Summary
Для получения достаточного количества высококачественной РНК для анализа экспрессии генов в костных клетках был разработан протокол лазерного захвата микродиссекции (LCM). Текущее исследование фокусируется на секциях бедренной кости мыши. Тем не менее, протокол LCM сообщил здесь может быть использован для изучения экспрессии генов в клетках любой твердой ткани.
Abstract
Урожайность РНК и целостность имеют решающее значение для анализа РНК. Тем не менее, это часто технически сложной задачей для поддержания целостности РНК на протяжении всей процедуры микродиссекции лазерного захвата (LCM). Поскольку исследования LCM работают с низким количеством материала, озабоченность по поводу ограниченных урожаев РНК также важны. Поэтому был разработан протокол LCM для получения достаточного количества высококачественной РНК для анализа экспрессии генов в костных клетках. Оценивался эффект протокола окрашивания, толщина криосекций, количество микрорассеченной ткани, комплект экстракции РНК и система LCM, используемая на выходе РНК и целостность, полученная из микрорасчленетированных костных клеток. Восемь мкм толщиной замороженных костных секций были сделаны с использованием клейкой пленки и окрашенных с помощью быстрого протокола для коммерческих LCM пятно. Образец был зажат между полиэтиленовой терефталат (ПЭТ) мембраной и клейкой пленкой. Для получения высококачественных РНК достаточной урожайности использовалась система LCM, использующую гравитацию для сбора образцов, и метод извлечения РНК на основе столбцов. Текущее исследование фокусируется на секциях бедренной кости мыши. Тем не менее, протокол LCM сообщил здесь может быть использован для изучения экспрессии генов situ в клетках любой твердой ткани как в физиологических условиях и процессах болезни.
Introduction
Ткани состоят из разнородных и пространственно распределенных типов клеток. Различные типы клеток в данной ткани могут по-разному реагировать на один и тот же сигнал. Поэтому важно уметь изолировать определенные популяции клеток для оценки роли различных типов клеток как в физиологических, так и в патологических условиях. Лазерный захват микродиссекции (LCM) предлагает относительно быстрый и точный метод для изоляции и удаления указанных клеток из сложных тканей1. Системы LCM используют силу лазерного луча для отделения интересных клеток от секций гистологических тканей без необходимости ферментативной обработки или роста культуры. Это означает, что клетки находятся в естественной среде обитания тканей, и что архитектура тканей, включая пространственные отношения между различными клетками сохраняется. Морфология как захваченных клеток, так и остаточной ткани хорошо сохранилась, и несколько компонентов ткани можно отобирать последовательно с одного слайда. Изолированные клетки могут быть использованы для последующего анализа их РНК, ДНК, белка или содержания метаболита2,3.
Для того, чтобы проанализировать экспрессию генов в различных популяциях клеток, или после различных процедур, необходимо получить мРНК достаточного качества и количества для последующего анализа4,5. В отличие от ДНК, РНК более чувствительны к фиксации и использование замороженных тканей рекомендуется, когда цель заключается в изучении РНК. Так как мРНК быстро деградируют вездесущими рибонуклеазами (RNase), требуются строгие условия без RNase при обработке и подготовке образцов и избежании хранения образцов при комнатной температуре. Кроме того, быстрые методы без каких-либо длительных шагов водной фазы имеют решающее значение для предотвращения деградации РНК6. Выход И целостность РНК также могут быть затронуты процессом LCM и системой LCM, используемой7,8. В настоящее время доступны четыре LCM-системы с различными принципами работы2. Метод извлечения РНК также может быть важным, так как различные комплекты изоляции РНК были протестированы со значительными различиями в количестве РНК и качестве7,8.
Любой метод подготовки тканей требует нахождения баланса между получением хорошего морфологического контраста и поддержанием целостности РНК для дальнейшего анализа. Для приготовления замороженных секций из кости была разработана клеевая пленка, которая постоянно совершенствуется9. Костные секции вырезаны и окрашены непосредственно на клейкой пленке. Эта клейкая пленка применима ко многим типам окрашивания, и может быть использована для изоляции клеток, представляющих интерес от костных криосекций с помощью LCM9,10,11,12,13, 14. Все шаги, включая хирургическое удаление, встраивание, замораживание, резки и окрашивания могут быть завершены в течение менее одного часа. Важно отметить, что клетки, такие как остеобласты, клетки костной подкладки, и остеокласты могут быть четко определены9,10,11,12,13,14. Преимущество этого метода заключается в том, что он быстр и прост. Альтернативный метод генерации криосекций костей заключается в использовании системы передачи ленты15. Однако последний метод занимает больше времени и требует дополнительных приборов, так как секции должны быть перенесены из клейкой ленты на предпокрываемые мембранные горки ультрафиолетовым (УФ) поперечное соединение. Хотя система передачи ленты была успешно соединена с LCM16,17,18,19, следует отметить, что перекрестное покрытие может создать фоновый шаблон, который может мешать идентификации клеточного типа20.
Как правило, из микрорасчленированных клеток извлекается лишь небольшое количество РНК, а качество и количество РНК часто оцениваются микрокапиллярным электрофорезом21. Компьютерная программа используется для присвоения индекса качества экстрактам РНК, называемому номером целостности РНК (RIN). Значение RIN 1.0 указывает на полностью деградированную РНК, в то время как значение 10.0 указывает на то, что РНК полностью нетронута22. Как правило, индексы старше 5 считаются достаточными для исследований РНК. Модели экспрессии генов в образцах со значением RIN 5.0-10.0, как сообщается, хорошо коррелируют друг с другом23. Хотя чувствительность этого метода высока, так как всего 50 пг/ зл общей РНК может быть обнаружено, это может быть очень трудно получить оценку качества, если концентрация РНК в образце очень низка. Таким образом, для того, чтобы оценить качество РНК, секция ткани, оставшаяся после LCM часто используется для извлечения РНК, путем трубоукладки буфера на слайд24.
Хотя LCM широко используется на различных замороженных тканях, значения RIN извлеченных РНК редко регистрируются. Кроме того, нет сравнительных исследований для уточнения наиболее подходящего метода для изучения РНК в костях мыши. В настоящем исследовании, замороженные участки из взрослых мачан бедренной кости были использованы для оптимизации подготовки образца, ПРОТОКОЛ LCM и экстракции РНК для получения высококачественных РНК. Настоящий протокол был оптимизирован, в частности, для системы LCM, которая использует гравитацию для сбора образцов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Костная ткань мышей использовалась в строгом соответствии с руководящими принципами по уходу за животными, и были предприняты все усилия, чтобы свести к минимуму страдания животных.
1. Животные и замораживание встраивания
- Домашние животные в условиях постоянной комнатной температуры (RT; 24 градуса по Цельсию) и 12 ч свет/12 ч темный цикл с бесплатным доступом к пище и воде.
ПРИМЕЧАНИЕ: Костные ткани в этом исследовании были получены от 3-месячного самца дикого типа C57BL/6 мышей. - При некропсии, exsanguinate мышей из брюшной полы вены под общим наркозом (кетамин / ксилазин, 100/6 мг/кг интраперитонеальной).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы избежать деградации РНК, используйте инструменты и материалы без RNase, надевайте перчатки и работайте быстро, избегая хранения образцов на RT на протяжении всего эксперимента. - Удалите целые бедренные кости быстро, очистить их от окружающих мягких тканей с помощью скальпеля и бумажных полотенец. Налейте оптимальную температуру резки (OCT) соединения в встраивание формы, и положить бедренной кости в нижней части встраивания формы. Прикрепите-заморозить образцы в жидком азоте. OCT является прозрачным на RT и белый, когда замороженные.
- После полного замораживания, завернуть образцы в фольгу и передать их на сухой лед до -80 градусов по Цельсию. Храните образцы при -80 градусах По Цельсию до дальнейшей обработки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь.
2. Подготовка секции
- Установите температуру в криостате до -19 градусов по Цельсию, а держателя блока - до -17 градусов. Протрите интерьер криостата, используя 70% этанола. Поместите одноразовые лезвие для твердых тканей, стеклянные слайды и подходящий инструмент в криостат, чтобы охладиться. Держите их внутри криостата в течение всего периода секции.
- Перенесите замороженный блок ткани на сухой лед в криостат и дайте ему уравновеситься не менее 10 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте повторного оттаивания и частого езды на велосипеде в одном блоке от -80 градусов по Цельсию до -19 градусов по Цельсию для криосекции. - Нажмите на дно встраивающей формы, чтобы вытолкнуть блок OCT из формы. Примените достаточное количество OCT-среды к держателю блока, чтобы прилипать к нему. Подождите, пока среда OCT полностью не будет заморожена.
- Поместите держатель блока в держатель объекта и затяните его на месте. Отрегулируйте положение лезвия и обрезать блок с помощью 15 мкм резки шагом, чтобы удалить ОКТ покрытие образца. Если образец был вырезан раньше, а поверхность подвергалась воздействию воздуха, отбросьте первые участки ткани из блока.
- Отрегулируйте криостат, чтобы создать 8 мкм секций и вырезать 2'3 криосекций, которые будут отброшены (первые несколько, как правило, толще, чем 8 мкм). Поместите клейкую пленку на блок и используйте подходящий инструмент, чтобы придерживаться пленки к блоку. Сделайте разрез медленно и на постоянной скорости, удерживая секцию пленкой.
- Поместите пленку (образец вверх) сразу же на предварительно охлажденный стеклянный слайд (на криобаре в криостате), чтобы избежать оттаивания образца. Используйте ленту, чтобы исправить пленку на стеклянную горку для облегчения окрашивания. Немедленно приступайке к протоколу окрашивания.
3. Протокол быстрого окрашивания
- Приготовьте 40 мл следующих растворов в трубках 50 мл и положите их на лед: 95% этанола, безрычанина, 100% этанола, 100% этанола и 100% ксилена. Выполните все шаги на льду (кроме окрашивания). Для каждого экспериментального дня, подготовить все водные реагенты свежие с RNase-свободной воды.
ПРЕДЕКТО: Работа в капюшоне, чтобы избежать интоксикации ксилена. - Инкубировать разделы для 30 с в 95% этанола, а затем окунуть разделы 30 с в RNase свободной воды, чтобы удалить OCT тщательно и полностью, которые могут помешать LCM и вниз по течению приложений.
- Распределить 50 зл коммерческих LCM замороженных пятно раздела (Таблица материалов) на раздел, инкубировать в течение 10 с на RT и слейте его, поместив край слайда на абсорбцивательной бумаги ткани. Удалите избыточное пятно, промыв 30 с в 100% этанола.
- Погрузите костные секции во вторую трубку со 100% этанолом на 30 с и перенесите их на 100% ксилен на 30 с.
- Положите клейкую пленку (образец вверх) на сухую стеклянную горку в качестве опоры. Позаботьтесь о том, чтобы пленка не была затронута и помещена как можно более плоской. Не допускайте полного высыхания образца.
- Поместите ПЭТ мембраны кадр слайд на нем. Вскоре нажмите пальцем в перчатках на мембрану, чтобы прикрепить его к пленке. Образец затем зажат между мембраной и клейкой пленкой. Клейкая пленка не должна быть сложена или морщинистой и не должно быть пузырьков воздуха между пленкой и мембраной. Немедленно приступайте к РАБОТЕ с LCM.
4. Лазерная микродиссекция захвата
- Очистите сцену и крышку держателя от RNase с помощью поверхности обеззараживание (Таблица материалов). Загрузите слайд и колпачки в держатель слайда и держатель крышки, соответственно.
- Отрегулируйте фокус и приобретите обзор слайдов с целью 1.25x. Измените к цели 40x и отрегулируйте фокус. Выберите интересуемую область, используя обзор слайдов. Отрегулируйте параметры лазера следующим образом: диафрагма, 7; лазерная мощность, 60; скорость, 5; частота импульса, 201; баланс образца, 20. Оптимизируйте эти параметры для каждой цели.
- Если лазер не может сократить образец, увеличить мощность лазера. Кроме того, лазер может быть применен более одного раза. Кроме того, проинспектировать цель на пятна неполных разрезов и повторно нарисованной линии в этих местах с помощью переместить и вырезать вариант. Сохраните лазерные настройки для вскрытия последующих слайдов.
- Выберите остеобласты, остеоциты и клетки костной подкладки в дистальной бедренной или корковой кости на основе морфологических критериев. Нарисуйте линию для лазерного пути дальше от целевых ячеек, чтобы свести к минимуму ущерб от УФ-лазера. Выполните все микродиссекции в течение менее 1 ч после окрашивания.
- Соберите каждый тип ячейки в отдельную крышку трубки 0,5 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сухой захват вместо жидкостного восстановления может избежать деградации РНК. Кроме того, очень небольшие объемы буфера, содержащиеся в крышке микроцентрифугной трубки, могут либо испаряться, либо кристаллизоваться (в зависимости от его состава) во время LCM. - Подтвердите успех захвата путем наблюдения крышки трубки сбора после LCM, где это применимо. Немедленно приступайке к извлечению РНК.
5. Добыча РНК
- Распределите 50 зл и буфера лизиса, содержащего й-меркаптаэтанол, в крышку трубки для сбора и лизацить образец путем pipetting вверх и вниз в крышке в течение 1 мин. Спин вниз lysate и добавить 300 л из буфера лизиса, содержащего й-mercaptoethanol в трубку. Если несколько колпачков будут объединены, позаботьтесь о том, чтобы общий объем буфера, как рекомендуется для комплекта экстракции РНК(Таблица материалов).
ВНИМАНИЕ: к меркаптоэтанолу необходимо добавить, чтобы защитить РНК от деградации, но он считается токсичным. Носите защитную одежду и перчатки и работайте в капюшоне. - Кроме того, для каждого слайда подготовьте одну помеченную 1,5 мл микроцентрифуговой трубки с 350 злисовым буфером лизиса, содержащим й-меркаптоэтанол. Используйте разделы, оставшиеся после LCM, для извлечения РНК. Тщательно отделить пленку от мембраны и лиза образец медленно pipetting буфера лизиса на секцию несколько раз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Общее количество буфера лиза должно составлять 350 л. Не используйте все это сразу для пищеварения, как он будет стекать с слайда. -
Положите образцы лисата на сухой лед и храните их при -80 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь. - Оттепель лисаты на RT. Передача lysates из LCM-собранных клеток из коллекторских труб в 1,5 мл микроцентрифуговых труб. Если для сбора проб было использовано несколько колпачков, сваите с себя несколько лисатов.
- Извлекайте РНК в соответствии с инструкциями производителя. Лечить столбцы с DNase I, чтобы удалить геномную ДНК. Elute РНК с 14 л безR воды, в результате чего 12 л eluate. Храните РНК при -80 градусах По Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь.
6. Измерение урожайности и целостности РНК
- Оттепель РНК на мокром льду. Измерьте урожайность и целостность изолированной РНК с помощью микрокапиллярного электрофорасиса. Загрузите общую РНК (1 л на образец) в чип(Таблица материалов)в соответствии с инструкциями производителя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол LCM был разработан для получения достаточного количества высококачественной РНК для анализа экспрессии генов в костных клетках бедренной кости мыши. В оптимизированном протоколе, 8 мкм толщиной замороженных костных секций были вырезаны на клейкой пленки и окрашенных с помощью быстрого протокола для коммерческих LCM замороженных пятен раздела. Образец был зажат между ПЭТ-мембраной и клейкой пленкой. Клетки кости мыши были микрорасчленены с помощью системы LCM, которая использует гравитацию для сбора образцов. Для получения высококачественной РНК достаточной урожайности использовался метод извлечения РНК на основе столбцов. Урожайность и целостность изолированной РНК измерялась с помощью микрокапиллярного электрофорасиса(рисунок 1).
Разница в качестве и количестве РНК, полученных с помощью различных протоколов лизиса можно увидеть в представительном геле и электроферограммах. Когда образец был лисичен путем pipetting вверх и вниз в крышке в течение 1 мин, можно было изолировать около 8,5 нг РНК от 1 мм2 микрорасчлененных костной ткани (8 мкм толщиной разделе). Значение RIN составило 8,60(рисунок 2).
Кроме того, LCM был выполнен с помощью системы LCM, которая использует де-фокусированный лазерный импульс, который катапультирует материал в нависающей клейовой крышкой. Качество и количество РНК можно оценить в репрезентативном геле и электроферограммах. Для свежих замороженных костей можно было изолировать примерно 1,6 нг РНК от 1 мм2 микрорасчлененных костной ткани (8 мкм толщиной секции). Значение RIN составило 1(рисунок 3).
Рисунок 1: Flowchart лазерного протокола захвата микрорассечения для свежезамороженных костей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Представительный гель (вверху) и электроферограммы (внизу) образцов РНК. LCM был выполнен с помощью системы LCM, которая использует гравитацию для сбора образцов. Образцы РНК были извлечены из lcM-собранных тканей (образцы 1, 3, 5, 7 и 9) и соответствующих контрольных секций (образцы 2, 4, 6, 8 и 10, соответственно). Один образец РНК был извлечен из раздела управления, который был окрашен, но не использовался для LCM (образец 11). Общая площадь 1 мм2 была микрорасчленена, и различные протоколы lysis были использованы. Образец 1: В трубку было добавлено 350 л буфера лизиса, содержащего q-mercaptoethanol. Крышка была закрыта тщательно, и трубка перевернута. LcM-собранные клетки были лисичены вихрем 1 мин, инкубируя на RT на 10 min и вихрь 1 мин. Образец 3: 350 qL буфера лизиса содержа q-mercaptoethanol был добавлен в трубку собрания, крышка была тщательно закрыта, и пробка inverted. LcM-собранные клетки были лисицированы инкубационными трубками сбора вверх дном в течение 30 минут на RT. Образец 5: 50 л буфера лизиса, содержащего й-меркаптоэтанол, был добавлен в крышку трубки сбора и образец был lysed трубами вверх и вниз в крышке в течение 1 мин. Лизат был центрифугировался, и в трубку было добавлено 300 л люсисбуфера, содержащего й-меркаптоэтанол. Образец 7: в трубку было добавлено 350 л буфера лизиса, содержащего к-меркаптоэтанол. Крышка была закрыта тщательно, и трубка перевернута. Клетки, собранные LCM, были лисичены путем вихря и инвертирования несколько раз. Образец 9: 50 юл буфера лизиса, содержащего q-mercaptoethanol, был добавлен в крышку трубки сбора, и образец был лиизирован инкубации в течение 5 минут на RT в крышке. Лизат был центрифугировался, и в трубку было добавлено 300 л люсисбуфера, содержащего к-меркаптоэтанол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Представительный гель (вверху) и электроферограммы (внизу) образцов РНК. LCM была выполнена с помощью системы LCM, которая использует де-ориентированный лазерный импульс, который катапультирует материал в клей крышку, расположенную над секцией. Образцы РНК были извлечены из ткани LCM-harvested (образцы 5 и 6) и соответствующего контрольного раздела (образец 7). Один образец РНК был извлечен из раздела управления, который был окрашен, но не использовался для LCM (образец 8). Общая площадь 0,5 мм2 или 1 мм2 была микрорасчленена (образцы 5 и 6, соответственно). В трубку для сбора было добавлено 350 кл/ сбуфера лизиса, содержащего к-меркаптоэтанол, крышка была тщательно закрыта и трубка перевернута. LCM-собранные клетки были лисицированы инкубации трубки сбора вверх дном в течение 30 минут на RT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Как качество РНК, так и количество могут быть негативно затронуты на всех этапах подготовки образца, таких как манипуляции с тканями, процесс LCM и экстракция РНК. Поэтому был разработан протокол LCM для получения достаточного количества высококачественной РНК для последующего анализа экспрессии генов.
Для LCM, большинство лабораторий используют разделы толщиной 7'8 мкм2. Более толстые секции позволят собрать больше материала. Однако, если они слишком толстые, это может уменьшить микроскопическое разрешение и лазер не может быть в состоянии прорезать. Вполне вероятно, что оптимальная толщина ткани зависит от системы LCM (и лазера и слайд типа) используется, а также от ткани в вопросе8,25. В настоящем исследовании были протестированы криосекции различной толщины (4, 8 или 12 мкм); Было установлено, что 8 мкм-толщиной секций идеально подходит для LCM, в то время как 12 мкм костных секций было труднее сократить с помощью лазера и 4 мкм разделы дали меньшее количество РНК.
Эндогенная активность RNase варьируется между различными тканями. Таким образом, окрашивание протоколы, разработанные для тканей с очень низкой активностью RNase может быть непригодным для других типов тканей. Ядерный быстрый красный26 и кресилфиолетовый24 было предложено, чтобы быть лучшим с точки зрения сохранения целостности РНК. Кроме того, методы на основе алкоголя были выше вавных пятен для поддержания целостности РНК. Тем не менее, они страдали от невоспроизводимой интенсивности окрашивания27. Время является важным параметром для рассмотрения. С одной стороны, время, необходимое для поиска и идентификации ячеек, представляющих интерес в разделе, и для выполнения LCM часто относительно долго. С другой стороны, время, доступное для LCM ограничено, так как в некоторых случаях, 20% деградации РНК была достигнута после 30 мин28. Таким образом, различные методы были применены для того, чтобы стабилизировать РНК, такие как воздействие секций на аргон поток во время микродиссекции28, или использование буферных спирта на основе кресилфийного окрашивания и поддержания уровня влажности в лаборатории низкой 27. Кроме того, максимум 15 мин для микрорассечения шаг был предложен2. В этом исследовании замороженные костные секции были окрашены с помощью быстрого протокола для коммерческого пятна LCM, и даже после 1 ч на RT значения RIN снизились с 8,3 до 9,1. Таким образом, все микродиссекции были выполнены в течение менее 1 ч после окрашивания. Кроме того, были протестированы различные протоколы для окрашивания (с более короткими инкубациями в водных реагентах или без ксиленового шага). Существенного улучшения значений RIN достигнуто не было.
В исследованиях LCM были сопоставлены два различных типа методов извлечения РНК: метод разделения фазы против метода на основе столбцов. Было установлено, что метод извлечения РНК на основе столбцов привел к улучшению качества РНК и более высокой урожайности по сравнению с методом фазового разделения8. В другом исследовании, коммерческий комплект, который использует минимальное время пищеварения и температуры (5 мин на RT) привело к превосходному качеству РНК по сравнению с РНК изоляции комплект, который требует больше времени пищеварения при более высокой температуре (30 мин при температуре 42 градусов по Цельсию)7. В настоящем исследовании, можно было извлечь высокое качество РНК (RIN Qgt; 8) достаточной концентрации из образцов LCM с использованием свежезамороженных костей мыши и на основе колонки РНК метод атр-экстракции. Тщательный лииз (1 мин трубач в крышке) имеет важное значение для хорошего выхода РНК. Влияние метода извлечения РНК на урожайность и целостность РНК, полученные после LCM, было исследовано с использованием нескольких различных комплектов изоляции РНК в соответствии с инструкциями производителей. Тем не менее, более качественные РНК и увеличенное количество были получены с комплектом, используемым в оптимизированном протоколе. В экспериментальном исследовании были вырезаны микрорасчленные ткани на 1 мм2 конечной области, и удалось изолировать примерно 8,5 нг РНК с помощью 8-мкм толщиной костных секций (примерно 800 пг/л). Как правило, остеобласты, остеоциты и клетки костной подкладки были захвачены в 2-3 секциях на образец.
Прямые сравнения между различными инструментами LCM скудны. В одном исследовании были протестированы два общих LCM-инструмента, которые отличаются по типу используемого лазера (УФ и инфракрасный (иР) и методу захвата ткани (клеевая изоляционная крышка против колпачков, покрытых прозрачной термопластичной пленкой, соответственно). Было установлено, что для тонко разделенных свежезамороженных секций мозга мыши, ИК-система привела к скромно более высокой РНК качества7. В настоящем исследовании были сопоставлены две системы LCM, позволяющие бесконтактный сбор образцов. В одной системе микрорасчлененный образец падает под действием силы тяжести в крышку, помещенную чуть ниже29. Другая система использует де-ориентированный лазерный импульс, который катапультирует материал в нависающей крышке30. Для свежих замороженных костей, более высокие количества РНК и RIN значения были получены, когда гравитация была использована для захвата тканей. Кроме того, технология катапультирования не совместима с «сэндвичом», состоящим из клейкой пленки, криосекционной и ПЭТ-мембраны, из-за дополнительного веса ПЭТ-мембраны.
LCM требует физического доступа к поверхности ткани. Поэтому монтаж и стеклянное покрытие образца неприменимы, что является следствием нарушения визуализации морфологии. Чтобы преодолеть это ограничение, жидкости покрова среды быларазработана 31. Кроме того, 10-15 л этанола может быть добавлено непосредственно на секции тканей, что позволяет лучше морфологический анализ перед испарением2. В настоящем исследовании замороженные костные секции были вырезаны на клейкой пленке и, прежде чем образец был полностью высох, он был зажат между ПЭТ мембраной и пленкой. Этот "сэндвич" метод дал хороший морфологический контраст и конкретные костные клетки были четко определены.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарят Уте Зейца и Никола Гинера за отличную техническую помощь, а также сотрудников Vetcore и по уходу за животными за их поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689-25ML-F | |
| Absolute ethanol EMPLURA | Merck Millipore | 8,18,76,01,000 | |
| Adhesive film (LMD film) | Section-Lab | C-FL001 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies | ||
| Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus HistoGene Staining Solution | Applied Biosystems | 12241-05 | |
| Cryofilm fitting tool | Section-Lab | C-FT000 | |
| Cryostat Leica CM 1950 | Leica Biosystems | ||
| Glass microscope slides, cut color frosted orange | VWR Life Science | 631-1559 | |
| Histology tissue molds PVC | MEDITE | 48-6302-00 | |
| LMD7 Laser Mikrodissektion System | Leica Microsystems | ||
| Low profile Microtome Blades Leica DB80 XL | Leica Biosystems | 14035843496 | |
| Nuclease-free water | VWR Life Science | E476-500ML | |
| PET membrane slides 1.4 μm | Molecular Machines & Industries GmbH | 50102 | |
| RNase Away surface decontaminant | Molecular BioProduct | 7002 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Xylene | VWR Life Science | 2,89,73,363 |
References
- Emmert-Buck, M. R., et al.
- Legres, L. G., Janin, A., Masselon, C., Bertheau, P. Beyond laser microdissection technology: follow the yellow brick road for cancer research. American journal of Cancer Research. 4 (1), 1-28 (2014).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Kerman, I. A., Buck, B. J., Evans, S. J., Akil, H., Watson, S. J. Combining laser capture microdissection with quantitative real-time PCR: effects of tissue manipulation on RNA quality and gene expression. Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 71-85 (2006).
- Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
- Golubeva, Y. G., Warner, A. C. Laser Microdissection Workflow for Isolating Nucleic Acids from Fixed and Frozen Tissue Samples. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 33-93 (2018).
- Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized Method for Robust Transcriptome Profiling of Minute Tissues Using Laser Capture Microdissection and Low-Input RNA-Seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).
- Garrido-Gil, P., Fernandez-Rodríguez, P., Rodríguez-Pallares, J., Labandeira-Garcia, J. L. Laser capture microdissection protocol for gene expression analysis in the brain. Histochemistry and Cell Biology. 148 (3), 299-311 (2017).
- Kawamoto, T., Kawamoto, K. Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot's film method. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1130, 149-164 (2014).
- Streicher, C., et al. Estrogen Regulates Bone Turnover by Targeting RANKL Expression in Bone Lining Cells. Scientific Reports. 7 (1), 6460 (2017).
- Vaidya, M., et al. Osteoblast-specific overexpression of amphiregulin leads to transient increase in femoral cancellous bone mass in mice. Bone. 81, 36-46 (2015).
- Jay, F. F., et al. Amphiregulin lacks an essential role for the bone anabolic action of parathyroid hormone. Molecular and Cellular Endocrinology. 417, 158-165 (2015).
- Murali, S. K., Andrukhova, O., Clinkenbeard, E. L., White, K. E., Erben, R. G. Excessive Osteocytic Fgf23 Secretion Contributes to Pyrophosphate Accumulation and Mineralization Defect in Hyp Mice. PLoS Biology. 14 (4), e1002427 (2016).
- Andrukhova, O., Schüler, C., Bergow, C., Petric, A., Erben, R. G. Augmented Fibroblast Growth Factor-23 Secretion in Bone Locally Contributes to Impaired Bone Mineralization in Chronic Kidney Disease in Mice. Frontiers in Endocrinology. 9, 311 (2018).
- Golubeva, Y. G., Smith, R. M., Sternberg, L. R. Optimizing Frozen Sample Preparation for Laser Microdissection: Assessment of CryoJane Tape-Transfer System®. PLoS ONE. 8 (6), e66854 (2013).
- Pacheco, E., Hu, R., Taylor, S. Laser Capture Microdissection and Transcriptional Analysis of Sub-Populations of the Osteoblast Lineage from Undecalcified Bone. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 191-202 (2018).
- Nioi, P., et al. Transcriptional Profiling of Laser Capture Microdissected Subpopulations of the Osteoblast Lineage Provides Insight Into the Early Response to Sclerostin Antibody in Rats. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (8), 1457-1467 (2015).
- Taylor, S., et al. Differential time-dependent transcriptional changes in the osteoblast lineage in cortical bone associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats. Bone Reports. 8, 95-103 (2018).
- Taylor, S., et al. Time-dependent cellular and transcriptional changes in the osteoblast lineage associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats. Bone. 84, 148-159 (2016).
- Martin, L. B. B., et al. Laser microdissection of tomato fruit cell and tissue types for transcriptome profiling. Nature Protocols. 11 (12), 2376-2388 (2016).
- Imbeaud, S., et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), e56 (2005).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
- Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11, 95 (2010).
- Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. Murray, G. I. , Humana Press. New York, NY. 1-17 (2018).
- Burgemeister, R., Gangnus, R., Haar, B., Schütze, K., Sauer, U. High quality RNA retrieved from samples obtained by using LMPC (laser microdissection and pressure catapulting) technology. Pathology, Research and Practice. 199 (6), 431-436 (2003).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Kölble, K. The LEICA microdissection system: design and applications. Journal of Molecular Medicine. 78 (7), B24-B25 (2000).
- Böhm, M., Wieland, I., Schütze, K., Rübben, H. Microbeam MOMeNT: non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue. The American Journal of Pathology. 151 (1), 63-67 (1997).
- Micke, P., et al. A fluid cover medium provides superior morphology and preserves RNA integrity in tissue sections for laser microdissection and pressure catapulting. The Journal of Pathology. 202 (1), 130-138 (2004).
