Isolering av spesifikke Nevron populasjoner fra roundworm Caenorhabditis elegans

Summary

Her presenterer vi en protokoll for enkel isolering av spesifikke grupper av levende neuronal celler som uttrykker grønt fluorescerende protein fra transgene Caenorhabditis elegans linjer. Denne metoden gjør det mulig for en rekke ex vivo studier fokusert på spesifikke neurons og har kapasitet til å isolere celler for ytterligere kortsiktige dyrking.

Abstract

Under aldringsprosessen, mange celler akkumuleres høye nivåer av skader som fører til cellulær dysfunksjon, som ligger til grunn mange aldersmedisinsk og patologiske tilstander. Post-mitotisk neurons representerer en stor celle type påvirkes av aldring. Selv om flere pattedyr modeller av neuronal aldring eksisterer, er de utfordrende og kostbare å etablere. Den roundworm Caenorhabditis elegans er en kraftfull modell for å studere neuronal aldring, som disse dyrene har kortlevetid, en tilgjengelig robust genetisk verktøykasse, og godt katalogisert nervesystemet. Metoden som presenteres her gir mulighet for sømløs isolering av spesifikke celler basert på uttrykk av et transgene grønt fluorescerende protein (GFP). Transgene Animal Lines uttrykker GFP under distinkte, celle type-spesifikke arrangører er fordøyd å fjerne den ytre cuticle og forsiktig mekanisk forstyrret for å produsere slurry inneholder ulike celletyper. Cellene av interesse blir deretter skilt fra ikke-Target celler gjennom fluorescens-aktivert celle sortering, eller av anti-GFP-sammenkoblede magnetiske perler. De isolerte cellene kan deretter kulturperler i en begrenset periode eller umiddelbart brukes for celle-spesifikke ex vivo analyser som transcriptional analyse av sanntids kvantitativ PCR. Dermed tillater denne protokollen for rask og robust analyse av celle-spesifikke tiltak innenfor ulike neuronal populasjoner i C. elegans.

Introduction

I løpet av de siste ti årene har metazoan modellen organisme Caenorhabditis elegans vært en enorm ressurs i studiet av neurons, neuronal kretser og dens rolle i fysiologiske og atferdsmessige responser, og aldring-assosiert nevrodegenerative Sykdommer. En unik funksjon i C. elegans er at dyrene er gjennomsiktige, noe som åpner for avstamning av alle voksne somatiske celler som skal tilordnes¹. C. elegans også havner håndterlig mengde neurons, som fører til morfologi og tilkobling av nervesystemet blir godt forstått². Den invariant celle avstamning, kortlevetid, og overflod av høy gjennomstrømming genetiske verktøy tilgjengelig for C. elegans gjør det til en ideell modell organisme for studiet av aldring innenfor ulike neuronal populasjoner.

Aldring av neurons og nevrodegenerative lidelser er komplekse, og hver lidelse har unike patologiske signaturer knyttet til den. Men for mange av disse lidelsene, slik som Parkinsons og Alzheimers sykdom, en felles funksjon er den progressive belastningen av misfolded proteiner^3,4,5. I begge disse sykdommene, proteiner misfold og samlet i cellen for å forårsake toksisitet, til slutt fører til celle død^4,5. For riktig aldring av neurons, homeostase av mitokondrier, mer spesifikt protein homeostase, er viktig, som forstyrrelser og dyshomeostasis kan føre til neurodegeneration^6,7,8. Cellene er utstyrt med ulike mekanismer for å opprettholde protein homeostase, som er den utfoldet proteinresponsen (UPR) – en klassisk vei der signaler fra endoplasmatiske retikulum (ER) aktiverer intracellulære signal kaskader, noe som fører til en transcriptional svar⁹. Beslektet med denne UPR^er, Metazoer vise et lignende svar på tap av mitokondrie protein homeostase, den såkalte mitokondrie UPR (UPR^Mt)^7,8. C. elegans synes å være den mest basale organismen å ha en bekreftet og veldefinert UPR^Mt Pathway⁷.

Funksjonen/dysfunksjon av spesifikke neuronal populasjoner innenfor et større nettverk kan være vanskelig å vurdere på grunn av deres iboende tilkobling og kompleksitet³. Det er imidlertid ofte behov for å studere distinkte neuronal populasjoner på grunn av celle type-spesifikke sykdommer med komplekse patologi, slik som de som er forbundet med nedsatt cellulær protein homeostase. I C. eleganskan spesifikke neuronal populasjoner være genetisk manipulert slik at facile observasjon in vivo. Nervesystemet i C. elegans består hovedsakelig av neurons, med en liten prosentandel av gliacellene celler. I voksen Hermafroditt ormer, det er ca 302 neurons, inndelt i over 100 forskjellige klasser^2,10. Neurons som kolinerge neurons dominerer i nevromuskulær veikryss, mens dopaminerg neurons er primært involvert i sensasjon^10,11. Som både motorisk aktivitet og sensoriske evner avta med alderen, er det viktig å detalj mekanistisk innsikt om defekter i disse individuelle neurons^11,12. Som sådan er det behov for en enkel og robust metode for å isolere intakte celler av interesse for senere ex vivo studier.

Her beskriver vi en optimalisert effektiv metode for rask isolering av spesifikke neuronal celler som uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP) fra C. elegans. Denne isolasjons metoden kan utføres på larvestadiet, juvenile eller voksen ormer. Isolering av celler fra larvestadiet ormer ble tidligere utgitt av Zhang et al.¹³ og vil ikke bli diskutert her. Et viktig notat her er at alle ormer må være på samme liv scenen for å hindre over-fordøyelsen av dyret eller forurensning fra dyr i ulike stadier. Gjennom både enzymatisk og mekanisk forstyrrelse av nematode cuticle, en Exoskeleton høy i kollagen og andre strukturelle proteiner, et bredt utvalg av celler kan isoleres^13,14. Celler kan deretter isoleres via strømnings flowcytometri eller antistoff merket magnetiske perler. Vanligvis er RNA isolert via en fenol-og guaniniumtiocyanat isothiocyanate metode for å sikre berikelse av ønsket celle befolkning¹⁵. Med mye omsorg disse isolerte celler kan opprettholdes i en kultur kolbe eller multi-brønn parabolen. Denne metoden representerer et unikt og kraftig verktøy i studiet av spesifikke neurons og har kapasitet til å isolere levende og funksjonelle celler for videre dyrking.

Protocol

1. utarbeidelse og innsamling av alderen ormer for celle isolasjon

Merk: forklart nedenfor er isolering av kolinerge neurons fra transgene UNC-17:: GFP STAMME (OH13083) Hentet fra Caenorhabditis genetikk Center (CGC) stamme depotet ved University of Minnesota. Det er viktig å opprettholde sterile forhold for å hindre forurensning fra sopp eller bakterier.

1. Klargjør og Synkroniser ormer via bleke metoden som beskrevet av T. Stiernagle¹⁶. For aldrende eksperimenter, plate ormer på nematode vekstmedium (NGM) plater som inneholder 25 μM vannoppløsning av fluorodeoxyuridine (FuDR) for å redusere eggproduksjon og arrest egg klekking. Inspiser agar plater regelmessig for å hindre forurensning eller egg klekking, da dette vil føre til upålitelige resultater.
   Merk: for UNC-17:: GFP-celler, vanligvis 3 100 mm x 15 mm NGM-plater brukes til å isolere en tilstrekkelig mengde celler av interesse¹⁶.
2. Samle ormer og klargjør buffere for celle isolering.
   1. Samle ormer i et 15 mL konisk rør. Vask ormer fra tallerken med 1,5 mL av M9 buffer (1 mM MgSO₄, 85 mm NaCl, 42 mm na₂HPO₄· 7H₂O, 22 mm KH₂Po, pH 7,0) og sentrifuge i 5 min ved 1 600 x g. Kast supernatanten og vaske ormer med 1 mL av M9 buffer. Gjenta sentrifugering og vask for totalt fem ganger for å fjerne så mye E. coli forurensning som mulig.
      Merk: Hvis du legger til antibiotika (50 μg/mL), for eksempel Ampicillin, kan dette trinnet bidra til å redusere bakteriell forurensning.
   2. For to prøver, Forbered 2 mL natrium natriumdodecylsulfat sulfat-dithiotreitol (SDS-DTT) lyseringsbuffer: 200 mM DTT, 0,25% (w/v) SDS, 20 mM HEPES (pH 8,0), og 3% (w/v) sukrose.
   3. Forbered 15 mL isolasjons buffer (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 2 mm MgCl₂, 25 mM HEPES [pH 7,3]) og oppbevar den på is.
      Merk: både SDS-DTT lyseringsbuffer og isolasjons buffer må gjøres friskt før hvert eksperiment.
3. Cuticle avbrudd og enkelt celle isolasjon
   1. Sentrifuger dyr samlet i trinn 1.2.1 i 5 min på 1 600 x g. Fjern alle supernatanten og suspendere ormer i 1 mL av M9 Media og overføre til 1,5 mL mikrosentrifugen tube.
   2. Pellet ormer med sentrifugering på 1 600 x g i 5 min.
   3. Tilsett 200 μL av SDS-DTT lyseringsbuffer til ormer og ruge i 5 minutter ved romtemperatur (RT). Worms skal synes å være "winkled" langs kroppen hvis sett under et lys mikroskop.
      Merk: langvarig eksponering for SDS-DTT lyseringsbuffer kan føre til død av ormer, som kan overvåkes ved å observere ormer. Ormer som er døde vil forlenge og vil ikke krølle.
   4. Tilsett 800 μL av iskald isolasjons buffer og bland ved å sveipe slangen forsiktig.
   5. Pellets ormer for 1 min ved 13 000 x g ved 4 ° c, Fjern supernatanten og vask med 1 ml isolasjons buffer.
   6. Gjenta trinn 1.3.5 for totalt fem ganger, forsiktig fjerne isolasjons bufferen hver gang.
   7. Tilsett 100 μL av protease blanding fra Streptomyces griseus (15 mg/ml) (tabell av materialer) oppløst i isolasjons buffer til pellet og ruge i 10 − 15 min ved RT.
      Merk: som med SDS-DTT lyseringsbuffer, kan den utvidede protease fordøyelsen føre til overdreven kløft av proteiner langs plasma membranen, som hindrer isolering av overflaten eksponert GFP via magnetiske perler.
   8. Ved inkubasjons med protease blanding, Påfør mekaniske forstyrrelser ved pipettering prøver opp og ned mot bunnen av 1,5 mL mikrosentrifugen rør med 200 μL micropipette spiss for ~ 60 − 70 ganger. Hold pipette spissen mot veggen av mikrosentrifugen røret med konstant press for å riktig oppheve celler.
   9. For å bestemme stadiet av fordøyelsen, fjerne et lite volum (~ 1 − 5 μL) av fordøyelsen blanding, slipp den på et glass lysbilde og inspisere den ved hjelp av en vev kultur mikroskop. Etter 5 − 7 min av inkubasjons, bør ormen fragmenter har synlig redusert cuticle og en slurry av celler vil være lett synlig.
   10. Halt reaksjon med 900 μL av kommersielt tilgjengelig kaldt Leibovitz ' s L-15 medium supplert med 10% fosterets storfe serum (FBS) og penicillin-Streptomycin (endelig konsentrasjon ved 50 U/mL penicillin og 50 μg/mL Streptomycin).
   11. Pellets isolerte fragmenter og celler ved sentrifugering i 5 min ved 10 000 x g ved 4 ° c. Vask pelleted celler med 1 mL kaldt L-15-supplert Media to ganger mer for å sikre at overflødig rusk og cuticle er fjernet.
   12. Resuspend pelleted celler i 1 mL L-15-supplert Media og la på isen i 30 min. Ta det øverste laget, ca 700 − 800 μL, til et mikrosentrifugen rør. Dette laget inneholder celler uten celle rusk og vil bli brukt i den påfølgende isolering av celler av interesse.
   13. Følg produsentens anvisninger og bruk en automatisert celle teller eller hemocytometer for å måle celle tettheten på 10 − 25 μL av isolerte celler.

2. isolering av GFP-positive celler via Flow flowcytometri eller anti-GFP magnetiske perler

Merk: det finnes to metoder som kan distribueres for å isolere bestemte celletyper. Den første metoden er å bruke fluorescens-aktivert celle sortering (FACS), mens den andre metoden bruker antistoff-bøyd magnetiske perler til basseng celler uttrykker distinkte plasma membran-lokaliserte proteiner. Den sistnevnte metoden krever lokalisering av GFP til plasma membranen, og dermed være tilgjengelig for interaksjon med antistoff-kombinert magnetisk perle.

1. Isolering av GFP-positive celler ved flyt flowcytometri
   1. Fra isolert celle fjæring samlet i trinn 1.3.12, sentrifuge celler i 5 min ved 10 000 x g ved 4 ° c. Kast supernatanten og suspendere pelleted celler i L-15-supplert medium til en celle tetthet på ikke mer enn 6 x 10⁶ celler/ml for å unngå overbelastning av strømnings flowcytometer.
   2. Sorter celler etter GFP-positivt uttrykk ved hjelp av en flyt flowcytometer som kan sortere prøver. GFP-negative celler kan brukes som en kontroll for ikke-celle type spesifikk analyse.
      Merk: som nevnt ovenfor, kan en alternativ tilnærming for å isolere GFP-positive celler brukes hvis GFP-Tagged protein av interesse er lokalisert til cellens plasma membran. I dette tilfellet kan protokollen som er beskrevet i avsnitt 2,2, brukes.
2. Isolering av GFP-positive celler via anti-GFP magnetiske perler
   1. Fra isolert celle fjæring samlet i trinn 1.3.12, sentrifuge celler i 5 min ved 10 000 x g ved 4 ° c. Kast supernatanten og suspendere celler i 485-μL av L-15-supplert medium. Tilsett 15 μL av ddH₂O pre-vasket α-GFP antistoff-sammenkoblede magnetiske perler til løsningen.
   2. Ruge celler med magnetisk perle slurry ved 4 ° c for 1 time med svært skånsom vending. Overdreven snu vil skade cellene.
   3. Etter inkubasjons, sentrifuge prøve for 5 min ved 10 000 x g ved 4 ° c, deretter vask pellet 2x med 1 ml L-15-supplert medium for å fjerne GFP-negative celler.
3. Dyrking av isolerte celler
   1. Plate isolerte celler i en steril 6-brønn multi-brønn plate.
      Merk: disse platene kan være belagt med peanut Lektiner å øke celle vedlegg; Hvis cellene skal brukes umiddelbart, kan det imidlertid hende at dette trinnet ignoreres.
   2. Plasser platen i en plastbeholder og ruge cellene ved 20 ° c med en fuktig tørke eller mykt papir (tilsett 50 μg/mL Ampicillin til ddH₂O for å sikre at det ikke dannes en bakteriell vekst på tørke) for å legge fuktighet til cellene. Ikke ruge i en CO₂ inkubator, som forhøyet co₂ nivåer kan skade cellene.

3. fluorescerende bilde av isolerte GFP-positive celler

1. Slå på fluorescerende pære av en invertert mikroskop med fluorescens vedlegg og la den varmes opp i ca 10 min.
2. Fjern cellekultur fra inkubator og satt på scenen av invertert mikroskop med florescence vedlegg. Skyv GFP-filteret inn i sporene under fasen av mikroskopet.
3. Vis cellene med en forstørrelse av 50x. Vellykket isolerte GFP-positive celler vil være lett synlig. Ta bilder ved hjelp av kamera vedlegget på mikroskopet.

4. ekstraksjon av RNA fra isolerte celler

Merk: utpakking av RNA skal utføres umiddelbart etter celle isolasjon for å sikre høy kvalitet på materialet. Isolert RNA kan brukes til å produsere cDNA og påfølgende måling av transkripsjon nivåer ved kvantitativ PCR (qPCR). Alle rør, spisser og reagenser skal være RNase frie, og arbeidsområdet bør vaskes i etanol før RNA-ekstraksjon.

1. Fra isolerte celler samlet på trinn 2.1.2, sentrifuger celler i en 1,5 mL steril, RNase-Free mikrosentrifugen tubefor 5 min ved 10 000 x g ved 4 ° c. Hvis cellene er isolert via magnetiske perler, følger celle samlingen som nevnt ovenfor.
2. Ved hjelp av en micropipette, Fjern supernatanten fra sentrifugert mikrosentrifugen rør og tilsett 100 μL av M9 medium for å vaske bort L-15-supplert medium. Sentrifuger celler 5 min ved 10 000 x g ved 4 ° c og fjern supernatanten. For å sikre at alle medier er fjernet, Gjenta for totalt tre vasker forsiktig fjerne supernatanten hver gang.
3. Tilsett 1 mL fenol og guaniniumtiocyanat isothiocyanate løsning (tabell av materialer) til cellene og Pipetter fjæringen opp og ned forsiktig. Ruge blandingen ved RT i 5 min.
4. Etter inkubasjons, tilsett 250 fenol og guaniniumtiocyanat isothiocyanate løsning
5. Sentrifuger oppløsningen i 5 min ved 10 000 x g ved 25 ° c.
6. Forsiktig fjerne så mye av den øverste vandige lag med en micropipette som mulig, uten å forstyrre den nederste organiske lag, og overføre det nederste laget til en ny 1,5 mL RNase-Free mikrosentrifugen tube. Til det nye røret, tilsett 500 μL av isopropanol og bland ved å invertere røret. Ruge denne løsningen på RT i 5 min.
7. Sentrifuger røret ved 14 000 x g i 20 min ved 25 ° c.
8. Mens du holder prøvene på isen, Fjern så mye isopropanol som mulig med en micropipette, og Legg forsiktig til 1 mL 70% (v/v) etanol i RNase-Free ddH₂O til røret. Pass på at du ikke løser ut løsningen direkte på undersiden av slangen; bruke etanol/vann blandingen til siden av røret.
9. Sentrifuger ved 10 000 x g i 5 min ved 25 ° c.
10. Fjern det meste av etanol og lufttørke på isen i 3 − 5 min.
    Merk: etanol bør fjernes etter dette trinnet; Imidlertid er nøye inspeksjon av bunnen av røret viktig å sikre at ingen etanol er igjen.
11. Etter at slangen er luft tørket, tilsett 15 − 20 μL av RNase-Free ddH₂O og mål RNA konsentrasjon og renhet ved hjelp av en spektrofotometer ved 260 NM bølgelengde. Renheten av prøven skal måles som en 260 NM/280 NM ratio. Dette forholdet bør være omtrent > 2.
    Merk: isolert RNA kan fryses og oppbevares ved-20 ° c. Det er imidlertid svært gunstige å bruke en cDNA syntese Kit så snart som mulig for å sikre høy kvalitet cDNA produksjon. Kvantitativ PCR kan følge ved hjelp av instruksjoner gitt av produsenten av thermocycler som brukes i laboratoriet.

Representative Results

Protokollen beskrevet her gir mulighet for spesifikk isolering av UNC-17:: GFP-positive kolinerge neurons fra roundworm C. elegans for senere ex vivo studier som celle type-spesifikke genuttrykk profilering og eventuelt kortsiktige dyrking for patch-klemme elektrofysiologi målinger.

Figur 1 viser UNC-17:: GFP-positive kolinerge neurons i sin normale innstilling. UNC-17- genet uttrykkes i hele C. elegans kropp og koder for en flytande acetylkolin transmembrane transporter¹⁷. Uttrykket av dette genet kan observeres i hodet, midbody, og halen neurons og Nevron anslag.

Figur 2a viser en billedlig oversikt over Nevron isolasjons prosedyren skissert i metodene delen. Trinn en er å synkronisere og kultur ormene. Ytterligere, skikkelsen 2b viser Distinguished fluorescens micrographs av UNC-17:: GFP-positiv neurons etter isolasjon likeledes idet respekt negativ administrere fra uforandret N2 vill type dyrene. Isolerte celler kan holde seg i live i opptil 3 dager, da supplert med Leibovitz L-15 medium og 10% FBS.

Figur 3 viser representative data for QPCR fra GFP uttrykker kolinerge NEURONS samt GFP-uttrykker muskelceller. Etter en vellykket sortering av celler ved begge metodene ble RNA isolert via en fenol-og guaniniumtiocyanat isothiocyanate-metode, hvoretter cDNA ble produsert ved hjelp av et syntese Kit. Uttrykk for kolinerge Nevron-spesifikke gener, tph-1 og SNB-1, en tryptofan hydroksylase og Synaptic vesicle transporter, henholdsvis, er forhøyet i UNC-17::GFP isolerte celler, men er ikke til stede i Myo-3::GFP isolerte celler. Den inverse er sant med uttrykket av muskel-spesifikke myosin tunge kjeden transkripsjon av Myo-2. Uttrykk for sistnevnte gen er begrenset til isolerte muskelceller, men ikke de isolerte kolinerge cellene.

Figur 1: rekonstruert bilde av kolinerge neurons i en-dag-gammel vill type transgene dyr uttrykker UNC-17:: GFP reporter. Bildet ble satt sammen av fire separate konfokalmikroskopi fluorescens bilder av den samme ormen, som dekker hele dyrets lengde. Skalaen stang av hver individ image er 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: arbeidsflyt av celle isolasjon og representative GFP-uttrykker celler isolert fra UNC-17::GFP belastning. (A) skjematisk arbeidsflyt avbildning for isolering av bestemte celle populasjoner beriket med UNC-17:: GFP-uttrykker kolinerge neurons fra respektive C. elegans transgene stammer. (B) representative fluorescens bilder som viser tilstedeværelsen av GFP-signal i de isolerte UNC-17:: GFP-positive cellene. Merk at bildet viser et enkelt fokal plan. Scale bar = 10 μm. Figur 2B er gjengitt med tillatelse fra Journal of Cell Science og har blitt utgitt av Tyskland et al.¹². Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: representative qPCR analyse av UNC-17-Nevron spesifikke markører (tph-1, UNC-47 og SNB-1) i hel-dyr versus UNC-17:: GFP reporter celle isolerer bekrefter spesifikk berikelse av kolinerge neurons av interesse. Ytterligere negative kontroller som brukes her var Myo-3:: GFP reporter-uttrykker muskelceller, som hadde blitt isolert etter samme protokoll. Data viser bety verdier ± SD (n = 3 biologiske replikerer). * p < 0,05; * * p < 0,01; p < 0,001 ved å parkoble t test. Dette tallet har blitt modifisert fra Tyskland et al.¹². Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Roundworm C. elegans er en veletablert og mektig modell for å studere neuronal helse og sykdom². Med rikelig genetisk verktøy for å manipulere disse dyrene og håndterbare mengde presist kartlagt ulike Nevron typer, kan en god del data samles med en relativt liten mengde materiale. Her skisserer vi en optimalisert metode for å isolere distinkte neurons fra hele dyr. Ved å forstyrre ormen ytre cuticle proteiner, kan en slurry av ulike celletyper isoleres, inkludert neurons og muskelceller⁵. Disse isolerte celler kan brukes i en rekke unike eksperimenter. Muligheten til å bruke enten celle sortering gjennom Flow flowcytometri eller antistoff-merket magnetiske perler gir en adaptiv teknikk avhengig av parametrene av spesifikke eksperiment. Utdrager RNA fra en spesifikk C. elegans cellen type likeledes innrømmer for en flere grundig eksamen og en mekanistisk forståelse av forskjellige Cellular prosesser.

Det er kritiske trinn diskutert her som må følges nøye: 1) aldring og høsting godt matet ormer fra 25 μM FuDR plater; 2) tid i SDS-DTT inkubasjons eller behandling med protease blanding; 3) valg av GFP-positive celler. Først under aldring av ormer, er det viktig å være flittig for å sikre at eventuelle egg lagt ikke klekkes, da dette vil føre til alder heterogenitet i de innsamlede ormer, forårsaker betydelig variasjon i data. Vasken trinn når høsting ormer for isolasjon er også nødvendig for å sikre at eventuelle døde eller umodne dyr ikke er samlet inn. For det andre, overdreven inkubasjons av ormer i SDS-DTT buffer kan føre til uønsket nedbrytning av viktige cellulære komponenter og toksisitet til ormer, forebygge isolering av mål celletyper. Opprettholdelse av celle levedyktighet er avgjørende for vellykket RNA-ekstraksjon fra eller ytterligere kortsiktige dyrking av isolerte celler. Fordi flertallet av neuronal celler er delikate, altfor harde behandling under enten SDS-DTT buffer eller protease blanding behandling kan føre til massiv skade på disse cellene. Hvis en stress respons vei er målet for eksperimentet, kan vilkårene for incubations være litt endret som den svært reductive kraften til DTT kan føre til forbedret uttrykk for visse stress respons gener. I dette tilfellet er det viktig å kunne vaske celle pellets med L-15-supplert medium for å stanse reaksjonen og raskt re-forsyne cellene med næringsstoffer. Til slutt, nøye velge hvilke valg trinn som er mest hensiktsmessig for cellen type interesse vil tillate maksimal utvinning av disse cellene. På samme måte, vurderer mobilnettet lokalisering av celle type-spesifikke markører kan hjelpe forskerne å velge den mest optimale celle berikelse tilnærming. Ved hjelp av Flow flowcytometri vil gi en mer homogen og levedyktig cellekultur, mens bruk anti-GFP magnetiske perler er mindre tidkrevende og arbeidsintensiv.

Det er viktig å merke seg at metoden beskrevet her har noen begrensninger. For det første bør robust uttrykk for GFP i ønskede celletyper verifiseres for å sikre egnet isolering av FACS eller antistoff-sammenkoblede magnetiske perler. For det andre kan selv milde cuticle forstyrrelser føre til en dårlig avkastning eller til og med tap av visse kroppens vegg celler, eller andre lav-overflod celle populasjoner som dat-1 dopaminerg neurons. Når du velger celletyper, kan den mer rikholdige celletypen vanligvis gi en mer vellykket avkastning. Likevel, denne metoden kan brukes for isolering av mindre rikelig celle type populasjoner også.

Oppsummert fremgangsmåten omtalt i denne artikkelen presenterer en effektiv metode for utvinning og isolering av enkelte celletyper fra roundworm C. elegans. Metoden er robust nok til å muliggjøre ekstraksjon av RNA, og påfølgende gen profilering, og følsom nok til å tillate dyrking av isolerte celler. Selv om den nøyaktige metoden som brukes til å isolere bestemte grupper av celler, kan variere mellom forskjellige celletyper, er arbeidsflyten som er beskrevet i denne rapporten, vanligvis effektiv og kan brukes på nesten alle typer orm celler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	Fisher Scientific	12-556-004
Agar, Molecular Biology Grade	VWR	A0930
CaCl2	Sigma	C5670
Chloroform	Sigma	496189
Contess Automated Cell Counter	Invitrogen	Z359629
DTT	USBiological	D8070
Ethanol	Decon Labs	2701
FBS	Omega Scientific	FB-02
Fluorodeoxyuridine	Sigma	F0503
HEPES	Sigma	H3375
Isopropanol	VWR	BDH1133
KCl	Amresco	O395
KH2PO4	USBiological	P5110
Kimwipes	Kimberly-Clark Professionals	7552
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco	21083027
MgCl2	Sigma	M8266
MgSO4	USBiological	M2090
Na2HPO4·7H2O	USBiological	S5199
NaCl	VWR	X190
NaOCl (Bleach)	Clorox
NaOH	Amresco	O583
Penicillin-Streptomicen	Fisher Scientific	15140122
Peptone Y	USBiological	P3306
Pronase E	Sigma	7433	protease mixture from Streptomyces griseus
SDS	Amresco	O227
SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope	Tritech Research
Sucrose	USBiological	S8010
SuperScript IV One-Step synthesis kit	ThermoFisher	12594025
TRIzol	Invitrogen	15596026	phenol and guanidine isothiocyanate solution
Trypan Blue Stain	Invitrogen	T10Z82
α-GFP magnetic beads	MBL	D153-11