazioni di neuroni specifici da nematode Caenorhabditis elegans
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per un semplice isolamento di specifici gruppi di cellule neuronali vive che esprimono proteine fluorescenti verdi dalle linee transgeniche di Caenorhabditis elegans . Questo metodo consente una varietà di studi ex vivo focalizzati su neuroni specifici e ha la capacità di isolare le cellule per ulteriori colture a breve termine.
Abstract
Durante il processo di invecchiamento, molte cellule accumulano alti livelli di danni che portano alla disfunzione cellulare, che sta alla base di molte condizioni geriatriche e patologiche. I neuroni post-mitotici rappresentano un tipo di cellula principale interessato dall’invecchiamento. Anche se esistono più modelli di mammiferi di invecchiamento neuronale, sono impegnativi e costosi da stabilire. Il nematode Caenorhabditis elegans è un potente modello per studiare l’invecchiamento neuronale, in quanto questi animali hanno una breve durata di vita, una cassetta degli attrezzi genetica robusta disponibile e un sistema nervoso ben catalogato. Il metodo qui presentato consente di un isolamento senza soluzione di continuità di cellule specifiche basato sull’espressione di una proteina fluorescente verde transgenica (GFP). Le linee animali transgeniche che esprimono GFP sotto distinti promotori tipo di cellule sono digerite per rimuovere la cuticola esterna e disturbati delicatamente meccanicamente per produrre liquami contenenti vari tipi di cellule. Le cellule di interesse vengono quindi separate dalle cellule non bersaglio attraverso lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza o da perline magnetiche ad accoppiamento anti-GFP. Le cellule isolate possono quindi essere coltivate per un tempo limitato o immediatamente utilizzate per analisi ex vivo specifiche per cellula, come l’analisi trascrizionale tramite PCR quantitativa in tempo reale. Pertanto, questo protocollo consente un’analisi rapida e robusta delle risposte specifiche delle cellule all’interno di diverse popolazioni neuronali in C. elegans.
Introduction
Nel corso degli ultimi decenni, l’organismo modello metazoano Caenorhabditis elegans è stata una risorsa enorme nello studio dei neuroni, circuiti neuronali e il suo ruolo nelle risposte fisiologiche e comportamentali, e neurodegenerative associato all’invecchiamento Malattie. Una caratteristica unica di C. elegans è che gli animali sono trasparenti, permettendo il lignaggio di tutte le cellule somatiche adulte da mappare1. C. elegans ospita anche una quantità gestibile di neuroni, portando alla morfologia e alla connettività del sistema nervoso ben comprese2. Il lignaggio cellulare invariante, breve durata della vita, e l’abbondanza di strumenti genetici ad alto throughput disponibili per C. elegans lo rendono un organismo modello ideale per lo studio dell’invecchiamento all’interno di diverse popolazioni neuronali.
L’invecchiamento dei neuroni e disturbi neurodegenerativi sono complessi, e ogni disturbo ha firme patologiche uniche associate ad esso. Tuttavia, per molti di questi disturbi, come il morbo di Parkinson e di Alzheimer, una caratteristica comune è il carico progressivo di proteine piegate in modo non corretto3,4,5. In entrambe queste malattie, le proteine si piegano in modo equilone e si aggregano all’interno della cellula per causare tossicità, portando infine alla morte cellulare4,5. Per il corretto invecchiamento dei neuroni, l’omeostasi dei mitocondri, più specificamente proteina omeostasi, è importante, in quanto le perturbazioni e la dishomeostasi possono portare alla neurodegenerazione6,7,8. Le cellule sono dotate di vari meccanismi per mantenere l’omeostasi proteica, uno dei quali è la risposta delle proteine spiegata (UPR), un percorso classico in cui i segnali provenienti da reticolato endoplasmico (ER) attivano le cascate di segnali intracellulari, portando ad una risposta9. In forma diquesto UPR ER, i metazoi mostrano una risposta simile alla perdita di omeostasi delle proteine mitocondriali, la cosiddetta UPR mitocondriale (UPRmt)7,8. C. elegans sembra essere l’organismo più basale ad avere un percorso UPRmt confermato e ben definito7.
La funzione/disfunzione di specifiche popolazioni neuronali all’interno di una rete più ampia può essere difficile da valutare a causa della loro connettività intrinseca e complessità3. Tuttavia, c’è spesso la necessità di studiare popolazioni neuronali distinte a causa di malattie specifiche del tipo di cellula con patologie complesse, come quelle associate all’omeostasi delle proteine cellulari alterate. In C. elegans,specifiche popolazioni neuronali possono essere geneticamente manipolate permettendo una facile osservazione in vivo. Il sistema nervoso di C. elegans è costituito principalmente da neuroni, con una piccola percentuale di cellule gliali. Nei vermi di ermafrodite adulti, ci sono circa 302 neuroni, suddivisi in oltre 100 classi diverse2,10. Neuroni come neuroni colinergici predominano nelle giunzioni neuromuscolari, mentre i neuroni dopaminergici sono principalmente coinvolti nella sensazione10,11. Poiché sia l’attività motoria che le capacità sensoriali diminuiscono con l’età, è importante dettagliare le intuizioni meccanicistiche sui difetti in questi singoli neuroni11,12. Come tale, vi è la necessità di un metodo semplice e robusto per isolare le cellule intatte di interesse per i successivi studi ex vivo.
Qui, descriviamo un metodo efficace ottimizzato per il rapido isolamento di specifiche cellule neuronali che esprimono proteine fluorescenti verdi (GFP) da C. elegans. Questo metodo di isolamento può essere eseguito su vermi larvali, giovani o adulti. L’isolamento delle cellule dai vermi larvali è stato precedentemente pubblicato da . Una nota importante qui è che tutti i vermi devono essere allo stesso stadio di vita per evitare una digestione eccessiva dell’animale o contaminazione da animali in diverse fasi di vita. Attraverso la rottura sia enzimatica che meccanica della cuticola nematode, un esoscheletro alto nel collagene e in altre proteine strutturali, un’ampia varietà di cellule può essere isolata13,14. Le cellule possono quindi essere isolate tramite citometria di flusso o anticorpi etichettati perline magnetiche. Tipicamente, l’RNA è isolato tramite un fenolo e un metodo isothiocyanato di fenidine per garantire l’arricchimento della popolazione cellulare desiderata15. Con molta cura queste cellule isolate possono essere mantenute in un flacone di coltura o piatto multi-bene. Questo metodo rappresenta uno strumento unico e potente nello studio di neuroni specifici e ha la capacità di isolare le cellule vive e funzionali per un’ulteriore coltura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il nematode C. elegans è un modello consolidato e potente per studiare la salute neuronale e la malattia2. Con ampi strumenti genetici per manipolare questi animali e una quantità gestibile di vari tipi di neuroni mappati con precisione, una grande quantità di dati può essere raccolta con una quantità relativamente piccola di materiale. Qui, illustreremo un metodo ottimizzato per isolare neuroni distinti da animali interi. Interrompendo le proteine cutici esterne del verme, un liquam…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo la dott.ssa Jennifer Fox e i membri del laboratorio Khalimonchuk per commenti approfonditi. Riconosciamo il sostegno dei National Institutes of Health (R01 GM108975 a O.K. e T32 GM107001-01A1 a E.M.G.).
Materials
| 6-well plate | Fisher Scientific | 12-556-004 | |
| Agar, Molecular Biology Grade | VWR | A0930 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Chloroform | Sigma | 496189 | |
| Contess Automated Cell Counter | Invitrogen | Z359629 | |
| DTT | USBiological | D8070 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| FBS | Omega Scientific | FB-02 | |
| Fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Isopropanol | VWR | BDH1133 | |
| KCl | Amresco | O395 | |
| KH2PO4 | USBiological | P5110 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professionals | 7552 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| MgSO4 | USBiological | M2090 | |
| Na2HPO4·7H2O | USBiological | S5199 | |
| NaCl | VWR | X190 | |
| NaOCl (Bleach) | Clorox | ||
| NaOH | Amresco | O583 | |
| Penicillin-Streptomicen | Fisher Scientific | 15140122 | |
| Peptone Y | USBiological | P3306 | |
| Pronase E | Sigma | 7433 | protease mixture from Streptomyces griseus |
| SDS | Amresco | O227 | |
| SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope | Tritech Research | ||
| Sucrose | USBiological | S8010 | |
| SuperScript IV One-Step synthesis kit | ThermoFisher | 12594025 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596026 | phenol and guanidine isothiocyanate solution |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | T10Z82 | |
| α-GFP magnetic beads | MBL | D153-11 |
References
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100, 64-119 (1983).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society B. 314, 1-340 (1986).
- Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews in Neuroscience. 18, 530-546 (2017).
- Selkoe, D. J. Cell biology of protein misfolding: The examples of Alzheimer’s and Parkinson’s disease. Nature Cell Biology. 6, 1054-1061 (2004).
- Choi, M. L., Gandhi, S. Crucial role of protein oligomerization in the pathogenesis of Alzheimer’s and Parkinson’s disease. FEBS Journal. 285, 3631-3644 (2018).
- Burman, J. L., et al. Mitochondrial fission facilitates the selective mitophagy of protein aggregates. Journal of Cell Biology. 210, 3231-3247 (2017).
- Shpilka, T., Haynes, C. M. The mitochondrial UPR: mechanisms, physiological functions and implications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, 109-120 (2018).
- Haynes, C. M., Petrova, K., Benedetti, C., Yang, Y., Ron, D. ClpP mediates activation of a mitochondrial unfolded protein response in C. elegans. Developmental Cell. 13, 467-480 (2007).
- Walter, P., Ron, D. The unfolded protein response: from stress pathway to homeostatic regulation. Science. 334, 1081-1086 (2011).
- Chen, C., Chen, Y., Jiang, H., Chen, C., Pan, C. Neuron aging: learning from C. elegans. Journal of Molecular Signal. 8 (14), 1-10 (2013).
- Germany, E. M., et al. The AAA-ATPase Afg1 preserves mitochondrial fidelity and cellular health by maintaining mitochondrial matrix proteostasis. Journal of Cell Science. 131, jcs219956 (2018).
- Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLOS One. 6 (4), e19505 (2011).
- Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Molecular Biology of the Cell. 15, 657-664 (2004).
- Pereira, L., et al. A cellular regulatory map of the cholinergic nervous system of C. elegans. eLife. 4, e12432 (2015).
