Summary
Het doel van het protocol is om de mechanische eigenschappen van de membraan van gigantische blaasjes betrouwbaar te meten met micro pipet aspiratie.
Abstract
Reuzen blaasjes verkregen uit fosfolipiden en copolymeren kunnen worden uitgebuit in verschillende toepassingen: gecontroleerde en gerichte levering van geneesmiddelen, biomoleculaire herkenning binnen biosensoren voor diagnose, functionele membranen voor kunstmatige cellen, en ontwikkeling van biogeïnspireerde micro/nano-reactoren. In al deze toepassingen is de karakterisering van hun membraan eigenschappen van fundamenteel belang. Onder bestaande karakterisatie technieken, micropipet aspiratie, gepionierd door E. Evans, maakt het mogelijk om mechanische eigenschappen van het membraan te meten, zoals het gebied comprimeerbare modulus, buig modulus en Lysis stress en stam. Hier presenteren we alle methodologieën en gedetailleerde procedures om gigantische blaasjes te verkrijgen van de dunne film van een lipide of copolymeer (of beide), de fabricage-en oppervlaktebehandeling van micropipetten, en de aspiratie procedure die leidt tot de meting van alle eerder genoemde parameters.
Introduction
Reuzen blaasjes verkregen uit fosfolipiden (liposomen) zijn op grote schaal gebruikt sinds de jaren 1970 als basis celmembraan model1. In de late jaren negentig, vesiculaire morfologieën verkregen uit de zelf-assemblage van copolymeren, genaamd polymersomes in verwijzing naar hun lipide analogen2,3, snel verscheen als een interessant alternatief voor liposomen die zwakke mechanische stabiliteit en slechte modulaire chemische functionaliteit bezitten. Echter, hun cel biomimetische karakter is vrij beperkt in vergelijking met liposomen, omdat de laatste zijn samengesteld uit fosfolipiden, de belangrijkste component van de celmembraan. Bovendien, hun lage membraan permeabiliteit kan een probleem in sommige toepassingen zoals drug delivery waar gecontroleerde verspreiding van soorten door het membraan is vereist. Onlangs, de vereniging van fosfolipiden met blok copolymeren voor het ontwerpen van hybride polymeer-lipide blaasjes en membranen is het onderwerp geweest van een toenemend aantal studies4,5. Het belangrijkste idee is om entiteiten te ontwerpen die synergetisch de voordelen van elk onderdeel combineren (bio-functionaliteit en permeabiliteit van lipide-bilayers met de mechanische stabiliteit en chemische veelzijdigheid van polymeer membranen), die kunnen worden uitgebuit in verschillende toepassingen: gecontroleerde en gerichte drug delivery, biomoleculaire erkenning binnen biosensoren voor diagnose, functionele membranen voor kunstmatige cellen, ontwikkeling van bio-geïnspireerde micro-/nano-reactors.
Tegenwoordig hebben verschillende wetenschappelijke gemeenschappen (biochemici, chemici, biophysicisten, fysico-chemici, biologen) steeds meer belangstelling voor de ontwikkeling van een geavanceerder celmembraan model. Hier, ons doel is om te presenteren, zo gedetailleerd mogelijk, bestaande methodologieën (elektro vorming, micropipet aspiratie) om te verkrijgen en karakteriseren van de mechanische eigenschappen van gigantische blaasjes en de recente "geavanceerde" celmembraan modellen die hybride polymeer lipide reus blaasjes4,5.
Het doel van deze methoden is om betrouwbare meting van het gebied Comprimeer baarheid en buig moduli van het membraan, evenals hun lysis stress en spanning te verkrijgen. Een van de meest gebruikte technieken voor het meten van buigstijfheid van een reusachtig blaasje is fluctuatie analyse6,7, gebaseerd op directe video-Microscoop observatie; maar dit vereist een grote zichtbare membraan fluctuatie, en wordt niet systematisch verkregen op dikke membranen (bv. polymersomes). Area samendrukbaarheids modulus kan experimenteel worden bepaald met behulp van de Langmuir Blodgett techniek, maar meestal op een monolaag8. De micropipet aspiratie techniek maakt de meting van beide moduli op een dubbellaagvormende reus unilamellaire blaasje (guv) in één experiment mogelijk.
De volgende methode is geschikt voor alle amfifiele moleculen of macromoleculen die bilayers kunnen vormen en, bijgevolg, blaasjes door elektro vorming. Dit vereist een vloeiend karakter van de dubbellaagte bij de temperatuur van elektro vorming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fabricating micropipetten
Let op: hier zijn micropipetten met een inwendige diameter variërend van 6 tot 12 μm en een conus lengte rond 3-4 mm noodzakelijk. Een gedetailleerde methode voor het vervaardigen van micropipetten wordt hieronder beschreven.
- Plaats het boor silicaatglas capillair in de dissel van de trekker en bevestig een van de uiteinden door de knop aan te spannen.
- Schuif het glas voorzichtig door de openingen aan de zijkant van de verwarmingskamer.
- Draai de klem knop aan de andere kant vast.
- Bedien de grootte van de tip en de taper-lengte om de gewenste specificaties te bereiken. Voor dat, optimaliseren van technische parameters zoals verwarmingstemperatuur, pull, snelheid, vertraging en druk. Hier is een voorbeeld van een programma dat wordt gebruikt:
Serie: 550 °C
Pull: 10 (bereik van de machine: 0-255 in willekeurige eenheden)
Snelheid: 30 (bereik: 0-255 in willekeurige eenheden)
Vertraging: 1 (bereik: 0-255 in willekeurige eenheden)
Druk: 500 (sprei: 0-999 in willekeurige eenheden) - Klik op PULL voor het uitvoeren van de gebeurtenissen die zijn gedefinieerd door het programma. Het capillair wordt vervolgens gescheiden in twee micropipetten, waarvan de afmetingen moeten worden aangepast met behulp van een microforge.
- Plaats de micro pipet in de metalen pipet houder van de microforge (Zie Figuur 1). Pas met behulp van de 10x-doelstelling de Microscoop fase en de pipet manipulator aan (verticaal en horizontaal bewegen) tot de pipetpunt dicht bij het oppervlak van de glazen kraal ligt.
- Druk op de voetschakelaar om de glazen kraal te smelten. Verlaag de punt en leg het in contact met de gesmolten glas kraal. Gesmolten glas zal via capillaire werking in de pipet stromen. Wacht een paar seconden tot het niveau van het gesmolten glas een bepaalde hoogte bereikt, zoals weergegeven in de insert van de Figuur 1.
- Stop de verwarming door de druk op de voetschakelaar te verwijderen en trek de punt snel weg met behulp van de verticale pipet manipulator om een scherpe pauze te veroorzaken.
- Herhaal de stappen 1,7 en 1,8 totdat de gewenste diameter is verkregen (6 tot 12 μm).
Opmerking: om de nauwkeurigheid van de diameter meting te verbeteren, gebruikt u tijdens de laatste stap een 32x-doelstelling die is uitgerust met een dradenkruis.
2. pipetpunten van de coating met BSA (runderserum albumine)
- Om een 0,1 M-oplossing van glucose met 1% gew. BSA in zuiver water te bereiden.
- Weeg 180 mg glucose poeder, plaats in een conische buis van 15 mL polypropyleen en vul met 10 mL zuiver water.
- Voeg 0,1 g BSA poeder toe en schud zachtjes met behulp van een test buis hiervoor mixer tot volledige ontbinding (ongeveer 4 uur).
- Neem de oplossing met een wegwerpbare Luer-spuit van 10 mL met een naald. Eenmaal gevuld, verwijder de naald en installeer een 0,22 μm acetaat cellulose filter. Vul verschillende polypropyleen micro-centrifugebuizen (1,5 mL) die gebruikt zullen worden om de tip onder te dompelen.
- Plaats de capillairen verticaal in de houders. Verlaag de houder en dompel de tip 's nachts onder in de glucose/BSA-oplossing. De oplossing moet ongeveer 1 cm hoog stijgen door capillaire werking.
- Verwijder de pipetpunt uit de glucose/BSA-oplossing. Bereid 5 mL van 0,1 M glucoseoplossing (Verdun 90 mg glucose poeder in 5 mL zuiver water) en filtreer door een 0,22 μm acetaat cellulose filter.
- Vul de pipet met de glucoseoplossing met behulp van een glazen spuit van 500 μL, uitgerust met een flexibel gesmolten silica capillair. Verwijder vervolgens alle glucoseoplossing door het terug te zuigen en weg te gooien (Figuur 2). Herhaal deze stap meerdere malen om de onbegrensde BSA te verwijderen.
3. vorming van Guv's en Ghuv's door elektro vorming
Let op: elektro vorming is een veelgebruikte TECHNIC ontwikkeld door ANGELOVA9. De procedures voor het verkrijgen van een electroformation kamer, het storten van een lipide of polymeer film (of beide voor GHUVs (gigantische hybride Unilamellar blaasjes)) en hydrateren de film onder een alternatief elektrisch veld worden beschreven in het volgende. De procedure voor het verzamelen van de verkregen GUV wordt ook beschreven.
- Voorbereiding van Amfifiel, sucrose en glucoseoplossingen
- Bereid een amfifiele oplossing met een concentratie van 1 mg/ml. Weeg 10 mg amfifiele af en los op in 10 ml chloroform. Bewaar de oplossing in verzegelde flacons om oplosmiddel verdamping te voorkomen.
- Bereid een stamoplossing van 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-foshoethanolamine-N-(lissamine Rhodamine B sulfonyl) (dope-Rhod) bij 1 mg/ml in chloroform.
- Voeg 10 μL fluorescerende lipide-oplossing toe aan de amfifiele oplossing. Bewaar de oplossingen in verzegelde flacons om oplosmiddel verdamping te voorkomen.
- Bereid sucrose-en glucoseoplossingen met een concentratie van 0,1 M. weeg respectievelijk 342 mg en 180 mg sucrose en glucose af en los ze op in 10 mL zuiver water.
- Bereiding van de elektro vormings kamer
Opmerking: verschillende geleidende materialen kunnen worden gebruikt om een elektrovormings apparaat te maken (bijv. platina draden10, roestvrij naalden11). De electroformation kamer bestaat uit twee ITO-glijbanen gescheiden door een O-ring rubberen afstandhouder die aan de ene kant is gesneden om een diafragma te creëren. De dia's zijn via twee elektrische draden met een spannings Generator verbonden (Figuur 3 en Figuur 4a).- Reinig de ITO-slides met organisch oplosmiddel (bijv. chloroform). Identificeer het geleidende oppervlak met behulp van een ohmmeter.
- Bevestig de elektrische draden aan de geleidende kant met behulp van plakband.
- Afzetting van amfifiele oplossingen
- Dompel een capillair in de oplossing tot het niveau toeneemt door capillaire werking en verzamel ongeveer 5 μL van de oplossing.
- Plaats het capillair in contact met het midden van de ITO-glasplaat en verdeel de oplossing zachtjes. Wacht 10 seconden om een volledige verdamping van het oplosmiddel te garanderen (Figuur 4A).
- Herhaal deze procedure 3 keer voor elke zijde.
- Voeg aan beide zijden van de geopende O-ring spacer een laagje silicium vrij vet toe. Zet het rond het gebied van depositie. Plaats het geleidende vlak van de tweede ITO-glasplaat op de bovenkant van de afstandhouder.
- Plaats de electrovormings kamer onder vacuüm gedurende 3 uur om eventuele sporen van organisch oplosmiddel te verwijderen.
- Elektrovormings procedure
- Sluit de elektrische draden aan op de generator.
- Gebruik de volgende instellingen voor de generator:
Alternatieve sinusoïdale spanning
Frequentie: 10 Hz
Amplitude: 2 VPeak-to-Peak
Opmerking: voor elk systeem moet een optimale spannings frequentie en-duur worden gevonden. - Zorg ervoor dat de spanning wordt toegepast vóór de injectie van de oplossing in de kamer.
- Injecteer 1 mL oplossing met behulp van een injectiespuit met een naald van 0,8 mm met binnendiameter om de kamer te vullen. Verwijder eventuele bubbels.
- Laat de kamer onder de toegepaste spanning/frequentie voor 75 min (Figuur 4B).
- GUVs oogst
- Schakel de generator uit.
- Gebruik 1 mL spuit met 0,8 mm binnendiameter naald, zuig een klein deel van de oplossing om een luchtbel in de kamer te produceren. Kantel de kamer lichtjes om deze bubble in de kamer te laten bewegen. Dit kan helpen om de Guv's los te maken van het ITO-oppervlak (Figuur 4C).
- Zuig alle oplossing en breng het over in een plastic buis van 1 mL.
- Verwijder de draden en reinig de ITO-dia's met organische oplosmiddelen (tolueen dan chloroform).
4. instellen van Micro manipulatie
Opmerking: het principe van micropipet aspiratie is het zuigen van een enkel blaasje door een glazen micro pipet door het toepassen van een depressie. De lengte van de tong in de pipet wordt gemeten als een functie van de aanzuigdruk. De pipet coating met BSA, eerder beschreven, is essentieel om elke hechting tussen blaasjes membranen en de pipet te voorkomen of te minimaliseren.
Het protocol wordt hieronder geïllustreerd.
- Pipet en water gevulde reservoir aansluiting
Opmerking: de water gevulde tank en de micrometer zijn bevestigd aan een Schuifplaat. Een digitale teller met een micrometer kop maakt een verticale verplaatsing van het apparaat mogelijk in een bereik van 0 tot 2,5 cm en een nauwkeurigheid van 1 μm. verplaatsing langs een aluminium optische Rail is mogelijk tot 1 meter lang. Een silicium slang verbindt het reservoir en de capillaire houder (Figuur 5A).- Vul de tank met zuiver water. Sluit een wegwerpspuit van 5 ml aan op de capillaire metalen houder via een Siliconen slang en aspiraat om een waterstroom van de tank naar de houder te maken.
- Raak de buis iets aan om luchtbellen te elimineren. Breng tegelijkertijd het waterreservoir omhoog om een positieve druk te creëren. De 5 mL spuit is nog steeds aan de houder bevestigd.
- Na de coating en reinigingsstappen die eerder zijn beschreven (zie stap 2), vult u een capillair met glucose-oplossing tot een druppel vorm aan het einde. Verwijder de slang van de metalen houder om aan het uiteinde een lichte waterstroom te creëren.
- Draai het capillair ondersteboven en verbind de glucose druppel met de waterstroom van de houder. Bevestig het capillair en de houder door ze samen te schroeven.
- Plaats een pipet
Opmerking: tijdens deze operatie is het waterreservoir nog steeds gepositioneerd op de aluminium rail om een positieve druk te behouden.- Neem de zelfgemaakte aluminium podium uitgerust met twee glazen glijbanen (voorheen gereinigd met ethanol) en lijm ze met vacuüm vet aan elke kant. Installeer het op de Microscoop en vorm een meniscus tussen de twee dia's met behulp van een 1 mL spuit die 0,1 M glucose bevat, zoals afgebeeld in Figuur 5B, C.
- Plaats de pipet en de houder ervan op de motoreenheid van de micro manipulator en draai de klem knop aan.
- Gebruik de joystick van het bedieningspaneel in grove modus om de micropipet in de buurt van de glucose meniscus te verlagen. Pas de positie van de punt aan het midden van de meniscus aan met behulp van de fijnmodus.
- Houd de punt gedurende enkele minuten ondergedompeld in glucose om het buitenste en binnenste oppervlak te reinigen (als een positieve druk wordt gehandhaafd, zal de waterstroom het binnenste oppervlak van de pipet afspoelen om ongecoate BSA te verwijderen).
- Bewaar de positie van de tip op het micromanipulator toetsenbord en trek het uit de meniscus.
- Verwijder de glucose meniscus en vervang deze door een nieuwe. Zuig 2 μL Guv's op in 0,1 M sucrose met behulp van een micro Pipet van 20 μL en zet het in de verse glucose meniscus. Observeer in DIC-modus (differentieel interferentie contrast) de Guv's die zich onderaan bevinden vanwege het verschil in dichtheid tussen sucrose (voornamelijk in de Guv's) en glucose (voornamelijk buiten de Guv's).
- Wanneer de blaasjes licht leeg zijn, plaatst u de zuig pipet terug en concentreert u zich op de punt. Stel de hoogte H0 in van de watertank waarvan de druk bijna 0 is. Profiteer hiervoor van kleine blaasjes of deeltjes die van nature in de oplossing aanwezig zijn en pas de hoogte van het waterreservoir aan totdat de beweging van deze deeltjes is gestopt.
- Op dit punt, omringen de meniscus met minerale olie om te voorkomen dat Waterverdamping, Zie Figuur 5D.
Opmerking: de kamertemperatuur moet worden geregeld tussen 20-22 °C met behulp van airconditioning.
- Micropipet aspiratie-experiment
- Verlaag de pipetpunt (6-12 μm in diameter) en maak een kleine zuigkracht (-1 cm) om een blaasje (15-30 μm in diameter) aan te zuigen. Het membraan van het geselecteerde vesikel moet lichtjes schommelen en mag geen zichtbare gebreken vertonen (geen kiem of filament) (Figuur 6).
- Til de pipet naar een hoger niveau om het aanzuig blaasje van de andere blaasjes te isoleren, door de micromanipulator te gebruiken en deze positie tijdens het hele experiment te behouden.
- Pre-stress het blaasje door het verlagen van de water gevulde tank tot ongeveer-10 cm, dan verlagen de druk om terug te keren naar de initiële waarde (-1 cm). Herhaal deze stap meerdere malen om membraan overmaat en kleine defecten uit het membraan te verwijderen.
- Vanaf een hoogte van-0,5 cm, gedefinieerd door de positie van het waterreservoir, verlaagt u langzaam de zuigdruk met de micrometer om een regime te bereiken waarin het membraan fluctueert. Verhoog vervolgens de druk om een tong in de tip duidelijk te visualiseren met een significante projectie lengte (een paar micron).
Opmerking: de laagste toegepaste druk (P0) waarmee de kleinste membraan projectie lengte kan worden opzuigen (L0) zal het referentiepunt α0 (Figuur 7A) definiëren. Alle punten van de curve worden gemeten volgens deze referentie (ΔL = L-L0 en Δp = P-p0). - Verhoog de aanzuigdruk met de micrometer op een stapsgewijze manier tot 0,5-0,8 mN/m bereikt wordt. Wacht bij elke stap 5 sec. en neem een momentopname van de tong. Deze procedure bij lage spanning maakt de bepaling van de buig modulus mogelijk.
- Blijf de zuigdruk verhogen van 0,5 mN/m naar de breuk spanning door het aanpassen van de hoogte van het water dat op de Rail glijdt (variërend van-2 tot-50 cm) (Figuur 7B-D). Van dit experiment met een hoge spanningsregeling wordt het gebied comprimeerbare modulus, lysisspanning en lysisstam gemeten.
- Strek ongeveer 15-20 blaasjes om belangrijke statistieken te verwerven. Elk micropipet aspiratie-experiment duurt tussen de 7 en 10 minuten. Voer beeldanalyse uit met behulp van de LASAF-software voor het meten van de projectie lengte van de tong, de diameter van de blaasjes en de straal van het capillair.
- Meten van buig modulus, gebied compressibiliteit modulus, lysisspanning en lysisstam
- Om toegang te krijgen tot deze parameters, gebruik maken van het formalisme opgericht door E. Evans12. Bereken de aanzuigdruk die over het membraan wordt uitgeoefend vanaf vergelijking 1:
Δ P =US wg (h − H0) (1)
waar g de zwaartekrachtversnelling is (9,8 m ∙ s− 2), is pw de dichtheid van het water (p = 1 g ∙ cm− 3), h is de positie van het waterreservoir en h0 is de beginpositie waar de druk gelijk is aan nul. - Bereken de membraanspanning van de Laplace-vergelijking:
2
Wanneer δp de aanzuigdruk op de micro Pipet is, zijn rp en rv respectievelijk de micro pipet en de blaasje radii (buiten de micro pipet). De stam van het oppervlaktegebied (α) van het membraan wordt gedefinieerd als:
3
het membraan gebied van de blaasje bij de lagere aanzuigdruk. - Bereken α van de toename van de projectie lengte ΔL van het vesikel in de capillaire punt volgens vergelijking 412:
4 - Onder een zeer laag spannings regime domineert het verzachten van thermische buig-uitvloeiingen de schijnbare expansie. Plot ln (σ) versus α. Bij lage-σ waarden (meestal 0,001 – 0,5 mN. m− 113) geeft dit een rechte lijn waarvan de helling gekoppeld is aan de buig modulus, Kb (eerste termijn van de vergelijking 5)14:
5
Let op: onder hoge spanningen (> 0,5 mN. m− 1), membraan-golvende worden volledig onderdrukt en membraan gebied toeneemt als gevolg van de toegenomen afstand tussen moleculen. In dit regime domineert de tweede term van vergelijking 5 en geeft hij toegang tot het gebied Comprimeer baarheid modulus Ka (Figuur 8 en Figuur 9).
- Om toegang te krijgen tot deze parameters, gebruik maken van het formalisme opgericht door E. Evans12. Bereken de aanzuigdruk die over het membraan wordt uitgeoefend vanaf vergelijking 1:
2
3
het membraan gebied van de blaasje bij de lagere aanzuigdruk.
4
5Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met het bovengenoemde protocol hebben we verschillende synthetische reus unilamellaire blaasje (guv) bestudeerd, verkregen uit een fosfolipide: 2-oleoyl-1-Palmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (popc), een triblock copolymeer: poly (ethyleeneoxide)-b-poly (dimethylsiloxaan)-b-poly (ethyleeneoxide) (PEO12-b-PDMS43-b-PEO12) gesynthetiseerd in een eerdere studie13, en een diblock copolymeer poly (dimethylsiloxaan)-b-poly ( ethyleeneoxide) (PDMS27-b-PEO17). Het is al eerder door onze groep aangetoond dat de vereniging van triblock copolymeer PEO8-b-PDMS22-b-PEO8 met fosfolipide popc leidt tot een enorme afname van membraan taaiheid van de resulterende ghuvs (gigantische hybride unilamellaire blaasjes)15. De meting is herhaald voor deze studie en uitgebreid tot Guv's verkregen uit diblock copolymeer en GHUV verkregen uit de associatie van dit copolymeer van diblock en POPC.
De resultaten worden geïllustreerd in Figuur 10 en tabel 1. Het gebied Comprimeer baarheid modulus en lysisstam voor POPC zijn in perfecte overeenstemming met literatuur16. De meting van de buig moduli van het hybride vesikel is nog niet uitgevoerd in het laboratorium. Voor de verkregen polymerosomen worden typische waarden gegeven. Het is de moeite waard om te vermelden dat de taaiheid van membraan (Ec) verkregen uit diblock copolymeren is veel verder dan die verkregen met triblock copolymeer. Meer interessant, met het copolymeer van diblock is het mogelijk om gigantische hybride unilamellaire lipide/polymeer blaasjes te verkrijgen die een hogere taaiheid dan de liposomen presenteren, wat het belangrijkste belang is van een dergelijke vereniging.
Figuur 1: Microforge voor het polijsten van pipetpunten. De afbeelding toont de verschillende onderdelen van het apparaat: de metalen pipet houder (a), het Glazen capillair (b), de micromanipulator-verwarmings zone (c), de lichtbron (d), de 10x, 32x, 40x-objectieven (e) en de Microscoop-oculairen (f). In de insert wordt de pipetpunt, ondergedompeld in een glazen kraal, waargenomen door middel van een 32x-doelstelling met dradenkruis. Het niveau van het gesmolten glas in de punt is na afkoeling vastgesteld op een tussenliggende hoogte (H). Door de punt weg te trekken ontstaat een scherpe pauze. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: experimentele opstelling voor het coaten en vullen van pipetpunten. A) eenglazen spuit van 500 μL voorzien van een flexibele silica capillaire is gemonteerd om de micro pipet met een glucoseoplossing te vullen. B) vergroting van het capillaire onderste deel. Tijdens de nachtelijke onderdompeling stijgt het niveau van de BSA-oplossing met capillaire werking tot 1 cm lang. De pipet wordt vervolgens gevuld met glucose door een flexibel capillair in te voegen om niet-geadsorreven BSA te verwijderen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: materialen om een op ito gebaseerd elektrovormings apparaat te bouwen. Het apparaat bestaat uit twee glazen glijbanen die aan één kant gecoat zijn met indium tin oxide (a). Een rubberen O-ring is aan één kant gesneden zodat het laden van de oplossing in de kamer en de oogst van de GUVs suspensie (b). De rubberen O-ring wordt gebruikt als afstandhouder om de twee dia's te scheiden. De dia's zijn aangesloten op de spannings Generator via elektrische draden (c) en bevestigd aan het oppervlak door plakband (d). Er wordt silicium vrij vet gebruikt om de afstandhouder te verzegelen met de glaasjes (e). Ohmmeter wordt gebruikt om de met ITO beklede zijkanten te identificeren en de geleiding (f) te controleren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: elektro vorming opgezet. A) de amfifiele oplossing wordt afgezet met behulp van een glas capillair op de met ito beklede zijkanten van de glasplaten. B) na de assemblage en de droog stap is de kamer aangesloten op de spannings Generator (10 Hz, 2 V) en vervolgens gevuld met sucrose-oplossing. (C) na elektro vorming wordt in de kamer een luchtbel gecreëerd om de guv's van het oppervlak te laten losmaken. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: aspiratie van micro pipet instellen. A) beschrijving van de componenten: fluorescentiemicroscoop (1), water gevulde tank en micrometer glijden op een aluminium optische Rail (2), Siliconen slang geleidende waterstroom van het reservoir naar de micro Pipet (3), micromanipulator controle paneel (4), motoreenheid van de micro manipulator die X, Y en Z verplaatsing (5), vibratie isolatie tabel (6) mogelijk maakt. B) vergroting van het huisgemaakte aluminium podium uitgerust met twee glazen glijbanen (7), Pipet (8) en pipet houder (9) gemonteerd op de motoreenheid van de micro manipulator en bevestigd door klem knop (10). Houd er rekening mee dat de pipetpunt wordt ondergedompeld in het midden van glucose meniscus. (C) glaasjes gelijmd met vacuüm vet aan elke zijde waardoor de vorming van glucose meniscus (zijaanzicht). D) glucose meniscus omgeven door minerale olie om Waterverdamping te voorkomen (bovenaanzicht). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: beeld van een GUV onder spanning met behulp van micropipet aspiratie. Het rode kanaal verzamelen van de fluorescentie van de Rhodamine gelabeld lipide en het transmissiekanaal (DIC) zijn samengevoegd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Afbeelding 7: beelden van een GUV bij verschillende aanzuigdruk. A) de laagst toegepaste spanning die een tong vorming induceert, wordt gebruikt als referentie om de initiële tong lengte (L0) en de blaasje RADIUS (Rv) te bepalen. B) tussen toegepaste spanningswaarde met de bijbehorende tong lengte (L). C) zeer hoge uitgeoefende spanning. D) de afbeelding vlak na de membraan breuk waar de pipet RADIUS wordt gemeten (Rp). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 8: representatieve stress-strain plot van Guv's verkregen door micropipet aspiratie. Dezelfde gegevensset is gebruikt voor het uitzetten van ln (σ) = f (α) en σ = f (α). In het lage spannings regime varieert ln (σ) lineair met α (groene lineaire pasvorm) en geeft toegang tot de buig modulus (Kc); terwijl σ in het hoge spannings regime lineair varieert met α (rode lineaire pasvorm) en toegang geeft tot het gebied dat Samendrukbaarheids modulus (Ka) is. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 9: representatieve stress-strain plot van GUV verkregen door micropipet aspiratie in het rekregime. Uit de experimentele curve kunnen verschillende mechanische parameters van de Guv's worden bepaald. Het gebied Comprimeer baarheid modulus (Ka) komt overeen met de initiële helling en wordt gemeten door lineair de curve te monteren. Het laatste meetpunt geeft de Lysisstam (αl) en de lysis stress (σl) waarden. Tot slot kan de samenhangende dichtheids energie (Ec) worden geschat door het gebied onder de curve (oranje gebied) te integreren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 10: representatieve stress-strain percelen verkregen voor liposoom, Polymersome en hybride polymeer/lipide-vesikel. Guv's bestaan uit POPC (rode driehoeken), triblock copolymeer (groene cirkels), diblock copolymeer (blauwe vierkantjes), op triblock gebaseerde hybride (licht groene cirkels) en op diblock gebaseerde hybride (licht blauwe vierkantjes). De curves werden verkregen door het gemiddelde van de metingen op ten minste 15 Guv's voor elk systeem. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Ka | αL | σL | Ec | Kb | |
| (mN. m-1) | (%) | (mN. m-1) | (mN. m-1) | KT | |
| POPC | 194 ± 15 | 4 ± 1 | 8 ± 2 | 0,17 ± 0,09 | 21.1 ± 0,4 |
| PDMS27-b-PEO17 | 121 ± 8 | 16 ± 4 | 15 ± 3 | 1,37 ± 0,67 | 10,6 ± 3,5 |
| PDMS27-b-PEO17 | 132 ± 13 | 9 ± 4 | 10 ± 3 | 0,50 ± 0,38 | - |
| + 5 gew .% POPC | |||||
| PEO12-b-PDMS43-b-PEO12 | 84 ± 13 | 7 ± 1 | 6 ± 2 | 0,50 ± 0,38 | - |
| PEO12-b-PDMS43-b-PEO12 | 91 ± 11 | 3 ± 1 | 2 ± 1 | 0,03 ± 0,01 | - |
| + 5 gew .% POPC |
Tabel 1: Mechanische parameters bepaald met behulp van micropipet aspiratie technieken op Guv's samengesteld uit fosfolipide, copolymeren of beide.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De coating van de micro Pipet is een van de belangrijkste punten voor het verkrijgen van betrouwbare metingen. Hechting van het blaasje aan de micro pipet moet worden voorkomen, en een coating wordt vaak gebruikt in de literatuur17,18,19,20,21, met BSA, β-caseïne of surfasil. Details van de coating procedure worden zelden genoemd.
Het oplossen van de BSA dient gedurende ten minste 4 uur onder roeren te worden uitgevoerd om een goede solubilization te bereiken. Niettemin is de filtratie stap nog steeds vereist om aggregaten te verwijderen die de micropipet punt kunnen belemmeren. Als BSA niet goed is opgelost, zal het grootste deel van het worden verwijderd door filtratie, en coating zal niet effectief zijn. De ideale concentratie en ontbinding tijd zijn respectievelijk 0,8-1 gew .% en 4 h.
Een ander belangrijk punt is het verzekeren van een constante osmotische druk binnen en buiten de vesikel tijdens de meting. Een verhoging van de glucoseconcentratie als gevolg van Waterverdamping tijdens het experiment kan leiden tot deflatie van het blaasje en perturb de meting (onderschatting van Ka, enz.). De afzetting van een olielaag is verplicht om dit verschijnsel te voorkomen (Figuur 3D). Om de efficiëntie van de olielaag te controleren, kan een constante aspiratie druk van weinig mN ∙ m-1 op een blaasje worden toegepast gedurende 5 minuten, en de lengte L van de tong in het capillair moet constant zijn.
Het laatste kritieke punt is de pre-stress stap (paragraaf 3,3), die zelden wordt vermeld in literatuur20. Deze stap is nodig om de toppen, de buisjes en het overtollige oppervlak van het blaasje te verwijderen en reproduceerbare resultaten van een blaasje naar de andere te krijgen.
De micropipet aspiratie methode kan worden toegepast op alle Guv's, zolang ze een vloeistof membraan presenteren (bijvoorbeeld Telektro vorming > tm van lipiden) en beschikken over een buig modulus onder 100 KT. In het geval van een dik en viskeuze membraan, zelfs in de vloeistof toestand, kunnen twee pipetten worden gebruikt om de moduli22te meten. De micropipet aspiratie techniek biedt een groot voordeel om toegang te geven tot verschillende parameters (buigen en Area samendrukbaarheids moduli) en dit is de enige techniek die beschikbaar is om direct toegang te krijgen tot het gebied samendrukbaarheids modulus van een guv's membraan.
Hoewel deze techniek al lange tijd bekend is, wordt het nog steeds vaak gebruikt door talrijke wetenschappelijke gemeenschappen (biophysicisten, fysico-chemici, chemici, enz.). De micropipet aspiratie methode zal in de toekomst een belangrijke techniek blijven, vooral om verdere membraan eigenschappen van geavanceerde synthetische cellen (bijv. hybride polymeer/lipide-blaasjes en protocellen) te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen de ANR voor financiële steun (ANR Sysa) dankbaar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Required equipment and materials for micropipette design | |||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | external and internal diameter of 1mm and 0.58 mm respectively. |
| Filament installed | Sutter Instrument Co. | FB255B | 2.5mm*2.5mm Box Filament |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | |
| Microforge | NARISHGE Co. | MF-900 | fitted with two objectives (10x and 32x) |
| Materials for coating pipette tips with BSA | |||
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Sigma-Aldrich | 10735078001 | |
| Disposable 1 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| Disposable 10 ml syringe Luer Tip | Codan | 626616 | |
| Disposable 5 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.5607 | |
| Disposable acetate cellulose filter | Cluzeau Info Labo | L5003SPA | Pore size: 0.22µm, diameter: 25mm |
| Flexible Fused Silica Capillary Tubing | Polymicro Technologies. | TSP530660 | Inner Diameter 536µm, Outer Diameter 660µm, |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Syringe 500 µL luer Lock GASTIGHT | Hamilton Syringe Company | 1750 | |
| Test tube rotatory mixer | Labinco | 28210109 | |
| Micromanipulation Set up | |||
| Aluminum Optical Rail, 1000 mm Length, M4 threads, X48 Series | Newport | ||
| Damped Optical Table | Newport | used as support of microscope to prevent external vibrations. | |
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP 2 | The module unit (motor unit for X, Y and Z movement) is mounted on the inverted microscope by the way of an adapter. |
| Micrometer | Mitutoyo Corporation | 350-354-10 | Digimatic LCD Micrometer Head 25,4 mm Range 0,001 mm |
| Plexiglass water reservoir (100 ml) | Home made | ||
| TCS SP5 inverted confocal microscope (DMI6000) equipped with a resonant scanner and a water immersion objective (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I). | Leica | ||
| X48 Rail Carrier 80 mm Length,with 1/4-20, 8-32 and 4-40 thread | Newport | ||
| Materials for sucrose and amphiphile solution preparation | |||
| 2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Sigma-Aldrich | ||
| Chloroform | VWR | 22711.244 | |
| L-α-Phosphatidylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) | Sigma-Aldrich | 810146C | Rhodamine tagged lipid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Electroformation set up | |||
| 10 µL glass capillary ringcaps | Hirschmann | 9600110 | |
| Disposable 1 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| H Grease | Apiezon | Apiezon H Grease | Silicon-free grease |
| Indium tin oxide coated glass slides | Sigma-Aldrich | 703184 | |
| Needle | Terumo | AN2138R1 | 0.8 x 38 mm |
| Ohmmeter (Multimeter) | Voltcraft | VC140 | |
| Toluene | VWR | 28676.297 | |
| Voltage generator | Keysight | 33210A |
References
- Bangham, A. D., Standish, M. M., Watkins, J. C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids. Journal of Molecular Biology. 13 (1), (1965).
- Discher, D. E., Eisenberg, A. Polymer vesicles. Science. 297 (5583), 967-973 (2002).
- Hammer, D., et al. Polymersomes: vesicles from block copolymers. Annals of Biomedical Engineering. 28 (SUPPL. 1), (2000).
- Le Meins, J. F., Schatz, C., Lecommandoux, S., Sandre, O. Hybrid polymer/lipid vesicles: state of the art and future perspectives. Materials Today. 16 (10), 397-402 (2013).
- Schulz, M., Binder, W. H. Mixed Hybrid Lipid/Polymer Vesicles as a Novel Membrane Platform. Macromolecular Rapid Communications. 36, 2031-2041 (2015).
- Schneider, M. B., Jenkins, J. T., Webb, W. W. Thermal fluctuations of large quasi-spherical bimolecular phospholipid vesicles. Journal De Physique. 45 (9), 1457-1472 (1984).
- Dimova, R. Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes. Advances in Colloid and Interface Science. 208, 225-234 (2014).
- Rodríguez-García, R., et al. Polymersomes: smart vesicles of tunable rigidity and permeability. Soft Matter. 7 (4), 1532-1542 (2011).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
- Dao, T. P. T., et al. Membrane properties of giant polymer and lipid vesicles obtained by electroformation and pva gel-assisted hydration methods. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 533, 347-353 (2017).
- Pereno, V., et al. Electroformation of Giant Unilamellar Vesicles on Stainless Steel Electrodes. ACS omega. 2 (3), 994-1002 (2017).
- Evans, E., Rawicz, W. Entropy-driven tension and bending elasticity in condensed-fluid membranes. Physical Review Letters. 64 (17), 2094-2097 (1990).
- Dao, T. P. T., et al. Modulation of phase separation at the micron scale and nanoscale in giant polymer/lipid hybrid unilamellar vesicles (GHUVs). Soft Matter. 13 (3), 627-637 (2017).
- Helfrich, W. Elastic properties of lipid bilayers: theory and possible experiments. Z Naturforsch C. 11 (11), 693-703 (1973).
- Dao, T. P. T., et al. The combination of block copolymers and phospholipids to form giant hybrid unilamellar vesicles (GHUVs) does not systematically lead to "intermediate'' membrane properties. Soft Matter. 14 (31), 6476-6484 (2018).
- Shoemaker, S. D., Kyle Vanderlick, T. Material Studies of Lipid Vesicles in the Lα and Lα-Gel Coexistence Regimes. Biophysical Journal. 84 (2), 998-1009 (2003).
- Longo, M. L., Ly, H. V. Methods in Membrane Lipids. Dopico, A. M. , Humana Press. 421-437 (2007).
- Chen, D., Santore, M. M. Hybrid copolymer-phospholipid vesicles: phase separation resembling mixed phospholipid lamellae, but with mechanical stability and control. Soft Matter. 11 (13), 2617-2626 (2015).
- Mabrouk, E., et al. Formation and material properties of giant liquid crystal polymersomes. Soft Matter. 5, 1870-1878 (2009).
- Henriksen, J., et al. Universal behavior of membranes with sterols. Biophysical Journal. 90 (5), 1639-1649 (2006).
- Ly, H. V., Block, D. E., Longo, M. L. Interfacial Tension Effect of Ethanol on Lipid Bilayer Rigidity, Stability, and Area/Molecule: A Micropipet Aspiration Approach. Langmuir. 18 (23), 8988-8995 (2002).
- Bermudez, H., Hammer, D. A., Discher, D. E. Effect of Bilayer Thickness on Membrane Bending Rigidity. Langmuir. 20, 540-543 (2004).
