Summary
توضح هذه المقالة كيفية إجراء اختبارات السلوك الجنسي في الفئران الذكور.
Abstract
السلوك الجنسي هو نوع خاص للغاية. على الرغم من أن القوارض لديها سلوكيات جنسية مختلفة قليلاً ، فإن الفئران والجرذان لديها نمط سلوكي جنسي مماثل. الغرض من هذه المقالة هو وصف النموذج الأنثوي المستحث بالهرمونات والإجراء التجريبي لتقييم السلوك الجنسي للفئران الذكور. يتم عرض أهم العناصر السلوكية الجنسية في الفيديو والرسوم التوضيحية. يتم شرح الخطوات الهامة والمزايا والقيود الخاصة باختبار السلوك الجنسي أيضًا. وأخيرا ، يتم تقديم معلمات السلوك ، وتصاعد ، والاستقراء ، وعمليات القذف في التزاوج وتتميز. يتم تقييم المعلمات السلوكية من حيث المدة التي حدثت والعد خلال فترة الاختبار.
Introduction
السلوك الجنسي في الفئران الذكور ناضجة النتائج من التفاعل من سلسلة من النظم الهرمونية المترابطة والمترابطة والنظم العصبية في دوائر الدماغ المختلفة1. كما يتطلب خبرات تنموية، وتعلم، وسياق، وشريك مناسب. التحليل السلوكي هو انعكاس مهم على وظيفة العصبية أو العصبية. وبالتالي ، تم استخدام دراسة السلوك الجنسي على نماذج الحيوانات على نطاق واسع في علم الأعصاب السلوكي والبحوث الأخرى ذات الصلة2. وقد تم شرح ethogram من السلوكيات الجنسية في القوارض في العديد من المقالات والكتب1،3،4. على سبيل المثال ، ساعد وصف Scahs و Barfield للسلوك الجنسي في الفئران5 على فهم نمط سلوكي مماثل في الفئران5. الفأر هو واحد من المواضيع الأكثر استخداما للدراسات السلوكية. هال وآخرون6 قدم مقدمة مفصلة من السلوكيات الجنسية الماوس الذكور: عندما يواجه فأر ذكر أنثى، فإنه يبدأ في التحقيق في المنطقة الأنوية التناسلية للأنثى. ثم يضغط الذكر على الكفوف الأمامية ضد أجنحة الأنثى لتركيب الأنثى من الخلف. الأنثى معارض موقف التقبل الجنسي مميزة، الانحناء عمودها الفقري إلى أسفل إلى القوس وتحريك ذيله إلى جانب واحد من الجسم، وفضح مقدمة فتح للاختراق الجنسي للذكر (أي lordosis). بعد تصاعد، والذكور يجعل السريع، والتوجهات الحوض الضحلة، تليها التوجهات المهبلية بطيئة وعميقة. بعد العديد من المقدمات ، يؤدي الدفع طويل الأمد إلى قذف السائل المنوي ، والتي قد يتجمد خلالها الفأر الذكر لحوالي 25 ث قبل الترجل أو السقوط من الأنثى6. في القذف قد تنتج الغدد الملحقة الماوس الذكور خليط يحتوي على السائل المنوي الذي يتصلب لتشكيل المكونات copulatory. وأخيرا، بعد القذف، يبدأ الذكور الاستمالة التناسلية ويظهر عدم الاهتمام في الأنثى. باختصار ، فإن التسلسل الأساسي للسلوك الجنسي الذكري يتكون من الشم ، والمتابعة ، والتركيب ، والانطوان ، والقذف ، والاستمالة بعد القذف. الفأر السلوك الجنسي معارض الخلافات سلالة. على سبيل المثال، تتراوح العداونات القذف من 594 إلى 6943 ث، وتتراوح أعداد المقدمات من 5 إلى أكثر من 100. تتراوح التار المتأخرة بعد القذف من 17 إلى 60 دقيقة. ومع ذلك ، فإن إدخال أنثى جديدة يمكن أن يقلل من هذه الفترة الزمنية. في بعض الحالات ، يقذف الذكور على الانطوان الأول مع الأنثى الجديدة7.
الأحداث الرئيسية لتقييم السلوك الجنسي تتصاعد، والانطوان، والقذف. وقد أوصى علماء السلوك قياس ليس فقط تواتر كل عمل، ولكن أيضا الكمون والفاصل الزمني5،8. وتشمل بعض مؤشرات القياس الرئيسية في الدراسات السابقة: عدد الجبال، وعدد من intromissions، جبل الكمون، الكمون استتار الاستقراء، الكمون القذف، بعد الكمون بعد التأنق بعد التبصر بعد التبصر (أو فترات ما بعد القذف)، بعد الاستجابة بعد القذف، عدد من سلسلة copulatory، ومدة سلسلة copulatory. ووصف بارك وآخرون8 وساكس وآخرون5 كيفية تحديد كل عمل من أعمال التركيب والمغفرة والقذف من القوارض. يتم تعريف تصاعد الذكور تصاعد الأنثى من العمق، بالربت جناحيها مع ساقيه، ودفع قضيبه بسرعة ومرارا وتكرارا دون إدراج القضيب. يتم تحديد الانساق ، المعروف أيضًا باسم إدخال القضيب ، من خلال واحد أو أكثر من الأفعال التالية: دفع طويل وعميق بعد الاتجاهات الضحلة السريعة ، وركلة سريعة مع ساق واحدة ، وانسحاب جانبي ملحوظ للذكر من الأنثى. يتم تحديد القذف من خلال قوة دفع الحوض الطرفية التي هي أبطأ وأعمق من ذلك من مقدمة وانخفاض في ارتفاع الساق الخلفية. يتم تحديد سلسلة copulatory من قبل كل تسلسل من تصاعد للقذف. وترد تعاريف البارامترات السلوكية المستخدمة في هذه الدراسة على النحو التالي: 1) تصاعد الكمون: الوقت من إدخال الأنثى إلى أول تركيب للذكر؛ (2) تصاعد الكمون: الفترة الزمنية من إدخال الأنثى إلى أول تركيب للذكر؛ (2) التأخر في العمل؛ (2) ارتفاع عدد الذكور؛ (2) ارتفاع عدد الذكور؛ (2) ارتفاع عدد الذكور؛ (2) ارتفاع درجة الاتساق بين الذكور؛ (2) ارتفاع عدد الذكور؛ (2) ارتفاع عدد الذكور؛ (2) ارتفاع درجة الإناث. 2) الكمون التقديم: الوقت من إدخال الأنثى إلى التقديم الأول؛ 3) الكمون القذف: الوقت من التقديم الأول إلى القذف الأول (عموما بعد دفعة الحوض الماضي)؛ 4) بعد الكمون جبل ما بعد القذف: الوقت من القذف إلى تصاعد المقبل؛ 5) بعد وصول الاستراحة بعد القذف: الوقت من القذف ومقدمة المقبل؛ 6) عدد من يتصاعد: عدد مرات تصاعد قبل القذف الأول؛ 7) عدد المقدمات: عدد المقدمات قبل القذف الأول؛ 8) عدد المسلسلات التعاونية: عدد المسلسلات التعاونية خلال فترة المراقبة؛ 9) مدة سلسلة copulatory: الوقت من جميع سلسلة copulatory خلال فترة المراقبة.
يمكن إجراء السلوك الجنسي والسلوك المرتبط به إما في قفص منزل الذكر أو في ساحة مغلقة ، من بينها جهاز يسمى مربع ريسمان "لا أسرار" معكوسلمراقبة سلوك التزاوج3. يتم وضع كاميرا فيديو أمام الصندوق لتسجيل عمل الفئران في وقت واحد من منظر جانبي ومن خلال مرآة مائلة من منظر بطني. ومع ذلك ، تتطلب هذه الطريقة أضواء ساطعة ، مما يؤدي حتما إلى التعود لفترة أطول من أجل القضاء على الإجهاد البيئي في الفئران. أما بالنسبة لطريقة القياس ، فمن المستحسن التحليل السلوكي المستند إلى الفيديو لتسجيل السلوك وقياسهكميًا 4. يمكن استخدام مسجل فيديو يحتوي على خيار متقدم فيديو إطاري مع سرعات مصراع موصى بها أكبر من 1/1000 s لتسجيل حركات الماوس السريعة. كاميرا الأشعة تحت الحمراء عالية الدقة ضرورية عند التسجيل في بيئة مظلمة. لتحليل الفيلم ، وهناك حاجة إلى جهاز كمبيوتر مع المختطف الإطار للسماح لإطارات السلوك الفردية ليتم التقاطها للتلاعب الكمبيوتر. الفئران هي متعددة للغاية ويمكن أن تظهر السلوك التعويضي بعد أي علاج تقريبا. الغموض يمكن أن توجد حول كل جزء الجسم تتحرك4. وبالتالي، قد يتطلب تحليل بعض السلوكيات دقة أكبر وكاميرات سرعة أعلى.
تتأثر السلوكيات الجنسية الذكورية في الفئران بالعديد من العوامل ، بما في ذلك اختلافات السلالات ، والتغيرات الهرمونية ، وطفرات الجينات1،3،9،10. وأوضح ماكغيل وبلايت11 الاختلافات سلالة في سلوكيات التزاوج الماوس. على سبيل المثال، C57BL/6 الذكور عادة الحصول على الانطوان بسرعة والقذف في حوالي 20 دقيقة11. DBA/2 الذكور بطيئة في الحصول على الانطوان ولكن القذف بسرعة. BALB / ج الذكور بطيئة لتحقيق القذف (متوسط الكمون من 1 ح) بسبب فترة طويلة من المغازلة11. التستوستيرون يسهل ويحافظ على السلوك الجنسي الذكور2, والتغيرات في مستويات هرمون تستوستيرون يمكن أن تغير أداء السلوك الجنسي12. يمكن أن يقلل كل من الإخصاء الجراحي وعلاج مضادات الاندروجين من مستوى هرمون التستوستيرون ويؤدي إلى انخفاض سريع في السلوكيات الجنسية وحتى الدافع الجنسي والإثارة الجنسية13. التستوستيرون تدار يمكن استعادة السلوكيات precopulatory وcopulatory في الفئران مخصي. وأخيرا، عرض الفئران بالضربة القاضية وضربة قاضية الاختلافات في جوانب السلوكيات الجنسية بالمقارنة مع الفئران نوع البرية. على سبيل المثال ، الفئران الذكور مع الطفرات المستهدفة من Adcy3 ، Cnga2 ، وGnao يحمل انخفاض القدرة على الكشف عن الفيرومونات ، في حين أن الفئران Trpc2 بالضربة القاضية تظهر تفضيل الشريك المتغير14،15،16. يتم شرح الآثار الأخرى من المعدلة وراثيا والضربات القاضية على السلوك الجنسي للفئران من قبل كراولي3.
هنا ، واحدة من الإجراءات الأكثر شيوعا لتقييم السلوك الجنسي في الاقتران من الفئران الذكور مع أنثى المبيضين التي تم تستعد هرمونيا لتكون متقبلة. يتم تقديم بروتوكول تجريبي لإجراء تجارب السلوك الجنسي في الفئران. بالإضافة إلى ذلك ، يظهر مثال على تغيير أنماط السلوك الجنسي الناتجة عن العزلة الاجتماعية في الفئران CD-1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع التجارب وفقا ً للمبادئ التوجيهية لمبادئ رعاية الحيوانات المختبرية (منشور المعاهد القومية للصحة رقم 80-23، المنقح لعام 1996) وتحت موافقة وإشراف أكاديمية مركز الحيوانات التجريبي التابع لمعهد الطب الطبي تطوير النباتات (الصين).
1- تربية الحيوانات
- منزل الفئران الإناث والذكور في 25 درجة مئوية ل12 ساعة الضوء / 12 ساعة دورات الظلام.
- توفير إمكانية الوصول المجاني إلى المياه واتباع نظام غذائي قياسي.
- السماح للفئران بالتكيف مع بيئتها لمدة 7 أيام قبل العملية إذا تم نقلها من منشأة مختلفة.
2. استئصال المبيضين في الفئران الإناث
- تفنيع الأنثى (8 أسابيع بعد الولادة، ولا تقل عن 6 أسابيع) مع الإيفورلوران (~ 4-5٪ للتحريض، ~ 1-2٪ للصيانة) في الأكسجين بنسبة 100٪ عن طريق قناع مخروط الوجه.
- تأكد من أن العمق المناسب للتخدير قد تحقق من خلال التأكد من عدم وجود حركات طوعية لأكثر من 30 عامًا ، جنبًا إلى جنب مع معدل تنفسية مناسب (على سبيل المثال ، نفسواحد لكل 2 s أو أكثر). بدلا من ذلك، اختبار استجابة الماوس للضغط لطيف على أقدام الكفوف الخلفية.
ملاحظة: معدل التنفس الطبيعي هو ~ 180/min. انخفاض معدل 50٪ مقبول أثناء التخدير17.- استخدام مرهم العيون لمنع جفاف القرنية وصدمة العين أثناء التخدير.
- الحفاظ على درجة حرارة الجسم من الماوس في أو فوق 36 درجة مئوية. توفير دعم حراري تكميلي خلال فترة التخدير عند الضرورة.
- تعقيم وتطهير جميع الأدوات الجراحية والأسطح الصلبة من طاولة العمليات مع الإيثانول 75٪ قبل الاستخدام.
- ضع الحيوان على ستارة معقمة.
- الفرون الحليق ثنائيا فوق العمود الفقري القطني على الجزء الخلفي من الماوس لفضح الجلد.
- تعقيم الجلد المكشوف بالإيثانول بنسبة 75%.
- جعل شق خط وسط واحد (حوالي 0.5 سم في الطول) على ظهره من وسط جذور الفخذين نحو رأس ~ 1 سم المسافة (يظهر الموقف في الشكل 1).
- استخدام مقص صغير لاختراق الجلد لتحرير الأنسجة تحت الجلد بلطف من العضلات الكامنة من أجل فضح طبقة العضلات.
- حدد موقع المبيض تحت طبقة العضلات الرقيقة واصنع شقًا صغيرًا (حوالي 5 مم في الطول) للدخول إلى التجويف الرُمي.
- استخدم ملاقط صغيرة لسحب الأنسجة قليلاً على الجانب الأيسر من تجويف البطن لإظهار التفاف المبيض الأيسر حول الأنسجة الدهنية البيضاء (كتلة شفافة وغير منتظمة كما تراها العين المجردة ، انظر الشكل 1).
- سحب وسادة الدهون المبيض المحيطة المبيض مع ملقط حادة لفضح oviduct.
- قم بإجراء رباط واحد حول القناة الهوائية لمنع النزيف.
- استخدام مقص صغير لقطع oviduct بلطف وإزالة المبيض.
- تحقق من المبيض بعناية للتأكد من إزالة جميع أنسجة المبيض. المبيض حوالي 5 ملم × 4 ملم × 3 ملم مع العقيدات غير النظامية على السطح.
- ضع الجزء المتبقي من المبيض مرة أخرى في تجويف البطن.
- خياطة طبقة العضلات مع الغرز القابلة للامتصاص.
- اسحب الجلد إلى الجانب الأيمن لكشف طبقة العضلات على الجانب الأيمن وإزالة المبيض الأيمن عن طريق تكرار الخطوات 2.9-2.16.
- أغلق شق الجلد باستخدام الغرز القابلة للامتصاص.
- حقن كل فأر داخل النبلانمع مع الصوديوم (10،000 وحدة / 10 غرام لكل فأرة) لمنع العدوى.
- حقن الليدوكائين (4 ملغ/كغ، 0.4 مل/كغ من محلول 1%) تحت الجلد على طول موقع الشق. كما توفر ايبوبروفين (50-60 ملغ / كغ / يوم؛ 10 مل من موترين الأطفال في 500 مل من الماء) بشكل مستمر في مياه الشرب لمدة 3 أيام لعلاج الألم.
- وضع كل فأر في قفص تعقيم على حدة.
- إبقاء تحت مراقبة وثيقة لمدة 1-2 ساعة تقريبا حتى يتعافى تماما من التخدير.
- استعادة الحيوانات على مناشف ورقية في قفص نظيف دون الفراش. تقلل هذه الخطوة من خطر انسداد القصبة الهوائية أو الالتهاب الرئوي. توفير دعم حراري تكميلي أثناء التعافي من التخدير. مراقبة موقع الجراحة لمنع تمزق الجرح.
- بعد فترة النقاهة (حوالي 24 ساعة بعد الجراحة) ، ضع الفئران مرة أخرى إلى قفصها المنزلي.
- لا تقم بإجراء التجربة لمدة أسبوعين على الأقل بعد الجراحة.
3. هرمون الناجمة عن estrus في الإناث
- تحديد مرحلة estrous من الإناث من خلال إجراء مسحة المهبل كما هو موضح في ماكلينوآخرون. لا يوجد تغيير في دورة estrus يشير إلى أن استئصال المبيض للأنثى كان ناجحًا.
- حقن بنزوات استراديول (20 ميكروغرام لكل فأر، حلفي في 0.1 مل من زيت الزيتون المعقم، داخل الانفيتيوني) 48 ساعة قبل اختبار السلوك الجنسي.
- حقن البروجسترون (500 ميكروغرام لكل فأر، حل في 0.1 مل من النفط، داخل العينية) 4 ساعة قبل اختبار السلوك الجنسي.
ملاحظة: يتم تحديد أهلية أنثى الإسترو من قبل الأنثى قبول إدخال الأعضاء التناسلية للفأر الذكر 3 مرات أو أكثر، عندما تتعايش مع ذكر نشط جنسيا ً وذو خبرة في قفص واحد.
4. التحضير لاختبار السلوك الجنسي
- إجراء اختبار السلوك الجنسي للفئران الذكور في مربع حقل مستطيل ومفتوح (40 سم × 40 سم × 40 سم) مع جدران زجاج شبكي أسود ، باستثناء جدار أمامي شفاف يسمح بمراقبة حركة الماوس.
- تعيين إضاءة الغرفة العامة إلى 650 لوكس.
ملاحظة: لا ينبغي أن تكون مضيئة الفئران مباشرة لتجنب أنماط السلوك غير طبيعية. - استخدم كاميرا رقمية مرتبطة بكمبيوتر لتصوير حركة الفئران وسلوكها بالفيديو.
- إجراء الاختبار السلوكي على الفئران الذكور خلال الساعات الأولى من الدورة المظلمة.
5- التعود
- أبقي غرفة التجارب هادئة.
- ضع الفئران ليتم اختبارها في وسط مربع الحقل المفتوح ، مما يسمح لها باستكشاف البيئة بحرية لمدة 30 دقيقة.
- معتاد الفئران لمدة 2 أيام متتالية قبل يوم الاختبار في الجهاز لمنع الإجهاد من البيئة الجديدة.
ملاحظة: يجب على الفئران التحرك واستكشاف بحرية دون الشعور بالتوتر. يجب أن تعتاد الفئران الذكور والإناث على بيئة الاختبار.
6. الاختبارات السلوكية
- قم بتشغيل الكاميرا قبل بداية الاختبار.
- ضع الماوس ليتم اختباره في وسط الحقل المفتوح في مربع الاختبار ، مما يسمح بالاستكشاف المجاني لمدة 5 سنوات للتأقلم مع البيئة.
- وضع أنثى في estrus في مربع الاختبار.
- تسجيل السلوكيات الاجتماعية والتزاوج والتفاعلات بين الفئران الذكور والإناث لمدة 30 دقيقة.
- قم بإيقاف تشغيل الكاميرا وتأكد من حفظ الفيديو.
- أخرج الأنثى من صندوق الاختبار وسجل تكوين قابس مهبلي.
ملاحظة: لا يمكن استخدام الماوس الأنثوي الذي قبل التزاوج في اختبار سلوك جنسي آخر في يوم واحد. - ضع الأنثى إلى قفصها المنزلي.
- أعد الذكر إلى قفصه المنزلي
- تنظيف البول والبراز والحشو داخل الجهاز.
- إزالة رائحة الفئران اختبارها مع الإيثانول 75٪.
- ابدأ اختبار الماوس الذكر التالي بتكرار الخطوات 6.1-6.10.
7. استخراج البيانات السلوكية
- تشغيل تسجيل الفيديو واستخراج المعلمات السلوكية (انظر الشكل 2).
- سجل عدد يتصاعد في 30 دقيقة.
- سجل عدد المقدمات في 30 دقيقة عد دفعة الحوض كمقدمة.
- سجل الوقت من إدخال الأنثى إلى أول تصاعد كما الكمون المتصاعد.
- تسجيل الوقت من إدخال الأنثى إلى أول استلمانة التقديم.
- سجل الوقت من أول استهتار إلى القذف الأول كما الكمون القذف.
- سجل الوقت من القذف إلى تركيب المقبل كما بعد الكمون جبل ما بعد القذف.
- رقم قياسي من سلسلة copulatory في 30 دقيقة. سلسلة copulatory هو كل تسلسل من تصاعد للقذف.
- سجل وقت جميع سلسلة copulatory في 30 دقيقة كمدة لسلسلة copulatory.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تظهر مقارنة السلوك الجنسي بين فئران CD-1 التي تربى في عزلة وفئران CD-1 التي تم إسكانها جماعيًا. تم تعيين فئران CD-1 الذكور بشكل عشوائي في مجموعة تربى العزل (IS، فأر واحد لكل قفص، n = 30) ومجموعة تضم مجموعة (GH، خمسة فئران لكل قفص، n = 15). خضعت الفئران لعزلتربية من يوم ما بعد الولادة 23 إلى اليوم 93. ثم، تم تقييم كلتا المجموعتين من الفئران للسلوك الجنسي. وجدت دراستنا أن معدل نجاح الجماع يميل إلى أن يكون أقل في مجموعة IS منه في مجموعة GH (IS: 80.0٪، GH: 86.7٪)، على الرغم من أنه لم يلاحظ فرق مهم إحصائيًا بين المجموعات (p = 0.458). كان زمن الوصول المتصاعد أطول في مجموعة IS منه في مجموعة GH (p = 0.002 ، الشكل 3A)، مما يشير إلى أن السابق يتطلب المزيد من الوقت لبدء السلوك الجنسي. كان زمن الاستجابة للاستنفاذ أطول في مجموعة IS منه في مجموعة GH (p = 0.015، الشكل 3B)،مما يشير إلى أن الأول يتطلب وقتًا أطول لإجراء إدخال القضيب في مهبل الأنثى. لم يلاحظ أي فرق مهم إحصائياً بين المجموعتين من حيث زمن القذف وزمن الوصول إلى جبل ما بعد القذف. كانت مدة سلسلة copulatory أقصر في مجموعة IS مما كانت عليه في مجموعة GH (p = 0.002، الشكل 3C). ولم تلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعتين من حيث عدد اليتصاعد، وعدد المقدمات، وعدد السلسلة المتعددة الحلقات19 (انظر الجدول 1).
| عزل تربى | مجموعة السكن | ر / ر' | ف | |
| ن | 30 | 15 | ||
| تركيب الكمون أ | 788.70 ± 262.77 | 365.03 ± 288.65 | -3.87 | 0.002 |
| زمن الاستجابة للاستراحة | 937.30 ± 369.87 | 542.94 ± 352.40 | -2.75 | 0.015 |
| زمن وصول القذف | 16.58 ± 9.78 | 17.37 ± 13.03 | -0.2 | 0.845 |
| زمن الوصول إلى جبل ما بعد القذف | 173.00 ± 89.84 | 192.87 ± 106.91 | 0.58 | 0.565 |
| مدة سلسلة copulatory | 88.27 ± 52.40 | 151.65 ± 40.87 | 3.44 | 0.002 |
| عدد من يتصاعد ب | 2.4 ± 2.0 | 3.3 ± 3.3 | 1.09 | 0.282 |
| عدد المقدمات | 20.1 ± 12.9 | 22.6 ± 12.3 | 0.58 | 0.564 |
| عدد المسلسلات التعاونية | 7.0 ± 4.3 | 9.3 ± 4.6 | 1.55 | 0.131 |
| يعني ± SD؛ وحدة هي الثانية (ثانية). ب وحدة هي التهم. | ||||
الجدول 1: المعلمات السلوكية الجنسية للفئران التي تربى في العزل وتؤوي المجموعة.
الشكل 1: استئصال المبايض للفئران الإناث. يتم عرض موضع الشق الرأسي والمبيض الأيمن. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: عملية السلوك الجنسي للفئران. يشير السهم الأحمر إلى الأنثى والسهم الأصفر يشير إلى الذكر. (أ)شم الذكر للمناطق التناسلية في بداية السلوك الجنسي. (ب)الذكور تصاعد الأنثى. (ج)وضعية التبطّن للذكر. (د)قذف الذكر. (هـ)الذكور يجهزون المناطق التناسلية بعد القذف. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: نتائج اختبار السلوك الجنسي. (أ)مؤامرة مربع من الكمون المتصاعد من الفئران IS وGH. (ب)مؤامرة مربع من الكمون استراحة من الفئران IS و GH. (ج)إجمالي مدة التزاوج لفئران IS وGH. *ص < 0.05، **p < 0.01. وقد تم تعديل هذا الرقم من ليو وآخرون19. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هناك بعض الخطوات الهامة في البروتوكول المقدم. فيما يتعلق باستئصال المبيض للإناث ، فإن فتحة شق الجراحة من الظهر أقل ضررًا من ذلك من البطن. وبالنظر إلى أن وضع المبيض عميق ، فإن سحب الأعضاء الأخرى عندما يتم قطع الشق مفتوحًا من البطن غالبًا ما يؤدي إلى النزيف ويؤدي إلى رؤية جراحية غير واضحة20. قمنا بإجراء الشق على الظهر للوصول إلى المبيض بسهولة وتقصير الوقت الجراحي ، وكذلك لضمان سلامة الجراحة.
الحفاظ على الظروف المعقمة أثناء الجراحة مهم للبقاء على قيد الحياة. يتم النظر في أربعة متغيرات رئيسية أثناء العملية الجراحية: المساحة الجراحية ، والأدوات ، والجراح ، والحيوان. بالنسبة للمساحة الجراحية ، بما في ذلك مساحات العمل والغرف الجراحية ، يتم تنظيف جميع الأسطح الضرورية وتطهيرها بالمطهرات المناسبة (على سبيل المثال ، التبييض المخفف ، منتجات بيروكسيد الهيدروجين) قبل الجراحة. بالإضافة إلى ذلك، ينصح بالبخار المضغوط مع الأوتوكلاف. خلال العملية الجراحية، يكون تدفق حركة المرور محدودًا في غرفة الجراحة. في العملية الجراحية ، يجب استخدام الأدوات والمواد المعقمة حديثًا لكل الحيوانات. وعندما تقع الأدوات خارج الحقل المعقم أو تصبح ملوثة، ينبغي استبدالها على الفور. وفي الوقت نفسه، بعد غسل / تنقية اليدين والذراعين بدقة، الجراحين بحاجة إلى ارتداء جميع الملابس المعقمة، بما في ذلك ثوب معقم وقفازات جراحية معقمة. إذا كانت أي مادة ملوثة ، يجب تغيير المادة المصابة مباشرة قبل الجراحة (على سبيل المثال ، ثوب جديد أو قفاز جراحي). وأخيرا، ينبغي إزالة الشعر من موقع الجراحة والمنطقة المحيطة بها لمنع التلوث. يجب تنظيف الجلد بالإيثانول بنسبة 75% بعد إزالة الشعر. يمكن استخدام القصاصات الكهربائية أو كريم إزالة الشعر لإزالة الشعر. قبل الجراحة ، يتم وضع ستارة معقمة على الحيوان مما يسمح بالوصول إلى موقع الجراحة للوقاية من التلوث.
ثلاثة جوانب من العلاج بعد الجراحة للحيوانات تتطلب الاهتمام: الانتعاش التخدير، والمسكنات ومراقبة الموقع الجراحي، وإزالة خياطة. عند الانتهاء من العملية الجراحية ، يجب مراقبة الحيوانات أثناء التعافي من التخدير. لا ينبغي ترك الحيوان دون مراقبة حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الرُكَب الرُقّي، ولا ينبغي إعادته إلى صحبة الحيوانات الأخرى حتى يتعافى تمامًا. وبالإضافة إلى ذلك، يجب توفير ظروف استرداد ملائمة، بما في ذلك بيئة دافئة خالية من الأشياء التي يمكن أن تسبب الضرر. على سبيل المثال، يتم استخدام المناشف الورقية بدلاً من فراش الذرة كوب في استرداد الفئران ويتم إزالة اللعب الكبيرة أو أوعية المياه من الأقلام الحيوانية الكبيرة. وفقا للمبادئ التوجيهية لجامعة مينيسوتا، فإن استئصال المبيض للإناث يسبب آلاممعتدلة إلى شديدة. وهكذا ، يجب أن تدار المسكنات مباشرة بعد العملية الجراحية عن طريق الحقن بالحقن أو الغاغ عن طريق الفم21. في هذه الدراسة، تم إجراء حقن الليدوكائين تحت الجلد بعد الجراحة والمياه التي تحتوي على ايبوبروفين تدار لمدة 1-2 أيام على الأقل لعلاج الألم. ومع ذلك ، يجب استشارة الطبيب البيطري في تطوير الخطة المسكنة. وأخيراً، يجب مراقبة صحة الحيوان بعد الجراحة وموقع الجراحة وتسجيلها لمدة لا تقل عن 3 أيام. يتم استخدام خط التشغيل أو مقاطع الجرح لخياطة الشق ، والتي يجب إزالتها من الجلد بعد 7-14 يومًا من الجراحة21. في هذه الدراسة ، تم استخدام خط قابل للامتصاص لخياطة الشق لتجنب إزالة الخياطة.
تم التحكم في estrus الأنثى بشكل مصطنع مع استئصال المبيض واستخدام الهرمونات ، بدلاً من استخدام أنثى ذات estrus الطبيعية. وقد اتخذت هذه الخطوة لضمان اتساق التقبل الجنسي للأنثى في الاختبار وضمان موثوقية القياسات عند مراقبة سلوك التزاوج الذكور. وعلاوة على ذلك، يمكن إعادة استخدام الأنثى المستحثة بالهرمونات في مجموعة من التجارب، ويتم منع تأثير الحمل. يتم حث استروس في الأنثى عن طريق حقن بنزوات استراديول والبروجسترون قبل التجربة. هذا الأسلوب هو سهل لإدارة، لديها نسبة نجاح عالية، ويمكن الحصول على الإناث estrus متعددة في نفس الوقت، وبالتالي تحسين كفاءة الاختبار بشكل كبير.
الفئران الساذجة جنسيا وذوي الخبرة تظهر أنماط السلوك المختلفة. وينبغي إيلاء الاهتمام لموثوقية التجربة في مختلف مراحل تطور الفئران. يجب النظر في التغيير الديناميكي في السلوك الجنسي قبل إجراء الاختبار وفي مرحلة التصميم التجريبي. في هذه الدراسة ، تم استخدام الذكور الساذجين جنسيًا لاختبار السلوك الجنسي وتم قياس أول حدث فقط للسلوك الجنسي دون أي تدريب قبل الاختبار. Copulation هو النتيجة النهائية لسلسلة من الكشف عن الفيرومون، وتركيب، والاستقراء، والقذف. هناك قيود على البروتوكول التجريبي الحالي عند تطبيقها على الفئران المتحولة. على سبيل المثال، الفئران الذكور مع الطفرات المستهدفة من Adcy3، Cnga2، وغناو انخفاض القدرة على الكشف عن الفيرومونات14،15،16،في حين أن الفئران Trpc2 خروج المغلوب تظهر تفضيل شريك تغيير22. قد لا يكون البروتوكول الحالي قادرًا على إظهار السلوك الجنسي للفئران المتحولة بسبب انخفاض قدرته على اكتشاف الفيرومونات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
نشكر لو كونغ، وتشانغ هونغ شيا، وتشانغ بييو، وهو مي على اقتراحاتهم للتجارب.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Choral hydrate | Sinopharm Chenmical Reagent Co., Ltd. | 20160225 | |
| Coated VICRYL Plus Sutures | Ethicon, Inc. | missing | |
| Estradiol benzoate | J&K Scientific, Ltd. | L930Q170 | |
| Ethanol absolute | Beijing Chemical Works Co., Ltd. | 20160715 | |
| Ibuprofen (Children's Motrin) | Shanghai Johnson & Johnson Co., Ltd. | 160629478 | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co., Ltd. | 217180501 | |
| Lidocaine | HebeI Tiancheng Pharmacreutical Co., Ltd. | 1170506107 | |
| Male and female CD-1 mice | Vital River Beijing | SCXK( )2013-0023 |
|
| Olive oil | |||
| Penicillin sodium | North China Pharmaceutical Co., Ltd. | F5126420 | |
| Progesterone | J&K Scientific, Ltd. | LR50Q07 | |
| Sony digital camera | Sony Corporation | HDR-CX290E | |
| Test box | DIY | ||
| ThinkStation Computer | Lenovo | S/N PCOGLQKG | |
| Vaporizer for Isoflurane | RWD Life Science Co., Ltd. | E05904-009M |
References
- The staff of the Jackson laboratory. Biology of the Laboratory Mouse. , Second Edition, Dover publications, inc. New York. Chapter 11 (2007).
- Burns-Cusato, M., Scordalakes, E. M., Rissman, E. F. Of mice and missing data: what we know (and need to learn) about male sexual behavior. Physiology & Behavior. 83 (2), 217-232 (2004).
- Crawley, J. N. What's Wrong With My Mouse?. , Second Edition, John Wiley & Sons, Inc. (2006).
- Whishaw, I. Q., Haun, F., Kolb, B. Analysis of Behavior in Laboratory Rodents. Modern Techniques in Neuroscience Research. Windhorst, U., Johansson, H. , Springer. Berlin, Heidelberg. (1999).
- Sachs, B., Barfield, R. Functional Analysis of Masculine Copulatory Behavior in the Rat. 7, (1976).
- Hull, E. M., Dominguez, J. M.
- Mosig, D. W., Dewsbury, D. A. Studies of the copulatory behavior of house mice (Mus musculus). Behavioral Biology. 16 (4), 463-473 (1976).
- Park, J. H. Assessment of Male Sexual Behavior in Mice. Mood and Anxiety Related Phenotypes in Mice. Gould, T. 63, Humana Press. (2011).
- Bonthuis, P. J., et al. Of mice and rats: key species variations in the sexual differentiation of brain and behavior. Frontiers in Neuroendocrinology. 31 (3), 341-358 (2010).
- Levine, L., Barsel, G. E., Diakow, C. A. Mating behaviour of two inbred strains of mice. Animal Behavior. 14 (1), 1-6 (1966).
- McGill, T. E. Sexual Behavior in Three Inbred Strains of Mice. Behaviour. 19 (4), 341 (1962).
- James, P. J., Nyby, J. G. Testosterone rapidly affects the expression of copulatory behavior in house mice (Mus musculus). Physiology & Behavior. 75 (3), 287-294 (2002).
- Arteaga-Silva, M., Rodriguez-Dorantes, M., Baig, S., Morales-Montor, J. Effects of castration and hormone replacement on male sexual behavior and pattern of expression in the brain of sex-steroid receptors in BALB/c AnN mice. Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Molecular & Integrative Physiology. 147 (3), 607-615 (2007).
- Zhang, Z., et al. Deletion of Type 3 Adenylyl Cyclase Perturbs the Postnatal Maturation of Olfactory Sensory Neurons and Olfactory Cilium Ultrastructure in Mice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 1 (2017).
- Mandiyan, V. S., Coats, J. K., Shah, N. M. Deficits in sexual and aggressive behaviors in Cnga2 mutant mice. Nature Neurosciemce. 8 (12), 1660-1662 (2005).
- Choi, C. I., et al. Simultaneous deletion of floxed genes mediated by CaMKIIalpha-Cre in the brain and in male germ cells: application to conditional and conventional disruption of Goalpha. Experimental & Molecular Medicine. 46, 93 (2014).
- Pelch, K. E., Sharpe-Timms, K. L., Nagel, S. C. Mouse model of surgically-induced endometriosis by auto-transplantation of uterine tissue. Journal of Visualized Experiments. (59), e3396 (2012).
- McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. Journal of Visualized Experiments. (67), e4389 (2012).
- Liu, Z. W., et al. Postweaning Isolation Rearing Alters the Adult Social, Sexual Preference and Mating Behaviors of Male CD-1 Mice. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13, 21 (2019).
- TIan, E. P., Long, T., Qin, D. N. Establishment and applications of mating model in male rat. Chinese Journal of Andrology. 22 (1), 7-10 (2008).
- University of Minnesota Academic Health Center Research Service. Anesthesia Guidelines: Mice. , Available from: https://www.researchservices.umn.edu/services-name/research-animal-resources/research-support/guidelines/anesthesia-mice (2019).
- Leypold, B. G., et al. Altered sexual and social behaviors in trp2 mutant mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (9), 6376-6381 (2002).
