Лазерный захват Microdissection Протокол, который дает высокое качество РНК из свежезамороженных костей мыши
Summary
Для получения достаточного количества высококачественной РНК для анализа экспрессии генов в костных клетках был разработан протокол лазерного захвата микродиссекции (LCM). Текущее исследование фокусируется на секциях бедренной кости мыши. Тем не менее, протокол LCM сообщил здесь может быть использован для изучения экспрессии генов в клетках любой твердой ткани.
Abstract
Урожайность РНК и целостность имеют решающее значение для анализа РНК. Тем не менее, это часто технически сложной задачей для поддержания целостности РНК на протяжении всей процедуры микродиссекции лазерного захвата (LCM). Поскольку исследования LCM работают с низким количеством материала, озабоченность по поводу ограниченных урожаев РНК также важны. Поэтому был разработан протокол LCM для получения достаточного количества высококачественной РНК для анализа экспрессии генов в костных клетках. Оценивался эффект протокола окрашивания, толщина криосекций, количество микрорассеченной ткани, комплект экстракции РНК и система LCM, используемая на выходе РНК и целостность, полученная из микрорасчленетированных костных клеток. Восемь мкм толщиной замороженных костных секций были сделаны с использованием клейкой пленки и окрашенных с помощью быстрого протокола для коммерческих LCM пятно. Образец был зажат между полиэтиленовой терефталат (ПЭТ) мембраной и клейкой пленкой. Для получения высококачественных РНК достаточной урожайности использовалась система LCM, использующую гравитацию для сбора образцов, и метод извлечения РНК на основе столбцов. Текущее исследование фокусируется на секциях бедренной кости мыши. Тем не менее, протокол LCM сообщил здесь может быть использован для изучения экспрессии генов situ в клетках любой твердой ткани как в физиологических условиях и процессах болезни.
Introduction
Ткани состоят из разнородных и пространственно распределенных типов клеток. Различные типы клеток в данной ткани могут по-разному реагировать на один и тот же сигнал. Поэтому важно уметь изолировать определенные популяции клеток для оценки роли различных типов клеток как в физиологических, так и в патологических условиях. Лазерный захват микродиссекции (LCM) предлагает относительно быстрый и точный метод для изоляции и удаления указанных клеток из сложных тканей1. Системы LCM используют силу лазерного луча для отделения интересных клеток от секций гистологических тканей без необходимости ферментативной обработки или роста культуры. Это означает, что клетки находятся в естественной среде обитания тканей, и что архитектура тканей, включая пространственные отношения между различными клетками сохраняется. Морфология как захваченных клеток, так и остаточной ткани хорошо сохранилась, и несколько компонентов ткани можно отобирать последовательно с одного слайда. Изолированные клетки могут быть использованы для последующего анализа их РНК, ДНК, белка или содержания метаболита2,3.
Для того, чтобы проанализировать экспрессию генов в различных популяциях клеток, или после различных процедур, необходимо получить мРНК достаточного качества и количества для последующего анализа4,5. В отличие от ДНК, РНК более чувствительны к фиксации и использование замороженных тканей рекомендуется, когда цель заключается в изучении РНК. Так как мРНК быстро деградируют вездесущими рибонуклеазами (RNase), требуются строгие условия без RNase при обработке и подготовке образцов и избежании хранения образцов при комнатной температуре. Кроме того, быстрые методы без каких-либо длительных шагов водной фазы имеют решающее значение для предотвращения деградации РНК6. Выход И целостность РНК также могут быть затронуты процессом LCM и системой LCM, используемой7,8. В настоящее время доступны четыре LCM-системы с различными принципами работы2. Метод извлечения РНК также может быть важным, так как различные комплекты изоляции РНК были протестированы со значительными различиями в количестве РНК и качестве7,8.
Любой метод подготовки тканей требует нахождения баланса между получением хорошего морфологического контраста и поддержанием целостности РНК для дальнейшего анализа. Для приготовления замороженных секций из кости была разработана клеевая пленка, которая постоянно совершенствуется9. Костные секции вырезаны и окрашены непосредственно на клейкой пленке. Эта клейкая пленка применима ко многим типам окрашивания, и может быть использована для изоляции клеток, представляющих интерес от костных криосекций с помощью LCM9,10,11,12,13, 14. Все шаги, включая хирургическое удаление, встраивание, замораживание, резки и окрашивания могут быть завершены в течение менее одного часа. Важно отметить, что клетки, такие как остеобласты, клетки костной подкладки, и остеокласты могут быть четко определены9,10,11,12,13,14. Преимущество этого метода заключается в том, что он быстр и прост. Альтернативный метод генерации криосекций костей заключается в использовании системы передачи ленты15. Однако последний метод занимает больше времени и требует дополнительных приборов, так как секции должны быть перенесены из клейкой ленты на предпокрываемые мембранные горки ультрафиолетовым (УФ) поперечное соединение. Хотя система передачи ленты была успешно соединена с LCM16,17,18,19, следует отметить, что перекрестное покрытие может создать фоновый шаблон, который может мешать идентификации клеточного типа20.
Как правило, из микрорасчленированных клеток извлекается лишь небольшое количество РНК, а качество и количество РНК часто оцениваются микрокапиллярным электрофорезом21. Компьютерная программа используется для присвоения индекса качества экстрактам РНК, называемому номером целостности РНК (RIN). Значение RIN 1.0 указывает на полностью деградированную РНК, в то время как значение 10.0 указывает на то, что РНК полностью нетронута22. Как правило, индексы старше 5 считаются достаточными для исследований РНК. Модели экспрессии генов в образцах со значением RIN 5.0-10.0, как сообщается, хорошо коррелируют друг с другом23. Хотя чувствительность этого метода высока, так как всего 50 пг/ зл общей РНК может быть обнаружено, это может быть очень трудно получить оценку качества, если концентрация РНК в образце очень низка. Таким образом, для того, чтобы оценить качество РНК, секция ткани, оставшаяся после LCM часто используется для извлечения РНК, путем трубоукладки буфера на слайд24.
Хотя LCM широко используется на различных замороженных тканях, значения RIN извлеченных РНК редко регистрируются. Кроме того, нет сравнительных исследований для уточнения наиболее подходящего метода для изучения РНК в костях мыши. В настоящем исследовании, замороженные участки из взрослых мачан бедренной кости были использованы для оптимизации подготовки образца, ПРОТОКОЛ LCM и экстракции РНК для получения высококачественных РНК. Настоящий протокол был оптимизирован, в частности, для системы LCM, которая использует гравитацию для сбора образцов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Как качество РНК, так и количество могут быть негативно затронуты на всех этапах подготовки образца, таких как манипуляции с тканями, процесс LCM и экстракция РНК. Поэтому был разработан протокол LCM для получения достаточного количества высококачественной РНК для последующего анализа э?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Уте Зейца и Никола Гинера за отличную техническую помощь, а также сотрудников Vetcore и по уходу за животными за их поддержку.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689-25ML-F | |
| Absolute ethanol EMPLURA | Merck Millipore | 8,18,76,01,000 | |
| Adhesive film (LMD film) | Section-Lab | C-FL001 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies | ||
| Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus HistoGene Staining Solution | Applied Biosystems | 12241-05 | |
| Cryofilm fitting tool | Section-Lab | C-FT000 | |
| Cryostat Leica CM 1950 | Leica Biosystems | ||
| glass microscope slides, cut colour frosted orange | VWR Life Science | 631-1559 | |
| Histology tissue molds PVC | MEDITE | 48-6302-00 | |
| LMD7 Laser Mikrodissektion System | Leica Microsystems | ||
| Low profile Microtome Blades Leica DB80 XL | Leica Biosystems | 14035843496 | |
| Nuclease-free water | VWR Life Science | E476-500ML | |
| PET membrane slides 1.4 mircon | Molecular Machines & Industries GmbH | 50102 | |
| RNase Away surface decontaminant | Molecular BioProduct | 7002 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Xylene | VWR Life Science | 2,89,73,363 |
References
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Legres, L. G., Janin, A., Masselon, C., Bertheau, P. Beyond laser microdissection technology: follow the yellow brick road for cancer research. American journal of Cancer Research. 4 (1), 1-28 (2014).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Kerman, I. A., Buck, B. J., Evans, S. J., Akil, H., Watson, S. J. Combining laser capture microdissection with quantitative real-time PCR: effects of tissue manipulation on RNA quality and gene expression. Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 71-85 (2006).
- Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
- Golubeva, Y. G., Warner, A. C. Laser Microdissection Workflow for Isolating Nucleic Acids from Fixed and Frozen Tissue Samples. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 33-93 (2018).
- Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized Method for Robust Transcriptome Profiling of Minute Tissues Using Laser Capture Microdissection and Low-Input RNA-Seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).
- Garrido-Gil, P., Fernandez-Rodríguez, P., Rodríguez-Pallares, J., Labandeira-Garcia, J. L. Laser capture microdissection protocol for gene expression analysis in the brain. Histochemistry and Cell Biology. 148 (3), 299-311 (2017).
- Kawamoto, T., Kawamoto, K. Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot’s film method. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1130, 149-164 (2014).
- Streicher, C., et al. Estrogen Regulates Bone Turnover by Targeting RANKL Expression in Bone Lining Cells. Scientific Reports. 7 (1), 6460 (2017).
- Vaidya, M., et al. Osteoblast-specific overexpression of amphiregulin leads to transient increase in femoral cancellous bone mass in mice. Bone. 81, 36-46 (2015).
- Jay, F. F., et al. Amphiregulin lacks an essential role for the bone anabolic action of parathyroid hormone. Molecular and Cellular Endocrinology. 417, 158-165 (2015).
- Murali, S. K., Andrukhova, O., Clinkenbeard, E. L., White, K. E., Erben, R. G. Excessive Osteocytic Fgf23 Secretion Contributes to Pyrophosphate Accumulation and Mineralization Defect in Hyp Mice. PLoS Biology. 14 (4), e1002427 (2016).
- Andrukhova, O., Schüler, C., Bergow, C., Petric, A., Erben, R. G. Augmented Fibroblast Growth Factor-23 Secretion in Bone Locally Contributes to Impaired Bone Mineralization in Chronic Kidney Disease in Mice. Frontiers in Endocrinology. 9, 311 (2018).
- Golubeva, Y. G., Smith, R. M., Sternberg, L. R. Optimizing Frozen Sample Preparation for Laser Microdissection: Assessment of CryoJane Tape-Transfer System®. PLoS ONE. 8 (6), e66854 (2013).
- Pacheco, E., Hu, R., Taylor, S. Laser Capture Microdissection and Transcriptional Analysis of Sub-Populations of the Osteoblast Lineage from Undecalcified Bone. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 191-202 (2018).
- Nioi, P., et al. Transcriptional Profiling of Laser Capture Microdissected Subpopulations of the Osteoblast Lineage Provides Insight Into the Early Response to Sclerostin Antibody in Rats. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (8), 1457-1467 (2015).
- Taylor, S., et al. Differential time-dependent transcriptional changes in the osteoblast lineage in cortical bone associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats. Bone Reports. 8, 95-103 (2018).
- Taylor, S., et al. Time-dependent cellular and transcriptional changes in the osteoblast lineage associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats. Bone. 84, 148-159 (2016).
- Martin, L. B. B., et al. Laser microdissection of tomato fruit cell and tissue types for transcriptome profiling. Nature Protocols. 11 (12), 2376-2388 (2016).
- Imbeaud, S., et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), e56 (2005).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
- Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11, 95 (2010).
- Mahalingam, M., Murray, G. I. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. , 1-17 (2018).
- Burgemeister, R., Gangnus, R., Haar, B., Schütze, K., Sauer, U. High quality RNA retrieved from samples obtained by using LMPC (laser microdissection and pressure catapulting) technology. Pathology, Research and Practice. 199 (6), 431-436 (2003).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Kölble, K. The LEICA microdissection system: design and applications. Journal of Molecular Medicine. 78 (7), B24-B25 (2000).
- Böhm, M., Wieland, I., Schütze, K., Rübben, H. Microbeam MOMeNT: non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue. The American Journal of Pathology. 151 (1), 63-67 (1997).
- Micke, P., et al. A fluid cover medium provides superior morphology and preserves RNA integrity in tissue sections for laser microdissection and pressure catapulting. The Journal of Pathology. 202 (1), 130-138 (2004).
