Immunology and Infection

从人类母乳中分离白细胞，用于HIV靶点抗体依赖性细胞噬菌体测定

Published: September 6, 2019 doi: 10.3791/60149

¹Division of Infectious Diseases, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Summary

母乳传播人体免疫缺陷病毒（HIV），尽管只有15%的感染艾滋病毒的母亲母乳喂养的婴儿被感染。母乳喂养的婴儿每天摄入+10⁵⁺¹⁰⁸母性白细胞，尽管这些细胞研究不足。在这里，我们描述了乳腺癌白细胞的分离，并分析了它们的噬菌体能力。

Abstract

即使在没有抗逆转录病毒药物的情况下，只有15%的感染艾滋病毒的母亲母乳喂养的婴儿受到感染，这表明母乳（BM）具有很强的保护作用。除非获得清洁水和适当的婴儿配方奶粉是可靠的，否则世卫组织不建议感染艾滋病毒的母亲停止母乳喂养。许多因素可能协同作用，以减少 BM 传输。母乳喂养的婴儿每天^摄入105~10⁸个母性白细胞，但基本上仍不清楚这些细胞对BM抗病毒特性的贡献。目前，我们的目标是从人类BM中分离细胞，以测量抗体依赖性细胞噬菌体（ADCP），BM噬菌体对HIV靶点最基本和普遍的先天免疫反应之一。从在哺乳不同阶段获得的5个人类BM样本中分离出细胞。分离是通过温和的离心进行，然后仔细去除乳脂和反复清洗细胞颗粒。涂有HIV包络（Env）表位的荧光珠子被用作ADCP分析的目标。细胞被染色与CD45表面标记，以识别白细胞。结果发现，ADCP活性明显高于对照实验，使用HIV特异性抗体830A可重复可测量。

Introduction

母乳（BM）由母细胞组成，这些细胞的存活率为 >90%¹。细胞组成受到哺乳阶段、母婴健康状况和个人变异的强烈影响，^{对1、2、3、4}仍然知之甚少。鉴于BM含有+10³⁺¹⁰⁵白细胞/mL，可以估计母乳喂养的婴儿每天摄入+10^5~10⁸母性白^细胞。各种体内研究表明，母性白细胞对婴儿提供关键免疫，其功能远远超过最初^{摄入5、6、7、8}这些部位。 ^，⁹^，¹⁰^，¹¹.婴儿摄入的所有母性衍生细胞都有可能与婴儿一起发挥免疫功能或补偿婴儿自己的白^细胞12。

在资源有限的国家，人体免疫缺陷病毒（艾滋病毒）的母婴传播仍然是一个危机。由于腹泻和呼吸道疾病是造成资源有限国家婴儿死亡率的显著原因，而且通过纯母乳喂养，这些疾病大大减少，这对感染艾滋病毒的母亲有利。母乳喂养远远超过风险13，14，15。除非获得清洁水和适当的婴儿配方奶粉是可靠的，否则世卫组织不建议^{感染艾滋病毒的母亲停止}母乳喂养。每年通过 BM 进行约 100，000 次 MTCT;然而，只有15%的婴儿由其感染艾滋病毒的母亲母乳喂养感染，这表明BM17，18，19，20，21的强烈保护作用。许多因素可能协同作用，以防止传输。重要的是，BM中艾滋病毒特异性抗体（Abs）与MTCT的减少和/或减少婴儿死于艾滋病毒感染^{有关22，23。}在很大程度上，仍不清楚的是BM细胞部分对其抗病毒特性的贡献。

许多Abs促进各种抗病毒活动，由免疫球蛋白分子的"恒定"区域，可结晶片段（Fc），通过与Fc受体（FcRs）的相互作用，发现几乎所有的先天免疫细胞，几乎所有发现在人类BM^24。抗体依赖性细胞噬菌体（ADCP）已被证明是清除病毒感染所必需的，在预防^{艾滋病毒MTCT}的情况下，已经研究不足。²⁸^,^29.鉴于对BM噬菌体活性对预防艾滋病毒MTCT的潜在贡献缺乏了解，我们旨在开发一种严格的方法，将细胞从人类BM中分离，以便对由细胞介导的ADCP进行研究。BM在哺乳的不同阶段获得。

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Protocol

本研究的每个参与者都是根据道德和机构审查委员会（IRB）的批准招募和面试的，并经过西奈山人类主体保护计划（PPHS）的指导和授权，使用 IRB 批准的获取母乳样本的协议。

1. 目标微球制备

选择相关靶抗原。
注：在此示例中，使用了重组蛋白V1V2-2F5K，它旨在模仿原生HIV包^络30的三分位。
根据制造商的协议，使用商业套件（材料表）进行生物异化.
1. 计算生物素试剂的 mmol，以添加 5 倍摩尔过量的反应使用公式： mmol 生物素 = mL 蛋白 x （mg 蛋白/mL 蛋白） x （mmol 生物素/mg 蛋白） x （5 mmol 生物素/mmol 蛋白）^30，³¹。然后计算使用公式添加的生物素试剂的μL：μL生物素 = mmol生物素 x （1，000，000 μL/L） x （L/10 mmol）。
2. 在打开前将生物锡与室温平衡。根据上述计算，将蛋白质溶解在0.5~2.0 mL的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。
3. 在二甲基硫酸盐（DMSO）中制备10mM生物锡试剂溶液，并在蛋白质溶液中加入适当体积的10mM生物锡试剂，并在冰上孵育反应2小时或在室温下30分钟。
使用蛋白质浓缩器去除多余的生物素（聚醚素 [PES] 膜，3 kDa 分子量切断 [MWCO]， 0.5 mL;材料表）根据制造商的说明。
1. 将样品沉积到自旋柱的上腔中，并加入高达400μL的PBS，然后将样品室插入收集管中。在室温下在12，000 x g下离心30分钟。
2. 丢弃流通，并将 PBS 添加到 400 μL. 重复离心。丢弃流通，将PBS添加到100μL。通过分光光度计测量蛋白质浓度。
  注：蛋白质可在-80°C下附注和冷冻，直到使用。

2. 抗体依赖细胞噬菌体（ADCP）测定板制备

将生物酸酯蛋白结合到1μm微球（"珠子";材料表）根据制造商的说明。
1. 每盘偶联珠，在室温下孵育6μg蛋白质，在室温下，在室温下，每20分钟轻轻涡旋12μL，在0.1%牛血清白蛋白（BSA）-PBS中，用12μL的库存珠子孵化。
2. 在13，000 x g下离心5分钟。丢弃上清液，轻轻涡旋，在1200μL0.1%BSA-PBS中重新悬浮。重复旋转并洗涤步骤 2x。在 1200 μL 的 0.1% BSA-PBS 中重新悬浮。
在圆底 96 孔板中，每孔的 10 μL 珠溶液的附量 10 μL。在 12 μL 的 2% HSA HBSS 中制备抗体或免疫血清的稀释，通常从 50 μg/mL 的抗体或 1/100 血清稀释处开始。
注：在样本数据中，使用了单克隆抗体（mAb）830A。
在珠板中加入10μL的带子抗体/血清，并在37°C下孵育2小时。将 200 μL 的 2% HSA HBSS 添加到每个孔和离心板，在 2，000 x g下 10 分钟。
通过快速翻动和将液体从板孔中放入水槽中小心地去除上清液，以避免干扰不可见的珠子颗粒。

3. 母乳细胞隔离

从健康哺乳期妇女那里获得母乳，使用双电子或手动泵表达。在+4h的表达范围内分离细胞，将牛奶保持在室温下。
使用 50 mL 管，以 800 x g将 50 mL 牛奶离心 15 分钟。小心地倒出脱脂牛奶和脂肪，同时使细胞颗粒不受干扰。用无绒抹布擦拭管内侧，去除管壁上的所有脂肪。
在汉克的平衡盐溶液中加入10 mL 2%的人类血清白蛋白（2%HSA HBSS [不含Ca²⁺^或Mg]）。通过温和的移液重新悬浮颗粒，以避免细胞激活和凋亡。转移到15 mL管和离心机在450 x g10分钟。
倒下上清液并重复步骤1.3。然后，根据预期的细胞数量，在1⁄2 mL的2%HSA HBSS中轻轻重新悬浮细胞，并通过血细胞计或自动细胞计数器对细胞进行计数，同时注意细胞的生存能力。

4. ADCP测定

注：本文描述的方法改编自阿克曼^等人32。

在 200 μL 的 2% HSA-HBSS 中，在每个 ADCP 测定盘中加入 50，000 个新分离的 BM 细胞。在37°C下孵育2小时。
1. 对于对照实验，在37°C下，用10μg/mL活性素抑制剂（细胞沙沙沙星-D）、50μg/mLFcR阻滞剂（FcBlock）在37°C前预孵化细胞，或两者结合后加入板。
930 x g的离心板 10 分钟，加入 200 μL 的 2% HSA HBSS 并重复离心。如步骤 2.7 中那样小心地去除上清液并重复洗涤。
使用 0.5 μg/mL（最终浓度）可修复的可修复性污渍 450 每井 450，在 50 μL 的 2% HSA HBSS 中小心去除上清液和染色细胞，以增强生存能力。在黑暗中室温下孵育20分钟。离心机板在930 x g 10分钟，并删除上清液，如步骤2.7。再次加入 200 μL 的 2% HSA HBSS 和离心板，然后按照步骤 2.7 中去除上清液。
在活力染色后，感兴趣的白细胞标记的染色细胞，最少包括CD45特异性染色，如PE-小鼠抗人CD45（克隆HI30），浓度为优化（1μg/μL，50μL，1%BSA HBSS）。
注：可以包含任何特定于血统的标记。
在黑暗中室温下孵育20分钟。离心机板在930 x g 10分钟，并删除上清液，如步骤2.7。加入 200 μL 的 1% BSA HBSS 和重复离心。去除上清液。在室温下将细胞固定在200μL的0.5%甲醛中，在室温下30分钟或在4°C下过夜。在黑暗中冷藏，直到分析。

5. 流量细胞学分析

执行初始浇注以消除正向散射（FSC）与侧散射（SSC）图和碎屑（小于 FSC = 5000 的材料）上的双精度点（参见图 1）。使用 SSC 与生存性染色（V450 在这种情况下）图消除死细胞（那些对活力染色呈阳性）。
使用 SSC vs. CD45 图来区分主要白细胞类（粒细胞、单核细胞、淋巴细胞），如广泛描述^33，³⁴。
注：此分类仅具有暗示性，并且需要特定于血统的标记来确认细胞类型。
对于所有CD45+细胞，或对于每个感兴趣的白细胞子集，通过在荧光素等分酸（FITC）通道的直方图上用标记注住标记来测量ADCP活性，其中检测荧光珠。
注：未添加磁珠的负对照井将指示直方图中珠正细胞的明显位置，因此指示将浇注标记放置的位置。
将ADCP分数计算为（珠阳性细胞的中位荧光强度[MFI]）x（CD45总量百分比=阳性总体细胞）。使用图形软件绘制每个 Ab/血清浓度的分数，并执行曲线下区域（AUC）分析。
注：如果 AUC 大于非特定负控制 mAb 的 ADCP 分数 AUC 的 3 倍标准差（本例中为 3865），则 ADCP 被视为正值。

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Representative Results

牛奶可在室温或冷却器下保存（但不冷冻）;然而，鉴于我们观察到当牛奶保持非常寒冷时，其生存能力降低（数据未显示），并且在环境温度下进行短暂收集、短暂储存和运输更简单，因此建议不要冷藏样品，以减少样本到样本的可变性。在产后7-183天获得的牛奶中，由自动细胞计数器测定的细胞浓度为16，083~222，857细胞/mL。图 1说明了消除双精度值、碎屑和死细胞的浇注策略。生存能力为+90~99%。约1.6~12.3%的活细胞为CD45+白细胞（表1）。大多数声称的单核细胞似乎是前体/未成熟细胞，如前所述，基于暗示性SSC vs. CD45^门34。所谓的单核细胞被定义为SSC^低中间/CD45^低，虽然很少表现出更高的CD45染色水平不同于所谓的淋巴细胞群（SSC低/CD45^低）更典型与血液单核细胞相关（图1），类似于以前的^{研究33，34。}所谓的粒细胞被定义为SSC高/CD45^{中间33，34（}表1）。请注意，此分类仅具有暗示性，并且需要特定系的标记来确认单元格类型。

使用HIV特异性人类mAb 830A测量新鲜分离的BM细胞的ADCP活性，该活性特定于HIV包络的V2区域，并结合在这里测试的V1V2-2F5K抗原。ADCP活性是在这里使用产后1个月获得的牛奶（图2A）的。示例数据显示了在 CD45⁺细胞上浇注时看到的预期的 FITC（珠*）直方图（显示使用 1 μg/mL mAb 生成的数据）。黑色标记表示用于计算 ADCP 分数的人口。在样本 830A 数据（图2A的第一面板）中显示了 CD45⁺细胞的百分比和该总体的平均荧光，这些百分比用于使用步骤 3.4 中的公式计算 ADCP 分数。用活性酶抑制剂细胞沙沙沙沙辛-D（细胞）和/或FcR阻断的Abs（FcBlock）孵育之前，用Ab-绑定/抗原耦合珠子预孵化的细胞在对照mAb 3865或以下水平上表现出ADCP活性，表明ADCP为FcR和与行为因相关（图2）。确定总CD45+细胞的ADCP评分比使用阴性对照抗炭疽mAb 3865定义的背景水平高出25~35倍。每个主要子集也分别进行分析。所谓的粒细胞表现出ADCP活性=比背景高12-29倍。所谓的单核化ADCP比背景高2~3倍（图2）。所谓的淋巴细胞没有表现出任何可测量的ADCP活性（非特异性阴性对照mAb 3865的ADCP分数AUC的3倍标准偏差;未显示数据）。

图1：从母乳中分离的细胞的样本流细胞测定数据。细胞被处理和染色，如协议所述。（A）单个单元被封闭，以消除 FSC-H vs. FSC-A 图中的双精度值，同时将 FSC-A 中的小碎片 <5，000 门。（B）此群体用于在 SSC vs. V450（活力染色）图中对活细胞（不用可活性染料染色）进行门禁。（C）这些活细胞用于 FSC vs. SSC 图。突出显示非白细胞的预期位置（"E"）。（D）相同的 FSC 与 SSC 图仅显示 CD45⁺单元格。注意到的主要白细胞子集只是根据既定和预期的SSC参数（G = 粒细胞;M = 单核细胞;L = 淋巴细胞）。（E）活细胞用于SSC与CD45图，并注明主要白细胞子集。此图的后门控产生了面板 D 中显示的数据。请点击此处查看此图的较大版本。

图2：使用从母乳中分离的细胞的ADCP数据样本。执行的ADCP测定基于阿克曼^等人30的测定。测定执行上述协议中所述。（A） 1 μg/mL mAb 的 FITC 直方图样本，带有标记，指示用于确定 ADCP 分数的珠/FITC+ 总体。分数计算为（珠阳性细胞的MFI）x（CD45总量的百^分比=珠/FITC+阳性总体中的细胞）。仅使用 mAb 830A 的第一个面板还指示了 CD45⁺细胞总数的百分比以及用于计算该示例中 ADCP 分数的平均荧光强度值。（B）每个mAb稀释测定的ADCP分数用于计算图形软件中的曲线下面积（AUC）值。对于对照实验，活性抑制剂细胞沙沙沙沙辛-D（细胞-D）、FcR阻断剂（FcBlock）或两者的组合在加入免疫复合物之前与细胞一起预先孵育（参见传说）。请注意，此单元格分类仅具有暗示性，并且需要系系特定的标记来确认细胞类型。请点击此处查看此图的较大版本。

样品	细胞/mL	% CD45^\|	% 粒细胞*	% 单核细胞*
1	222,857	12.3 × 1.9	13.6 × 3.8	65.9 × 5.6
2	27,361	1.6 ± 0.01	25.2 × 4.0	9.1 × 5.6
3	161,486	3.6 × 1.1	47.8 × 6.8	24.3 × 4.3
4	16,083	2.7 × 0.1	17.9 × 3.5	34.4 × 1.0
5	25,155	4.0 × 0.7	29.7 × 2.6	20.5 × 1.4
*CD45⁺细胞

表1：典型母乳细胞计数和特征的示例。

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Discussion

本文描述的用于测量ADCP活性的流式细胞学技术于2011年首次被^描述30，并自此被证明为稳健型，并在80多项研究中被引用。此处描述的协议首次将该技术用于初级 BM 单元。以前对BM细胞的Fc介导功能的研究主要限于使用从对口乳分离的细胞（出生后0⁄4天）测量氧化性爆裂或基于组织学的噬菌体测定。几乎没有研究对超过隆利阶段的人类BM细胞进行过检查。使用共体细胞的研究通常得出结论，隆利体中的粒细胞比从血液中分离出来的粒细胞活性较低，其作用是进入血管^外空间的"渗出细胞"，尽管相互矛盾的研究有报告类似的噬菌体和杀菌^能力36。

几十年来，传统的显微镜被用来识别BM白细胞，这种类型的视觉识别可能导致细胞误^认1。很少有研究比较BM白细胞成分超过哺乳的第一个月，大多数侧重于初乳。使用流式细胞测定来识别细胞可能准确地识别细胞，尽管只有少量的BM研究已经使用这种方法，通常样本数非常小。目前的研究表明，在哺乳的所有阶段，BM的白细胞含量差别很大，从早期初乳的+10⁴⁺⁷x 10⁵白细胞/mL，到成熟牛奶中的10³⁺⁵x 10⁴白细胞/mL，虽然所有研究都证实细胞浓度和组成受到哺乳^{期1、2、3、4、5}的强烈影响。随着牛奶向成熟成分过渡，嗜中性粒细胞浓度似乎增加，尽管此类研究通常不会延长到产后第一^{个月之后。}

本文所述的协议使用荧光珠作为噬菌体靶点，尽管它可能可用于研究各种更与生物学相关的靶点BM ADCP，如免疫复合物和受感染的细胞，由各种Ab等型和子。可采用更大的细胞染色面板来进一步区分白细胞。大型研究对于这些相关原细胞对ADCP的全面理解至关重要。该协议允许BM白细胞建立ADCP，作为减少艾滋病毒和其他病原体的MTCT的潜在机制。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们感谢西奈山伊坎医学院医学系和微生物学系的苏珊·佐拉-帕斯纳博士的手稿评论。NIH/NICHD为该项目提供了资助，赠款号为R21 HD095772-01A1。此外，R. Powell还得到西奈山伊坎医学院传染病司医学部的资金支持。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 µm FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres	Thermo Fisher	F8776
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45	BD	560975
Bovine serum Albumin	MP Biomedicals	8810025
Corning V-bottom polystyrene 96-well plate	Corning	3894
Cytochalasin D	Sigma	22144-77-0
EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit	Thermo Fisher	21338
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Corning	352196
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Corning	352070
Fixable Viability Stain 450	BD	562247
Formaldehyde solution	Sigma	252549
HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red	Life Technologies	14175-095
Human BD Fc Block	BD	564219
Human Serum Albumin	MP Biomedicals	2191349
Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers	Kimberly-Clark Professional	34120
PBS 1x pH 7.4	Thermo Fisher	10010023
Polystyrene 10 mL Serological Pipettes	Corning	4488
Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL	Pierce	88512