Obsistenza di Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration
Summary
L’obiettivo del protocollo è quello di misurare in modo affidabile le proprietà meccaniche della membrana delle vesciche giganti mediante aspirazione alla micropipetta.
Abstract
Le vesciche giganti ottenute da fosfolipidi e copolimeri possono essere sfruttate in diverse applicazioni: somministrazione controllata e mirata di farmaci, riconoscimento biomolecolare all’interno di biosensori per la diagnosi, membrane funzionali per cellule artificiali e sviluppo di micro/nanoreattori bioispirati. In tutte queste applicazioni, la caratterizzazione delle loro proprietà della membrana è di fondamentale importanza. Tra le tecniche di caratterizzazione esistenti, l’aspirazione di micropipette, introdotta da E. Evans, consente la misurazione delle proprietà meccaniche della membrana come il modulo di comprimibilità dell’area, la piegatura del modulo e lo stress e la deformazione della lisi. Qui, presentiamo tutte le metodologie e le procedure dettagliate per ottenere vesciche giganti dalla pellicola sottile di un lipidico o un polimero (o entrambi), la produzione e il trattamento superficiale delle micropipette, e la procedura di aspirazione che porta alla misurazione di tutti i parametri sopra menzionati.
Introduction
Le vesciche giganti ottenute dai fosfolipidi (liposomi) sono state ampiamente utilizzate fin dagli anni ’70 come modello di membrana cellulare di base1. Alla fine degli anni ’90, le morfologie vescicolari ottenute dall’auto-assemblaggio dei polimeri, chiamati polimeriini in riferimento ai loro analoghi lipidi2,3, sono apparse rapidamente come un’interessante alternativa ai liposomi che possiedono una debole stabilità meccanica e scarsa funzionalità chimica modulare. Tuttavia, il loro carattere biomimetico cellulare è piuttosto limitato rispetto ai liposomi poiché questi ultimi sono composti da fosfolipidi, il componente principale della membrana cellulare. Inoltre, la loro bassa permeabilità della membrana può essere un problema in alcune applicazioni come la somministrazione di farmaci in cui è necessaria la diffusione controllata delle specie attraverso la membrana. Recentemente, l’associazione dei fosfolipidi con i copomeri a blocchi per progettare vescicoli polimerici e membrane ibride è stata oggetto di un numero crescente di studi4,5. L’idea principale è quella di progettare entità che combininino in modo sinergico i benefici di ogni componente (bio-funzionalità e permeabilità dei bistrati lipidi con la stabilità meccanica e la versatilità chimica delle membrane polimeriche), che possono essere sfruttate in diverse applicazioni: somministrazione controllata e mirata di farmaci, riconoscimento biomolecolare all’interno di biosensori per la diagnosi, membrane funzionali per le cellule artificiali, sviluppo di microreattori bio-ispirati.
Al giorno d’oggi, diverse comunità scientifiche (biochimici, chimici, biofisici, fisici chimici, biologi) hanno crescente interesse per lo sviluppo di un modello di membrana cellulare più avanzato. Qui, il nostro obiettivo è quello di presentare, nel modo più dettagliato possibile, metodologie esistenti (elettroformazione, aspirazione micropipette) per ottenere e caratterizzare le proprietà meccaniche delle vescicoli giganti e i recenti modelli a membrana cellulare “avanzati” che sono vescicoli giganti lipidi polimeriici ibridi4,5.
Lo scopo di questi metodi è quello di ottenere una misurazione affidabile della comprimibilità dell’area e della moduli di flessione della membrana, nonché il loro stress e tensione di lisi. Una delle tecniche più comuni esistenti per misurare la rigidità di piegatura di una vescica gigante è l’analisi della fluttuazione6,7, basata sull’osservazione diretta del microscopio video; ma questo richiede una grande fluttuazione visibile della membrana, e non è sistematicamente ottenuto su membrane spesse (ad esempio polimero). Il modulo di comprimibilità dell’area può essere determinato sperimentalmente utilizzando la tecnica Langmuir Blodgett, ma il più delle volte su un monostrato8. La tecnica di aspirazione delle micropipette consente la misurazione di entrambi i moduli su un bistrato che formano la vescicle unilamellar gigante (GUV) in un esperimento.
Il seguente metodo è appropriato per tutte le molecole di anfifianco o macromolecole in grado di formare bistrati e, di conseguenza, vescicoli per elettroformazione. Ciò richiede un carattere fluido del biostrato alla temperatura dell’elettroformazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il rivestimento della micropipetta è uno dei punti chiave per ottenere misurazioni affidabili. L’adesione della vescica alla micropipetta deve essere prevenuta, e un rivestimento è comunemente usato nella letteratura17,18,19,20,21, con BSA, zo-casein o surfasil. I dettagli della procedura di rivestimento sono raramente menzionati.
<p class="jove_content"…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono con gratitudine l’ANR per il sostegno finanziario (ANR Sysa).
Materials
| Required equipment and materials for micropipette design | |||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | external and internal diameter of 1mm and 0.58 mm respectively. |
| Filament installed | Sutter Instrument Co. | FB255B | 2.5mm*2.5mm Box Filament |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | |
| Microforge | NARISHGE Co. | MF-900 | fitted with two objectives (10x and 32x) |
| Materials for coating pipette tips with BSA | |||
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Sigma-Aldrich | 10735078001 | |
| Disposable 1 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| Disposable 10 ml syringe Luer Tip | Codan | 626616 | |
| Disposable 5 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.5607 | |
| Disposable acetate cellulose filter | Cluzeau Info Labo | L5003SPA | Pore size: 0.22µm, diameter: 25mm |
| Flexible Fused Silica Capillary Tubing | Polymicro Technologies. | TSP530660 | Inner Diameter 536µm, Outer Diameter 660µm, |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Syringe 500 µL luer Lock GASTIGHT | Hamilton Syringe Company | 1750 | |
| Test tube rotatory mixer | Labinco | 28210109 | |
| Micromanipulation Set up | |||
| Aluminum Optical Rail, 1000 mm Length, M4 threads, X48 Series | Newport | ||
| Damped Optical Table | Newport | used as support of microscope to prevent external vibrations. | |
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP 2 | The module unit (motor unit for X, Y and Z movement) is mounted on the inverted microscope by the way of an adapter. |
| Micrometer | Mitutoyo Corporation | 350-354-10 | Digimatic LCD Micrometer Head 25,4 mm Range 0,001 mm |
| Plexiglass water reservoir (100 ml) | Home made | ||
| TCS SP5 inverted confocal microscope (DMI6000) equipped with a resonant scanner and a water immersion objective (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I). | Leica | ||
| X48 Rail Carrier 80 mm Length,with 1/4-20, 8-32 and 4-40 thread | Newport | ||
| Materials for sucrose and amphiphile solution preparation | |||
| 2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Sigma-Aldrich | ||
| Chloroform | VWR | 22711.244 | |
| L-α-Phosphatidylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) | Sigma-Aldrich | 810146C | Rhodamine tagged lipid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Electroformation set up | |||
| 10 µL glass capillary ringcaps | Hirschmann | 9600110 | |
| Disposable 1 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| H Grease | Apiezon | Apiezon H Grease | Silicon-free grease |
| Indium tin oxide coated glass slides | Sigma-Aldrich | 703184 | |
| Needle | Terumo | AN2138R1 | 0.8 x 38 mm |
| Ohmmeter (Multimeter) | Voltcraft | VC140 | |
| Toluene | VWR | 28676.297 | |
| Voltage generator | Keysight | 33210A |
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