Summary
In dit artikel wordt beschreven hoe u seksueel gedragstests uitvoeren bij mannelijke muizen.
Abstract
Seksueel gedrag is zeer soortspecifiek. Hoewel knaagdieren iets ander seksueel gedrag hebben, hebben muizen en ratten een vergelijkbaar seksueel gedragspatroon. Het doel van dit artikel is om het hormoon-geïnduceerde estrus ovariectomized vrouwelijk model en de experimentele procedure voor de beoordeling van seksueel gedrag van mannelijke muizen te beschrijven. De belangrijkste seksuele gedragselementen worden gedemonstreerd in de video en illustraties. De kritieke stappen, voordelen en beperkingen van de test voor seksueel gedrag worden ook uitgelegd. Ten slotte worden de gedragsparameters gepresenteerd en worden montage-, intromissie- en ejaculatieprocessen in de paring onderscheiden. Gedragsparameters worden beoordeeld in termen van de voorgekomen duur en tellingen tijdens de testperiode.
Introduction
Seksueel gedrag bij volwassen mannelijke muizen is het gevolg van de interactie van een reeks verwante en onderling afhankelijke hormonale systemen en neurale systemen in verschillende hersencircuits1. Het vereist ook ontwikkelingservaringen, leren, context en een geschikte partner. Gedragsanalyse is een belangrijke reflectie op neurale of neurocrine functie. Vandaar, seksueel gedrag studie op dier modellen is op grote schaal gebruikt in gedragsneurowetenschappen en ander gerelateerd onderzoek2. Het ethogram van seksueel gedrag bij knaagdieren is uitgelegd in vele artikelen en boeken1,3,4. Bijvoorbeeld, Scahs en Barfield's beschrijving van seksueel gedrag in de rat5 heeft geholpen begrijpen een soortgelijk gedragspatroon in muizen5. De muis is een van de meest gebruikte onderwerpen voor gedragsstudies. Hull et al.6 gaf een gedetailleerde introductie van mannelijke muis seksueel gedrag: Wanneer een mannelijke muis een vrouwtje tegenkomt, begint het anogenitale gebied van het vrouwtje te onderzoeken. Vervolgens drukt het mannetje zijn voorpoten tegen de flanken van het vrouwtje om het vrouwtje van achteren te monteren. Het vrouwtje vertoont een karakteristieke seksueel ontvankelijke houding, buigt zijn wervelkolom naar beneden in een boog en beweegt zijn staart naar één kant van het lichaam, waardoor een openingsintroitus wordt blootgelegd voor de seksuele penetratie van het mannetje (d.w.z. lordosis). Na de montage maakt het mannetje snelle, ondiepe bekkenstoten, gevolgd door langzame en diepe vaginale stoten. Na talrijke intromissies resulteert een langdurige stuwkracht in de ejaculatie van sperma, waarbij de mannelijke muis ongeveer 25 minuten kan bevriezen voordat hij van het vrouwtje wordt afgebroken of erafvalt. Bij ejaculatie kunnen de mannelijke muisaccessoireklieren een mengsel produceren dat sperma bevat dat verhardt om de copulatory plug te vormen. Ten slotte, na ejaculatie, het mannetje begint genitale verzorging en toont een gebrek aan interesse in het vrouwtje. Kortom, de basissequentie van mannelijk seksueel gedrag bestaat uit snuiven, volgen, monteren, intromissie, ejaculatie en post-ejaculatieverzorging. Het seksuele gedrag van de muis stelt spanningsverschillen tentoon. Bijvoorbeeld, ejaculatie latencies variëren van 594 tot 6943 s, en het aantal intromissies variëren van 5 tot meer dan 100. Post-ejaculatie latencies variëren van 17 tot 60 min. Echter, de invoering van een nieuw vrouwtje kan dit tijdsinterval verminderen. In sommige gevallen, de mannelijke ejaculeert op de eerste intromissie met de nieuwe vrouwelijke7.
De belangrijkste gebeurtenissen voor de evaluatie van seksueel gedrag zijn montage, intromissie en ejaculatie. Gedragswetenschappers hebben aanbevolen de meting van niet alleen de frequentie van elke actie, maar ook de latentie en het tijdsinterval5,8. Enkele belangrijke meetindicatoren in eerdere studies zijn: aantal mounts, aantal intromissies, mount latency, intromission latency, ejaculatielatentie, post-ejaculatoire mount latency (of post-ejaculatoire intervallen), post-ejaculatory intromission latency, aantal copulatory series, en de duur van copulatory series. Park et al.8 en Sachs et al.5 beschreven hoe elke actie van montage, intromissie en ejaculatie van knaagdieren kan worden geïdentificeerd. Montage wordt gedefinieerd als de mannelijke montage van het vrouwtje van de achterzijde, palpating haar flanken met zijn voorpoten, en stak zijn penis snel en herhaaldelijk zonder penis inbrengen. Intromissie, ook bekend als penis inbrengen, wordt geïdentificeerd door een of meer van de volgende handelingen: een lange, diepe stuwkracht na snelle ondiepe stoten, een snelle kick met een achterbeen, en een duidelijke laterale terugtrekking van het mannetje uit het vrouwtje. Ejaculatie wordt geïdentificeerd door een terminale bekkenstuwkracht die langzamer en dieper is dan die van een intromissie en een vermindering van de hoogte van het achterbeen. Een copulatory reeks wordt geïdentificeerd door elke opeenvolging van montage aan ejaculatie. De definities van gedragsparameters die in deze studie worden gebruikt, worden als volgt vermeld: 1) Montagelatentie: de tijd vanaf de introductie van het vrouwtje tot de eerste montage van het mannetje; 2) Intromission latentie: de tijd vanaf de introductie van het vrouwtje tot de eerste intromissie; 3) Ejaculatielatentie: de tijd vanaf de eerste intromissie tot de eerste ejaculatie (meestal na de laatste bekkenstuwkracht); 4) Post-ejaculatoire mount latency: de tijd van ejaculatie naar de volgende montage; 5) Post-ejaculatory intromission latency: de tijd van ejaculatie en de volgende intromissie; 6) Aantal mounts: het aantal montagetijden vóór de eerste ejaculatie; 7) Aantal intromissies: het aantal intromissies vóór de eerste ejaculatie; 8) Aantal copulatory reeksen: het aantal copulatory reeksen tijdens de observatieperiode; 9) Duur van de copulatory serie: de tijd van alle copulatory series tijdens de observatieperiode.
Seksueel gedrag en gerelateerd gedrag kan worden uitgevoerd in de kooi van de man of in een afgesloten arena, waaronder een apparaat genaamd Rissman's "No Secrets" gespiegelde doos wordt geïntroduceerd om het paringsgedrag te observeren3. Een videocamera wordt voor de doos geplaatst om tegelijkertijd de actie van de muizen op te nemen vanuit een zijdelingse weergave en door een hellende spiegel vanuit een ventrale weergave. Deze methode vereist echter felle lichten, wat onvermijdelijk leidt tot langere gewenning om milieustress bij muizen te elimineren. Wat de meetmethode betreft, wordt videogebaseerde gedragsanalyse aanbevolen om gedrag op te nemen en te kwantificeren4. Een videorecorder die een frame-voor-frame video vooraf optie met aanbevolen sluitertijden groter dan 1/1000 s heeft kan worden gebruikt om snelle muisbewegingen op te nemen. De hoge resolutie infrarood camera is noodzakelijk bij het opnemen in een donkere omgeving. Om de film te analyseren, is een computer met een framegrijper nodig om de afzonderlijke frames van gedrag te kunnen vastleggen voor computermanipulatie. Muizen zijn zeer veelzijdig en kunnen compenserend gedrag vertonen na bijna elke behandeling. Ambiguïteit kan bestaan over elk bewegend lichaamsdeel4. Vandaar, kan de analyse van sommige gedragingen nog grotere resolutie en hogere snelheidscamera's vereisen.
Mannelijk seksueel gedrag bij muizen wordt beïnvloed door vele factoren, waaronder stamverschillen, hormoonveranderingen en genmutantions1,3,9,10. McGill en Blight11 illustreerden de spanningsverschillen in het paringsgedrag van muizen. Bijvoorbeeld, C57BL / 6 mannen krijgen meestal intromissie snel en ejaculeren in ongeveer 20 min11. DBA/2 mannetjes zijn traag om intromissie te krijgen, maar ejaculeren snel. BALB/c mannetjes zijn traag om ejaculatie (gemiddelde latentie van 1 h) te bereiken als gevolg van een lange periode van verkering11. Testosteron vergemakkelijkt en onderhoudt mannelijk seksueel gedrag2, en veranderingen in testosteron niveaus kunnen veranderen seksueel gedrag prestaties12. Zowel chirurgische castratie en antiandrogene behandeling kan het niveau van testosteron verminderen en resulteren in een snelle daling van seksueel gedrag en zelfs seksuele motivatie en seksuele opwinding13. Toegediend testosteron kan herstellen precopulatory en copulatory gedrag in gecastreerde muizen. Ten slotte vertonen knock-out- en knockdownmuizen verschillen in facetten van seksueel gedrag in vergelijking met wilde muizen. Bijvoorbeeld, mannelijke muizen met gerichte mutaties van Adcy3, Cnga2, en Gnao vertonen een verminderd vermogen om feromonen te detecteren, terwijl Trpc2 knock-out muizen tonen veranderde partner voorkeur14,15,16. Andere effecten van transgenics en knock-outs op het seksuele gedrag van muizen worden verklaard door Crawley3.
Hier wordt een van de meest voorkomende procedures om seksueel gedrag te beoordelen in de koppeling van een mannelijke muis met een ovariectomized vrouwtje dat hormonaal is voorbereid om ontvankelijk te zijn beschreven. Een experimenteel protocol wordt gepresenteerd voor het uitvoeren van seksueel gedrag experimenten in muizen. Daarnaast wordt een voorbeeld getoond van het veranderen van seksuele gedragspatronen als gevolg van sociaal isolement in CD-1 muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Principles of Laboratory Animal Care (NIH Publicatie nr. 80-23, herziene 1996) en onder de goedkeuring en het toezicht van de Academie voor Experimentele Dierencentrum van het Instituut voor Medicinale Plant Development (China).
1. Veeteelt
- Huis vrouwelijke en mannelijke muizen bij 25 °C voor 12 uur licht/12 uur donkere cycli.
- Bied gratis toegang tot water en een standaard pelletdieet.
- Laat muizen 7 dagen voor de operatie wennen aan hun omgeving als ze vanuit een andere faciliteit worden vervoerd.
2. Ovariectomie bij vrouwelijke muizen
- Verdoven het vrouwtje (8 weken postnataal, niet minder dan 6 weken oud) met isoflurane (~ 4−5% voor inductie, ~1−2% voor onderhoud) in 100% zuurstof via een gezichtskegelmasker.
- Controleer of de juiste diepte van anesthesie is bereikt door ervoor te zorgen dat er gedurende meer dan 30 jaar geen vrijwillige bewegingen zijn, in combinatie met een passende ademhalingsfrequentie (bijvoorbeeld 1 adem per 2 s of langer). U ook de reactie van de muis testen op zachte druk op de tenen van de achterpoten.
LET OP: De normale ademhalingsfrequentie is ~ 180/min. Een tariefdaling van 50% is aanvaardbaar tijdens anesthesie17.- Gebruik oogheelkundige zalf om hoornvliesdrogen en oogtrauma te voorkomen terwijl onder narcose.
- Houd de lichaamstemperatuur van de muis op of boven 36 °C. Zorg voor aanvullende warmte ondersteuning tijdens de periode van anesthesie indien nodig.
- Steriliseren en desinfecteren alle chirurgische instrumenten en harde oppervlakken van de operatietafel met 75% ethanol voorafgaand aan het gebruik.
- Plaats het dier op een steriel laken.
- Scheer bont bilateraal over de lumbale wervelkolom op de achterkant van de muis om de huid bloot te leggen.
- Steriliseren van de blootgestelde huid met 75% ethanol.
- Maak een enkele middellijnincisie (ongeveer 0,5 cm lang) op de rug van het midden van de twee dijwortels naar het hoofd van ~ 1 cm afstand (positie wordt weergegeven in figuur 1).
- Gebruik kleine schaar om de huid te penetreren om voorzichtig vrij onderhuids weefsel van de onderliggende spier om de spierlaag bloot te leggen.
- Zoek de eierstok onder de dunne spierlaag en maak een kleine incisie (ongeveer 5 mm lang) om toegang te krijgen tot de peritoneale holte.
- Gebruik kleine pincet om het weefsel iets aan de linkerkant van de buikholte te trekken om de linker eierstok rond het witte vetweefsel (een doorschijnende, onregelmatige massa zoals te zien met het blote oog, zie figuur 1) te tonen.
- Trek de eierstok vet pad rond de eierstok met botte tangen om het oviduct bloot.
- Voer een enkele ligatuur rond het oviduct om bloeden te voorkomen.
- Gebruik kleine schaar om het oviduct voorzichtig te verbreken en verwijder de eierstok.
- Controleer het oviduct zorgvuldig om te bevestigen dat alle eierstokweefsel wordt verwijderd. De eierstok is ongeveer 5 mm × 4 mm × 3 mm met onregelmatige knobbeltjes op het oppervlak.
- Plaats het resterende deel van het oviduct terug in de buikholte.
- Hecht de spierlaag met opneembare hechtingen.
- Trek de huid naar de rechterkant om de spierlaag aan de rechterkant bloot te leggen en verwijder de juiste eierstok door de stappen 2.9–2.16 te herhalen.
- Sluit de huidincisie met behulp van absorbeerbare hechtingen.
- Injecteer elke muis intraperitoneally met penicillinenatrium (10.000 eenheden/10 g per muis) om infectie te voorkomen.
- Injecteer lidocaine (4 mg/kg, 0,4 mL/kg van een 1% oplossing) onder de huid langs de plaats van de incisie. Zorg ook voor ibuprofen (50-60 mg/kg/dag; 10 mL Apk in 500 mL water) continu in het drinkwater gedurende 3 dagen voor pijnbehandeling.
- Plaats elke muis individueel in een gesteriliseerde kooi.
- Houd onder nauwe observatie voor ongeveer 1-2 uur tot volledig hersteld van anesthesie.
- Herstel dieren op papieren handdoeken in een schone kooi zonder beddengoed. Deze stap minimaliseert het risico van tracheale obstructie of longontsteking. Zorg voor aanvullende warmteondersteuning tijdens het anesthetisch herstel. Controleer de chirurgische plaats om de scheuring van de wond te voorkomen.
- Na de herstelperiode (ongeveer 24 uur na de operatie) plaats je muizen terug naar hun thuiskooi.
- Voer het experiment niet ten minste 2 weken na de operatie uit.
3. Hormoon-geïnduceerde estrus bij vrouwen
- Bepaal het estrous stadium van de vrouwtjes door het uitvoeren van een vaginale uitstrijkje zoals beschreven in McLean et al.18. Geen estrus cyclus verandering geeft aan dat de ovariectomie van het vrouwtje succesvol was.
- Injecteer estradiol benzoaat (20 μg per muis, opgelost in 0,1 mL gesteriliseerde olijfolie, intraperitoneally) 48 uur voorafgaand aan de test voor seksueel gedrag.
- Injecteer progesteron (500 μg per muis, opgelost in 0,1 mL olie, intraperitoneally) 4 uur voorafgaand aan de test voor seksueel gedrag.
OPMERKING: De geschiktheid van een estrus vrouwtje wordt bepaald door het vrouwtje dat genitale invoeging van een mannelijke muis 3 of meer keer accepteert, wanneer ze samenwonen met een seksueel actief en ervaren mannetje in één kooi.
4. Voorbereiding op de test voor seksueel gedrag
- Voer de seksuele gedragstest van mannelijke muizen uit in een rechthoekige en open velddoos (40 cm x 40 cm x 40 cm) met zwarte plexiglaswanden, met uitzondering van een transparante voorwand die de waarneming van muisbewegingen mogelijk maakt.
- Stel de algemene kamerverlichting in op 650 lux.
OPMERKING: De muizen mogen niet direct worden verlicht om abnormale gedragspatronen te vermijden. - Gebruik een digitale camera gekoppeld aan een computer om de beweging en het gedrag van de muizen te filmen.
- Voer de gedragstest uit op de mannelijke muizen tijdens de eerste uren van de donkere cyclus.
5. Gewenning
- Houd de experimentruimte stil.
- Plaats de muizen te testen in het midden van het open veld vak, zodat ze de omgeving vrij te verkennen voor 30 min.
- Wenning muizen gedurende 2 opeenvolgende dagen voorafgaand aan de testdag in het apparaat om stress uit de nieuwe omgeving te voorkomen.
LET OP: Muizen moeten vrij bewegen en verkennen zonder stress te voelen. Zowel mannelijke als vrouwelijke muizen moeten worden gewend aan de testomgeving.
6. Gedragstesten
- Schakel de camera in voor het begin van de test.
- Plaats de muis te testen in het midden van het open veld in de testbox, waardoor gratis verkenning voor 5 min te acclimatiseren aan het milieu.
- Plaats een vrouwtje in estrus in de testbox.
- Noteer het sociale en paringsgedrag en de interacties tussen de mannelijke en vrouwelijke muizen gedurende 30 min.
- Schakel de camera uit en bevestig dat de video is opgeslagen.
- Haal het vrouwtje uit de testbox en noteer de vorming van een vaginale plug.
OPMERKING: Een vrouwelijke muis die de paring accepteerde, kan niet in één dag in een andere test voor seksueel gedrag worden gebruikt. - Plaats het vrouwtje terug naar zijn thuiskooi.
- Breng het mannetje terug naar zijn thuiskooi.
- Reinig de urine, ontlasting en vulling in het apparaat.
- Verwijder de geur van de geteste muizen met 75% ethanol.
- Start de test van de volgende mannelijke muis door de stappen 6.1–6.10 te herhalen.
7. Gedragsgegevensextractie
- Speel de video-opname af en haal de gedragsparameters eruit (zie figuur 2).
- Noteer het aantal mounts in 30 min.
- Noteer het aantal intromissies in 30 min. Tel een bekkenstuwkracht als intromissie.
- Noteer de tijd vanaf de introductie van het vrouwtje tot de eerste montage als montagelatentie.
- Noteer de tijd van de introductie van het vrouwtje tot de eerste intromissie als intromissielatentie.
- Noteer de tijd van de eerste intromissie tot de eerste ejaculatie als ejaculatielatentie.
- Noteer de tijd van ejaculatie naar de volgende montage als post-ejaculatoire mount latency.
- Recordaantal copulatory series in 30 min. Een copulatory reeks is elke opeenvolging van montage aan ejaculatie.
- Noteer de tijd van alle copulatory series in 30 min als de duur van de copulatory serie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een vergelijking van seksueel gedrag tussen CD-1 muizen die in isolatie en groep-gehuisveste CD-1 muizen worden getoond. Mannelijke CD-1 muizen werden willekeurig toegewezen in een isolatie-opgefokte groep (IS, een muis per kooi, n = 30) en een groep gehuisveste groep (GH, vijf muizen per kooi, n = 15). De muizen ondergingen isolatie die van postnatale dag 23 tot dag 93 wordt grootgebracht. Vervolgens werden beide groepen muizen beoordeeld op seksueel gedrag. Uit onze studie bleek dat het slagingspercentage van copulatie in de IS-groep lager was dan in de GH-groep (IS: 80,0%, GH: 86,7%), hoewel er geen statistisch significant verschil tussen groepen werd waargenomen (p = 0,458). De montagelatentie was langer in de IS-groep dan in de GH-groep (p = 0,002, figuur 3A),wat aangeeft dat de eerste meer tijd nodig had om seksueel gedrag te initiëren. Intromission latency was langer in de IS-groep dan in de GH-groep (p = 0,015, figuur 3B),wat aangeeft dat de eerste een langere tijd nodig had om de invoeging van de penis in de vagina van het vrouwtje uit te voeren. Er werd geen statistisch significant verschil tussen de twee groepen waargenomen in termen van ejaculatielatentie en post-ejaculatoire mount latentie. De duur van de copulatory-reeks was in de IS-groep korter dan in de GH-groep (p = 0,002, figuur 3C). Er werden geen statistisch significante verschillen tussen de twee groepen waargenomen in termen van het aantal mounts, het aantal intromissies en het aantal copulatiereeks19 (zie tabel 1).
| Isolatie-gefokt | Groeps-gehuisvest | t/t' | P | |
| N | 30 | 15 | ||
| Montage latentie a | 788,70 ± 262,77 | 365,03 ± 288,65 | -3.87 | 0.002 |
| Intromission latentie | 937,30 ± 369,87 | 542,94 ± 352,40 | -2.75 | 0.015 |
| Ejaculatielatentie | 16,58 ± 9,78 | 17,37 ± 13,03 | -0.2 | 0.845 |
| Post-ejaculatoire mount latentie | 173,00 ± 89,84 | 192,87 ± 106,91 | 0.58 | 0.565 |
| Duur van de copulatory reeksen | 88,27 ± 52,40 | 151,65 ± 40,87 | 3.44 | 0.002 |
| Aantal mounts b | 2,4±2,0 | 3.3±3.3 | 1.09 | 0.282 |
| Aantal intromissies | 20,1±12,9 | 22,6±12,3 | 0.58 | 0.564 |
| Aantal copulatory reeksen | 7,0±4,3 | 9,3±4,6 | 1.55 | 0.131 |
| Gemiddelde ± SD; een eenheid is tweede (s). b-eenheid telt. | ||||
Tabel 1: Seksuele gedragsparameters van isolatie-gekweekte en groepsgerichte muizen.
Figuur 1: Ovariectomie van vrouwelijke muizen. De positie van verticale incisie en de rechter eierstok worden getoond. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Proces van seksueel gedrag van muizen. De rode pijl geeft het vrouwtje aan en de gele pijl geeft het mannetje aan. (A) Het mannelijke snuiven van anale-genitale gebieden aan het begin van seksueel gedrag. (B) Het mannetje dat het vrouwtje monteert. (C) De intromissie houding van het mannetje. (D) De ejaculatie van het mannetje. (E) Het mannetje grooming de genitale gebieden na ejaculatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Resultaten van seksueel gedrag test. (A) Box plot van de montage latency van IS en GH muizen. (B) Box plot van de intromissie latentie van IS en GH muizen. (C) De totale paringsduur van IS- en GH-muizen. *p < 0,05, **p < 0,01. Dit cijfer is gewijzigd van Liu et al.19. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn een paar kritieke stappen in het gepresenteerde protocol. Met betrekking tot de ovariectomie van vrouwen, de operatie incisie opening van de rug is minder schadelijk dan die van de buik. Gezien het feit dat de positie van de eierstok diep is, trekt andere organen wanneer de incisie wordt opengesneden uit de buik leidt vaak tot bloeden en resulteert in onduidelijke chirurgische visie20. We voerden de incisie op de rug uit om de eierstok gemakkelijk te bereiken en de chirurgische tijd te verkorten, evenals om de veiligheid van de operatie te garanderen.
Het onderhoud van steriele omstandigheden tijdens de operatie is belangrijk om te overleven. Vier belangrijke variabelen worden overwogen tijdens een chirurgische ingreep: de chirurgische ruimte, de instrumenten, de chirurg en het dier. Voor de chirurgische ruimte, met inbegrip van werkruimten en chirurgische ruimten, worden alle noodzakelijke oppervlakken voorafgaand aan de operatie gereinigd en ontsmet met de nodige ontsmettingsmiddelen (bijvoorbeeld verdund bleekmiddel, waterstofperoxideproducten). Bovendien wordt stoom onder druk met een autoclave aanbevolen. Tijdens een chirurgische ingreep is de verkeersstroom beperkt in de chirurgische ruimte. In een chirurgische ingreep moeten nieuw gesteriliseerde instrumenten en materialen voor elk dier worden gebruikt. Wanneer instrumenten buiten het steriele veld vallen of besmet raken, moeten ze onmiddellijk worden vervangen. Ondertussen, na het wassen / schrobben handen en armen grondig, chirurgen moeten alle steriele kleding, met inbegrip van een steriele jurk en steriele chirurgische handschoenen aan te trekken. Als materiaal besmet is, moet het getroffen artikel onmiddellijk voor de operatie worden gewijzigd (bijvoorbeeld nieuwe jurk of chirurgische handschoen). Ten slotte moet haar van de chirurgische plaats en de omgeving worden verwijderd voor de preventie van besmetting. De huid moet na ontharing met 75% ethanol worden geschrobd. Elektrische tondeuse of ontharingscrème kan worden gebruikt om het haar te verwijderen. Voorafgaand aan de operatie wordt een steriel laken over het dier geplaatst, waardoor toegang tot de chirurgische plaats voor de preventie van besmetting.
Drie aspecten van de postchirurgische behandeling van de dieren vereisen aandacht: verdovingsherstel, analgesie en chirurgische locatiebewaking en hechtingsverwijdering. Na het voltooien van de chirurgische ingreep moeten dieren worden gecontroleerd tijdens het herstel van de anesthesie. Het dier mag niet zonder toezicht worden achtergelaten totdat het weer voldoende bewustzijn heeft gekregen om strengrecumbency te behouden en mag niet worden teruggebracht naar het gezelschap van andere dieren totdat het volledig is hersteld. Daarnaast moeten passende herstelomstandigheden worden geboden, waaronder een warme omgeving die vrij is van voorwerpen die schade kunnen veroorzaken. Bijvoorbeeld, papieren handdoeken in plaats van maïskolf beddengoed worden gebruikt bij het herstel van de muizen en grote speelgoed of water kommen worden verwijderd uit grote dierlijke hokken. Volgens de richtlijnen van de Universiteit van Minnesota, de ovariectomie van vrouwen veroorzaakt matige tot ernstige pijn. Analgesie moet dus direct postoperatief worden toegediend door parenterale injectie of orale gavage21. In deze studie werd een lidocaïne-injectie onder de huid uitgevoerd na een operatie en werd water met ibuprofen gedurende ten minste 1-2 dagen toegediend voor pijnbehandeling. Bij de ontwikkeling van het pijnstillende plan moet echter een dierenarts worden geraadpleegd. Ten slotte moeten de postchirurgische gezondheid van het dier en de chirurgische plaats minimaal 3 dagen worden waargenomen en geregistreerd. Een operatielijn of wondclips worden gebruikt voor het hechten van de incisie, die 7-14 dagen na de operatie21van de huid moet worden verwijderd. In deze studie werd een opneembare lijn gebruikt om de incisie te hechten om hechtingsverwijdering te voorkomen.
De estrus van het vrouwtje werd kunstmatig gecontroleerd met ovariectomie en hormoongebruik, in plaats van het gebruik van een vrouwtje met natuurlijke estrus. Deze stap werd genomen om de consistentie van de seksuele ontvankelijkheid van het vrouwtje in de test te garanderen en de betrouwbaarheid van metingen te garanderen bij het monitoren van mannelijk paringsgedrag. Bovendien kan het hormoon-geïnduceerde estrusvrouwtje worden hergebruikt in een reeks experimenten en wordt de invloed van zwangerschap voorkomen. Estrus bij het vrouwtje wordt veroorzaakt door het injecteren van estradiol benzoaat en progesteron voor het experiment. Deze methode is eenvoudig te beheren, heeft een hoog slagingspercentage en meerdere estrusvrouwtjes kunnen tegelijkertijd worden verkregen, waardoor de efficiëntie van de test aanzienlijk wordt verbeterd.
Seksueel naïeve en ervaren muizen vertonen verschillende gedragspatronen. Er moet aandacht worden besteed aan de testtestbetrouwbaarheid van het experiment in verschillende stadia van de ontwikkeling van muizen. De dynamische verandering in seksueel gedrag moet worden overwogen voordat de test wordt uitgevoerd en in de experimentele ontwerpfase. In deze studie werden seksueel naïeve mannen gebruikt voor de seksuele gedragstest en alleen het eerste optreden van seksueel gedrag werd gemeten zonder enige training voorafgaand aan de test. Copulatie is het uiteindelijke resultaat van een reeks van feromoon detectie, montage, intromissie, en ejaculatie. Er is een beperking van het huidige experimentele protocol wanneer toegepast op gemuteerde muizen. Bijvoorbeeld, mannelijke muizen met gerichte mutaties van Adcy3, Cnga2, en Gnao vertonen verminderd vermogen om feromonen te detecteren14,15,16, terwijl de Trpc2 knock-out muizen tonen veranderde partner voorkeur22. Het huidige protocol kan niet in staat zijn om het seksuele gedrag van gemuteerde muizen vertonen vanwege zijn verminderde vermogen om feromonen te detecteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Lu Cong, Zhang Hongxia, Zhang Beiyue en Hu Mi voor hun suggesties voor de experimenten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Choral hydrate | Sinopharm Chenmical Reagent Co., Ltd. | 20160225 | |
| Coated VICRYL Plus Sutures | Ethicon, Inc. | missing | |
| Estradiol benzoate | J&K Scientific, Ltd. | L930Q170 | |
| Ethanol absolute | Beijing Chemical Works Co., Ltd. | 20160715 | |
| Ibuprofen (Children's Motrin) | Shanghai Johnson & Johnson Co., Ltd. | 160629478 | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co., Ltd. | 217180501 | |
| Lidocaine | HebeI Tiancheng Pharmacreutical Co., Ltd. | 1170506107 | |
| Male and female CD-1 mice | Vital River Beijing | SCXK( )2013-0023 |
|
| Olive oil | |||
| Penicillin sodium | North China Pharmaceutical Co., Ltd. | F5126420 | |
| Progesterone | J&K Scientific, Ltd. | LR50Q07 | |
| Sony digital camera | Sony Corporation | HDR-CX290E | |
| Test box | DIY | ||
| ThinkStation Computer | Lenovo | S/N PCOGLQKG | |
| Vaporizer for Isoflurane | RWD Life Science Co., Ltd. | E05904-009M |
References
- The staff of the Jackson laboratory. Biology of the Laboratory Mouse. , Second Edition, Dover publications, inc. New York. Chapter 11 (2007).
- Burns-Cusato, M., Scordalakes, E. M., Rissman, E. F. Of mice and missing data: what we know (and need to learn) about male sexual behavior. Physiology & Behavior. 83 (2), 217-232 (2004).
- Crawley, J. N. What's Wrong With My Mouse?. , Second Edition, John Wiley & Sons, Inc. (2006).
- Whishaw, I. Q., Haun, F., Kolb, B. Analysis of Behavior in Laboratory Rodents. Modern Techniques in Neuroscience Research. Windhorst, U., Johansson, H. , Springer. Berlin, Heidelberg. (1999).
- Sachs, B., Barfield, R. Functional Analysis of Masculine Copulatory Behavior in the Rat. 7, (1976).
- Hull, E. M., Dominguez, J. M.
- Mosig, D. W., Dewsbury, D. A. Studies of the copulatory behavior of house mice (Mus musculus). Behavioral Biology. 16 (4), 463-473 (1976).
- Park, J. H. Assessment of Male Sexual Behavior in Mice. Mood and Anxiety Related Phenotypes in Mice. Gould, T. 63, Humana Press. (2011).
- Bonthuis, P. J., et al. Of mice and rats: key species variations in the sexual differentiation of brain and behavior. Frontiers in Neuroendocrinology. 31 (3), 341-358 (2010).
- Levine, L., Barsel, G. E., Diakow, C. A. Mating behaviour of two inbred strains of mice. Animal Behavior. 14 (1), 1-6 (1966).
- McGill, T. E. Sexual Behavior in Three Inbred Strains of Mice. Behaviour. 19 (4), 341 (1962).
- James, P. J., Nyby, J. G. Testosterone rapidly affects the expression of copulatory behavior in house mice (Mus musculus). Physiology & Behavior. 75 (3), 287-294 (2002).
- Arteaga-Silva, M., Rodriguez-Dorantes, M., Baig, S., Morales-Montor, J. Effects of castration and hormone replacement on male sexual behavior and pattern of expression in the brain of sex-steroid receptors in BALB/c AnN mice. Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Molecular & Integrative Physiology. 147 (3), 607-615 (2007).
- Zhang, Z., et al. Deletion of Type 3 Adenylyl Cyclase Perturbs the Postnatal Maturation of Olfactory Sensory Neurons and Olfactory Cilium Ultrastructure in Mice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 1 (2017).
- Mandiyan, V. S., Coats, J. K., Shah, N. M. Deficits in sexual and aggressive behaviors in Cnga2 mutant mice. Nature Neurosciemce. 8 (12), 1660-1662 (2005).
- Choi, C. I., et al. Simultaneous deletion of floxed genes mediated by CaMKIIalpha-Cre in the brain and in male germ cells: application to conditional and conventional disruption of Goalpha. Experimental & Molecular Medicine. 46, 93 (2014).
- Pelch, K. E., Sharpe-Timms, K. L., Nagel, S. C. Mouse model of surgically-induced endometriosis by auto-transplantation of uterine tissue. Journal of Visualized Experiments. (59), e3396 (2012).
- McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. Journal of Visualized Experiments. (67), e4389 (2012).
- Liu, Z. W., et al. Postweaning Isolation Rearing Alters the Adult Social, Sexual Preference and Mating Behaviors of Male CD-1 Mice. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13, 21 (2019).
- TIan, E. P., Long, T., Qin, D. N. Establishment and applications of mating model in male rat. Chinese Journal of Andrology. 22 (1), 7-10 (2008).
- University of Minnesota Academic Health Center Research Service. Anesthesia Guidelines: Mice. , Available from: https://www.researchservices.umn.edu/services-name/research-animal-resources/research-support/guidelines/anesthesia-mice (2019).
- Leypold, B. G., et al. Altered sexual and social behaviors in trp2 mutant mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (9), 6376-6381 (2002).
