마이크로 파이펫 포부로 전기 형성 및 기계적 특성 측정에 의한 거대한 Unilamellar 하이브리드 소포의 Obtention
Summary
이 프로토콜의 목표는 마이크로파이펫 흡인에 의해 거대 소포의 막 기계적 특성을 안정적으로 측정하는 것입니다.
Abstract
인지질및공중합체에서 얻은 거대 소포는 제어 및 표적 약물 전달, 진단을 위한 바이오센서 내 생체 분자 인식, 인공 세포를 위한 기능성 멤브레인, 바이오영감 마이크로/나노 반응기 개발 등 다양한 응용 분야에서 이용될 수 있습니다. 이러한 모든 응용 분야에서 멤브레인 특성의 특성화는 근본적으로 중요합니다. E. Evans가 개척한 기존 특성화 기술 중 에는 면적 압축성 계수, 굴곡 계수 및 용해 응력 및 변형과 같은 멤브레인의 기계적 특성을 측정할 수 있습니다. 여기서, 우리는 지질 또는 공중합체 (또는 둘 다)의 박막에서 거대한 소포를 얻기 위한 모든 방법론 및 상세한 절차, 마이크로파이펫의 제조 및 표면 처리, 및 이전에 언급한 모든 파라미터의 측정으로 이어지는 흡인 절차를 제시한다.
Introduction
인지질(liposomes)으로부터 얻은 거대 소포는 1970년대부터 기본 세포막 모델1로서널리 사용되어 왔다. 1990 년대 후반에, 그들의 지질 유사체2,3에관하여 명명된 폴리머의 자기 조립에서 얻은 포식어는, 급속하게 약한 기계적 안정성 및 가난한 모듈형 화학 기능을 가진 리포좀에 대한 흥미로운 대안으로 나타났습니다. 그러나, 그들의 세포 생모방 특성은 세포막의 주성분인 인지질로 구성되어 있기 때문에 리포좀에 비해 다소 제한적이다. 더욱이, 그들의 낮은 막 투과성은 막을 통해 종의 통제된 확산이 요구되는 약 납품 같이 몇몇 응용에서 문제가 될 수 있습니다. 최근, 하이브리드 폴리머-지질 소포 및 멤브레인을 설계하는 블록 공중합체와 인지질의 연관성이4,5연구의증가의 대상이 되고 있다. 주요 아이디어는 각 구성 요소의 이점 (지질 이중층의 생체 기능 및 투과성 및 폴리머 멤브레인의 기계적 안정성 및 화학적 다양성)을 시너지 효과로 결합하는 법인을 설계하는 것입니다: 제어 및 표적 약물 전달, 진단을위한 바이오 센서 내의 생체 분자 인식, 인공 세포를위한 기능성 멤브레인, 바이오 영감 마이크로 / 나노 반응기 의 개발.
요즘, 다른 과학 공동체 (생화학자, 화학자, 생물 물리학자, 물리 학자, 생물학자)는 더 진보 된 세포막 모델의 개발에 대한 관심이 증가하고있다. 여기서, 우리의 목표는 가능한 한 상세히, 기존의 방법론(전기형성, 마이크로파이펫 흡인)을 획득하고 거대 소포의 기계적 특성을 특성화하는 것 및 하이브리드 폴리머 지질 거대소포인최근 “고급” 세포막 모델을 제시하는것이다.
이러한 방법의 목적은 용해 응력 및 변형뿐만 아니라 멤브레인의 영역 압축성 및 굽힘 계수의 신뢰할 수있는 측정을 얻는 것입니다. 거대 소포의 굽힘 강성을 측정하기 위해 존재하는 가장 일반적인 기술 중 하나는 직접 비디오 현미경 관찰에 기초한 변동 분석6,7입니다. 그러나 이것은 큰 가시적인 막 변동을 요구하고, 두꺼운 막 (예를 들면 폴리머 섬)에 체계적으로 장악되지 않습니다. 면적 압축성 계수는 Langmuir Blodgett 기술을 사용하여 실험적으로 결정될 수 있지만 대부분의 경우 단층8에서결정됩니다. 마이크로파이펫 흡인 기술은 한 실험에서 거대한 unilamellar 소포 (GUV)를 형성하는 이중층에서 둘 다 moduli의 측정을 허용합니다.
다음 방법은 이중층을 형성할 수 있는 모든 양과성 분자 또는 거대 분자에 적합하며, 결과적으로 전기 형성에 의한 소포에 적합합니다. 이를 위해서는 전기 형성 온도에서 이중층의 유체 특성이 필요합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
마이크로파이펫 코팅은 신뢰할 수 있는 측정을 얻기 위한 핵심 포인트 중 하나입니다. 마이크로파이펫에 소포의 부착을 방지해야 하며, 코팅은 BSA, β-카제인 또는 서파실과 함께 문헌17,18,19,20,21에서일반적으로 사용된다. 코팅 절차의 세부 사항은 거의 언급되지 않습니다.</p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 감사하게 금융 지원 (ANR Sysa)에 대한 ANR을 인정합니다.
Materials
| Required equipment and materials for micropipette design | |||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | external and internal diameter of 1mm and 0.58 mm respectively. |
| Filament installed | Sutter Instrument Co. | FB255B | 2.5mm*2.5mm Box Filament |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | |
| Microforge | NARISHGE Co. | MF-900 | fitted with two objectives (10x and 32x) |
| Materials for coating pipette tips with BSA | |||
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Sigma-Aldrich | 10735078001 | |
| Disposable 1 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| Disposable 10 ml syringe Luer Tip | Codan | 626616 | |
| Disposable 5 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.5607 | |
| Disposable acetate cellulose filter | Cluzeau Info Labo | L5003SPA | Pore size: 0.22µm, diameter: 25mm |
| Flexible Fused Silica Capillary Tubing | Polymicro Technologies. | TSP530660 | Inner Diameter 536µm, Outer Diameter 660µm, |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Syringe 500 µL luer Lock GASTIGHT | Hamilton Syringe Company | 1750 | |
| Test tube rotatory mixer | Labinco | 28210109 | |
| Micromanipulation Set up | |||
| Aluminum Optical Rail, 1000 mm Length, M4 threads, X48 Series | Newport | ||
| Damped Optical Table | Newport | used as support of microscope to prevent external vibrations. | |
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP 2 | The module unit (motor unit for X, Y and Z movement) is mounted on the inverted microscope by the way of an adapter. |
| Micrometer | Mitutoyo Corporation | 350-354-10 | Digimatic LCD Micrometer Head 25,4 mm Range 0,001 mm |
| Plexiglass water reservoir (100 ml) | Home made | ||
| TCS SP5 inverted confocal microscope (DMI6000) equipped with a resonant scanner and a water immersion objective (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I). | Leica | ||
| X48 Rail Carrier 80 mm Length,with 1/4-20, 8-32 and 4-40 thread | Newport | ||
| Materials for sucrose and amphiphile solution preparation | |||
| 2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Sigma-Aldrich | ||
| Chloroform | VWR | 22711.244 | |
| L-α-Phosphatidylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) | Sigma-Aldrich | 810146C | Rhodamine tagged lipid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Electroformation set up | |||
| 10 µL glass capillary ringcaps | Hirschmann | 9600110 | |
| Disposable 1 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| H Grease | Apiezon | Apiezon H Grease | Silicon-free grease |
| Indium tin oxide coated glass slides | Sigma-Aldrich | 703184 | |
| Needle | Terumo | AN2138R1 | 0.8 x 38 mm |
| Ohmmeter (Multimeter) | Voltcraft | VC140 | |
| Toluene | VWR | 28676.297 | |
| Voltage generator | Keysight | 33210A |
References
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