Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

Fare Gözüne Biyolojik Teslim için Kapsüllü Hücre Teknolojisi

doi: 10.3791/60162 Published: March 30, 2020

Summary

Burada sunulan kemirgen gözlere biyolojik uzun süreli teslimat için ölümsüzleştirilmiş hücrelerin mikrokapsülasyonu bir polimer olarak aljinat kullanımı için bir protokoldür.

Abstract

Gözün arka kutbu hastalıkları için geliştirilmekte olan birçok mevcut tedavi biyolojiktir. Bu ilaçların sık sık uygulanması gerekir, genellikle intravitreal enjeksiyonları yoluyla. Tercih edilen biyolojik ifade kapsüllü hücreler yerel protein üretimi ve salınımı için bir araç haline gelmektedir (örneğin, uzun süreli ilaç teslimatyoluyla). Buna ek olarak, kapsülleme sistemleri besin, atık ve terapötik faktörlerin hücre içine ve dışarı difüzyon sağlayan geçirilebilir malzemeler kullanır. Bu konak bağışıklık yanıtı hücreleri maskeleme sırasında oluşur, konak bağışıklık sisteminin baskılanması için ihtiyaç kaçınarak. Bu protokol, mikrokapsüllemede polimer olarak aljinat kullanımını, elektrosprey yöntemi ile birleştiğinde mikrokapsülleme tekniği olarak tanımlar. ARPE-19 hücreleri, kendiliğinden ortaya çıkan insan RPE hücre hattı, yaşam boyu işlevselliği nedeniyle uzun vadeli hücre tedavisi deneylerde kullanılmıştır, ve kapsüllerin kapsülleme ve fare gözlerine teslimi için burada kullanılmaktadır. El yazması hücre mikrokapsülasyonu, kalite kontrolü ve oküler teslimat için adımları özetler.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hücre temelli tedaviler tıpta yaygın olarak uygulanan devrimci biyolojik teknikleri temsil eder. Son zamanlarda, onlar başarıyla nörodejeneratif hastalıkların tedavisinde uygulanmıştır, göz hastalıkları, ve kanser. Hücre tedavileri hücre protezinden ilaç dağıtımına kadar geniş bir alanı kapsamaktadır ve bu protokol ikincisine odaklanır. Biyobozunur aljinat mikrokapsüller (MC) bir dağıtım sistemi olarak etkinliğini göstermiştir, ve yaygın biyomedikal alanda kullanılmaktadır. Aljinat basit jelleşme işlemi, biyobozunurluk, mükemmel biyouyumluluk ve in vivo koşullar altında stabilite nedeniyle mikrokapsülasyon kullanılmıştır1,2,3,4.

Elektrosprey yöntemi, mikrokapsülleme tekniği olarak, aljinat (baz polimer) ve poli-l-ornitin (ikincil kaplama polimeri) kullanılarak peptidve proteinleri kapsüllemek için başarıyla kullanılmıştır. Her iki polimerdoğal olarak bulunur ve biyouyumluluk için kullanılır5,6,7. Ancak, hücre tabanlı tedavilerde ana sorun immünsupresif ilaçların neden olduğu yan etkileri önlemek için konak bağışıklık sisteminin bastırılmasıdır. Aljinat mikrokapsüllerin geçirgenliği hücre kapsülülasyonu için uygun bir özellik olarak kabul edilir, hangi besin difüzyon sağlar, atık, ve hücrelerin içine ve dışında terapötik faktörler in host bağışıklık yanıtı onları maskeleme8,9,10.

Gözde, kapsüllü hücreler retinitis pigmentosa veya yaşa bağlı makula dejenerasyonu tedavisi için biyolojik (yani, büyüme faktörleri11,,12 ve büyüme faktörü antagonistleri13)sürekli teslimat için klinik çalışmalarda kullanılmıştır. Kompleman inhibitörleri14 gibi diğer hedefler de şu anda klinik öncesi ortamlarda araştırılmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tüm deneyler, Göz Ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımına İlişkin ARVO Bildirimi uyarınca gerçekleştirildi ve Güney Carolina Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Tarafından 00399 protokolü altında onaylandı.

1. Hücre Kültürü

  1. İnsan retinapigment epitel hücreleri oluşturmak (ARPE-19) hücre hattı stably yayınlanan protokollere göre tercih edilen geni ifade14,15.
  2. Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta (DMEM)%10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenen hücreleri koruyun.
  3. Hücreleri 37 °C ve %5 CO2'dekuluçkaya yatırın.
  4. Orta yı 2-3 günde bir değiştirin.
  5. Standart doku kültürü prosedürleri kullanılarak %70-%80 biraraya geldikten sonra hücreleri geçiş.

2. Hücre Kapsülleme

  1. Sodyum aljinat %2 w/v'lik son konsantrasyon için deiyonize (DI) su ile karıştırın ve 0,2 m steril şırınga filtresi ile filtrasyon ile arındırın.
  2. Hücreleri aljinat çözeltisi ile karıştırılarak 10 mM HEPES tamponlu salin çözeltisi (pH = 7.4) ile inceleyerek, santrifüj ederek ve yıkayarak hazırlayın. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve aljinat çözeltisinde son hücre konsantrasyonu 1 x 106'ya ayarlayın.
    NOT: Kapsülleme işlemi steril bir başlık içinde çalıştırılmalıdır.
  3. 3 mL şırınga içine aljinat ve hücre karışımı ~ 300 μL aliquots yük ve bir şırınga pompası takın. Çözelti, 30 G künt uçlu iğneile steril jelling banyosuna pompalanır ve 7 mm'de şırınga ucunun altında steril 50 mL kabına yerleştirilir.
  4. Jelleme banyosu 100 mM kalsiyum klorür (CaCl2)ve %0,5 w/v poli-L-ornit (FKÖ) içeren 10 mM HEPES tamponlu salin hacmi40 mL içerir. FKÖ, araştırmacının ihtiyaçlarına göre atlanabilen veya değiştirilebilen ikincil bir polimer kaplamadır.
  5. Gerilimi ve akış hızını ayarlayın ve kapsülleme işlemi sırasında her ikisini de 60 mm/h akış hızında ve 6,0 kV başlangıç voltajında sabit tutun ve ~150 μm mikrokapsül boyutunda üretin.
  6. Yüksek voltajlı jeneratör iğne ucunun anodu telinin (kırmızı) klibini iğneye bağlayın ve zemin klibini (siyah) jelle banyosuna yarı yarıya batırılmış bakır kabloya bağlayın. Aljinat + hücre karışımı (1 mL) bir toplu kapsüllü hücreleri (yaklaşık 25.000 mikrokapsül) hazırlamak için yaklaşık 30 dakika sürer.
  7. Hücreleri içeren mikrokapsülleri yıkama solüsyonuyla yıkayın (10 mM HEPES tamponlu tuzlu içeren 1.5 mM CaCl2, pH = 7.4) iki kez. Yıkama için PBS kullanmayın.
  8. Kapsüllü hücreleri %10 FBS destekli DMEM media ile 37 °C ve %5 CO2'denemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın.
    NOT: Kapsülleme proses aletleri Şekil 1'degösterilmiştir.

3. Kapsüllemenin Hücre Canlılığını Etkilemediğinin Teyidi

  1. Kapsüllü hücreleri 24 saat boyunca ortama kattıktan sonra, boyama için 500 μL (~30 mikrokapsül) küçük bir örnek hazırlayın.
  2. Mikrokapsülleri yıkama solüsyonu (10 mM HEPES tamponlu tuzlu 1,5 mM CaCl2)kullanarak yıkayın ve canlı/ölü bir asay kiti kullanarak canlı ölü canlılığı için lekeleyin.
  3. Calcein (asetoksimetil) ve ethidyum homodimer-1'in boyanma karışımını sırasıyla 2 μM ve 4 ΜM'lik son konsantrasyonlarda hazırlayın.
  4. Kapsüllü hücrelere 2 mL boyama karışımı ekleyin ve oda sıcaklığında karanlıkta 30-45 dakika kuluçka (RT).
  5. Dikkatli aspirasyon ile, boyama çözeltisi aspire ve yıkama çözeltisi ile mikrokapsül 2x yıkayın. Kapsüllenmiş hücreleri gözlemlemek ve görüntülemek için floresan mikroskop sistemi kullanın.
    NOT: Kapsülleme dokümantasyonu Şekil 2'degösterilmiştir.

4. Kapsüllerin Biyolojik Teslim ve Teslim için Uygun Boyut olduğunun teyidi

  1. Fare gözündeki intravitreal enjeksiyonlar genellikle 2,5 μL Hamilton şırıngayA bağlı 27 G künt uçlu iğne (iç çap 210 μm) ile yapılır.
  2. 100 ila 200 μm arasında değişen kapsüller oluşturun, serumsuz ortamda seyreltin ve dikkatlice Hamilton şırınga içine çekin. PBS uygun bir araç değildir, aljinit kapsüller PBS çözünür gibi.
  3. Kapsül içeren 1μL damlaları mikroskop slaytına yavaşça çıkarve dik parlak alan mikroskobu kullanarak bütünlüklerini belirleyin.
  4. Voltajı ve akış hızını buna göre ayarlayarak kapsül boyutunu (bkz. adım 2.3) ayarlayın. Daha küçük mikrokapsüller gerilimi artırarak ve akış hızını biraz azaltarak doğrusal olmayan bir şekilde üretilmektedir8. Elimizde 150 m çapında kapsüllerin en uygun olduğu kanıtlanmıştır. Kapsül boyutunun ayarlanı da diğer parametreleri değiştirirken aljinat konsantrasyonu sabit tutmaya bağlıdır.
  5. İstenilen biyolojik salgı miktarını belirlemek için serumiçermeyen ortamda uygun boyutta kapsüllerde ayrı bir hücre kümesi saklayın. Supernatant biyolojik konsantrasyonu belirlemek için hassas ELISA veya batı lekeleme kullanın.
  6. Terapötik bilinen PK/PD'ye (farmakokinetik/farmakodinamik) dayanarak enjekte edilmesi gereken kapsülmiktarını belirleyin. Elimizde, fare gözü başına 10 kapsül en etkili olduğu kanıtlanmıştır.

5. Fare Vitreus içine Kapsül Teslim

  1. Bir diseksiyon mikroskop kullanarak intravitreal enjeksiyonları gerçekleştirin. Ameliyat sırasında kullanılan cerrahi kurulum ve malzemeler için Şekil 3'e bakınız. İntravitreous enjeksiyonlar için ayrıntılı bir protokol başka bir yerde bulunabilir16.
  2. Ksilazin ve ketamin intraperitoneal enjeksiyon (20 mg/kg ve 80 mg/kg) veya özel kurumun Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan diğer tercih edilen anestezikler ile fareleri anestezik. Bir parmak tutam17kullanarak anestezi uygun derinliği ni sağlamak.
  3. Fare gözbebeklerini fenilefrin HCL (%2.5) ile dilate ve atropin sülfat (%1) vitreus odasının iyi görünürlüğü için izin vermek ve işlem sırasında onları sulu tutmak için gözlere bir yağlayıcı göz jeli uygulamak.
  4. Kılavuz deliği olarak 26 G iğne ile limbustaki sklerayı delin, 1) iğnenin göz ve masa ile 45° açıda olduğundan emin olun ve 2) eğimli uç, merceğin delinmesini önlemek için yukarı doğru işaret edin.
  5. Kapsülleri, görsel inceleme altında 45° açıyla Hamilton şırıngasına bağlı 27 G künt uçlu iğne kullanarak dikkatlice enjekte edin ve iğneyle merceğe dokunmaktan kaçının. Lensin yaralanması katarakt oluşumuna yol açacaktır. Kapsüller, kesişme mikroskobu kullanılarak vitreusta görülmelidir(Şekil 4A).
  6. İğnenin geri çekilmesinden sonra, deksametazon oftalmik antibiyotik merhemine ek olarak enjeksiyon bölgesini neomisin ve polimiksin B sülfatları ile tedavi edin.
  7. Goniotaire hypromellose demulcent oftalmik solüsyon (%2.5) uygulayın her iki göze korneaların iyileşme döneminde kurumasını önlemek için.
  8. Fareyi 37°C'de tutulan bir ısıtma yastığına yerleştirin ve tamamen uyanana kadar izleyin.
  9. Kapsüllü ARPE-19 hücrelerinin başarılı bir enjeksiyon optik koherence tomografi veya diğer yöntemlerle göz görüntüleme enkaz sadece küçük miktarlarda farenin vitreus odasında bozulmamış kapsül varlığını ortaya çıkarmalıdır(Şekil 4B).
  10. Enjekte edilen fare gözü, ameliyat nedeniyle birkaç gün sonra, şimdi eldeki deneysel paradigma için hazırdır.
    NOT: Gözdeki kapsüllerin cerrahi kurulumu ve dokümantasyonu sırasıyla Şekil 3 ve Şekil 4'tegösterilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ARPE-19 hücreleri kapsüllerin göze yerleştirilmesi üzerine kapsülleme ve uzun süreli sağkalım için uygun olduğu gösterilmiştir bir spontan ölümsüzleştirilmiş insan RPE hücre hattı vardır. Aljinat kapsülleme araçları Şekil 1'degösterilmiştir. Bu çalışmada aljinat kapsüllerinin kapsüllenmesi üzerine aljinit kapsüllü hücrelerin parlak alan görüntüleme ile doğrulanmış olduğu gösterilmiştir(Şekil 2A). Kapsüllerin içindeki hücrelerde canlı ölü tahlilleri yapıldı ve kapsülleme sonrası %90 canlılık gösterdiler(Şekil 2B). Kapsüllerin içindeki hücrelerin uzun süreli canlılığını sağlamak için kapsüller sodyum sitratta çözünmüş ve hücreler yeniden kaplandı(Şekil 2C). Bağımsız deneylerde kararlı transfected ARPE-19 hücreleri ifade ve istenilen biyolojik salgılanan doğruladıktan sonra14, ve güvenli bir şekilde kapsülleme hücreleri için parametreleri kurulduktan sonra, kapsül göz içi enjeksiyonu için üretildi.

Fare gözüne yapılan intravitreal enjeksiyonlar, gerekli 1 μL'lik küçük hacmi sürekli olarak enjekte etmek için 27 G künt uçlu iğne (iç çap 210 μm) ve doğru dağıtım sistemi kullanılmasını gerektirir. 27 G iğnesi ile ejeksiyon sırasında hasar görmemiş kapsüllerin boyutu mikroskopi ile doğrulandı(Şekil 2A). Optimum boyut 150 μm olarak belirlendi. İntravitreal enjeksiyon görsel muayene altında yapıldı, hangi vitreus kapsül görselleştirilmesi izin(Şekil 4A). Aynı şekilde, OCT görüntüleme yapıldı, hangi farenin vitreus odasında kapsül çoğunluğu enkaz nispeten küçük miktarlarda bozulmamış olduğunu doğruladı(Şekil 4B). Yayınlanan deneylerin takibinde, tedavi ye uygun dozlarda gözde istenilen biyolojik maddenin mevcut olduğu doğrulanmış, araştırma altında hastalık sürecini inhibe14. Bu sonuçlar, kapsüllenmiş hücrelerin biyolojik uzun süreli teslimat için fare gözlerine güvenle enjekte edilebileni doğrulamıştır.

Figure 1
Şekil 1: Kapsülleme proses aletleri. Kurulum (A) 3 mL şırınga içerir, (B) 0.2 μm filtreler, (C) 30 G, 1/2 inç künt ucu iğne, (D) elektronik şırınga sürücüsü, (E) yüksek voltaj jeneratörü, (F) sistem kurulum, ve (G) iğne ucu ve jelleme çözeltisi yüzeyi arasında 7 mm sabit mesafe. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Hücre kapsüllemi. (A) Arpe 19 hücreleri ile dolu mikrokapsüller. (B) Canlı/ ölü teşp: [a] kırmızı floresan renk ölü hücreleri gösterir, ve [b] yeşil floresan renk canlı hücreleri gösterir. (C) Küçük bir küme ile başlayan mikrokapsüllerden geri kazanıldıktan sonra kültürlü hücreler biraraya gelir. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Cerrahi kurulum. Prosedürü görselleştirmek için video kameralı (2) bir kesme mikroskobu (1) kullanılır. Fare (3) anestezi uygun miktarda yönetmek için tartılır ve küçük bir platform (4) işleme ve enjeksiyon kolaylaştırmak için yerleştirilir. Gözler midrietik atropin ve fenilepinefrin (5) ile genişlemiş ve yağlayıcı ile sulu tutulur (6). Bir kılavuz delik 26 G iğne (7) kullanılarak limbus hemen dışında delinmiş. Uygun şekilde seyreltilmiş kapsüllerle (9) yüklenen cam şırınga (8), fare gözüne 45° açıyla yerleştirilir ve mikromanipülatör (10) kullanılarak kılavuz deliğinden geçer. İğne izi ve serbest bırakılan kapsüller görselleştirilebilir [(11); bkz. Şekil 4]. İğnenin geri çekilmesi üzerine kornea, enfeksiyondan korunmak için enjeksiyon bölgesine uygulanan hypromellose (12) ve antibiyotik merhem (13) ile nemlendirilir. İşlemden sonra, fare 37 °C'lik bir ısıtma yastığına yerleştirilir ve tamamen uyanana kadar izlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: ARPE-19'u göze getirmek için kapsüllenmiş hücre teknolojisi. (A) Enjeksiyonlar Hamilton şırıngasına bağlı künt 27 G iğne kullanılarak yapılır. İğne ucu göze girerken, merceğin (ok ucu) önlenerek, fare gözünün optik sistemi yle büyütülerek görüntülenebilir. Işık kaynağının dairesel yansıması olduğu unutulmamalıdır. (B) Kapsüller (ok ucu) optik koherens tomografi kullanılarak vitreus içinde görüntülenebilir. Ölçek çubukları = 200 μm. Panel B Annamalai ve ark.14izni ile yeniden basıldıBu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu hücre kapsülleme tekniği nispeten hızlı ve gerçekleştirmek kolaydır; ancak, doğru downstream sonuçları elde etmek için bazı noktalar akılda tutulmalıdır. Hücreler kapsülleme den önce bir Petri kabında kültür de muhafaza edilmeli ve uygun bir araya tutulmalıdır. Kapsülleme, mümkünse düzenlenmiş hava akışı ile uygun bir havalandırma kaputunda yapılmalıdır. Çok güçlü bir hava akımı kapsül oluşumunu etkileyebilir, özellikle uzun vadeli deneylerde. Steril gereçler ve çözümler kapsül içindeki hücrelerin uzun süreli bakımı için önemlidir.

Şu anda, canlı ölü boyama kapsül içinde hücrelerin canlılığını belirlemek için doğrulayıcı bir araç olarak kullanılır. Kapsül başına ve mevcut durumun altında hücre sayısı (yani, normalde kapsül başına 12-20 hücre) de görsel olarak belirlenir. Kapsüllenmiş hücre toplu her toplu canlılık bu yöntemle izlenir. Hücrelerin canlılığını daha fazla belirlemek için kapsüllenmiş hücreler çözülür ve yeniden kültürlenir. Bu daha da kapsül içinde hücrelerin canlılık ve bütünlüğünü gösterir, başarılı hücresel kapsülleme doğrulayan.

Hücresel kapsülleme için kullanılan parametreler bu özel hücre tipi için kurulmuştur. Yukarıda belirtilen parametreler, bu deneyler için ARPE 19 hücrelerinin kapsüllanması nda kullanılan parametrelerdir. Akış hızı, aljinat konsantrasyonu, uygulanan gerilim ve kapsüllerin ikincil kaplama kapsüllerin uygun kullanımı için ayarlanabilir tüm değişkenler vardır. Aynı şekilde, belirli bir deney için gerekli kapsül miktarı ampirik ya da biyolojik bilinen PK / PD dayalı belirlenmesi gerekir. Her zaman uygun kontrol deneyleri yapmak önemlidir, kapsül ve kapsül ler salgılanan faktörlerin varlığını kontrol etmek için transfected ARPE-19 hücreleri ile yüklü varlığını kontrol etmek için boş kapsül ekleyerek. ARPE-19 hücreleri de bir kontrol plazmid ivedi olabilir, farenin küçük vitreous kapsül bile az sayıda varlığı olarak (<10 μL) gözün normal fizyolojisini değiştirmek için görünür. Bu bağlamda, salgılanan proteinler araştırma altında biyolojik etkinliğini engelleyebilir gibi, kapsülleme koşulları altında APRE-19 hücrelerinin salgılanması bilmek önemlidir (yanı sıra belirli bir hastalık durumunda vitreus varlığında).

Son olarak, bu teknik AMD tedavisi için kompleman inhibitörleri uzun vadeli teslimat için proof-of-prensip sağlamak ve intravitreal enjeksiyonları mevcut yöntemini geliştirmek için uygulanmıştır14. Gelişimin mevcut aşamasında, kompleman inhibitörleri genellikle aylık enjeksiyonlar kullanılarak vitreus içine enjekte edilir. Bu kompleman faktörü D bloke antikor lampalizumab enjeksiyonu içerir18, coğrafi atrofi ilerlemesini azaltmak için bir faz III klinik çalışmada başarısız olan, veya kompleman faktörü 3 inhibitörü APL-219, şu anda bir faz III klinik çalışmada.

İntravitreal enjeksiyon enjeksiyon kendisi yan etkileri tarafından engellenir (yani, retina dekolmanı riski, göz içi basıncında artış, endoftalmit, vb). Buna ek olarak, ilaç düzeyleri aylık intravitreal enjeksiyonları üzerine ay boyunca önemli ölçüde değişecektir, ve rebound reaksiyonlar beklenebilir. Alternatif olarak, gen tedavisi stratejileri geliştirilmektedir, çözünür CD59 kompleman inhibitörü20gibi , şu anda bir faz I klinik denemede. Kapsüllü hücreler de uzun süre bir biyolojik sürekli üretim için izin ve sonlandırılabilir (yani, kapsül ekstrplanting), gerekirse.

Bugüne kadar, biz sadece ~ 6 hafta14boyunca bir biyolojik üretim için test ettik. Burada açıklanan yöntemin sadece hayvan modellerinde prensip kanıtı için kullanılması gerektiği ve hastalarda kullanılmaması gerektiği unutulmamalıdır, çünkü aljinit kapsüller enjeksiyon sırasında parçalanmasını tamamen önleyecek kadar stabil değildir ve birkaç haftadan uzun sürmesi beklenmez. Buna karşılık, Neurotech tarafından geliştirilen gibi sağlam bir cihaz yıl21 gerekli faktörleri sunmak için sürebilir22,23,24. Buna ek olarak, bu yeni teknik de kapsüllü ilaç teslimatı ile kombine edilebilir. Genel olarak, bu gelişmekte olan alan hızla gen tedavisi terapötik tekrarlanan enjeksiyonlar için alternatif bir strateji olarak gelişecektir beklenmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları beyan.

Acknowledgments

Çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01EY019320), Gazi İşleri Bakanlığı (RX000444 ve BX003050) ve Güney Carolina SmartState Vakfı tarafından B.R.'ye verilen hibelerle desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3 mL Syringe BD 309656
30 G 1" Blunt needle SAI Infusion technology B30-100
Alginic acid sodium salt, from brown algae Sigma A0682
Atropine Sulfate Ophthalmolic solution (1%) Akorn NDC 17478-215-15 for pupil dilation
BD 1 mL Syringe 26 G x 3/8 (0.45 mm x 10 mm) Becton, Dickinson and Company DG518105 500029609 REF 309625 to generate the guide hole
Calcium chloride, Anhydrous, granular Sigma C1016
GenTeal Tears Alcon NDC 0078-0429-47 to lubricate the eyes during anesthesia
Goniotaire: Hypromellose (2.5%) Ophthalmolic Demulcent Solution (Sterile) Altaire Pharmaceuticals Inc. NDC 59390-182-13 to lubricate the eyes during anesthesia
Hamilton Needle/syringe Tip: 27 G, Small Hub RN NDL, custum length (12 mm), point style 3, 6/PK Hamilton 7803-01 for intravitreal delivery of capsules
Hamilton Syringe: 2.5 µL, Model 62 RN SYR, NDL Sold Separately Hamilton 7632-01 for intravitreal delivery of capsules
HEPES buffer, 1 M Fisher Bioreagents BP299100
High voltage generator ESD EMC Technology ES813-D20
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit Thermofisher Scientific L3224
L-Ornithine hydrochloride, 99% Alfa Aesar A12111
Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone Ophthalmolic Ointment SANDOZ NDC 61314-631-36 antibiotic to prevent infection after intravitreal injection
Phenolephrine Hydrochloride Ophthalmolic Solution (2.5%) Akorn NDC 17478-201-15 for pupil dilation
Sodium Chloride Sigma S-5886
Sterile syringe filters, 0.2 μm VWR 28143-312
Syringe pump GRASEBY MS16A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Allen, T. M., Cullis, P. R. Drug delivery systems: entering the mainstream. Science. 303, (5665), 1818-1822 (2004).
  2. Tonnesen, H. H., Karlsen, J. Alginate in drug delivery systems. Drug Development and Industrial Pharmacy. 28, (6), 621-630 (2002).
  3. Vilos, C., Velasquez, L. A. Therapeutic strategies based on polymeric microparticles. Journal of Biomedical Biotechnology. 672760, (2012).
  4. Gasperini, L., Mano, J. F., Reis, R. L. Natural polymers for the microencapsulation of cells. Journal of the Royal Society Interface. 11, (100), 20140817 (2014).
  5. Gasper, D. P. R. Novel strategy to produce a drug delivery system for skin regeneration. Uma nova estratégia para produzir um dispositivo para entrega de fármacos que será usado na regeneração da pele. (2012).
  6. Huang, S., Fu, X. Naturally derived materials-based cell and drug delivery systems in skin regeneration. Journal of Controlled Release. 142, (2), 149-159 (2010).
  7. Nograles, N., Abdullah, S., Shamsudin, M. N., Billa, N., Rosli, R. Formation and characterization of pDNA-loaded alginate microspheres for oral administration in mice. Journal of Bioscience and Bioengineering. 113, (2), 133-140 (2012).
  8. Moore, K., Amos, J., Davis, J., Gourdie, R., Potts, J. D. Characterization of polymeric microcapsules containing a low molecular weight peptide for controlled release. Microscopy and Microanalysis. 19, (1), 213-226 (2013).
  9. Xu, Y., Skotak, M., Hanna, M. Electrospray encapsulation of water-soluble protein with polylactide. I. Effects of formulations and process on morphology and particle size. Journal of Microencapsulation. 23, (1), 69-78 (2006).
  10. Gryshkov, O., et al. Process engineering of high voltage alginate encapsulation of mesenchymal stem cells. Materials Science and Engineering: C. 36, 77-83 (2014).
  11. Thanos, C. G., et al. Sustained secretion of ciliary neurotrophic factor to the vitreous, using the encapsulated cell therapy-based NT-501 intraocular device. Tissue Engineering. (11-12), 1617-1622 (2004).
  12. Kauper, K., et al. Two-year intraocular delivery of ciliary neurotrophic factor by encapsulated cell technology implants in patients with chronic retinal degenerative diseases. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, (12), 7484-7491 (2012).
  13. Kauper, K., et al. Long term, sustained intraocular delivery of a VEGF antagonist using encapsulated cell technology implant for the treatment of choroidal neovascular diseases. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, 455 (2012).
  14. Annamalai, B., et al. Encapsulated Cell Technology-Based Delivery of a Complement Inhibitor Reduces Choroidal Neovascularization in a Mouse Model. Translational Visual Science Technology. 7, (2), 3 (2018).
  15. Alge, C. S., et al. Retinal Pigment Epithelium Is Protected Against Apoptosis by αB-Crystallin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43, (11), 3575-3582 (2002).
  16. Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. Intravitreous injection for establishing ocular diseases model. Journal of Visualized Experiments. (8), 313 (2007).
  17. Jove Science Education Database. Lab Animal Research. Anesthesia Induction and Maintenance. Journal of Visualized Experiments. (2019).
  18. Holz, F. G., et al. Efficacy and Safety of Lampalizumab for Geographic Atrophy Due to Age-Related Macular Degeneration: Chroma and Spectri Phase 3 Randomized Clinical Trials. JAMA Ophthalmology. 136, (6), 666-677 (2018).
  19. Kassa, E., Ciulla, T. A., Hussain, R. M., Dugel, P. U. Complement inhibition as a therapeutic strategy in retinal disorders. Expert Opinion in Biological Therapy. 19, (4), 335-342 (2019).
  20. Cashman, S. M., Ramo, K., Kumar-Singh, R. A Non Membrane-Targeted Human Soluble CD59 Attenuates Choroidal Neovascularization in a Model of Age Related Macular Degeneration. PLoS ONE. 6, (4), e19078 (2011).
  21. Vincent, L., et al. Generation of combination PDGF / VEGF-antagonist ECT devices. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54, 3290 (2013).
  22. Zhang, K., et al. Ciliary neurotrophic factor delivered by encapsulated cell intraocular implants for treatment of geographic atrophy in age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci USA. 108, (15), 6241-6245 (2011).
  23. Chew, E. Y., et al. Ciliary neurotrophic factor for macular telangiectasia type 2: results from a phase 1 safety trial. American Journal of Ophthalmology. 159, (4), 659-666 (2015).
  24. Birch, D. G., et al. Randomized trial of ciliary neurotrophic factor delivered by encapsulated cell intraocular implants for retinitis pigmentosa. American Journal of Ophthalmology. 156, (2), 283-292 (2013).
Fare Gözüne Biyolojik Teslim için Kapsüllü Hücre Teknolojisi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Belhaj, M., Annamalai, B., Parsons, N., Shuler, A., Potts, J., Rohrer, B. Encapsulated Cell Technology for the Delivery of Biologics to the Mouse Eye. J. Vis. Exp. (157), e60162, doi:10.3791/60162 (2020).More

Belhaj, M., Annamalai, B., Parsons, N., Shuler, A., Potts, J., Rohrer, B. Encapsulated Cell Technology for the Delivery of Biologics to the Mouse Eye. J. Vis. Exp. (157), e60162, doi:10.3791/60162 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter