Summary
本文介绍如何在雄性小鼠身上进行性行为测试。
Abstract
性行为是高度物种特异性。虽然啮齿动物的性行为略有不同，但老鼠有相似的性行为模式。本文旨在描述激素引起的雌性细胞化女性模型和雄性小鼠性行为评估的实验程序。最重要的性行为元素在视频和插图中得到证明。还解释了性行为测试的关键步骤、优点和局限性。最后，给出了行为参数，并区分了交配中的安装、内向和射精过程。行为参数根据在测试期间发生的持续时间和计数进行评估。
Introduction
成熟雄性小鼠的性行为是不同大脑回路中一系列相关和相互依存的荷尔蒙系统和神经系统相互作用的结果1。它还需要发展经验、学习、背景和适当的合作伙伴。行为分析是神经或神经神经功能的重要反映。因此，动物模型的性行为研究已广泛应用于行为神经科学等相关研究中。啮齿动物性行为的类表已被许多文章和书籍1，3，4解释。例如，斯卡斯和巴菲尔德对大鼠5的性行为的描述帮助理解了小鼠5的类似行为模式。鼠标是行为研究最常用的主题之一。赫尔等人对雄性小鼠的性行为进行了详细的介绍：当雄性小鼠遇到雌性时，它开始调查雌性小鼠的生殖器区域。然后，男性按前爪对女性的侧翼，从后方安装女性。女性表现出典型的性接受姿势，将脊柱弯曲成弓，将尾巴移到身体的一侧，露出男性性渗透的开口（即领口）。安装后，男性进行快速、浅骨盆推力，然后进行缓慢而深的阴道推力。经过无数次的接种，一个持久的推力导致精液射精，在此期间，雄性小鼠可以冻结约25s之前，从雌性6。在射精时，雄性小鼠附属腺可产生含有精液的混合物，这种混合物会硬化成刺激塞。最后，射精后，男性开始生殖器梳理，并表现出对女性缺乏兴趣。简而言之，男性性行为的基本顺序包括嗅探、跟踪、安装、内化、射精和射精后梳理。老鼠性行为表现出应变差异。例如，射精延迟从594到6943s不等，入院人数从5个到100个以上不等。射精后延迟范围从17至60分钟。然而，引入一个新颖的女性可以减少这个时间间隔。在某些情况下，男性射精在第一次介绍与新的女性7。
评估性行为的主要事件是增加、介绍和射精。行为科学家建议不仅测量每个动作的频率，而且测量其延迟和时间间隔5，8。过去研究中的一些主要测量指标包括：安装次数、入院次数、安装延迟、延迟、射精延迟、射电后安装延迟（或接种后间隔）、按摩后住院延迟、共支系列数和共支序列的持续时间。Park等人8和Sachs等人5描述了如何识别啮齿动物的安装、介绍和射精的每个作用。安装的定义是男性从后方安装女性，用前腿拍打她的侧翼，并快速和反复地推力他的阴茎，没有阴茎插入。内省，也称为插入，由以下一种或多种行为确定：快速浅推力后长而深的推力，一个后腿的快速踢，以及男性从女性明显横向退出。射精由一个终端骨盆推力识别，比内向和后腿高程减少的速度慢、更深。从安装到射精的每个序列都确定了共支序列。本研究中使用的行为参数定义如下：1）安装延迟：从引入女性到首次安装男性的时间;2）介绍延迟：从引入女性到第一次介绍的时间;3）射精延迟：从第一次接种到第一次射精的时间（一般遵循最后骨盆推力）;4）射精后安装延迟：从射精到下一次安装的时间;5） 射精后介绍延迟：从射精到下一次的接种时间;6）安装次数：首次射精前的安装时间数;7）入院次数：第一次射精前的介绍次数;8）共合系列的数量：观察期间共合序列的数量;9）共合序列的持续时间：观察期间所有共合序列的时间。
性行为和相关行为可以在男性的家庭笼子或封闭的竞技场进行，其中介绍一种叫做里斯曼的"无秘密"镜盒的装置来观察交配行为3。摄像机放置在盒子前面，以同时记录从横向视图和从心室视图的倾斜镜镜中小鼠的动作。然而，这种方法需要明亮的灯光，这不可避免地导致更长的居住时间，以消除小鼠的环境压力。在测量方法方面，建议对基于视频的行为进行分析，以记录和量化行为4。具有逐帧视频前进选项、建议快门速度大于 1/1000 s 的录像机可用于记录鼠标的快速移动。在黑暗的环境中录制时，高分辨率红外摄像机是必需的。要分析胶片，需要使用帧抓取器的计算机，以便捕获单个行为帧以进行计算机操作。小鼠用途极多，在几乎任何治疗后都能表现出补偿行为。模糊性可能存在于每个移动的身体第4部分。因此，分析某些行为可能需要更高的分辨率和更高速的摄像机。
小鼠的男性性行为受多种因素影响，包括菌株差异、激素变化和基因突变体1、3、9、10。麦吉尔和布莱特11说明了小鼠交配行为中的应变差异。例如，C57BL/6雄性通常快速获得内向和射精在大约20分钟11。DBA/2 男性获得内省速度很慢，但射精速度很快。BALB/c男性缓慢实现射精（平均延迟1小时），由于长期求爱11。睾丸激素促进和维护男性性行为2，睾丸激素水平的变化可以改变性行为表现12.手术割礼和抗雄激素治疗可以降低睾丸激素水平，并导致性行为，甚至性动机和性兴奋迅速下降13。施用的睾丸激素可以恢复在割礼小鼠的预刺激和共亲行为。最后，与野生型小鼠相比，淘汰和击倒小鼠在性行为方面存在差异。例如，具有Adcy3、Cnga2和Gnao靶向突变的雄性小鼠检测信息素的能力降低，而Trpc2敲除小鼠表现出改变的伙伴偏好14，15，16。克劳利3解释了转基因和敲除对小鼠性行为的其他影响。
在这里，描述了评估雄性小鼠与卵巢细胞化女性配对时性行为的最常见程序之一，该女性已被激素准备接受。提出了在小鼠进行性行为实验的实验方案。此外，还展示了CD-1小鼠社会隔离引起的性行为模式改变的一个例子。
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Protocol
所有实验都是按照《实验室动物护理原则》（NIH第80-23号出版物，1996年修订）的指导方针进行的，并在医学研究所实验动物中心委员会的批准和监督下进行。工厂开发（中国）。
1. 畜牧业
- 在25°C下容纳雌性小鼠和雄性小鼠，温度为12小时光/12小时暗循环。
- 提供免费用水和标准颗粒饮食。
- 如果从其他设施运输，允许小鼠在手术前 7 天适应其环境。
2. 雌性小鼠的卵巢切除术
- 通过面锥面膜将雌性（产后8周，6周大）与同一雌性麻醉（诱导4~5%，维护1~2%）。
- 检查是否达到了适当的麻醉深度，确保超过30s没有自愿运动，同时结合适当的呼吸速率（例如，每2 s或更长呼吸1次）。或者，测试鼠标对后爪脚趾的温和压力的反应。
注：正常呼吸速率为+180/分钟。麻醉期间，50%的率下降是可以接受的。- 使用眼科药膏，防止角膜干燥和眼外伤，而麻醉。
- 将鼠标的体温保持在 36 °C 或以上。必要时在麻醉期间提供补充热支持。
- 使用前用75%乙醇对手术台的所有手术器械和硬表面进行消毒和消毒。
- 把动物放在无菌窗帘上。
- 在老鼠的背上，将毛皮双发在腰椎上，露出皮肤。
- 用75%的乙醇对暴露的皮肤进行消毒。
- 从两个大腿根的中心朝 ±1 厘米距离的头部（如图所示），在背面进行单个中线切口（约 0.5 厘米长）。
- 使用小剪刀穿透皮肤，从底层肌肉中轻轻释放皮下组织，以暴露肌肉层。
- 找到薄肌肉层下的卵巢，并做一个小切口（约5毫米长），以获得进入圆锥腔。
- 使用小钳子将组织稍微拉在腹腔左侧，以显示在白色脂肪组织周围包裹的左侧卵巢（肉眼看到的半透明、不规则的质量，见图1）。
- 用钝力收回卵巢周围的卵巢脂肪垫，以暴露排卵管。
- 在排卵管周围执行单个连字，以防止出血。
- 使用小剪刀轻轻切断排卵并去除卵巢。
- 仔细检查卵巢，确认所有卵巢组织都已切除。卵巢约 5 毫米 × 4 毫米 × 3 毫米，表面结节不规则。
- 将排卵的剩余部分放回腹腔。
- 用可吸收的缝合缝合肌肉层。
- 将皮肤拉到右侧，露出右侧的肌肉层，并通过重复步骤 2.9_2.16 去除右卵巢。
- 使用可吸收缝合线关闭皮肤切口。
- 向每只小鼠注射青霉素钠（每只小鼠10，000单位/10克），以防止感染。
- 沿切口部位在皮肤下方注射利多卡因（4毫克/千克，0.4 mL/kg溶液）。还提供布洛芬（50~60毫克/千克/天;10mL的儿童Motrin在500mL水中）连续在饮用水中持续3天进行疼痛治疗。
- 将每只小鼠单独放入消毒笼中。
- 保持密切观察约1⁄2小时，直到完全从麻醉中恢复。
- 用纸巾将动物放在干净的笼子里，没有床上用品。此步骤将气管阻塞或肺炎的风险降至最低。在麻醉恢复期间提供补充热支持。监控手术部位，防止伤口破裂。
- 恢复期过后（手术后约24小时），将小鼠放回家中的笼子。
- 手术后至少2周不要进行实验。
3. 女性激素诱导的雌性雌性雌性
- 通过进行阴道涂片，如麦克莱恩等人18所述，确定女性的最刺激阶段。没有雌性周期变化表明女性的卵巢切除术是成功的。
- 注射雌二醇苯甲酸酯（每只小鼠20微克，溶解在0.1 mL消毒橄榄油中，内腹）48小时前进行性行为测试。
- 在性行为测试前4小时注射黄体酮（每只小鼠500微克，溶解在0.1 mL油中，内腹） 4小时。
注：雌性小鼠的资格由女性接受男性小鼠生殖器插入3次或3次以上，当她们与性活跃和有经验的男性在一个笼子里同居时，由她们决定。
4. 准备性行为测试
- 在带有黑色Plexiglass墙壁的矩形和开放式场盒（40 厘米 x 40 厘米 x 40 厘米）中对雄性小鼠进行性行为测试，但允许观察小鼠运动的透明前墙除外。
- 将一般房间照明设置为 650 lux。
注：不应直接照亮小鼠，以避免异常行为模式。 - 使用连接到计算机的数码相机来录影鼠标的运动和行为。
- 在暗周期的最初几个小时对雄性小鼠进行行为测试。
5. 居住
- 保持实验室安静。
- 将要测试的小鼠放在开放式盒子的中心，让他们自由探索环境 30 分钟。
- 在仪器中连续2天对小鼠进行食用，以防止来自新环境的压力。
注：老鼠应该自由移动和探索，而不会感到压力。雄性小鼠和雌性小鼠都需要适应测试环境。
6. 行为测定
- 在测试开始之前打开相机。
- 将要测试的鼠标放在测试箱中的开放字段中央，允许 5 分钟自由探索，以适应环境。
- 将雌性放入测试盒中。
- 记录30分钟的社会和交配行为以及雄性小鼠和雌性小鼠之间的相互作用。
- 关闭摄像机并确认视频已保存。
- 将女性带出测试盒，记录阴道塞的形成。
注：接受交配的雌性小鼠不能在一天内用于另一个性行为测试。 - 把雌性放回笼子里。
- 把雄性送回家里的笼子里
- 清洁仪器内的尿液、粪便和衬垫。
- 用75%的乙醇去除被测试小鼠的气味。
- 通过重复步骤 6.1_6.10 开始测试下一只雄性小鼠。
7. 行为数据提取
- 播放视频录制并提取行为参数（参见图 2）。
- 在 30 分钟内记录装载次数。
- 在30分钟内记录内向次数。
- 将引入母级到首次安装的时间记录为安装延迟。
- 将引入女性到第一次介绍的时间记录为内费延迟。
- 将从第一次介绍到第一次射精的时间记录为射精延迟。
- 将从射精到下一次安装的时间记录为接种后安装延迟。
- 30 分钟内记录的共合系列数量。从安装到射精的每个序列都是一个共支系列。
- 将所有共合系列的时间记录在 30 分钟中作为共合系列的持续时间。
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Representative Results
显示了被隔离饲养的CD-1小鼠和组安置的CD-1小鼠的性行为的比较。雄性CD-1小鼠被随机分配成隔离饲养组（IS，每个笼子一只老鼠，n = 30）和一组组（GH，每个笼子5只老鼠，n = 15）。这些小鼠从产后23天到第93天进行了隔离饲养。然后，对两组小鼠的性行为进行评估。我们的研究发现，在IS组，交配的成功率往往低于GH组（IS：80.0%，GH：86.7%），尽管观察到各组之间没有统计学显著差异（p = 0.458）。IS 组中的安装延迟比 GH 组（p = 0.002，图 3A）长，这表明前者需要更多的时间来发起性行为。在IS组中，内省延迟比GH组（p = 0.015，图3B）长，表明前者需要更长的时间才能将阴茎插入女性的阴道。在射精延迟和射精后安装延迟方面，两组之间没有统计学上显著的差异。在 IS 组中，共吸序列的持续时间比 GH 组长（p = 0.002，图 3C）。在安装次数、介绍次数和共合系列19方面，两组之间没有统计上显著的差异（见表1）。
| 隔离后 | 集团安置 | t/t' | P | |
| N | 30 | 15 | ||
| 安装延迟 a | 788.70 × 262.77 | 365.03 × 288.65 | -3.87 | 0.002 |
| 介绍延迟 | 937.30 × 369.87 | 542.94 × 352.40 | -2.75 | 0.015 |
| 射精延迟 | 16.58 × 9.78 | 17.37 × 13.03 | -0.2 | 0.845 |
| 后射管安装延迟 | 173.00 × 89.84 | 192.87 × 106.91 | 0.58 | 0.565 |
| 共合系列的持续时间 | 88.27 × 52.40 | 151.65 × 40.87 | 3.44 | 0.002 |
| 装载次数 b | 2.4±2.0 | 3.3±3.3 | 1.09 | 0.282 |
| 介绍次数 | 20.1×12.9 | 22.6×12.3 | 0.58 | 0.564 |
| 共合系列数量 | 7.0±4.3 | 9.3×4.6 | 1.55 | 0.131 |
| 均值 = SD;单位为第二（秒）。b 单位是计数。 | ||||
表1：隔离饲养和群体安置小鼠的性行为参数。
图1：雌性小鼠的卵巢切除术。显示了垂直切口和右手卵巢的位置。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：小鼠性行为的过程。红色箭头表示母箭头，黄色箭头表示男性。（A） 男性在性行为开始时嗅探肛门生殖器区域。（B） 男性安装女性。（C） 男性的内向姿势。（D） 男性的射精。（E） 射精后男性梳理生殖器区域。请点击此处查看此图形的较大版本。
图3：性行为测试结果。（A） IS 和 GH 小鼠安装延迟的框图。（B） IS 和 GH 小鼠的介绍延迟的盒形图。（C） IS 和 GH 小鼠的总交配持续时间。=p < 0.05， =p < 0.01.这个数字是从刘等人19号修改的。请点击此处查看此图形的较大版本。
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Discussion
在介绍的协议中有一些关键步骤。关于女性的卵巢切除术，背部的手术切口开口比腹部的切口没有危害。鉴于卵巢的位置是深的，拉其他器官，当切口从腹部切开时往往导致出血，并导致手术视力不明20。我们的背部进行切口，以容易地到达卵巢，缩短手术时间，并确保手术安全。
手术期间维持无菌条件对生存很重要。在外科手术中考虑了四个主要变量：手术空间、器械、外科医生和动物。对于手术空间，包括工作空间和手术室，所有必要的表面在手术前均使用适当的消毒剂（例如稀释漂白剂、过氧化氢产品）进行清洁和消毒。此外，建议使用高压灭菌器加压蒸汽。在外科手术期间，手术室的交通流量受到限制。在外科手术中，新消毒的仪器和材料应该用于每一种动物。当仪器落在无菌场外或受到污染时，应立即更换。同时，在彻底清洗/擦洗手和手臂后，外科医生需要穿上所有无菌服装，包括无菌礼服和无菌手术手套。如果任何材料被污染，受影响的物品需要在手术前立即更换（例如，新礼服或手术手套）。最后，应去除外科部位及周边地区的头发，以防止污染。脱毛后，必须用75%的乙醇擦洗皮肤。电动剪子或脱毛霜可用于去除头发。手术前，动物上放置了无菌窗帘，允许进入手术部位，防止污染。
手术后动物治疗的三个方面需要注意：麻醉恢复、麻醉和手术部位监测以及缝合切除。手术完成后，在麻醉过程中必须监测动物。在动物恢复足够的意识以保持清醒状态之前，不应无人看管，在动物完全康复之前，不应将其送回其他动物的陪伴。此外，必须提供适当的恢复条件，包括温暖的环境，没有可能造成伤害的对象。例如，纸巾代替玉米棒床上用品用于小鼠的回收，大型玩具或水碗从大型动物笔中取出。根据明尼苏达大学的指南，女性的卵巢切除术会导致中度至重度疼痛。因此，肛门必须在术后直接由肠外注射或口服性治疗21。在这项研究中，在手术后对皮肤下注射了利多卡因，并注射了含有布洛芬的水，至少1-2天进行疼痛治疗。然而，在制定镇痛剂计划时，必须咨询兽医。最后，必须观察和记录动物的手术后健康和手术部位至少3天。手术线或伤口夹用于缝合切口，应在手术后7-14天从皮肤中取出切口。在这项研究中，使用了一条可吸收的线来缝合切口以避免缝合。
雌性雌性雌性由卵巢切除术和激素使用人工控制，而不是使用雌性与天然雌性。采取这一步骤是为了确保女性在测试中的性接受性一致性，并确保在监测雄配行为时测量的可靠性。此外，激素诱导雌性雌性可重复使用在一组实验中，并防止怀孕的影响。雌性雌性雌性在实验前通过注射雌二醇苯甲酸酯和孕酮引起。该方法易于管理，成功率高，同时可获得多只雌性，大大提高了测试效率。
性天真和有经验的老鼠表现出不同的行为模式。在小鼠发育的各个阶段，需要注意实验的试验可靠性。在进行试验和实验设计阶段之前，需要考虑性行为的动态变化。在这项研究中，性天真的男性被用于性行为测试，只有第一次发生性行为是在测试前没有任何训练的情况下测量的。交配是一系列信息素检测、安装、和射精的最终结果。当应用于突变小鼠时，本实验协议有局限性。例如，具有Adcy3、Cnga2和Gnao靶向突变的雄性小鼠表现出检测信息素14、15、16的能力，而Trpc2敲除小鼠表现出改变的伙伴偏好22。由于检测信息素的能力降低，本协议可能无法表现出突变小鼠的性行为。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢陆聪、张红霞、张北岳和胡米对实验的建议。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Choral hydrate | Sinopharm Chenmical Reagent Co., Ltd. | 20160225 | |
| Coated VICRYL Plus Sutures | Ethicon, Inc. | missing | |
| Estradiol benzoate | J&K Scientific, Ltd. | L930Q170 | |
| Ethanol absolute | Beijing Chemical Works Co., Ltd. | 20160715 | |
| Ibuprofen (Children's Motrin) | Shanghai Johnson & Johnson Co., Ltd. | 160629478 | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co., Ltd. | 217180501 | |
| Lidocaine | HebeI Tiancheng Pharmacreutical Co., Ltd. | 1170506107 | |
| Male and female CD-1 mice | Vital River Beijing | SCXK( )2013-0023 |
|
| Olive oil | |||
| Penicillin sodium | North China Pharmaceutical Co., Ltd. | F5126420 | |
| Progesterone | J&K Scientific, Ltd. | LR50Q07 | |
| Sony digital camera | Sony Corporation | HDR-CX290E | |
| Test box | DIY | ||
| ThinkStation Computer | Lenovo | S/N PCOGLQKG | |
| Vaporizer for Isoflurane | RWD Life Science Co., Ltd. | E05904-009M |
References
- The staff of the Jackson laboratory. Biology of the Laboratory Mouse. , Second Edition, Dover publications, inc. New York. Chapter 11 (2007).
- Burns-Cusato, M., Scordalakes, E. M., Rissman, E. F. Of mice and missing data: what we know (and need to learn) about male sexual behavior. Physiology & Behavior. 83 (2), 217-232 (2004).
- Crawley, J. N. What's Wrong With My Mouse?. , Second Edition, John Wiley & Sons, Inc. (2006).
- Whishaw, I. Q., Haun, F., Kolb, B. Analysis of Behavior in Laboratory Rodents. Modern Techniques in Neuroscience Research. Windhorst, U., Johansson, H. , Springer. Berlin, Heidelberg. (1999).
- Sachs, B., Barfield, R. Functional Analysis of Masculine Copulatory Behavior in the Rat. 7, (1976).
- Hull, E. M., Dominguez, J. M.
- Mosig, D. W., Dewsbury, D. A. Studies of the copulatory behavior of house mice (Mus musculus). Behavioral Biology. 16 (4), 463-473 (1976).
- Park, J. H. Assessment of Male Sexual Behavior in Mice. Mood and Anxiety Related Phenotypes in Mice. Gould, T. 63, Humana Press. (2011).
- Bonthuis, P. J., et al. Of mice and rats: key species variations in the sexual differentiation of brain and behavior. Frontiers in Neuroendocrinology. 31 (3), 341-358 (2010).
- Levine, L., Barsel, G. E., Diakow, C. A. Mating behaviour of two inbred strains of mice. Animal Behavior. 14 (1), 1-6 (1966).
- McGill, T. E. Sexual Behavior in Three Inbred Strains of Mice. Behaviour. 19 (4), 341 (1962).
- James, P. J., Nyby, J. G. Testosterone rapidly affects the expression of copulatory behavior in house mice (Mus musculus). Physiology & Behavior. 75 (3), 287-294 (2002).
- Arteaga-Silva, M., Rodriguez-Dorantes, M., Baig, S., Morales-Montor, J. Effects of castration and hormone replacement on male sexual behavior and pattern of expression in the brain of sex-steroid receptors in BALB/c AnN mice. Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Molecular & Integrative Physiology. 147 (3), 607-615 (2007).
- Zhang, Z., et al. Deletion of Type 3 Adenylyl Cyclase Perturbs the Postnatal Maturation of Olfactory Sensory Neurons and Olfactory Cilium Ultrastructure in Mice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 1 (2017).
- Mandiyan, V. S., Coats, J. K., Shah, N. M. Deficits in sexual and aggressive behaviors in Cnga2 mutant mice. Nature Neurosciemce. 8 (12), 1660-1662 (2005).
- Choi, C. I., et al. Simultaneous deletion of floxed genes mediated by CaMKIIalpha-Cre in the brain and in male germ cells: application to conditional and conventional disruption of Goalpha. Experimental & Molecular Medicine. 46, 93 (2014).
- Pelch, K. E., Sharpe-Timms, K. L., Nagel, S. C. Mouse model of surgically-induced endometriosis by auto-transplantation of uterine tissue. Journal of Visualized Experiments. (59), e3396 (2012).
- McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. Journal of Visualized Experiments. (67), e4389 (2012).
- Liu, Z. W., et al. Postweaning Isolation Rearing Alters the Adult Social, Sexual Preference and Mating Behaviors of Male CD-1 Mice. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13, 21 (2019).
- TIan, E. P., Long, T., Qin, D. N. Establishment and applications of mating model in male rat. Chinese Journal of Andrology. 22 (1), 7-10 (2008).
- University of Minnesota Academic Health Center Research Service. Anesthesia Guidelines: Mice. , Available from: https://www.researchservices.umn.edu/services-name/research-animal-resources/research-support/guidelines/anesthesia-mice (2019).
- Leypold, B. G., et al. Altered sexual and social behaviors in trp2 mutant mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (9), 6376-6381 (2002).
