Summary
Este artículo describe cómo realizar pruebas de comportamiento sexual en ratones macho.
Abstract
El comportamiento sexual es muy específico de cada especie. Aunque los roedores tienen comportamientos sexuales ligeramente diferentes, los ratones y las ratas tienen un patrón de comportamiento sexual similar. El propósito de este artículo es describir el modelo femenino ovariectomizado estrus inducido por hormonas y el procedimiento experimental para la evaluación del comportamiento sexual de ratones machos. Los elementos de comportamiento sexual más importantes se muestran en el video y las ilustraciones. También se explican los pasos críticos, las ventajas y las limitaciones de la prueba de comportamiento sexual. Por último, se presentan los parámetros de comportamiento y se distinguen los procesos de montaje, intromisión y eyaculación en el apareamiento. Los parámetros de comportamiento se evalúan en términos de la duración ocurrida y los recuentos durante el período de prueba.
Introduction
El comportamiento sexual en ratones machos machos maduros es el resultado de la interacción de una serie de sistemas hormonales y sistemas neuronales relacionados e interdependientes en diferentes circuitos cerebrales1. También requiere experiencias de desarrollo, aprendizaje, contexto y un socio adecuado. El análisis conductual es un reflejo importante sobre la función neuronal o neurocrina. Por lo tanto, estudio de comportamiento sexual en modelos animales ha sido ampliamente utilizado en la neurociencia del comportamiento y otras investigaciones relacionadas2. El etograma de las conductas sexuales en roedores se ha explicado en muchos artículos y libros1,3,4. Por ejemplo, la descripción de Scahs y Barfield del comportamiento sexual en la rata5 ha ayudado a entender un patrón de comportamiento similar en ratones5. El ratón es uno de los sujetos más utilizados para estudios conductuales. 6 dio una introducción detallada de los comportamientos sexuales del ratón masculino: Cuando un ratón macho se encuentra con una hembra, comienza a investigar la región anogenital de la hembra. Luego, el macho presiona sus patas delanteras contra los flancos de la hembra para montar a la hembra desde la parte trasera. La hembra exhibe una postura sexualmente receptiva característica, doblando su columna vertebral hacia abajo en un arco y moviendo su cola a un lado del cuerpo, exponiendo una apertura introitus para la penetración sexual del macho (es decir, lordosis). Después del montaje, el macho hace impulsos pélvicos rápidos y poco profundos, seguidos de impulsos vaginales lentos y profundos. Después de numerosas intromisiones, un empuje de larga duración resulta en la eyaculación del semen, durante el cual el ratón macho puede congelarse durante unos 25 s antes de desmontar o caer de la hembra6. En la eyaculación, las glándulas accesorias machos del ratón pueden producir una mezcla que contiene semen que se endurece para formar el tapón copulatorio. Finalmente, después de la eyaculación, el macho comienza el aseo genital y muestra una falta de interés en la hembra. En resumen, la secuencia básica del comportamiento sexual masculino consiste en oler, seguir, montar, intromisión, eyaculación y acicalamiento posterior a la eyaculación. El comportamiento sexual del ratón presenta diferencias de tensión. Por ejemplo, las latencias de eyaculación oscilan entre 594 y 6943 s, y el número de intromisiones oscila entre 5 y más de 100. Las latencias posteriores a la eyaculación oscilan entre 17 y 60 min. Sin embargo, la introducción de una hembra novedosa puede disminuir este intervalo de tiempo. En algunos casos, el macho eyacula en la primera intromisión con la nueva hembra7.
Los principales eventos para la evaluación del comportamiento sexual son el montaje, la intromisión y la eyaculación. Científicos del comportamiento han recomendado la medición no sólo de la frecuencia de cada acción, sino también de su latencia y intervalo de tiempo5,8. Algunos de los principales indicadores de medición en estudios anteriores incluyen: número de montajes, número de intromisiones, latencia de montaje, latencia de intromisiones, latencia de eyaculación, latencia de montaje post-eyaculatoria (o intervalos post-eyaculatorios), latencia de intromisiones post-eyaculatoria, número de series de cópula y duración de series de cópula. 5 describieron cómo identificar cada acción de montaje, intromisión y eyaculación de roedores. El montaje se define como el macho que monta la hembra desde la parte trasera, palpar sus flancos con sus patas delanteras, y empujar su pene rápida y repetidamente sin inserción del pene. La intromisión, también conocida como inserción del pene, se identifica mediante uno o más de los siguientes actos: un empuje largo y profundo después de rápidos empujes superficiales, una patada rápida con una pata trasera, y una marcada retirada lateral del macho de la hembra. La eyaculación se identifica por un empuje pélvico terminal que es más lento y más profundo que el de una intromisión y una reducción en la elevación de la pata trasera. Cada secuencia, desde el montaje hasta la eyaculación, identifica una serie copulatoria. Las definiciones de parámetros de comportamiento utilizados en el presente estudio se enumeran de la siguiente manera: 1) Latencia de montaje: el tiempo desde la introducción de la hembra hasta el primer montaje del macho; 2) Latencia de intromisión: el tiempo desde la introducción de la hembra hasta la primera intromisión; 3) Latencia de la eyaculación: el tiempo desde la primera intromisión hasta la primera eyaculación (generalmente después del último empuje pélvico); 4) Latencia de montaje post-eyaculatorio: el tiempo de la eyaculación al siguiente montaje; 5) Latencia de intromisión post-eyaculatoria: el tiempo de la eyaculación y la siguiente intromisión; 6) Número de soportes: el número de tiempos de montaje antes de la primera eyaculación; 7) Número de intromisiones: el número de intromisiones antes de la primera eyaculación; 8) Número de series copulatorias: el número de series copulatorias durante el período de observación; 9) Duración de la serie copulatoria: el tiempo de todas las series copulatorias durante el período de observación.
El comportamiento sexual y el comportamiento relacionado se pueden llevar a cabo en la jaula del varón o en una arena cerrada, entre las cuales se introduce un aparato llamado caja espejada "Sin secretos" de Rissman para observar el comportamiento de apareamiento3. Una cámara de vídeo se coloca delante de la caja para grabar simultáneamente la acción de los ratones desde una vista lateral y a través de un espejo inclinado desde una vista ventral. Sin embargo, este método requiere luces brillantes, lo que inevitablemente conduce a una mayor habituación con el fin de eliminar el estrés ambiental en ratones. En cuanto al método de medición, se recomienda el análisis de comportamiento basado en vídeo para registrar y cuantificar el comportamiento4. Una grabadora de vídeo que tiene una opción de avance de vídeo fotograma a fotograma con velocidades de obturación recomendadas superiores a 1/1000 s se puede utilizar para grabar movimientos rápidos del ratón. La cámara infrarroja de alta resolución es necesaria cuando se graba en un entorno oscuro. Para analizar la película, se necesita un ordenador con un agarrador de marcos para permitir que los fotogramas individuales de comportamiento se capturen para la manipulación del ordenador. Los ratones son extremadamente versátiles y pueden mostrar un comportamiento compensatorio después de casi cualquier tratamiento. La ambiguidad puede existir sobre cada parte del cuerpo en movimiento4. Por lo tanto, el análisis de algunos comportamientos puede requerir una resolución aún mayor y cámaras de mayor velocidad.
Las conductas sexuales masculinas en ratones se ven afectadas por muchos factores, incluyendo diferencias de tensión, cambios hormonales y mutanticiones genéticas1,3,9,10. McGill y Blight11 ilustraron las diferencias de tensión en los comportamientos de acoplamiento del ratón. Por ejemplo, los machos C57BL/6 suelen obtener intromisión rápidamente y eyacular en unos 20 min11. Los machos DBA/2 tardan en obtener intromisión, pero eyaculan rápidamente. Los machos BALB/c son lentos para lograr la eyaculación (latencia media de 1 h) debido a un largo período de cortejo11. Testosterona facilita y mantiene el comportamiento sexual masculino2, y los cambios en los niveles de testosterona pueden alterar el rendimiento del comportamiento sexual12. Tanto la castración quirúrgica como el tratamiento antiandrógeno pueden reducir el nivel de testosterona y resultar en una rápida disminución de las conductas sexuales e incluso la motivación sexual y la excitación sexual13. La testosterona administrada puede restaurar comportamientos precopulatorios y copulatorios en ratones castrados. Por último, los ratones noqueadores y knockdowns muestran diferencias en las facetas de los comportamientos sexuales en comparación con los ratones de tipo salvaje. Por ejemplo, los ratones machos con mutaciones específicas de Adcy3, Cnga2 y Gnao exhiben una capacidad reducida para detectar feromonas, mientras que los ratones noqueadores Trpc2 muestran la preferencia alterada de la pareja14,15,16. Otros efectos de los transgénicos y nocauts en el comportamiento sexual de los ratones se explican por Crawley3.
Aquí, se describe uno de los procedimientos más comunes para evaluar el comportamiento sexual en el emparejamiento de un ratón masculino con una hembra ovariectomizada que ha sido preparada hormonalmente para ser receptiva. Se presenta un protocolo experimental para llevar a cabo experimentos de comportamiento sexual en ratones. Además, se muestra un ejemplo de cambio de patrones de comportamiento sexual resultantes del aislamiento social en ratones CD-1.
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Protocol
Todos los experimentos se realizaron de conformidad con las directrices de los Principios de Cuidado Animal de Laboratorio (NiH Publication No 80-23, revisada en 1996) y bajo la aprobación y supervisión del Centro Animal Experimental del Instituto de Medicamentos Desarrollo Vegetal (China).
1. La cría de animales
- Casa de ratones hembra y macho a 25oC durante ciclos oscuros de 12 h de luz/12 h.
- Proporcionar acceso gratuito al agua y una dieta estándar de pelleted.
- Permita que los ratones se aclimaten a su entorno durante 7 días antes de la operación si son transportados desde una instalación diferente.
2. Ovariectomía en ratones hembra
- Anestesia rinde a la hembra (8 semanas después del natal, no menos de 6 semanas de edad) con isoflurano (4-5% para la inducción, -1-2% para el mantenimiento) en oxígeno del 100% a través de una máscara de cono facial.
- Compruebe que se ha alcanzado la profundidad adecuada de la estesia asegurándose de que no haya movimientos voluntarios durante más de 30 s, en combinación con una frecuencia respiratoria adecuada (por ejemplo, 1 respiración por 2 s o más). Alternativamente, pruebe la respuesta del ratón a una presión suave en los dedos de los pies de las patas traseras.
NOTA: La frecuencia respiratoria normal es de 180 euros/min. Una caída de la tasa del 50% es aceptable durante la anestesia17.- Use pomada oftálmica para prevenir el secado de la córnea y traumatismo ocular mientras está bajo anestesia.
- Mantenga la temperatura corporal del ratón a 36 oC o por encima de ella. Proporcionar soporte térmico suplementario durante el período de anestesia cuando sea necesario.
- Esterilice y desinfecte todos los instrumentos quirúrgicos y superficies duras de la mesa de operación con 75% de etanol antes de su uso.
- Coloque el animal sobre una cortina estéril.
- Afeitar el pelaje bilateralmente sobre la columna lumbar en la parte posterior del ratón para exponer la piel.
- Esterilice la piel expuesta con 75% de etanol.
- Haga una sola incisión de la línea media (alrededor de 0,5 cm de longitud) en la parte posterior desde el centro de las dos raíces del muslo hacia la cabeza de 1 cm de distancia (la posición se muestra en la Figura 1).
- Utilice tijeras pequeñas para penetrar la piel para liberar suavemente el tejido subcutáneo del músculo subyacente con el fin de exponer la capa muscular.
- Localice el ovario debajo de la capa muscular delgada y haga una pequeña incisión (alrededor de 5 mm de longitud) para entrar en la cavidad peritoneal.
- Utilice pinzas pequeñas para tirar del tejido ligeramente en el lado izquierdo de la cavidad abdominal para mostrar el envoltorio del ovario de la mano izquierda alrededor del tejido adiposo blanco (una masa translúcida e irregular como se ve a simple vista, ver Figura 1).
- Retirar la almohadilla de grasa ovárica que rodea el ovario con fórceps contundentes para exponer el oviducto.
- Realice una sola ligadura alrededor del oviducto para prevenir el sangrado.
- Use tijeras pequeñas para cortar el oviducto suavemente y retire el ovario.
- Revise el oviducto cuidadosamente para confirmar que se extraen todos los tejidos ováricos. El ovario es de unos 5 mm a 4 mm a 3 mm con nódulos irregulares en la superficie.
- Coloque la parte restante del oviducto de nuevo en la cavidad abdominal.
- Sutura rinde la capa muscular con suturas absorbibles.
- Tire de la piel hacia el lado derecho para exponer la capa muscular en el lado derecho y retire el ovario derecho repitiendo los pasos 2.9–2.16.
- Cierre la incisión cutánea utilizando suturas absorbibles.
- Inyectar cada ratón por vía intraperitoneal con penicilina sódica (10.000 unidades/10 g por ratón) para evitar la infección.
- Inyectar lidocaína (4 mg/kg, 0,4 ml/kg de una solución al 1%) debajo de la piel a lo largo del sitio de la incisión. También proporcionar ibuprofeno (50–60 mg/kg/día; 10 ml de Motrin para niños en 500 ml de agua) continuamente en el agua potable durante 3 días para el tratamiento del dolor.
- Coloque cada ratón en una jaula esterilizada individualmente.
- Mantener bajo observación cercana durante aproximadamente 1-2 h hasta que se recupere completamente de la anestesia.
- Recuperar animales con toallas de papel en una jaula limpia sin ropa de cama. Este paso minimiza el riesgo de obstrucción traqueal o neumonía. Proporcionar soporte térmico suplementario durante la recuperación anestésica. Supervise el sitio quirúrgico para evitar la rotura de la herida.
- Después del período de recuperación (aproximadamente 24 h después de la cirugía), coloque los ratones de vuelta a su jaula de origen.
- No realice el experimento durante al menos 2 semanas después de la cirugía.
3. Estrus inducido por hormonas en las hembras
- Determinar la etapa estrosa de las hembras mediante la realización de un frotis vaginal como se describe en McLean et al.18. Ningún cambio en el ciclo de estrus indica que la ovariectomía de la hembra tuvo éxito.
- Inyectar benzoato de estradiol (20 g por ratón, disuelto en 0,1 ml de aceite de oliva esterilizado, intraperitonealmente) 48 h antes de la prueba de comportamiento sexual.
- Inyectar progesterona (500 g por ratón, disuelto en 0,1 ml de aceite, intraperitoneal) 4 horas antes de la prueba de comportamiento sexual.
NOTA: La elegibilidad de una hembra estrus está determinada por la hembra que acepta la inserción genital de un ratón macho 3 o más veces, cuando conviven con un macho sexualmente activo y experimentado en una jaula.
4. Preparación para la prueba de comportamiento sexual
- Realizar la prueba de comportamiento sexual de ratones machos en una caja rectangular y de campo abierto (40 cm x 40 cm x 40 cm) con paredes de plexiglás negro, a excepción de una pared frontal transparente que permite la observación del movimiento del ratón.
- Ajuste la iluminación general de la habitación a 650 lux.
NOTA: Los ratones no deben iluminarse directamente para evitar patrones de comportamiento anormales. - Utilice una cámara digital conectada a un ordenador para grabar en vídeo el movimiento y el comportamiento de los ratones.
- Realizar la prueba de comportamiento en los ratones machos durante las primeras horas del ciclo oscuro.
5. Habituación
- Mantenga la sala de experimentos en silencio.
- Coloque los ratones a probar en el centro de la caja de campo abierto, lo que les permite explorar el entorno libremente durante 30 minutos.
- Habituate ratones durante 2 días consecutivos antes del día de prueba en el aparato para evitar el estrés del nuevo entorno.
NOTA: Los ratones deben moverse y explorar libremente sin sentir estrés. Tanto los ratones machos como los machos deben habituarse en el entorno de pruebas.
6. Ensayos conductuales
- Encienda la cámara antes del comienzo de la prueba.
- Coloque el ratón que se va a probar en el centro del campo abierto en el cuadro de prueba, lo que permite una exploración gratuita durante 5 minutos para aclimatarse al entorno.
- Coloque una hembra en estrus en la caja de prueba.
- Registre los comportamientos sociales y de apareamiento y las interacciones entre los ratones masculinos y femeninos durante 30 min.
- Apague la cámara y confirme que el vídeo está guardado.
- Saque a la hembra de la caja de prueba y registre la formación de un tapón vaginal.
NOTA: Un ratón femenino que aceptó el apareamiento no puede ser empleado en otra prueba de comportamiento sexual en un día. - Coloque a la hembra de vuelta a su jaula.
- Devuelva al macho a su jaula.
- Limpie la orina, las heces y el relleno dentro del aparato.
- Elimine el olor de los ratones probados con un 75% de etanol.
- Comience la prueba del siguiente ratón macho repitiendo los pasos 6.1–6.10.
7. Extracción de datos conductuales
- Reproduzca la grabación de vídeo y extraiga los parámetros de comportamiento (consulte la figura 2).
- Registre el número de monturas en 30 min.
- Registre el número de intromisiones en 30 min. Cuente un empuje pélvico como una intromisión.
- Registre el tiempo desde la introducción de la hembra hasta el primer montaje como latencia de montaje.
- Registre el tiempo desde la introducción de la hembra hasta la primera intromisión como latencia de intromisión.
- Registre el tiempo desde la primera introducción hasta la primera eyaculación como latencia de eyaculación.
- Registre el tiempo desde la eyaculación hasta el siguiente montaje como latencia de montaje post-eyaculatorio.
- Número récord de series de cópula en 30 min. Una serie copulatoria es cada secuencia desde el montaje hasta la eyaculación.
- Registre el tiempo de todas las series de cópulatos en 30 minutos como la duración de la serie de cópulatorio.
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Representative Results
Se muestra una comparación del comportamiento sexual entre ratones CD-1 criados en aislamiento y ratones CD-1 alojados en grupo. Los ratones CD-1 machos fueron asignados aleatoriamente a un grupo de aislamiento (IS, un ratón por jaula, n a 30) y a un grupo alojado en grupo (GH, cinco ratones por jaula, n a 15). Los ratones se sometieron a una crianza aislada desde el día 23 postnatal hasta el día 93. Luego, ambos grupos de ratones fueron evaluados por comportamiento sexual. Nuestro estudio encontró que la tasa de éxito de la cópula tendía a ser menor en el grupo DE EI que en el grupo de GH (IS: 80,0%, GH: 86,7%), aunque no se observó ninguna diferencia estadísticamente significativa entre los grupos (pág. 0,458). La latencia de montaje fue más larga en el grupo IS que en el grupo de GH (p - 0.002, Figura 3A), lo que indica que el primero requería más tiempo para iniciar el comportamiento sexual. La latencia de Intromission fue más larga en el grupo IS que en el grupo de GH (p - 0.015, Figura 3B), lo que indica que el primero requería un tiempo más largo para realizar la inserción del pene en la vagina de la hembra. No se observó ninguna diferencia estadísticamente significativa entre los dos grupos en términos de latencia de eyaculación y latencia de montaje post-eyaculatoria. La duración de la serie copulatoria fue más corta en el grupo IS que en el grupo DE GH (p a 0,002, Figura 3C). No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los dos grupos en cuanto al número de monturas, el número de intromisiones y el número de series de cópula19 (véase el Cuadro 1).
| Crianza en aislamiento | Casa en grupo | t/t' | P | |
| N | 30 | 15 | ||
| Latencia de montaje a | 788,70 a 262,77 | 365,03 a 288,65 | -3.87 | 0.002 |
| Latencia de intromisión | 937,30 a 369,87 | 542,94 a 352,40 | -2.75 | 0.015 |
| Latencia de eyaculación | 16,58 x 9,78 | 17,37 a 13,03 | -0.2 | 0.845 |
| Latencia de montaje post-eyaculatorio | 173,00 a 89,84 | 192,87 a 106,91 | 0.58 | 0.565 |
| Duración de la serie copulatoria | 88,27 a 52,40 | 151,65 a 40,87 | 3.44 | 0.002 |
| Número de monturas b | 2,4 x 2,0 | 3,3 x 3,3 | 1.09 | 0.282 |
| Número de intromisiones | 20,1 x 12,9 | 22,6 x 12,3 | 0.58 | 0.564 |
| Número de series copulatorias | 7,0 x 4,3 | 9,3 x 4,6 | 1.55 | 0.131 |
| Media: SD; una unidad es la segunda (s). b unidad es cuenta. | ||||
Tabla 1: Parámetros de comportamiento sexual de ratones criados en aislamiento y alojados en grupo.
Figura 1: Ovariectomía de ratones hembra. Se muestra la posición de la incisión vertical y el ovario a la derecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Proceso de comportamiento sexual de ratones. La flecha roja indica la hembra y la flecha amarilla indica el macho. (A) El olfato del macho de áreas anal-genitales al comienzo de la conducta sexual. (B) El macho que monta la hembra. (C) La postura intromisión del macho. (D) La eyaculación del macho. (E) El macho que acicala las zonas genitales después de la eyaculación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Resultados de la prueba de comportamiento sexual. (A) Gráfica de caja de la latencia de montaje de ratones IS y GH. (B) Gráfico de caja de la latencia de introducción de ratones IS y GH. (C) La duración total de acoplamiento de los ratones IS y GH. *p < 0.05, **p < 0.01. Esta cifra ha sido modificada de Liu et al.19. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hay algunos pasos críticos en el protocolo presentado. En cuanto a la ovariectomía de las hembras, la apertura de la incisión quirúrgica desde la espalda es menos perjudicial que la del abdomen. Dado que la posición del ovario es profunda, tirar de otros órganos cuando la incisión se abre desde el abdomen a menudo conduce a sangrado y resulta en una visión quirúrgica poco clara20. Realizamos la incisión en la espalda para llegar al ovario fácilmente y acortar el tiempo quirúrgico, así como para garantizar la seguridad de la cirugía.
El mantenimiento de condiciones estériles durante la cirugía es importante para la supervivencia. Cuatro variables principales se consideran durante un procedimiento quirúrgico: el espacio quirúrgico, los instrumentos, el cirujano y el animal. Para el espacio quirúrgico, incluidos los espacios de trabajo y las salas quirúrgicas, todas las superficies necesarias se limpian y desinfectan con desinfectantes apropiados (por ejemplo, lejía diluida, productos de peróxido de hidrógeno) antes de la cirugía. Además, se recomienda el vapor presurizado con un autoclave. Durante un procedimiento quirúrgico, el flujo de tráfico es limitado en la sala quirúrgica. En un procedimiento quirúrgico, se deben utilizar instrumentos y materiales recientemente esterilizados para cada animal. Cuando los instrumentos caen fuera del campo estéril o se contaminan, deben reemplazarse inmediatamente. Mientras tanto, después de lavarse/lavarse bien las manos y los brazos, los cirujanos necesitan ponerse todos los atuendos estériles, incluyendo una bata estéril y guantes quirúrgicos estériles. Si algún material está contaminado, el artículo afectado debe cambiarse inmediatamente antes de la cirugía (por ejemplo, bata nueva o guante quirúrgico). Por último, el cabello del sitio quirúrgico y del área circundante debe ser removido para la prevención de la contaminación. La piel debe ser limpiada con 75% de etanol después de la depilación. Se pueden utilizar cortadoras eléctricas o crema depilatoria para eliminar el cabello. Antes de la cirugía, se coloca una cortina estéril sobre el animal que permite el acceso al sitio quirúrgico para la prevención de la contaminación.
Tres aspectos del tratamiento postquirúrgico de los animales requieren atención: recuperación anestésica, analgesia y monitoreo del sitio quirúrgico, y extirpación de sutura. Al finalizar el procedimiento quirúrgico, los animales deben ser monitoreados durante la recuperación de la anestesia. El animal no debe dejarse desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la recuperación esternal y no debe ser devuelto a la compañía de otros animales hasta que se haya recuperado por completo. Además, se deben proporcionar condiciones de recuperación adecuadas, incluido un ambiente cálido y libre de objetos que puedan causar daños. Por ejemplo, las toallas de papel en lugar de la ropa de cama de mazorca de maíz se utilizan en la recuperación de los ratones y los juguetes grandes o recipientes de agua se retiran de los corrales de animales grandes. Según las directrices de la Universidad de Minnesota, la ovariectomía de las mujeres causa dolor de moderado a intenso. Por lo tanto, la analgesia debe administrarse directamente después de la operación mediante inyección parenteral o gavage oral21. En este estudio, se realizó una inyección de lidocaína debajo de la piel después de la cirugía y se administró agua que contiene ibuprofeno durante al menos 1-2 días para el tratamiento del dolor. Sin embargo, se debe consultar a un veterinario en el desarrollo del plan analgésico. Por último, la salud postquirúrgica del animal y el sitio quirúrgico deben ser observados y registrados durante un mínimo de 3 días. Se utiliza una línea de operación o clips de herida para suturar la incisión, que se debe retirar de la piel 7-14 días después de la cirugía21. En este estudio, se utilizó una línea absorbible para suturar la incisión para evitar la eliminación de la sutura.
El estrus de la hembra fue controlado artificialmente con ovariectomía y uso hormonal, en lugar de usar una hembra con estrus natural. Este paso se tomó para asegurar la consistencia de la receptividad sexual de la hembra en la prueba y garantizar la fiabilidad de las mediciones al monitorear el comportamiento de apareamiento masculino. Además, la hembra de estrus inducida por hormonas se puede reutilizar en un conjunto de experimentos, y se previene la influencia del embarazo. Estrus en la hembra se induce mediante la inyección de benzoato de estradiol y progesterona antes del experimento. Este método es fácil de manejar, tiene una alta tasa de éxito, y se pueden obtener múltiples hembras de estrus al mismo tiempo, mejorando así en gran medida la eficiencia de la prueba.
Los ratones sexualmente ingenuos y experimentados muestran diferentes patrones de comportamiento. Se debe prestar atención a la fiabilidad de prueba-retest del experimento en varias etapas del desarrollo de ratones. El cambio dinámico en el comportamiento sexual debe ser considerado antes de realizar la prueba y en la etapa de diseño experimental. En este estudio, los machos sexualmente ingenuos fueron utilizados para la prueba de comportamiento sexual y sólo la primera ocurrencia de comportamiento sexual se midió sin ningún entrenamiento antes de la prueba. La cópula es el resultado final de una serie de detección de feromonas, montaje, intromisión y eyaculación. Hay una limitación al protocolo experimental actual cuando se aplica a ratones mutantes. Por ejemplo, los ratones machos con mutaciones específicas de Adcy3, Cnga2 y Gnao exhiben una capacidad reducida para detectar feromonas14,15,16,mientras que los ratones noqueadores Trpc2 muestran una preferencia alterada de la pareja22. El protocolo actual puede no ser capaz de exhibir el comportamiento sexual de ratones mutantes debido a su capacidad reducida para detectar feromonas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Lu Cong, Zhang Hongxia, Zhang Beiyue y Hu Mi por sus sugerencias para los experimentos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Choral hydrate | Sinopharm Chenmical Reagent Co., Ltd. | 20160225 | |
| Coated VICRYL Plus Sutures | Ethicon, Inc. | missing | |
| Estradiol benzoate | J&K Scientific, Ltd. | L930Q170 | |
| Ethanol absolute | Beijing Chemical Works Co., Ltd. | 20160715 | |
| Ibuprofen (Children's Motrin) | Shanghai Johnson & Johnson Co., Ltd. | 160629478 | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co., Ltd. | 217180501 | |
| Lidocaine | HebeI Tiancheng Pharmacreutical Co., Ltd. | 1170506107 | |
| Male and female CD-1 mice | Vital River Beijing | SCXK( )2013-0023 |
|
| Olive oil | |||
| Penicillin sodium | North China Pharmaceutical Co., Ltd. | F5126420 | |
| Progesterone | J&K Scientific, Ltd. | LR50Q07 | |
| Sony digital camera | Sony Corporation | HDR-CX290E | |
| Test box | DIY | ||
| ThinkStation Computer | Lenovo | S/N PCOGLQKG | |
| Vaporizer for Isoflurane | RWD Life Science Co., Ltd. | E05904-009M |
References
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