Summary
ここで、トランスジェニック・カエオルハブ炎エレガンス線から緑色蛍光タンパク質を発現する生きている神経細胞の特定の群を単純に単離するためのプロトコルを提示する。この方法は、特定のニューロンに焦点を当てた様々なex vivo研究を可能にし、さらに短期的な培養のために細胞を分離する能力を有する。
Abstract
老化プロセスの間に, 多くの細胞は、細胞機能障害につながる損傷の高レベルを蓄積します, 多くの老人および病理学的状態の下に.有人性後ニューロンは、加齢の影響を受ける主要な細胞型を表します。神経老化の複数の哺乳類モデルが存在するが、それらは確立するために挑戦的で高価である。回虫のカエモルハブ炎エレガンスは、これらの動物は短い寿命、利用可能な堅牢な遺伝的ツールボックス、およびよくカタログ化された神経系を持っているので、神経老化を研究するための強力なモデルです。本明細書に提示される方法は、トランスジェニック緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現に基づいて特定の細胞をシームレスに単離することを可能にする。異なる、細胞型特異的プロモーターの下でGFPを発現するトランスジェニック動物株は、外側のキューティクルを除去するために消化され、様々な細胞タイプを含むスラリーを生成するために穏やかに機械的に破壊される。その後、目的の細胞は、蛍光活性化細胞選別、または抗GFP結合磁気ビーズによって非標的細胞から分離されます。その後、単離された細胞を限られた時間で培養するか、リアルタイム定量PCRによる転写分析などの細胞特異的な生体内分析に直ちに使用することができます。したがって、このプロトコルは、C.エレガンスの異なるニューロン集団内の細胞特異的応答の迅速かつ堅牢な分析を可能にする。
Introduction
過去数十年にわたり、メタゾンモデル生物のカエオルハブ炎エレガンスは、ニューロン、ニューロン回路、生理的および行動的応答におけるその役割、および老化関連神経変性の研究において、多大な財産となっています。病気。C.エレガンスのユニークな特徴は、動物が透明であり、すべての成人体細胞の系統をマッピングできるようにすることです 1.C. エレガンスはまた、神経細胞の管理可能な量を収容し、神経系の形態と接続性がよく理解されている2.C.エレガンスで利用可能な不変細胞系統、短い寿命、および豊富なハイスループット遺伝的ツールは、異なる神経集団内の老化の研究のための理想的なモデル生物を作る。
ニューロンの老化と神経変性疾患は複雑であり、各疾患はそれに関連するユニークな病理学的特徴を有する。しかし、パーキンソン病やアルツハイマー病などのこれらの疾患の多くでは、一般的な特徴は、誤ったたんぱく質3、4、5の進行性負荷である。これらの疾患の両方において、タンパク質は細胞内で誤って折り畳まれ、凝集して毒性を引き起こし、最終的には細胞死4、5につながる。ニューロンの適切な老化のために、ミトコンドリアの恒常性、より具体的にはタンパク質恒常性は、摂動および嚥下障害が神経変性6、7、8を引き起こす可能性があるとして重要である。細胞はタンパク質恒常性を維持するための様々なメカニズムを備え、1つは展開されたタンパク質応答(UPR)である-小球網膜(ER)からのシグナルが細胞内シグナルカスケードを活性化し、転写につながる古典的な経路である。応答9.このUPRERに似て、メタゾンはミトコンドリアタンパク質恒常性の喪失に対して同様の応答を示し、いわゆるミトコンドリアUPR(UPRmt)7,8である。C. エレガンスは、確認され、明確に定義されたUPRmt経路7を持っている最も基底生物であるように見えます.
大規模なネットワーク内の特定のニューロン集団の機能/機能不全は、その本質的な接続性と複雑さ3を評価するのが難しい場合があります。しかし、細胞性タンパク質恒常性障害に関連するものなど、複雑な病理を有する細胞型特異的疾患のために、異なる神経集団を研究する必要が生じることが多い。C.エレガンスでは、特定の神経集団を遺伝的に操作し、生体内での顔の観察を可能にする。C.エレガンスの神経系は、主に神経細胞で構成され、グリア細胞の割合は小さい。成人のヘルマクロダイトワームでは、約302のニューロンがあり、100以上の異なるクラス2、10に細分化されている。コリン作動性ニューロンなどのニューロンは神経筋接会で優勢であり、ドーパミン作動性ニューロンは主に感覚10,11に関与する。運動活動と感覚能力の両方が年齢とともに低下するにつれて、これらの個々のニューロンの欠陥に関する機械的洞察を詳細に述べる必要があります11,12.そのため、その後のex vivo研究のために目的とする無傷の細胞を単離するシンプルで堅牢な方法が必要である。
ここでは、C.エレガンスから緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現する特定の神経細胞を迅速に単離するための最適化された有効な方法について説明する。この分離方法は、幼虫、若年性または成人のワームに対して行うことができる。幼虫ワームからの細胞の分離は、以前にZhang et al. al.13によって発表され、ここでは議論されません。ここで重要な注意事項は、すべてのワームが異なるライフステージで動物の過剰消化や動物からの汚染を防ぐために同じライフステージにある必要があることです。線虫キューティクルの酵素および機械的破壊の両方を通じて、コラーゲンおよび他の構造タンパク質の高い外骨格は、多種多様な細胞を単離することができる13、14。細胞は、その後、フローサイトメトリーまたは抗体標識磁気ビーズを介して単離することができる。典型的には、RNAは、所望の細胞集団15の濃縮を確実にするためにフェノールおよびグアニジンイソチオシアネート法を介して単離される。多くの注意を払って、これらの単離された細胞は、培養フラスコまたはマルチウェル皿で維持することができる。この方法は、特定のニューロンの研究におけるユニークで強力なツールを表し、さらなる培養のための生細胞および機能細胞を分離する能力を有する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 細胞分離のための老化したワームの準備と収集
注:以下に説明すると、ミネソタ大学のカエノルハブティス遺伝学センター(CGC)株リポジトリから得られたトランスジェニックunc-17::GFP株(OH13083)からのコリン作動性ニューロンの単離です。 真菌や細菌からの汚染を防ぐために、滅菌条件を維持することが不可欠です。
- T. Stiernagle16で説明されているように、漂白方法を介してワームを準備し、同期します。老化実験では、フルオロデオキウリジン(FuDR)の25μM水溶液を含む線虫成長培地(NGM)プレート上にプレートワームを取り出し、卵の産生を減らし、卵の孵化を阻止する。寒天プレートを定期的に検査し、汚染や卵の孵化を防ぐため、信頼性の低い結果を引き起こします。
注:unc-17::GFP細胞の場合、通常3つの100mm x 15 mm NGMプレートを使用して、目的の十分な量の細胞を単離する16。 - ワームを収集し、セルの分離用にバッファーを準備します。
- 15 mLの円錐形の管でワームを集める。M9バッファーの1.5 mL(1 mM MgSO 4、85 mM NaCl、42 mM Na2HPO4·7H2O、22 mM KH2PO、pH 7.0)と遠心分離機を1,600 x gで5分間洗浄します。上清を捨て、M9バッファーの1 mLでワームを洗います。遠心分離を繰り返し、合計5回洗浄し、できるだけ多くの大腸菌汚染を除去します。
注:このステップでアンピシリンなどの抗生物質(50 μg/mL)を添加すると、細菌汚染を減らすことができます。 - 2つのサンプルの場合は、2mLのドデシル硫酸ジチオスレイトール(SDS-DTT)リシスバッファーを調製します:200 mM DTT、0.25%(w/v)SDS、20 mM HEPES(pH 8.0)、および3%(w/v)サッ糖。
- 15 mLの絶縁バッファー(118 mM NaCl、48 mM KCl、2 mM CaCl2、2 mM MgCl 2、25 mM HEPES [pH 7.3]))を準備し、氷の上に保管します。
注: SDS-DTT リシス バッファーと分離バッファーの両方を、各実験の前に新たにする必要があります。
- 15 mLの円錐形の管でワームを集める。M9バッファーの1.5 mL(1 mM MgSO 4、85 mM NaCl、42 mM Na2HPO4·7H2O、22 mM KH2PO、pH 7.0)と遠心分離機を1,600 x gで5分間洗浄します。上清を捨て、M9バッファーの1 mLでワームを洗います。遠心分離を繰り返し、合計5回洗浄し、できるだけ多くの大腸菌汚染を除去します。
- キューティクル破壊と単一細胞分離
- 1,600 x gで5分間ステップ1.2.1で収集された遠心分離動物。M9培体の1mLで上清とサスペンドワームをすべて取り除き、1.5mLマイクロ遠心管に移します。
- 遠心分離を持つペレットワームを1,600 x gで5分間使用します。
- ワームに200 μLのSDS-DTTリシスバッファーを追加し、室温(RT)で5分間インキュベートします。虫は、光顕微鏡で見ると、体に沿って「ウィンクル」しているように見えるはずです。
注:SDS-DTTリシスバッファーへの長時間の暴露は、ワームを観察することによって監視することができるワームの死をもたらす可能性があります。死んだワームは伸び、カールしません。 - 800 μLの氷冷絶縁バッファーを追加し、チューブを軽くフリックして混ぜます。
- ペレットワームを4°Cで13,000 x gで1分間、上清を除去し、1mLの単離バッファーで洗浄する。
- ステップ 1.3.5 を合計 5 回繰り返し、毎回分離バッファーを慎重に削除します。
- ストレプトマイセスグリセス(15mg/mL)(材料表)からプロテアーゼ混合物の100 μLをペレットに溶解し、RTで10-15分間インキュベートします。
注:SDS-DTTリシスバッファーと同様に、拡張プロテアーゼ消化は、プラズマ膜に沿ってタンパク質の過剰な切断をもたらし、磁気ビーズを介して表面露出GFPの単離を防ぐ可能性があります。 - プロテアーゼ混合物によるインキュベーション中に、200μLマイクロピペットチップを使用して1.5mLマイクロ遠心分離管の底部に対してピペッティングサンプルを約60-70回使用して機械的破壊を行います。細胞を適切に切り離すために一定の圧力でマイクロ遠心管の壁に対してピペットの先端を保ちます。
- 消化の段階を決定するには、消化混合物の少量(〜1〜5 μL)を取り除き、ガラススライドに落とし、組織培養顕微鏡を使用して検査します。インキュベーションの5−7分後、ワームの断片は目に見えてキューティクルを減少させ、細胞のスラリーが容易に見えるようにする必要があります。
- 市販の冷たいライボヴィッツのL-15培地の900 μLとの反応を停止し、10%の胎児ウシ血清(FBS)およびペニシリン連鎖マイシン(50 Μg/mLペニシリンおよび50 μg/mLストレプトマイシンの最終濃度)を補充した。
- ペレットは4°Cで10,000 x gで5分間遠心分離により断片および細胞を単離した。余分な破片やキューティクルが除去されることを確認するために、冷たいL-15補充培温の1 mLでペレット化した細胞をもう2回洗浄します。
- L-15補充培養物の1mLでペレット化した細胞を再中断し、30分間氷の上に放置する。最上層(約700~800μL)をマイクロ遠心管に取ります。この層は、細胞の破片のない細胞を含み、目的の細胞のその後の単離に使用されます。
- メーカーの指示に従って、自動セルカウンターまたはヘモサイトメーターを使用して、単離された細胞の10−25 μLの細胞密度を測定します。
2. フローサイトメトリーまたは抗GFP磁気ビーズによるGFP陽性細胞の単離
注: 特定のセル・タイプを分離するためにデプロイできる方法は 2 つあります。第1の方法は蛍光活性化細胞選別(FACS)を用い、2番目の方法は抗体共役磁気ビーズを用して、異なる血漿膜局在タンパク質を発現する細胞をプールする。後者の方法は、GFPを血漿膜に局在化させる必要があり、したがって、抗体結合磁気ビーズとの相互作用のために利用できる。
- フローサイトメトリーによるGFP陽性細胞の単離
- ステップ1.3.12で採取した単離細胞懸濁液から、4°Cで10,000 x gで5分間遠心分離細胞を採取した。流れ細胞計の過負荷を避けるために、L-15補充培地で上清細胞を廃棄し、6 x 106細胞/mL以下の細胞密度に懸濁します。
- サンプルをソートできるフローサイトメーターを用いてGFP陽性発現で細胞をソートする。GFP陰性細胞は、非細胞型特異的分析の制御として使用することができる。
注:前述のように、GFPタグ付きタンパク質が細胞の血漿膜に局在する場合、GFP陽性細胞を単離する代替アプローチを使用することができる。この場合、セクション2.2で説明するプロトコルを採用することができます。
- 抗GFP磁気ビーズによるGFP陽性細胞の単離
- ステップ1.3.12で採取した単離細胞懸濁液から、4°Cで10,000 x gで5分間遠心分離細胞を採取した。上清を廃棄し、L-15補充培地の485μLで細胞を懸濁させる。溶液にddH2O予洗浄されたα-GFP抗体結合磁気ビーズの15 μLを添加する。
- 非常に穏やかな回転で1時間4°Cで磁気ビーズスラリーで細胞をインキュベートします。過度の回転は細胞に損傷を与えます。
- インキュベーション後、4°Cで10,000 x gで5分間遠心分離液を洗浄し、次いでL-15補充培地の1mLでペレット2xを洗浄し、GFP陰性細胞を除去する。
- 単離細胞の培養
- 無菌6ウェルマルチウェルプレートに分離した細胞をプレート化する。
注:これらのプレートは、細胞の付着を増加させるためにピーナッツレクチンでコーティングすることができます;ただし、セルをすぐに使用する場合は、この手順を無視する可能性があります。 - プレートをプラスチック容器に入れ、湿った拭き取り紙または軟部組織紙で20°Cの細胞をインキュベートします(50 μg/mLアンピシリンをddH2Oに加えて、拭き取りに細菌の増殖を防ぎます)。上昇したCO2レベルが細胞に損傷を与える可能性があるため、CO2インキュベーターでインキュベートしないでください。
- 無菌6ウェルマルチウェルプレートに分離した細胞をプレート化する。
3. 単離GFP陽性細胞の蛍光イメージング
- 蛍光付着付きの反転顕微鏡の蛍光球根をオンにし、約10分間ウォームアップします。
- インキュベーターから細胞培養物を取り出し、蛍花付着を持つ反転顕微鏡のステージに設定します。GFPフィルターを顕微鏡の段階の下の溝にスライドさせます。
- 50倍の倍率でセルを表示します。正常に単離されたGFP陽性細胞は容易に見える。顕微鏡のカメラアタッチメントを使用して写真を撮ります。
4. 単離細胞からのRNAの抽出
注:RNAの抽出は、材料の高品質を確保するために、細胞単離直後に行われるべきです。単離されたRNAは、定量的PCR(qPCR)による転写レベルのcDNAおよびその後の測定に使用することができる。すべてのチューブ、チップ、試薬はRNaseフリーで、ワークスペースはRNA抽出の前にエタノール洗浄する必要があります。
- ステップ2.1.2で採取した単離細胞から、1.5mL無菌中の遠心分離細胞、4°Cで10,000 x gで5分間RNaseフリーマイクロ遠心管チューブ。細胞が磁気ビーズを介して単離される場合は、上記のように細胞採取に従ってください。
- マイクロピペットを使用して、遠心分離管から上清を取り出し、L-15補充培地を洗い流すためにM9培地の100 μLを追加します。遠心分離細胞は4°Cで10,000 x gで5分、上清を除去する。すべてのメディアを確実に取り除くために、毎回慎重に上清を取り除く合計3回の洗い流しを繰り返します。
- フェノールとグアニジンイソチオシアネート溶液(材料の表)の1 mLを細胞に加え、懸濁液を慎重に上下にピペットします。RTで混合物を5分間インキュベートします。
- インキュベーション後、250フェノールとグアニジンイソチオシアネート溶液を添加する
- 25 °Cで10,000 x gで5分間溶液を遠心分離します。
- 最下層の有機層を邪魔することなく、マイクロピペットでトップ水層をできるだけ慎重に取り除き、下層を新しい1.5 mL RNaseフリーマイクロ遠心管に移します。新しいチューブに、イソプロパノールの500 μLを追加し、チューブを反転して混合します。この溶液をRTで5分間インキュベートします。
- 25 °Cで20分間14,000 x gでチューブを遠心分離します。
- サンプルを氷の上に保ちながら、マイクロピペットでできるだけ多くのイソプロパノールを取り出し、RNaseフリーddH2Oに70%(v/v)エタノールの1 mLをチューブに静かに加えます。溶液をチューブの底に直接排出しないようにしてください。チューブの側面にエタノール/水の混合物を適用します。
- 遠心分離機 10,000 x gで 25 °C で 5 分間。
- エタノールの大部分を取り除き、氷の上で空気乾燥を3-5分間取り除きます。
注: エタノールは、この手順の後に削除する必要があります。しかし、エタノールが残らないように、チューブの底部を注意深く検査することが重要です。 - チューブを空気乾燥させた後、RNaseフリーddH 2Oの15−20μLを追加し、260nm波長の分光光度計を使用してRNA濃度と純度を測定します。サンプルの純度は260 nm/280 nm比として測定する必要があります。この比率は約 >2 である必要があります。
注:絶縁されたRNAは-20°Cで凍結および貯蔵することができる。しかし、cDNA合成キットをできるだけ早く使用して、高品質のcDNA生産を確保することは非常に優遇されています。定量的なPCRは実験室で使用される熱サイクラーの製造業者によって提供される指示を使用して従うことができる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ここで説明するプロトコルは、細胞型特異的遺伝子発現プロファイリングおよび最終的な結果のような後続のex vivo研究のための回虫C.エレガンスからのunc-17::GFP陽性コリン作動性ニューロンの特異的な単離を可能にするパッチクランプ電気生理学測定のための短期培養。
図1は、unc-17::GFP陽性コリン作動性ニューロンを正常な設定で示す。unc-17遺伝子は、C.エレガンス体全体で発現され、小胞性アセチルコリン膜トランスヒ容者17のコードである。この遺伝子の発現は、頭部、中体、尾ニューロンおよびニューロン突起で観察することができる。
図2Aは、方法セクションで概説されたニューロン単離手順の絵画的概要を示す。ステップ 1 は、ワームを同期してカルチャすることです。さらに、図2Bは、unc-17::GFP陽性ニューロンの代表的な蛍光顕微鏡写真と、未改変N2野生動物からのそれぞれの陰性対照を示す。 単離された細胞は、ライボヴィッツのL-15培地と10%FBSを補充した場合、最大3日間生き続けることができます。
図3は、GFP発現筋細胞と同様にコリン作動性ニューロンを発現するGFPからのqPCRの代表的なデータを示す。いずれの方法で細胞の選別に成功した後、RNAをフェノールおよびグアニジンイソチオシアネート法を介して単離し、その後cDNAを合成キットを用いて製造した。コリン作動性ニューロン特異的遺伝子の発現は、tph-1およびsnb-1、トリプトファンヒドロキシラーゼおよびシナプス小胞トランスポーター、それぞれunc-17:::GFP単離細胞では上昇しているが、myo-3::GFPには存在しない分離されたセル。逆は、myo-2の筋肉特異的ミオシン重鎖転写物の発現に当てはまる。後者の遺伝子の発現は、単離された筋肉細胞に限定されるが、単離されたコリン作動性細胞には限定されない。
図1:unc-17を発現する1日前の野生型トランスジェニック動物におけるコリン作動性ニューロンの再構成画像::GFPレポーター。画像は、同じワームの4つの別々の共焦点蛍光画像から組み立てられ、動物全体の長さをカバーした。個々の画像のスケールバーは50 μmです。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:unc-17から単離した細胞単離および代表的なGFP発現細胞のワークフロー:GFP株。(A) unc-17で濃縮された特定細胞集団の単離に関する概略ワークフロー描写::GFP発現コリン作動性ニューロンは、それぞれのC.エレガンストランスジェニック株から。(B)単離されたunc-17におけるGFPシグナルの存在を示す代表的な蛍光画像::GFP陽性細胞。画像は単一の焦点面を示している。スケールバー = 10 μm.図2Bは、細胞科学雑誌の許可を得て複製され、ドイツら12.らによって出版されている。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:全動物対unc-17::GFPレポーター細胞単離におけるunc-17-ニューロン特異的マーカー(tph-1、unc-47およびsnb-1)の代表的なqPCR分析::GFPレポーター細胞はコリン作動性の特異的濃縮を確認する興味のあるニューロン。ここで使用される追加の負の対照は、同じプロトコルに従って単離されたmyo-3::GFPレポーター発現筋細胞であった。データは平均値±SD(n=3生物学的反復)を示す。*p < 0.05;**p < 0.01;p < 0.001 対ペアtテストによる。この数字はドイツら12から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
回虫C.エレガンスは、神経の健康と病気2を研究するための確立された強力なモデルです。これらの動物を操作するための十分な遺伝的ツールと正確にマッピングされた様々なニューロンタイプの管理可能な量を使用すると、比較的少量の材料で大量のデータを収集することができます。ここでは、動物全体から異なるニューロンを分離するための最適化された方法を概説する。ワームの外側キューティクルタンパク質を破壊することにより、ニューロンおよび筋肉細胞を含む様々な細胞タイプのスラリーを単離することができる5。これらの単離された細胞は、多数のユニークな実験で使用することができる。フローサイトメトリーまたは抗体標識磁気ビーズを介して細胞選別を使用する能力は、特定の実験のパラメータに依存する適応技術を可能にします。特定のC.エレガンス細胞型からRNAを抽出することで、より徹底的な検査と様々な細胞プロセスの機械的理解を可能にします。
ここで詳しく説明する必要がある重要な手順があります: 1) 25 μM FuDR プレートから十分に供給されたワームの老化と収穫;2)SDS-DTTインキュベーションまたはプロテアーゼ混合物による治療における時間;3)GFP陽性細胞の選択。第一に、ワームの老化の間に、採取されたワームの年齢の不均一性を引き起こし、データに大きなばらつきを引き起こすので、産卵した卵が孵化しないことを確実にすることが不可欠です。隔離のためにワームを収穫する際の洗浄手順は、死んだ動物や未熟な動物が収集されないようにするためにも必要です。第二に、SDS-DTTバッファー内のワームの過剰なインキュベーションは、重要な細胞成分の望ましくない分解およびワームへの毒性を引き起こし、標的細胞型の単離を防ぐ可能性がある。細胞の生存率を維持することは、単離細胞のRNA抽出を成功させるか、またはさらに短期的な培養を行う上で不可欠です。神経細胞の大部分はデリケートであるため、SDS-DTTバッファーまたはプロテアーゼ混合物処理中に過度に過酷な治療は、これらの細胞に大きな損傷をもたらす可能性があります。ストレス応答経路が実験の対象である場合、DTTの高度に還元力が特定のストレス応答遺伝子の発現を増強する可能性があるため、インキュベーションの条件がわずかに変化する可能性がある。この場合、L-15補充培地で細胞ペレットを正常に洗浄し、反応を停止し、迅速に栄養素を細胞に再供給することが重要です。最後に、目的の細胞タイプに最も適した選択ステップを慎重に選択すると、これらの細胞の最大回復が可能になります。同様に、細胞型特異的マーカーの細胞局在化を考慮すると、研究者は最適な細胞濃縮アプローチを選択するのに役立つ可能性があります。フローサイトメトリーを使用すると、より均質で生存可能な細胞培養が得られるのに対し、抗GFP磁気ビーズを使用すると時間がかかり、労働集約的になります。
ここで説明する方法にはいくつかの制限があることに注意してください。まず、所望の細胞型におけるGFPの堅牢な発現を検証し、FACSまたは抗体結合磁気ビーズによる適切な単離を確保する必要があります。第二に、穏やかなキューティクル破壊は、収率が低下したり、特定の体壁細胞の損失、またはdat-1ドーパミン作動性ニューロンなどの他の低存在量の細胞集団を失う可能性があります。セルの種類を選択する場合、セルの種類が多いほど、通常は歩留まりが成功します。それにもかかわらず、この方法は、より少ない細胞型集団の単離にも使用することができる。
要約すると、この記事で説明する手順は、回虫C.エレガンスからの個々の細胞型の抽出および単離の効果的な方法を提示する。この方法は、RNAの抽出、およびその後の遺伝子プロファイリングを可能にするのに十分な堅牢性を備えており、単離細胞の培養を可能にするのに十分な感度である。細胞の特定のグループを分離するために使用される正確な方法論は、異なる細胞タイプによって異なる場合がありますが、このレポートで説明するワークフローは一般的に有効であり、事実上すべての種類のワーム細胞に適用することができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
ジェニファー・フォックス博士とカリモンチュク研究所のメンバーに、洞察力に満ちたコメントをいただき、感謝します。我々は、国立衛生研究所(R01 GM108975からO.K.およびT32 GM107001-01A1からE.M.G.への支援を認める)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | Fisher Scientific | 12-556-004 | |
| Agar, Molecular Biology Grade | VWR | A0930 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Chloroform | Sigma | 496189 | |
| Contess Automated Cell Counter | Invitrogen | Z359629 | |
| DTT | USBiological | D8070 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| FBS | Omega Scientific | FB-02 | |
| Fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Isopropanol | VWR | BDH1133 | |
| KCl | Amresco | O395 | |
| KH2PO4 | USBiological | P5110 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professionals | 7552 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| MgSO4 | USBiological | M2090 | |
| Na2HPO4·7H2O | USBiological | S5199 | |
| NaCl | VWR | X190 | |
| NaOCl (Bleach) | Clorox | ||
| NaOH | Amresco | O583 | |
| Penicillin-Streptomicen | Fisher Scientific | 15140122 | |
| Peptone Y | USBiological | P3306 | |
| Pronase E | Sigma | 7433 | protease mixture from Streptomyces griseus |
| SDS | Amresco | O227 | |
| SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope | Tritech Research | ||
| Sucrose | USBiological | S8010 | |
| SuperScript IV One-Step synthesis kit | ThermoFisher | 12594025 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596026 | phenol and guanidine isothiocyanate solution |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | T10Z82 | |
| α-GFP magnetic beads | MBL | D153-11 |
References
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100, 64-119 (1983).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society B. 314, 1-340 (1986).
- Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews in Neuroscience. 18, 530-546 (2017).
- Selkoe, D. J. Cell biology of protein misfolding: The examples of Alzheimer’s and Parkinson’s disease. Nature Cell Biology. 6, 1054-1061 (2004).
- Choi, M. L., Gandhi, S. Crucial role of protein oligomerization in the pathogenesis of Alzheimer’s and Parkinson’s disease. FEBS Journal. 285, 3631-3644 (2018).
- Burman, J. L., et al. Mitochondrial fission facilitates the selective mitophagy of protein aggregates. Journal of Cell Biology. 210, 3231-3247 (2017).
- Shpilka, T., Haynes, C. M. The mitochondrial UPR: mechanisms, physiological functions and implications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, 109-120 (2018).
- Haynes, C. M., Petrova, K., Benedetti, C., Yang, Y., Ron, D. ClpP mediates activation of a mitochondrial unfolded protein response in C. elegans. Developmental Cell. 13, 467-480 (2007).
- Walter, P., Ron, D. The unfolded protein response: from stress pathway to homeostatic regulation. Science. 334, 1081-1086 (2011).
- Hobert, O. Specification of the nervous system. WormBook. , Available from: http://www.wormbook.org (2005).
- Chen, C., Chen, Y., Jiang, H., Chen, C., Pan, C. Neuron aging: learning from C. elegans. Journal of Molecular Signal. 8 (14), 1-10 (2013).
- Germany, E. M., et al. The AAA-ATPase Afg1 preserves mitochondrial fidelity and cellular health by maintaining mitochondrial matrix proteostasis. Journal of Cell Science. 131, jcs219956 (2018).
- Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLOS One. 6 (4), e19505 (2011).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , Available from: http://www.wormbook.org (2007).
- Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Molecular Biology of the Cell. 15, 657-664 (2004).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , Available from: http://www.wormbook.org (2006).
- Pereira, L., et al. A cellular regulatory map of the cholinergic nervous system of C. elegans. eLife. 4, e12432 (2015).
