Summary
Burada, biz transgenik Caenorhabditis elegans hatları yeşil floresan protein ifade canlı nöronal hücrelerin belirli grupların basit yalıtım için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, belirli nöronlara odaklanan ex vivo çalışmaların çeşitli sağlar ve daha kısa vadeli kültür için hücreleri yalıtmak için kapasitesine sahiptir.
Abstract
Yaşlanma sürecinde, birçok hücre, birçok geriatrik ve patolojik koşula karşı gelen hücresel fonksiyon bozukluğu olan yüksek hasar düzeylerini birikir. Post-mitotik nöronlar yaşlanma tarafından etkilenen büyük bir hücre türünü temsil eder. Nöronal yaşlanma birden fazla memeliyen modelleri var olsa da, onlar zorlu ve kurmak için pahalıdır. Yuvarlak kurt Caenorhabditis elegans nöronal yaşlanma çalışması için güçlü bir modeldir, bu hayvanların kısa ömürlü olduğu gibi, mevcut sağlam genetik araç, ve iyi kataloglanmış sinir sistemi. Burada sunulan yöntem, transjenik yeşil floresan proteinin (GFP) ifadesine dayalı olarak belirli hücrelerin kesintisiz yalıtımına olanak sağlar. Farklı altında Gfp ifade transgenik hayvan hatları, hücre tipine özgü promotörler dış manikür kaldırmak için sindirilmiş ve hafifçe mekanik çeşitli hücre türleri içeren bulamaç üretmek için kesintiye uğrattı. Daha sonra ilgi hücreleri floresans aktif hücre sıralama yoluyla hedef olmayan hücrelerden ayrılır, veya anti-GFP-bağlantılı manyetik boncuklar tarafından. Yalıtılmış hücreler daha sonra sınırlı bir süre için kültürlü olabilir veya hemen gerçek zamanlı nicel PCR tarafından transkripsiyon analizi gibi hücreye özgü ex vivo analizler için kullanılır. Böylece, bu protokol C. elegansfarklı nöronal nüfus içinde hücreye özgü tepkiler hızlı ve sağlam analizi için izin verir.
Introduction
Geçtiğimiz birkaç yıl içinde, Metazoan model organizma Caenorhabditis elegans nöronlar, nöronal devre ve fizyolojik ve davranışsal tepkiler rol ve yaşlanma ilişkili nörodejeneratif çalışmada muazzam bir varlık olmuştur Hastalık. C. elegans benzersiz bir özelliği hayvanların şeffaf olduğunu, tüm yetişkin somatik hücrelerin soy için izin eşleştirilir1. C. elegans da sinir sisteminin Morfoloji ve bağlantı yol açan nöronların yönetilebilir miktar liman iyi2anlaşılabilir. Sabit hücre soyluğu, kısa ömrü ve C. elegans için mevcut yüksek verimlilik genetik araçların bolluk farklı nöronal nüfus içinde yaşlanma çalışması için ideal bir model organizma olun.
Nöronların yaşlanma ve nörodejeneratif bozukluklar karmaşıktır, ve her bozukluk ile ilişkili benzersiz patolojik imzaları vardır. Ancak, Parkinson ve Alzheimer hastalığı gibi bu bozuklukların birçoğu için, ortak bir özellik, yanlış katlanan proteinlerin Progressive yükü3,4,5. Bu hastalıkların her ikisi de, proteinlerin hücre içinde toksisite neden, sonuçta hücre ölümü4,5yol açan ve toplu. Nöronların uygun yaşlanma için, mitokondri homeostaz, daha spesifik protein homeostaz, önemlidir, gibi perturbations ve dyshomeostasis nörodejenerasyon6,7,8yol açabilir. Hücreler protein homeostazı korumak için çeşitli mekanizmalar ile donatılmıştır, bir biri olmayan protein tepkisi (UPR) ― endoplazmik retikulum sinyalleri (er) hücre içi sinyal Cascades etkinleştirmek klasik bir yol, bir transkripsiyonel yol Yanıt9. Bu UPReriçin, metazoanlar mitokondrial protein homeostasis kaybına benzer bir yanıt görüntüler, sözde mitokondriyal UPR (UPRMT)7,8. C. elegans bir teyit ve iyi tanımlı UPRMT yolu7için en bazal organizma gibi görünüyor.
Daha büyük bir ağ içinde belirli nöronal nüfus fonksiyon/disfonksiyon kendi içsel bağlantı ve karmaşıklık nedeniyle değerlendirmek zor olabilir3. Ancak, genellikle karmaşık patolojiler ile hücre türüne özgü hastalıklar nedeniyle farklı nöronal nüfus çalışması için bir ihtiyaç vardır, gibi bozulmuş hücresel protein homeostaz ile ilişkili olanlar gibi. C. elegans, spesifik nöronal nüfus genetiği izlenmesine izin in vivo olarak manipüle edilebilir. C. elegans sinir sistemi öncelikle nöronlar oluşur, glial hücrelerin küçük bir yüzdesi ile. Yetişkin hermafrodit solucanlarında, yaklaşık 100 farklı sınıflar2,10bölünür 302 nöronlar vardır. Nöromüsküler kavşakların içinde kolinerjik nöronlar gibi nöronlar, dopaminerjik nöronlar öncelikle Sensation10,11' de yer almakta. Hem motor aktivitesi hem de duyusal yetenekler yaş ile düşüş olarak, bu bireysel nöronlar üzerinde kusurları hakkında mekanik Öngörüler ayrıntı önemlidir11,12. Bu nedenle, sonraki ex vivo çalışmalarda ilgi bozulmamış hücreleri yalıtmak için basit ve sağlam bir yöntem için bir ihtiyaç vardır.
Burada, C. eleganlar 'dan yeşil floresan proteini (Gfp) ifade eden belirli nöronal hücrelerin hızlı yalıtımı için optimize edilmiş etkili bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yalıtım yöntemi larval, juvenil veya erişkin solucanlar üzerinde gerçekleştirilebilir. Larva solucanlardan hücrelerin izolasyonu daha önce Zhang ve al.13 tarafından yayınlandı ve burada tartışılmaz. Burada önemli bir Not Tüm solucanlar hayvan veya farklı yaşam aşamalarında hayvanların kontaminasyonu aşırı sindirimi önlemek için aynı yaşam aşamasında olması gerekir. Nematod manikür hem enzimatik ve mekanik bozulma ile, kollajen ve diğer yapısal proteinler yüksek bir dış iskelet, hücreler çok çeşitli yalıtılmış olabilir13,14. Hücreler sonra akış sitometri veya antikor etiketli manyetik boncuk ile izole edilebilir. Genellikle, RNA, istenilen hücre popülasyonunun zenginleştirilmesi için bir fenol ve guanidin isothiocyanate yöntemi ile izole edilir15. Çok bakım ile bu izole hücreler bir kültür Flask veya çok iyi yemek muhafaza edilebilir. Bu yöntem, spesifik nöronların çalışmasında benzersiz ve güçlü bir aracı temsil eder ve daha fazla kültür için canlı ve fonksiyonel hücreleri izole etme kapasitesine sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hücre yalıtımı için yaşlı solucanların hazırlanması ve toplanması
Not: aşağıda açıklanan transjenik UNC-17kolinerjik nöronların yalıtım:: Gfp GERINIM (OH13083) Minnesota Üniversitesi 'Nde Caenorhabditis GENETIĞI Merkezi (CGC) gerinim deposundan elde edilmiştir. Mantar veya bakterilerden kontaminasyonu önlemek için steril koşulları korumak zorunludur.
- Hazırlamak ve T. Stiernagle16tarafından açıklandığı gibi beyazlatma yöntemi ile solucanlar senkronize. Yaşlanma denemeleri için, yumurta üretimini azaltmak ve yumurta hatching tutuklamak için fluorodeoxyuridine (fudr) 25 μM su çözeltisi içeren nematod büyüme orta (NGM) plakaları üzerine plaka solucanlar. Bu güvenilir olmayan sonuçlara neden olacak gibi kontaminasyon veya yumurta hatching önlemek için düzenli olarak agar plakaları inceleyin.
Not: UNC-17:: Gfp hücreleri için, genellikle 3 100 mm x 15 mm NGM plakaları, yeterli miktarda hücre faiz16yalıtmak için kullanılır. - Solucanlar toplayın ve hücre yalıtımı için arabellekleri hazırlayın.
- 15 mL konik tüpte solucanlar toplayın. 1,5 mL M9 tampon (1 mM MgSO4, 85 mm nacl, 42 mm na2HPO4· 7H2O, 22 mm KH2Po, pH 7,0) ve 1.600 x g'de 5 dakika santrifüjten solucanlar yıkama. 1 ml M9 tampon ile süpernatant ve yıkamak solucanlar atın. Santrifüjleme tekrarlayın ve kadar E. coli kontaminasyonu mümkün olduğunca kaldırmak için toplam beş kez yıkayın.
Not: Bu adımda, ampisilin gibi antibiyotik (50 μg/mL) ekleme, bakteriyel kontaminasyonunu azaltmaya yardımcı olabilir. - İki numune için, 2 ml sodyum Dodesil sülfat-dithiothreitol (SDS-DTT) liziz tamponu hazırlayın: 200 mm DTT, 0,25% (w/v) SDS, 20 mm HEPES (pH 8,0) ve% 3 (w/v) sucrose.
- 15 mL yalıtım tamponu hazırlayın (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mm MgCl2, 25 mm hepes [pH 7,3]) ve buzda saklayın.
Not: her deneyden önce SDS-DTT liziz tamponu ve yalıtım tamponu taze yapılmalıdır.
- 15 mL konik tüpte solucanlar toplayın. 1,5 mL M9 tampon (1 mM MgSO4, 85 mm nacl, 42 mm na2HPO4· 7H2O, 22 mm KH2Po, pH 7,0) ve 1.600 x g'de 5 dakika santrifüjten solucanlar yıkama. 1 ml M9 tampon ile süpernatant ve yıkamak solucanlar atın. Santrifüjleme tekrarlayın ve kadar E. coli kontaminasyonu mümkün olduğunca kaldırmak için toplam beş kez yıkayın.
- Cuticle bozulma ve tek hücreli yalıtım
- 1.600 x g'de 5 dakika için 1.2.1 adımda toplanan Santrifüjü hayvanlar. Tüm süpernatant kaldırmak ve 1 ml M9 medya solucanlar askıya ve 1,5 ml mikrosantrifüj tüp transfer.
- 1.600 x g 'de santrifüjleme ile Pellet solucanlar 5 dk.
- 200 μL SDS-DTT liziz tamponunu solucanlara ekleyin ve oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca inküye yapın. Worms, ışık mikroskobu altında görünürseniz vücut boyunca "kırışık" olarak görünmelidir.
Not: SDS-DTT liziz tamponunun uzun süreli maruz kalması, solucanlar gözlemleyerek izlenebilir solucanların ölümüne neden olabilir. Ölü olan solucanlar uzacak ve kıvrılacak değil. - Ekle 800 μL buz-soğuk yalıtım tampon ve hafifçe Flicking tüp karışımı.
- 13.000 x g 'de 4 °c ' de 1 dk için Pellet solucanlar, süpernatant çıkarın ve 1 ml yalıtım tampon ile yıkayın.
- Her seferinde yalıtım tamponunu dikkatle kaldırarak, toplam beş kez adım 1.3.5 yineleyin.
- Streptomyces griseus 'dan (15 mg/ml) (malzeme tablosu) izolasyon tamponunun IÇINDE çözünmüş ve RT 'de 10 − 15 dakika boyunca inküserden proteaz karışımı 100 μL ekleyin.
Not: SDS-DTT lizis tamponunda olduğu gibi, uzatılmış proteaz sindirimi plazma membranı boyunca proteinleri aşırı açıya neden olabilir, manyetik boncuk aracılığıyla yüzey izolasyonunu önler. - Proteaz karışımı ile inkübasyon sırasında, 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünün alt kısmına kadar pipetleme örnekleri ile ~ 60 − 70 kez 200 μL mikropipet ucu ile mekanik bozulma uygulayın. Hücreleri düzgün bir şekilde ilişkilendirmeniz için, Pipet ucunu mikrosantrifüjler tüpünün duvarına karşı sabit basınçla tutun.
- Sindirim aşamasını belirlemek için, sindirim karışımının küçük bir hacmini (~ 1 − 5 μL) çıkarın, bir cam kaydırağa bırakın ve doku kültürü mikroskobu kullanarak inceleyin. 5 − 7 dk. inkübasyon işleminden sonra, solucan parçaları gözle görülür bir şekilde azaltılmalıdır ve hücrelerin Bulamaç kolayca görülebilir.
- % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve penisilin-streptomisin (50 U/mL penisilin ve 50 μg/mL streptomisin 'de son konsantrasyon) ile tamamlayıcı olarak ticari olarak kullanılabilen soğuk Leibovitz 'in L-15 orta 900 μL ile reaksiyonu durdurun.
- 4 °C ' de 10.000 x g 'de 5 dakika boyunca santrifüjleme ile izole parçaları ve hücreleri Pellet. Aşırı enkaz ve manikür kaldırıldığından emin olmak için iki kez daha soğuk L-15-Tamamlayıcı medya 1 mL ile pelleted hücreleri yıkayın.
- 1 mL L-15-tamamlayıcı medyada resuspend pelleted hücreler ve 30 dakika buz üzerinde bırakın. En üst tabakası, yaklaşık 700 − 800 μL, bir mikrosantrifüjlü tüp alın. Bu katman hücre enkaz olmadan hücreleri içerir ve ilgi hücrelerin sonraki izolasyonda kullanılacaktır.
- Üreticinin talimatlarını takiben, 10 − 25 μL yalıtılmış hücrelerin hücre yoğunluğunu ölçmek için otomatik bir hücre sayacı veya hemokytometer kullanın.
2. GFP-pozitif hücrelerin akış sitometri veya anti-GFP manyetik boncuk ile yalıtım
Not: belirli hücre türlerini yalıtmak için dağıtılabilir iki yöntem vardır. İlk yöntem floresan aktif hücre sıralama (FACS) kullanmaktır, ikinci yöntem, ayrı plazma membranı lokalize proteinleri ifade havuz hücrelerine antikor-konjugated manyetik boncuk kullanır iken. Ikinci yöntem, böylece antikor bağlantılı manyetik boncuk ile etkileşim için kullanılabilir olmak, plazma membranı GFP lokalizasyonu gerektirir.
- GFP-pozitif hücrelerin Akış sitometrisi ile izolasyonu
- Adım 1.3.12 toplanan yalıtılmış hücreli süspansiyondan, 4 °C ' de 10.000 x g 'de 5 dak. için santrifüj hücreler. Süpernatant atın ve L-15-tamamlayıcı Orta içinde pelleted hücreleri askıya 6 x 106 hücreler/ml daha fazla bir hücre yoğunluğuna akış cytometer aşırı önlemek için.
- Örnekleri sıralama yeteneğine sahip bir akış sitometresi kullanarak Gfp pozitif ifade ile hücreleri Sırala. GFP-negatif hücreler, hücre dışı türe özel analiz için bir denetim olarak kullanılabilir.
Not: yukarıda belirtildiği gibi, Gfp-pozitif hücreleri yalıtmak için alternatif bir yaklaşım hücre plazma membranı için lokalize olan bir faiz FIS etiketlenmiş protein kullanılabilir. Bu durumda, 2,2 bölümünde açıklanan protokol istihdam edilebilir.
- Anti-GFP manyetik boncuklar üzerinden GFP-pozitif hücrelerin yalıtımı
- Adım 1.3.12 toplanan yalıtılmış hücreli süspansiyondan, 4 °C ' de 10.000 x g 'de 5 dak. için santrifüj hücreler. Süpernatant atın ve 485 μL l-15-tamamlayıcı orta hücreleri askıya. Çözüm için 15 μL ddH2O önceden yıkanmış α-Gfp antikor-bağlantılı manyetik boncuk ekleyin.
- Çok nazik tornalama ile 1 saat boyunca 4 °c ' de manyetik boncuk Bulamaç ile hücreleri inkük. Aşırı tornalama hücrelere zarar verecektir.
- İnkübasyon sonrası, 4 °C ' de 10.000 x g 'de 5 dak için santrifüjler örnek, sonra Gfp-negatif hücreleri kaldırmak Için 1 ml L-15-tamamlayıcı orta ile Pelet 2x yıkayın.
- İzole hücrelerin kültürü
- Steril 6-iyi çok-iyi plaka içine plaka izole hücreler.
Not: Bu plakalar hücre ekini artırmak için fıstık Leki ile kaplanabilir; Ancak, hücreler hemen kullanılmak üzere ise, bu adımı gözardı. - Plakayı plastik bir kabın içine yerleştirin ve 20 °C ' de, nemli bir silme veya yumuşak doku kağıdıyla hücreleri inkük et (50 μg/mL ampisilin ile ddH2O 'ya ekleyin) hücrelere nem ekleme. Yüksek CO2 seviyeleri hücrelere zarar verebilir olarak, bir Co2 kuluçko içinde inkübe etmeyin.
- Steril 6-iyi çok-iyi plaka içine plaka izole hücreler.
3. yalıtılmış GFP-pozitif hücrelerin floresan görüntüleme
- Floresans ataşmanı ile ters çevrilmiş bir mikroskop floresan ampulünü açın ve yaklaşık 10 dakika ısınmasına izin verin.
- Kuluçta hücre kültürünü çıkarın ve floresan eki ile ters mikroskop aşamasında ayarlayın. GFP filtresini mikroskop aşamasının altındaki kanalların içine kaydırın.
- 50x büyütme ile hücreleri görüntüleyin. Başarıyla yalıtılmış GFP-pozitif hücreler kolayca görünür olacaktır. Mikroskop üzerindeki kamera ekini kullanarak fotoğraf çekin.
4. yalıtılmış hücrelerden RNA çıkarılması
Not: RNA ekstraksiyonu, yüksek kalitede malzeme sağlamak için hücre yalıtım işleminden hemen sonra yapılmalıdır. Yalıtılmış RNA, nicel PCR (qPCR) ile cDNA ve transkript düzeylerinin sonraki ölçümü için kullanılabilir. Tüm tüpler, ipuçları ve reaktifler RNase-Free olmalıdır ve çalışma alanı RNA ekstraksiyonu öncesinde etanol yıkanmış olmalıdır.
- 2.1.2 adımda toplanan yalıtılmış hücrelerden, 1,5 mL steril, 4 °C ' de 10.000 x g 'de 5 dakika Için RNase-ücretsiz mikrosantrifüjte santrifüj hücreler. Hücreler manyetik boncuk aracılığıyla yalıtılmış ise, yukarıda belirtildiği gibi hücre koleksiyonunu izleyin.
- Bir micropipet kullanarak, santrifüjlenmiş mikrosantrifüjlü tüpten süpernatant kaldırmak ve L-15-tamamlayıcı orta yıkamak için M9 orta 100 μL ekleyin. Santrifüjler 5 dk at 10.000 x g 4 °c ve Kaldır supernatant. Tüm medyanın kaldırıldığından emin olmak için, her seferinde süpernatant 'ı dikkatle kaldırarak toplam üç yıkanmasını tekrarlayın.
- Hücrelere 1 mL fenol ve guanidin isothiocyanate çözeltisi (malzeme tablosu) ekleyin ve süspansiyonu dikkatle yukarı ve aşağı pipet. Karışımı RT 'de 5 dak.
- İnkübasyon sonrasında, 250 fenol ve guanidin isothiocyanate solüsyonu ekleyin
- Solüsyonu 5 dakika 10.000 x g 'de 25 °c ' de santrifüjle yapın.
- Alt organik katmanları rahatsız etmeden, mümkün olduğunca bir mikropipet ile en iyi sulu tabakayı dikkatle kaldırın ve alt katmanı yeni bir 1,5 mL RNase-Free mikrosantrifüjlü tüpe aktarın. Yeni tüp için, 500 μL izopropanol ekleyin ve tüp tersine çevirme ile karıştırın. Bu çözelti RT 'de 5 dakika süreyle inküyün.
- Tüpü 25 °C ' de 20 dakika için 14.000 x g 'de santrifüjün.
- Numuneleri buzda tutarken, bir mikropipet ile mümkün olduğunca çok izopropanol çıkarın ve RNase-Free DDH2O ' da tüp için 1 ml% 70 (v/v) etanol ekleyin. Doğrudan tüpün altına çözüm çıkarmak için emin olun; Tüp tarafına etanol/su karışımı uygulayın.
- 10.000 x g 'de 25 °c ' de 5 dakika Santrifüjü.
- 3 − 5 dakika boyunca buzda kuru ve etanol ve havanın çoğunu çıkarın.
Not: etanol Bu adımın ardından kaldırılmalıdır; Ancak, tüp alt dikkatli muayene hiçbir etanol bırakıldığından emin olmak için önemlidir. - Tüp hava kurutulduktan sonra, 260 nm dalga boyunda bir spektrofotometre kullanarak 15 − 20 μL RNase-Free ddH2O ekleyın ve RNA konsantrasyonu ve saflığını ölçün. Numunenin saflığı 260 Nm/280 nm oranı olarak ölçülmelidir. Bu oran yaklaşık olarak > 2 olmalıdır.
Not: yalıtılmış RNA dondurulmuş ve-20 °C ' de depolanabilir. Ancak, yüksek kaliteli cDNA üretimini sağlamak için mümkün olan en kısa sürede bir cDNA sentezi kiti kullanmak için son derece Tercihli. Nicel PCR, Laboratuvarda kullanılan termocycler üreticisi tarafından sağlanan talimatları kullanarak takip edebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada açıklanan protokol, UNC-17özel yalıtım sağlar:: Gfp-pozitif kolinerjik nöronlar yuvarlak solucan C. elegans hücre tipine özgü gen ifade profil ve nihai gibi sonraki ex vivo çalışmalar için yama-kelepçe Elektrofizyoloji ölçümleri için kısa süreli kültür.
Şekil 1 gösterir UNC-17:: Gfp-pozitif kolinerjik nöronlar normal ortamda. UNC-17 geni bir veziküler asetilkolin transmembran Transporter17için C. elegans vücut ve kodları boyunca ifade edilir. Bu genin ifadesi baş, orta vücut ve kuyruk nöronları ve nöron projeksiyonlarına göre görülebilir.
Şekil 2a yöntemleri bölümünde özetlenen nöron yalıtım prosedürü resimsel bir genel bakış gösterir. Adım bir senkronize etmek ve kültür solucanlar olduğunu. Ayrıca Şekil 2B , UNC-17' nin temsili floresan mikrografisini gösterir: Izolasyondan sonra Gfp-pozitif nöronlar ve değiştirilmemiş N2 yabani tip hayvanlardan gelen negatif kontrol. Yalıtılmış hücreler kadar hayatta kalabilir 3 gün, Leibovitz 's L-15 orta ve% 10 FBS ile tamamlayıcı zaman.
Şekil 3 Gfp gelen qPCR temsili veri gösterir kolinerjik nöronların yanı sıra Gfp ifade kas hücreleri ifade. Hücrelerin her iki yöntemle de başarılı bir şekilde sıralanması sonrasında, RNA bir fenol ve guanidin isothiocyanate yöntemi ile yalıtıldı ve sonra cDNA sentezleme kiti kullanılarak üretiliyordu. Kolinerjik neuron-specific genler ifadesi, TPH-1 ve SNB-1, bir triptofan hidroksilaz ve sinaptik vezikül taşıyıcı, sırasıyla, UNC-17' d a yükselmiştir:: Gfp izole hücreler ancak MYO-3' te mevcut değildir:: Gfp yalıtılmış hücreler. Ters MYO-2kas spesifik miyozin ağır zincir transkript ifadesi ile doğrudur. İkinci genin ifadesi izole kolinerjik hücreler değil, yalıtılmış kas hücreleriyle sınırlıdır.
Resim 1: UNC-17ifade eden bir günlük eski vahşi tip transjenik hayvanlarda kolinerjik nöronların yeniden oluşturulmuş görüntüsü:: Gfp muhabiri. Görüntü, tüm hayvanın uzunluğunu kaplayan aynı solucanın dört ayrı konfokal floresan görüntüsünden toplandı. Her görüntünün ölçek çubuğu 50 μm ' dir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: UNC-17::Gfp gerinim yalıtılmış hücre yalıtımı ve temsilcisi Gfp Ifade hücreleri iş akışı. (A) UNC-17' d a zenginleştirilmiş belirli hücre popülasyonlarının yalıtım için şematik iş akışı betimlenmesi:: Gfp-ilgili C. elegans transgenik suşlarından kolinerjik nöronların ifade edilmesi. (B) yalıtılmış UNC-17' d e Gfp sinyalinin varlığını gösteren temsili floresans görüntüleri:: Gfp-pozitif hücreler. Görüntünün tek bir odak düzlemi gösterdiğini unutmayın. Ölçek çubuğu = 10 μm. Şekil 2B hücre Bilimi Dergisi 'nin izni ile çoğaltılmaktadır ve Almanya ve el.12tarafından yayınlandı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: UNC- 17-nöron spesifik işaretçileri (TPH-1, UNC-47 ve SNB-1) temsilcisi qPCR analizi, tam-hayvan-a- 17karşı:: Gfp muhabiri hücre yalıtır kolinerjik belirli zenginleştirme teyit ilgili nöronlar. Burada kullanılan ek negatif kontroller MYO-3:: Gfp muhabiri ifade eden kas hücrelerini, aynı protokolün ardından izole edilmişti. Veri göstermek ortalama değerleri ± SD (n = 3 biyolojik çoğaltır). * p < 0,05; * * p < 0,01; p < 0,001 eşleştirilmiş t testi ile. Bu rakam Almanya ve ark.12' den değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yuvarlak kurt C. elegans nöronal sağlık ve hastalık2çalışma için iyi kurulmuş ve güçlü bir modeldir. Bu hayvanları manipüle etmek için geniş genetik araçlarla ve tam eşleştirilen çeşitli nöron türlerinin yönetilebilir miktarını, nispeten az miktarda malzeme ile büyük bir veri toplanabilir. Burada, tüm hayvanlardan farklı nöronları izole etmek için optimize edilmiş bir yöntem özetlemektedir. Solucanın dış manikür proteinleri bozarak, çeşitli hücre türleri bir bulamaç izole edilebilir, nöronlar ve kas hücreleri dahil olmak üzere5. Bu yalıtılmış hücreler, çok sayıda benzersiz deneylerde kullanılabilir. Akış sitometrisi veya antikor etiketli manyetik boncuklar aracılığıyla hücre sıralamasını kullanma yeteneği, belirli bir denemenin parametrelerine bağımlı adaptif bir teknik sağlar. Belirli bir C. elegans hücre tipi RNA ayıklanması da daha kapsamlı bir muayene ve çeşitli hücresel süreçlerin mekanik bir anlayış sağlar.
Burada, yakından takip edilmesi gereken önemli adımlar vardır: 1) yaşlanma ve 25 μM FuDR plakalardan iyi beslenen solucanlar hasat; 2) SDS-DTT inkübasyon veya proteaz karışımı ile tedavi süresi; GFP-pozitif hücrelerin 3) seçimi. İlk olarak, solucanların yaşlanma sırasında, bu toplanan solucanlar yaş heterojenlik neden olur, veri önemli değişkenlik neden olduğu gibi, herhangi bir yumurta yumurtlamak değil koydu sağlamak için çalışkan olması zorunludur. İzole etmek için solucanlar hasat ederken yıkama adımları da herhangi bir ölü veya olgunlaşmamış hayvanların toplanmadığından emin olmak için gereklidir. İkinci olarak, SDS-DTT tampon içinde solucanların aşırı kuluçlması önemli hücresel bileşenlerin istenmeyen dökümünü ve solucanlara toksisite neden olabilir, hedef hücre türlerinin yalıtımını önler. Hücre canlılığı korunması başarılı RNA ekstraksiyon veya daha kısa süreli yalıtılmış hücrelerin kültür için önemlidir. Çünkü nöronal hücrelerin çoğunluğu, SDS-DTT tampon veya proteaz karışım tedavisi sırasında hassas, aşırı sert tedavi bu hücrelerin büyük hasara neden olabilir. Eğer bir stres tepkisi yolu denemenin hedefi ise, DTT 'in son derece azaltıcı gücü bazı stres tepkisi genlerinin gelişmiş ifadesine neden olabilir gibi inküstasyon koşulları biraz değişebilir. Bu durumda, reaksiyonu durdurmak için L-15-tamamlayıcı orta ile hücre Pelet başarıyla yıkamak için önemlidir ve hızlı bir şekilde besinleri ile hücreleri yeniden tedarik. Son olarak, dikkatle hangi seçim adımının en çok ilgi hücre türüne uygun olduğunu seçerek bu hücrelerin maksimum kurtarma için izin verecektir. Aynı şekilde, hücre türüne özgü işaretçilerin hücresel lokalizasyonu dikkate alınarak araştırmacılar en optimum hücre zenginleştirme yaklaşımı seçmesine yardımcı olabilir. Akış cytometri kullanarak daha homojen ve uygun bir hücre kültürü verecektir, Anti-GFP manyetik boncuklar kullanarak daha az zaman alıcı ve emek yoğun olduğunu.
Burada açıklanan yöntemin bazı sınırlamalar olduğunu dikkate almak önemlidir. İlk olarak, istenilen hücre tiplerindeki GFP 'nin sağlam ifadesi, FACS veya antikor ile bağlantılı manyetik boncuklar tarafından uygun izolasyonu sağlamak için doğrulanmalıdır. İkinci olarak, hatta nazik manikür bozulma kötü bir verim veya belirli vücut duvar hücrelerinin bile kaybına yol açabilir, veya diğer düşük bolluk hücre nüfus gibi dat-1 dopaminerjik nöronlar. Hücre türlerini seçerken, daha bol hücre türü genellikle daha başarılı bir verim sağlayabilir. Yine de, bu yöntem daha az bol hücre türü nüfus yalıtım için de kullanılabilir.
Özetle, bu makalede tartışılan prosedür çıkarma ve tek hücre türleri yuvarlak solucan C. elegansgelen yalıtım etkili bir yöntem sunar. Yöntem RNA çıkarılması için izin verecek kadar sağlam ve sonraki gen profil, ve izole hücrelerin ekimi için izin verecek kadar hassas. Belirli hücre gruplarını yalıtmak için kullanılan tam metodoloji farklı hücre türleri arasında farklılık gösterebilir, ancak bu raporda açıklanan iş akışı genellikle etkilidir ve neredeyse her türlü solucan hücrelerinin uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz Dr Jennifer Fox ve anlayışlı Yorumlar için Khalimonchuk Laboratuvarı üyelerine teşekkür ederiz. Biz Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 GM108975 için ok ve T32 GM107001-01A1 için E.M.G.) destek kabul ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | Fisher Scientific | 12-556-004 | |
| Agar, Molecular Biology Grade | VWR | A0930 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Chloroform | Sigma | 496189 | |
| Contess Automated Cell Counter | Invitrogen | Z359629 | |
| DTT | USBiological | D8070 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| FBS | Omega Scientific | FB-02 | |
| Fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Isopropanol | VWR | BDH1133 | |
| KCl | Amresco | O395 | |
| KH2PO4 | USBiological | P5110 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professionals | 7552 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| MgSO4 | USBiological | M2090 | |
| Na2HPO4·7H2O | USBiological | S5199 | |
| NaCl | VWR | X190 | |
| NaOCl (Bleach) | Clorox | ||
| NaOH | Amresco | O583 | |
| Penicillin-Streptomicen | Fisher Scientific | 15140122 | |
| Peptone Y | USBiological | P3306 | |
| Pronase E | Sigma | 7433 | protease mixture from Streptomyces griseus |
| SDS | Amresco | O227 | |
| SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope | Tritech Research | ||
| Sucrose | USBiological | S8010 | |
| SuperScript IV One-Step synthesis kit | ThermoFisher | 12594025 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596026 | phenol and guanidine isothiocyanate solution |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | T10Z82 | |
| α-GFP magnetic beads | MBL | D153-11 |
References
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100, 64-119 (1983).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society B. 314, 1-340 (1986).
- Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews in Neuroscience. 18, 530-546 (2017).
- Selkoe, D. J. Cell biology of protein misfolding: The examples of Alzheimer’s and Parkinson’s disease. Nature Cell Biology. 6, 1054-1061 (2004).
- Choi, M. L., Gandhi, S. Crucial role of protein oligomerization in the pathogenesis of Alzheimer’s and Parkinson’s disease. FEBS Journal. 285, 3631-3644 (2018).
- Burman, J. L., et al. Mitochondrial fission facilitates the selective mitophagy of protein aggregates. Journal of Cell Biology. 210, 3231-3247 (2017).
- Shpilka, T., Haynes, C. M. The mitochondrial UPR: mechanisms, physiological functions and implications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, 109-120 (2018).
- Haynes, C. M., Petrova, K., Benedetti, C., Yang, Y., Ron, D. ClpP mediates activation of a mitochondrial unfolded protein response in C. elegans. Developmental Cell. 13, 467-480 (2007).
- Walter, P., Ron, D. The unfolded protein response: from stress pathway to homeostatic regulation. Science. 334, 1081-1086 (2011).
- Hobert, O. Specification of the nervous system. WormBook. , Available from: http://www.wormbook.org (2005).
- Chen, C., Chen, Y., Jiang, H., Chen, C., Pan, C. Neuron aging: learning from C. elegans. Journal of Molecular Signal. 8 (14), 1-10 (2013).
- Germany, E. M., et al. The AAA-ATPase Afg1 preserves mitochondrial fidelity and cellular health by maintaining mitochondrial matrix proteostasis. Journal of Cell Science. 131, jcs219956 (2018).
- Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLOS One. 6 (4), e19505 (2011).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , Available from: http://www.wormbook.org (2007).
- Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Molecular Biology of the Cell. 15, 657-664 (2004).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , Available from: http://www.wormbook.org (2006).
- Pereira, L., et al. A cellular regulatory map of the cholinergic nervous system of C. elegans. eLife. 4, e12432 (2015).
