Summary
Målet med protokollen er at pålideligt måle membran mekaniske egenskaber af gigantiske vesikler ved mikropipette aspiration.
Abstract
Gigantiske vesikler fra phospholipider og copolymere kan udnyttes i forskellige anvendelser: kontrolleret og målrettet lægemiddel levering, biomolekulær genkendelse inden for biosensorer til diagnosticering, funktionelle membraner til kunstige celler og udvikling af bioinspirerede mikro/nano-reaktorer. I alle disse applikationer er karakteriseringen af deres membran egenskaber af fundamental betydning. Blandt eksisterende karakterisering teknikker, mikropipette aspiration, pioneret af E. Evans, gør det muligt at måle mekaniske egenskaber af membranen såsom område komprimerbarhed modulus, bøjning modulus og lysis stress og stamme. Her præsenterer vi alle de metoder og detaljerede procedurer for at opnå gigantiske vesikler fra den tynde film af en lipid eller copolymer (eller begge), fremstilling og overfladebehandling af Mikropipetter, og aspiration procedure, der fører til måling af alle de parametre, der tidligere er nævnt.
Introduction
Gigantiske vesikler opnået fra phospholipider (Liposomer) har været meget anvendt siden 1970 ' erne som den grundlæggende celle membran model1. I slutningen af 1990 'erne,vesikulære morfologier opnået fra den selv-samling af Copolymerer, kaldes polymersomer med henvisning til deres lipid analoger2,3, hurtigtdukkede op som et interessant alternativ til Liposomer, der besidder svag mekanisk stabilitet og dårlig modulære kemiske funktionalitet. Men, deres celle biomimetic karakter er temmelig begrænset i forhold til Liposomer da sidstnævnte er sammensat af phospholipider, den vigtigste komponent i cellemembranen. Desuden kan deres lave membran permeabilitet være et problem i nogle applikationer som lægemiddel levering, hvor kontrolleret diffusion af arter gennem membranen er påkrævet. For nylig har sammenslutningen af phospholipid'er med blok copolymere til at designe hybrid polymer-lipid vesikler og membraner været genstand for et stigende antal undersøgelser4,5. Hovedidéen er at designe enheder, der synergistisk kombinerer fordelene ved hver komponent (Bio-funktionalitet og permeabilitet af lipid-dobbeltlag med mekanisk stabilitet og kemisk alsidighed af polymer membraner), som kan udnyttes i forskellige anvendelser: kontrolleret og målrettet lægemiddel levering, biomolekulær genkendelse inden for biosensorer til diagnosticering, funktionelle membraner til kunstige celler, udvikling af bio-inspirerede mikro-/nano-Reactors.
I dag, forskellige videnskabelige samfund (biokemikere, kemikere, biophysicister, fysisk-kemikere, biologer) har stigende interesse i udvikling af en mere avanceret celle membran model. Her er vores mål at præsentere, så detaljeret som muligt, eksisterende metoder (elektro dannelse, mikropipette aspiration) for at opnå og karakterisere de mekaniske egenskaber af gigantiske vesikler og de seneste "avancerede" celle membran modeller, der er hybrid polymer lipid gigantiske vesikler4,5.
Formålet med disse metoder er at opnå pålidelig måling af områdets kompressionsevne og bøjning moduli af membranen samt deres lysis stress og stamme. En af de mest almindelige teknikker, der findes til at måle bøjning stivhed af en kæmpe vesikelprotein er udsvings analyse6,7, baseret på direkte video mikroskop observation; men dette kræver store synlige membran udsving, og er ikke systematisk opnået på tykke membraner (f. eks. polymersomer). Område Komprimerbar modulus kan eksperimentelt bestemmes ved hjælp af Langmuir Blodgett teknik, men oftest på en enkeltlags8. Den mikropipette aspiration teknik gør det muligt at måle begge moduli på en tolags danner Giant af vesikelprotein (GUV) i et eksperiment.
Følgende metode er hensigtsmæssig for alle amfifilic molekyler eller makromolekyle, der kan danne dobbeltlag og dermed vesikler ved elektro dannelse. Dette kræver en flydende karakter af den tolags ved temperaturen af elektro dannelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fabrikbearbejdning af Mikropipetter
Bemærk: her er der behov for Mikropipetter med en indvendig diameter på mellem 6 og 12 μm og en tilspidsning på omkring 3-4 mm. En detaljeret metode til fremstilling af mikropipette er beskrevet i det følgende.
- Placer borosilikat glasset kapillar i trækstangen af pulleren og fastgør en af enderne ved at stramme knappen.
- Skub forsigtigt glasset gennem hullerne ved siden af varmekammeret.
- Stram spændegrebet i den anden ende.
- Kontroller størrelsen på spidsen og tilspidseren for at opnå de ønskede specifikationer. For at optimere tekniske parametre såsom varme temperatur, træk, hastighed, forsinkelse og tryk. Her er et eksempel på et program, der bruges:
Varme: 550 °C
Træk: 10 (rækkevidde af maskinen: 0-255 i vilkårlige enheder)
Hastighed: 30 (interval: 0-255 i vilkårlige enheder)
Forsinkelse: 1 (interval: 0-255 i vilkårlige enheder)
Tryk: 500 (interval: 0-999 i vilkårlige enheder) - Klik på PULL for at udføre de begivenheder, der er defineret af programmet. Kapillar er derefter opdelt i to Mikropipetter, hvis dimensioner skal justeres ved hjælp af en mikroforge.
- Indsæt mikropipetten i mikrosmedens metal pipette holder (Se figur 1). Ved hjælp af 10x mål justeres mikroskopet og pipette manipulatoren (vertikal og horisontal bevægelse), indtil pipettespidsen er tæt på glas perlens overflade.
- Tryk på fodkontakten for at smelte glaskuglen. Sænk spidsen og læg den i kontakt med den smeltede glaskugle. Smeltet glas vil flyde ind i pipetten ved kapillar handling. Vent et par sekunder, indtil niveauet af det smeltede glas når en vis højde som vist i skær af figur 1.
- Stop opvarmningen ved at fjerne trykket på fodkontakten, og træk hurtigt spidsen væk ved hjælp af den lodrette pipette manipulator for at forårsage en skarp pause.
- Gentag trin 1,7 og 1,8, indtil den ønskede diameter er opnået (6 til 12 μm).
Bemærk: for at forbedre nøjagtigheden af diameter målingen skal du under det sidste trin bruge en 32x-objektiv, der er udstyret med en retikel.
2. pipettespidser til belægning med BSA (bovint serumalbumin)
- Til klargøring af en 0,1 M opløsning af glucose indeholdende 1% WT. BSA i rent vand.
- 180 mg glucosepulver afvejes, placeres i et 15 mL konisk rør af polypropylen og komplet med 10 mL rent vand.
- Tilsæt 0,1 g BSA pulver og Ryst forsigtigt ved hjælp af en test tube rotatory mixer indtil fuldstændig opløsning (ca. 4 h).
- Opløsningen tages med en 10 mL engangs luer, der er forsynet med en nål. Når den er fyldt, fjernes nålen og installeres et 0,22 μm acetat cellulose filter. Fyld flere mikro-centrifugeglas af polypropylen (1,5 mL), der vil blive brugt til at sænke spidsen.
- Placer kapillærer lodret i holdere. Sænk holderen, og sænk spidsen ind i glukose/BSA-opløsningen natten over. Opløsningen skal stige ca. 1 cm høj ved kapillar handling.
- Fjern pipettespidsen fra glucose/BSA-opløsningen. Der fremstilles 5 mL 0,1 M glucoseopløsning (fortyndet 90 mg glucosepulver i 5 mL rent vand) og filtreres gennem et 0,22 μm acetat cellulose filter.
- Fyld pipetten med glucoseopløsningen ved hjælp af en 500 μL glassprøjte udstyret med en fleksibel smeltet silica kapillær. Fjern derefter alle glucoseopløsningen ved at sutte den tilbage og kassere den (figur 2). Gentag dette trin flere gange for at fjerne den ubundet BSA.
3. dannelse af GUVs og GHUVs ved elektro dannelse
Bemærk: elektro dannelse er en almindeligt anvendt teknik udviklet af Angelova9. Procedurerne for at opnå et elektro formation kammer, deponere en lipid eller polymer film (eller begge for GHUVs (Giant hybrid Unilamellar vesikler)) og Hydrere filmen under et alternativt elektrisk felt er beskrevet i det følgende. Proceduren for at indsamle de opnåede GUV er også beskrevet.
- Fremstilling af amfier, saccharose og glukoseopløsninger
- Forbered en amfifili opløsning i en koncentration på 1 mg/mL. 10 mg amphiphil afvejes og opløses i 10 mL chloroform. Opløsningen opbevares i forseglede hætteglas for at undgå fordampning af opløsningsmiddel.
- Forbered en stamopløsning af 1,2-dioleoyl-SN-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(lissamine Rhodamin B-sulfonyl) (dope-rhod) ved 1 mg/ml i chloroform.
- Tilsæt 10 μl fluorescerende lipid-opløsning til aktivt-opløsningen. Opbevar løsningerne i forseglede hætteglas for at undgå fordampning af opløsningsmiddel.
- Der forberedes saccharose og glucoseopløsninger i en koncentration på 0,1 M. vejer 342 mg og 180 mg saccharose og glucose henholdsvis og opløses i 10 mL rent vand.
- Klargøring af elektro formation kammer
Bemærk: forskellige ledende materialer kan bruges til at lave en elektro dannelses anordning (f. eks. platin ledninger10, rustfri nåle11). Elektro dannelsen kammer er sammensat af to ITO dias adskilt af en O-ring gummi spacer, der er blevet skåret på den ene side til at skabe en blænde. De slides er forbundet til en spændings generator via to elektriske ledninger (figur 3 og figur 4a).- Rengør ITO-gliderne med organisk opløsningsmiddel (f. eks. chloroform). Identificer den ledende overflade ved hjælp af en Ohmmeter.
- Fastgør de elektriske ledninger på den ledende side ved hjælp af tape.
- Aflejring af amphiphile-opløsning
- Dyp en kapillær i opløsningen, indtil niveauet stiger ved kapillar handling og indsamle omkring 5 μL af opløsningen.
- Sæt kapillær i kontakt med centrum af ITO glaspladen og forsigtigt sprede opløsningen. Vent 10 sekunder for at sikre fuldstændig fordampning af opløsningsmidlet (figur 4A).
- Gentag denne procedure 3 gange for hver side.
- Tilsæt et lag silicium frit fedt på begge sider af den åbne O-ring spacer. Læg det omkring aflejrings området. Placer det ledende ansigt på den anden ITO-glasplade på toppen af spaceren.
- Anbring elektrode kammeret under vakuum i 3 timer for at fjerne eventuelle spor af organisk opløsningsmiddel.
- Elektro formation procedure
- Tilslut de elektriske ledninger til generatoren.
- Brug følgende indstillinger for generatoren:
Alternativ sinusformet spænding
Frekvens: 10 Hz
Amplitude: 2 Vpeak-til-peak
Bemærk: den optimale spændings frekvens og-varighed skal findes for hvert system. - Sørg for, at spændingen påføres før injektion af opløsningen i kammeret.
- Injicer 1 mL opløsning ved hjælp af en sprøjte med 0,8 mm kanyle til indvendig diameter for at fylde kammeret. Fjern eventuelle bobler.
- Lad kammeret under den anvendte spænding/frekvens for 75 min (figur 4B).
- GUVs Harvest
- Sluk for generatoren.
- Brug 1 mL sprøjte med 0,8 mm indre diameter nål, suge en lille del af opløsningen for at producere en luftboble inde i kammeret. Drej kammeret lidt for at få denne boble til at bevæge sig ind i kammeret. Dette kan hjælpe GUVs at løsne fra ITO overflade (figur 4C).
- Suge alle opløsningen og overføre den til en 1 mL plastik rør.
- Fjern ledningerne og rengør ITO-gliderne med organiske opløsningsmidler (toluen og chloroform).
4. opsætning af micromanipulation
Bemærk: princippet om mikropipette aspiration er at suge en enkelt vesikelprotein gennem en glas mikropipette ved at anvende en depression. Længden af tungen inde i pipetten måles som en funktion af sugetrykket. Pipette belægningen med BSA, der er beskrevet tidligere, er afgørende for at forhindre eller minimere adhæsion mellem vesikler membraner og pipetten.
Protokollen er illustreret nedenfor.
- Pipette og vand fyldt reservoir tilslutning
Bemærk: den vandfyldte tank og mikrometer er fastgjort til en glideplade. En digital tæller med et mikrometer hoved tillader en vertikal forskydning af enheden i en afstand af 0 til 2,5 cm og en nøjagtighed på 1 μm. forskydning langs en optisk aluminium skinne er muligt op til 1 meter i længden. En silikone slange forbinder reservoiret og kapillar holderen (figur 5A).- Fyld tanken med rent vand. Tilslut en engangssprøjte med 5 mL til kapillar metalholderen via silikone slange og sug for at skabe en vandstrøm fra tanken til holderen.
- Rør lidt for at eliminere luftbobler. Løft samtidig vandbeholderen for at skabe et positivt tryk. 5 mL-sprøjten er stadig fastgjort til holderen.
- Efter belægning og rengøring trin beskrevet tidligere (Se trin 2), fylde en kapillar med glukose opløsning, indtil en dråbe former i slutningen. Fjern sprøjteslangen fra metal holderen for at skabe en let vandstrøm ved enden.
- Vend kapillær på hovedet, og forbind glukose faldet med vandstrømmen fra holderen. Fastgør kapillar og holderen ved at skrue dem sammen.
- Anbring en pipette
Bemærk: under denne operation er vandbeholderen stadig placeret på aluminiums skinnen for at opretholde et positivt tryk.- Tag den hjemmelavede aluminiums Stage udstyret med to glas glider (tidligere renset med ethanol) og lim dem med vakuum fedt på hver side. Installer det på mikroskop scenen og danne en menisk mellem de to slides ved hjælp af en 1 ml sprøjte indeholdende 0,1 M glukose som vist i figur 5B, C.
- Anbring pipetten og holderen på motorenheden på micromanipulatoren, og stram spænde knappen ned.
- Brug betjeningspanelets joystick i grov tilstand til at sænke mikropipetten i nærheden af glukose-meniscus. Justér spidsen til midten af menisk ved hjælp af fin-modus.
- Hold spidsen nedsænket i glucose i et par minutter for at rense sin ydre og indre overflade (som et positivt tryk opretholdes, vil vandstrømmen skylle den indvendige overflade af pipetten for at fjerne ubelagt BSA).
- Opbevar positionen af spidsen på micromanipulator tastaturet og trække det tilbage fra meniscus.
- Fjern glukose menisk og Udskift den med en frisk. Sutte 2 μL GUVs i 0,1 M saccharose ved hjælp af en 20 μL mikropipette og læg den i den friske glukose meniscus. Observere i DIC-tilstand (differential interferens kontrast) GUVs placeret i bunden på grund af forskellen i tæthed mellem saccharose (hovedsagelig inde i GUVs) og glukose (hovedsagelig uden for GUVs).
- Når vesiklerne er lidt deformeret, skal du isætte sugepipetten igen og fokusere på spidsen. Indstil højden H0 af vandbeholderen, for hvilken trykket er næsten 0. For at, drage fordel af små vesikler eller partikler, som er naturligt til stede i opløsning og justere vandtank højde indtil bevægelsen af disse partikler er stoppet.
- På dette tidspunkt omgiver menisk med mineralolie for at forhindre vand fordampning, se figur 5D.
Bemærk: rumtemperaturen skal styres mellem 20-22 °C ved hjælp af aircondition.
- Forsøg med aspiration af mikropipette
- Sænk pipettespidsen (6-12 μm i diameter), og lav en lille suge (-1 cm) for at aspirere en vesikelprotein (15-30 μm i diameter). Membranen i den valgte vesikel skal variere lidt og må ikke fremvise synlige defekter (ingen opløbet eller glødetråd) (figur 6).
- Hæv pipetten op på et højere niveau for at isolere den aspirerede vesikler fra de andre vesicles ved hjælp af micromanipulatoren, og opbevar denne position under hele forsøget.
- Pre-stress vesikelprotein ved at sænke den vandfyldte tank til ca-10 cm, derefter sænke trykket for at vende tilbage til sin oprindelige værdi (-1 cm). Gentag dette trin flere gange for at fjerne membran overskydende og små defekter fra membranen.
- Fra en højde på-0,5 cm defineret ved placeringen af vandbeholderen, langsomt sænke sugetrykket med mikrometer at nå et regime, hvor membranen svinger. Derefter øge trykket til klart at visualisere en tunge i spidsen med en betydelig projektion længde (et par mikron).
Bemærk: det laveste anvendte tryk (P0), der gør det muligt at suge den mindste membran projektions længde (L0) op, vil definere referencepunktet α0 (figur 7A). Alle kurvens punkter måles i henhold til denne reference (ΔL = L-L0 og Δp = P-P0). - Forøg sugetrykket med mikrometer på en trinvis måde indtil 0,5-0,8 mN/m. På hvert trin skal du vente 5 s og tage et øjebliksbillede af tungen. Denne procedure ved lav spænding muliggør bestemmelse af bøjnings modulus.
- Fortsæt med at øge sugetrykket fra 0,5 mN/m til brud spændingen ved at justere højden på den vandfyldte glide på skinnen (fra-2 til-50 cm) (figur 7B-D). Fra dette eksperiment ved højspændings regime måles området kompressibilitet modulus, lysis-spænding og lysis-stamme.
- Strække omkring 15-20 vesikler at erhverve betydelige statistikker. Hvert forsøg med mikropipette aspiration tager mellem 7 og 10 minutter. Udfør billedanalyse ved hjælp af LASAF-software til måling af tungen i projektions længden, vesikles diameter og kapillær radius.
- Måling af bøjnings modulus, område komprimeringsmodulus, lyse spændinger og lyse stamme
- For at få adgang til disse parametre, brug den formalisme etableret af E. Evans12. Beregn det sugetryk, der påføres over membranen fra ligning 1:
Δ P = ρwg (h − H0) (1)
hvor g er gravitations accelerationen (9,8 m ∙ s− 2), per vandets tæthed (ρ = 1 g ∙ cm− 3), h er Vandtankens position, og h0 er den oprindelige position, hvor trykket er lig nul. - Beregn membranen spænding fra Laplace ligningen:
2
Hvis ΔP er sugetrykket på mikropipetten, er Rp og rv henholdsvis mikropipetten og vesikel radier (uden for mikropipetten). Membranens overfladeareal stamme (α) defineres som:
3
er membran området af vesikle ved det lavere sugetryk. - Beregn α fra stigningen i projektions længden ΔL af vesikel inde i kapillar spidsen i henhold til ligning 412:
4 - Under et meget lavt spændings regime dominerer udglatningen af termiske bøjnings bevægelser den tilsyneladende ekspansion. Plot ln (σ) vs α. Ved lav-σ-værdier (typisk 0,001 – 0,5 mN. m− 113) giver dette en lige linje, hvis hældning er knyttet til bøjnings modulus, Kb (første periode af ligningen 5)14:
5
Bemærk: under høje spændinger (> 0,5 mN. m− 1), er membran-undulationer helt undertrykt, og membran området øges som følge af øget afstand mellem molekyler. I denne ordning dominerer den anden periode i ligning 5 og giver adgang til område komprimeringen modulus Ka (figur 8 og figur 9).
- For at få adgang til disse parametre, brug den formalisme etableret af E. Evans12. Beregn det sugetryk, der påføres over membranen fra ligning 1:
2
3
er membran området af vesikle ved det lavere sugetryk.
4
5Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med protokollen førnævnte, har vi studeret forskellige syntetiske gigant af vesikelprotein (GUV), opnået fra en phospholipid: 2-oleoyl-1-Palmitoyl-SN-glycero-3-phosphocholin (popc), en triblokcopolymer copolymer: poly (ethyleneoxid)-b-poly (dimethylsiloxan)-b-poly (ethyleneoxid) (PEO12-b-PDMS43-b-PEO12) syntetiseret i et tidligere studie13, og en diblok copolymer poly (dimethylsiloxan)-b-poly ( ethyleneoxid) (PDMS27-b-PEO17). Det er tidligere blevet påvist af vores gruppe, at sammenslutningen af triblokcopolymer copolymer PEO8-b-PDMS22-b-PEO8 med phospholipid popc fører til et stort fald i membran sejhed af de resulterende ghuvs (Giant hybrid unilamellar vesicles)15. Målingen er blevet gentaget i denne undersøgelse og udvidet til guvs opnået fra diblok copolymer og ghuv opnået fra Sammenslutningen af denne diblok copolymer og popc.
Resultaterne er illustreret i figur 10 og tabel 1. Området kompressibilitet modulus og lysis stamme for POPC er i perfekt aftale med litteratur16. Målingen af den bøje ende moduli af hybrid vesikelprotein er endnu ikke blevet udført i laboratoriet. Der er angivet typiske værdier for de fremstillede polymersomer. Det er værd at nævne, at sejhed af membran (Ec) fremstillet af diblok copolymere er langt ud over dem, der opnås med triblokcopolymer copolymer. Mere interessant, med diblok copolymer er det muligt at opnå gigantiske hybrid af lipid/polymer vesikler, der præsenterer højere sejhed end Liposomer, som er den vigtigste interesse for en sådan forening.
Figur 1: Microforge til polering af pipettespidser. Billedet viser de forskellige dele af anordningen: metal pipette holderen (a), glas kapillar (b), micromanipulatorvarmezonen (c), lyskilden (d), 10x, 32x, 40x mål (e) og mikroskopet okularer (f). I skæret observeres pipettespidsen, nedsænket i en glasperle, gennem et 32x-mål med retikel. Niveauet af det smeltede glas i spidsen er fastgjort til en mellem højde (H) efter afkøling. Træk spidsen væk forårsager en skarp pause. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: eksperimentel opsætning til belægning og påfyldning af pipettespidser. A) en500 μl glassprøjte udstyret med en fleksibel silica kapillær er monteret for at fylde mikropipetten med en glucoseopløsning. (B) forstørrelse af kapillær nedre del. Under nedsænkning i natten stiger BSA-løsnings niveauet ved kapillar handling op til 1 cm i længden. Pipetten fyldes derefter med glucose ved at indsætte en fleksibel kapillær for at fjerne uadsorbet BSA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: materialer til at bygge en Ito-baseret elektro formation enhed. Anordningen består af to glas slids, der er belagt på den ene side med indium tin oxid (a). En gummi O-ring er blevet skåret på den ene side for at tillade lastning af opløsningen inde i kammeret og høst af GUVs suspension (b). Gummi O-ringen bruges som spacer til at adskille de to slides. De slides er forbundet til spændings generatoren via elektriske ledninger (c) og fastgjort til overfladen ved tape (d). Silicium frit fedt bruges til at forsegle afstandsstykket med slides (e). Ohmmeter bruges til at identificere ITO-belagte sider og kontrollere ledningsevnen (f). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Opsætning af elektro dannelse. A) aktivt opløsningen deponeres ved hjælp af et glas kapillær på de Ito-belagte sider af glaspladerne. B) efter monteringen og tørre trinnet er kammeret forbundet med spændings generatoren (10 Hz, 2 V) og fyldes derefter med saccharoseopløsning. (C) efter elektro dannelse dannes en luftboble inde i kammeret for at hjælpe guv's til at løsne sig fra overfladen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: opsugning af mikropipette. A) Beskrivelse af komponenter: fluorescens mikroskop (1) vand fyldt tank og mikrometer glidende på en aluminium optisk skinne (2), silikone slange gennemføre vand flow fra reservoiret til mikropipetten (3), micromanipulator Kontrolpanel (4), motorenhed af micromanipulator, som tillader X, Y og Z forskydning (5), vibrationsisolering tabel (6). (B) forstørrelse, der viser det hjemmelavede aluminiums Stage udstyret med to glas skred (7), pipette (8) og pipette holder (9) monteret på motorenheden på micromanipulatoren og fastgjort af klem knop (10). Bemærk, at pipettespidsen er nedsænket i midten af glukose-menisk. C) glas glider limet med vakuum fedt på hver side, hvilket giver mulighed for dannelse af glukose-menisk (sidevisning). (D) glucose menisk omgivet af mineralolie for at forhindre vand fordampning (top view). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: billede af et GUV under spænding ved hjælp af mikropipette aspiration. Den røde kanal, som samler fluorescensen fra rhodaminmærkede lipid og transmissionskanalen (DIC), er blevet fusioneret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: billeder af et GUV ved forskelligt sugetryk. A) den laveste anvendte spænding, der inducerer en tungen dannelse, anvendes som reference til bestemmelse af den oprindelige tungen længde (L0) og vesikelprotein radius (Rv). B) mellemliggende anvendt spændingsværdi med den tilhørende tunge længde (L). C) meget høje påførte spændinger. D) billede lige efter membranen Bristning, hvor pipette radius måles (Rp). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: repræsentativ stress-stamme plot af GUVs opnået ved mikropipette aspiration. Det samme datasæt er blevet brugt til at afbilde ln (σ) = f (α) og σ = f (α). I lavspændings regimet varierer ln (σ) lineært med α (grøn lineær pasform) og giver adgang til bøjnings modulus (Kc); der henviser til, at σ i det høje spændings regime varierer lineært med α (rød lineær pasform) og giver adgang til området kompressions modulus (Ka). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: repræsentativ stress-stamme plot af GUV opnået ved mikropipette aspiration i stretching regime. Fra den eksperimentelle kurve flere mekaniske parametre af GUVs kan bestemmes. Området kompressibilitet modulus (Ka) svarer til den oprindelige hældning og måles ved at montere lineært kurven. Det sidste målte punkt giver lysis-stammen (αl) og lysis-stress (σl)-værdierne. Endelig kan den sammenhængende tæthed energi (Ec) anslås ved at integrere arealet under kurven (orange område). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10: repræsentative stress-stamme parceller opnået for Liposom, Polymersome og hybrid polymer/lipid vesicle. Guvs sammensat af popc (røde trekanter), triblokcopolymer copolymer (grønne cirkler), diblok copolymer (blå firkanter), triblokcopolymer-baserede hybrid (lyse grønne cirkler) og diblok-baserede hybrid (lyseblå firkanter). Kurverne blev opnået ved at gennemsnit målingerne på mindst 15 GUVs for hvert system. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Ka | αL | σL | Ec | Kb | |
| (mN. m-1) | (%) | (mN. m-1) | (mN. m-1) | KT | |
| POPC | 194 ± 15 | 4 ± 1 | 8 ± 2 | 0,17 ± 0,09 | 21.1 ± 0,4 |
| PDMS27-b-PEO17 | 121 ± 8 | 16 ± 4 | 15 ± 3 | 1,37 ± 0,67 | 10,6 ± 3,5 |
| PDMS27-b-PEO17 | 132 ± 13 | 9 ± 4 | 10 ± 3 | 0,50 ± 0,38 | - |
| + 5 WT .% POPC | |||||
| PEO12-b-PDMS43-b-PEO12 | 84 ± 13 | 7 ± 1 | 6 ± 2 | 0,50 ± 0,38 | - |
| PEO12-b-PDMS43-b-PEO12 | 91 ± 11 | 3 ± 1 | 2 ± 1 | 0,03 ± 0,01 | - |
| + 5 WT .% POPC |
Tabel 1: Mekaniske parametre bestemmes ved hjælp af mikropipette aspiration teknikker på GUVs sammensat af phospholipid, copolymere eller begge.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Belægningen af mikropipetten er et af de vigtigste punkter for at opnå pålidelige målinger. Adhæsion af vesikel til mikropipetten skal forhindres, og en belægning er almindeligt anvendt i litteratur17,18,19,20,21, med BSA, β-Casein eller surfasil. Detaljer om belægningen procedure er sjældent nævnt.
Opløsningen af BSA skal udføres i mindst 4 timer under agitation for at opnå god opløselibilisering. Ikke desto mindre er filtrerings trinnet stadig påkrævet for at fjerne eventuelle aggregater, der kan blokere mikropipette spidsen. Hvis BSA ikke er godt opløst, det meste af det vil blive fjernet ved filtrering, og belægning vil være ineffektiv. Den ideelle koncentration og opløsnings tiden er henholdsvis 0,8-1 WT .% og 4 h.
Et andet kritisk punkt er at sikre et konstant osmotisk tryk i og uden for vesikle under målingen. En forøgelse af glucosekoncentrationen som følge af fordampning af vand under forsøget kan føre til deflation af vesikel og forstyrrer målingen (undervurdering af Ka, osv.). Aflejring af et olie lag er obligatorisk for at forhindre dette fænomen (figur 3D). For at kontrollere effektiviteten af olie laget kan et konstant Aspirations Tryk på få MN ∙ m-1 påføres på en vesikelprotein i 5 min, og længden L af tungen inde i kapillar skal være konstant.
Det sidste kritiske punkt er det præ-stress trin (afsnit 3,3), der sjældent nævnes i litteratur20. Dette trin er nødvendigt for at fjerne knopperne, rørene og det overskydende overfladeareal af vesikle og få reproducerbare resultater fra en vesikelprotein til en anden.
Den mikropipette aspiration metode kan anvendes på alle GUVs, så længe de præsenterer en flydende membran (f. eks Telektro dannelse > tm af lipider) og besidder en bøjning modulus under 100 kt. I tilfælde af en tyk og viskøs membran, selv i væsken tilstand, to pipetter kan bruges til at måle moduli22. Den mikropipette aspiration teknik giver en stor fordel at give adgang til flere parametre (bøjning og område komprimerbarhed moduli), og dette er den eneste teknik til rådighed direkte adgang til området komprimerbarhed modulus af en GUV membran.
Selv om denne teknik har været velkendt i lang tid, det er stadig almindeligt anvendt af talrige videnskabelige samfund (biophysicister, fysisk-kemikere, kemikere, etc.). Den mikropipette aspiration metode vil fortsat være en betydelig teknik i fremtiden, især for at undersøge yderligere membran egenskaber af avanceret syntetisk celle (f. eks hybrid polymer/lipid vesikler og protoceller).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender taknemmeligt ANR for finansiel støtte (ANR sysa).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Required equipment and materials for micropipette design | |||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | external and internal diameter of 1mm and 0.58 mm respectively. |
| Filament installed | Sutter Instrument Co. | FB255B | 2.5mm*2.5mm Box Filament |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | |
| Microforge | NARISHGE Co. | MF-900 | fitted with two objectives (10x and 32x) |
| Materials for coating pipette tips with BSA | |||
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Sigma-Aldrich | 10735078001 | |
| Disposable 1 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| Disposable 10 ml syringe Luer Tip | Codan | 626616 | |
| Disposable 5 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.5607 | |
| Disposable acetate cellulose filter | Cluzeau Info Labo | L5003SPA | Pore size: 0.22µm, diameter: 25mm |
| Flexible Fused Silica Capillary Tubing | Polymicro Technologies. | TSP530660 | Inner Diameter 536µm, Outer Diameter 660µm, |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Syringe 500 µL luer Lock GASTIGHT | Hamilton Syringe Company | 1750 | |
| Test tube rotatory mixer | Labinco | 28210109 | |
| Micromanipulation Set up | |||
| Aluminum Optical Rail, 1000 mm Length, M4 threads, X48 Series | Newport | ||
| Damped Optical Table | Newport | used as support of microscope to prevent external vibrations. | |
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP 2 | The module unit (motor unit for X, Y and Z movement) is mounted on the inverted microscope by the way of an adapter. |
| Micrometer | Mitutoyo Corporation | 350-354-10 | Digimatic LCD Micrometer Head 25,4 mm Range 0,001 mm |
| Plexiglass water reservoir (100 ml) | Home made | ||
| TCS SP5 inverted confocal microscope (DMI6000) equipped with a resonant scanner and a water immersion objective (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I). | Leica | ||
| X48 Rail Carrier 80 mm Length,with 1/4-20, 8-32 and 4-40 thread | Newport | ||
| Materials for sucrose and amphiphile solution preparation | |||
| 2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Sigma-Aldrich | ||
| Chloroform | VWR | 22711.244 | |
| L-α-Phosphatidylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) | Sigma-Aldrich | 810146C | Rhodamine tagged lipid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Electroformation set up | |||
| 10 µL glass capillary ringcaps | Hirschmann | 9600110 | |
| Disposable 1 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| H Grease | Apiezon | Apiezon H Grease | Silicon-free grease |
| Indium tin oxide coated glass slides | Sigma-Aldrich | 703184 | |
| Needle | Terumo | AN2138R1 | 0.8 x 38 mm |
| Ohmmeter (Multimeter) | Voltcraft | VC140 | |
| Toluene | VWR | 28676.297 | |
| Voltage generator | Keysight | 33210A |
References
- Bangham, A. D., Standish, M. M., Watkins, J. C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids. Journal of Molecular Biology. 13 (1), (1965).
- Discher, D. E., Eisenberg, A. Polymer vesicles. Science. 297 (5583), 967-973 (2002).
- Hammer, D., et al. Polymersomes: vesicles from block copolymers. Annals of Biomedical Engineering. 28 (SUPPL. 1), (2000).
- Le Meins, J. F., Schatz, C., Lecommandoux, S., Sandre, O. Hybrid polymer/lipid vesicles: state of the art and future perspectives. Materials Today. 16 (10), 397-402 (2013).
- Schulz, M., Binder, W. H. Mixed Hybrid Lipid/Polymer Vesicles as a Novel Membrane Platform. Macromolecular Rapid Communications. 36, 2031-2041 (2015).
- Schneider, M. B., Jenkins, J. T., Webb, W. W. Thermal fluctuations of large quasi-spherical bimolecular phospholipid vesicles. Journal De Physique. 45 (9), 1457-1472 (1984).
- Dimova, R. Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes. Advances in Colloid and Interface Science. 208, 225-234 (2014).
- Rodríguez-García, R., et al. Polymersomes: smart vesicles of tunable rigidity and permeability. Soft Matter. 7 (4), 1532-1542 (2011).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
- Dao, T. P. T., et al. Membrane properties of giant polymer and lipid vesicles obtained by electroformation and pva gel-assisted hydration methods. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 533, 347-353 (2017).
- Pereno, V., et al. Electroformation of Giant Unilamellar Vesicles on Stainless Steel Electrodes. ACS omega. 2 (3), 994-1002 (2017).
- Evans, E., Rawicz, W. Entropy-driven tension and bending elasticity in condensed-fluid membranes. Physical Review Letters. 64 (17), 2094-2097 (1990).
- Dao, T. P. T., et al. Modulation of phase separation at the micron scale and nanoscale in giant polymer/lipid hybrid unilamellar vesicles (GHUVs). Soft Matter. 13 (3), 627-637 (2017).
- Helfrich, W. Elastic properties of lipid bilayers: theory and possible experiments. Z Naturforsch C. 11 (11), 693-703 (1973).
- Dao, T. P. T., et al. The combination of block copolymers and phospholipids to form giant hybrid unilamellar vesicles (GHUVs) does not systematically lead to "intermediate'' membrane properties. Soft Matter. 14 (31), 6476-6484 (2018).
- Shoemaker, S. D., Kyle Vanderlick, T. Material Studies of Lipid Vesicles in the Lα and Lα-Gel Coexistence Regimes. Biophysical Journal. 84 (2), 998-1009 (2003).
- Longo, M. L., Ly, H. V. Methods in Membrane Lipids. Dopico, A. M. , Humana Press. 421-437 (2007).
- Chen, D., Santore, M. M. Hybrid copolymer-phospholipid vesicles: phase separation resembling mixed phospholipid lamellae, but with mechanical stability and control. Soft Matter. 11 (13), 2617-2626 (2015).
- Mabrouk, E., et al. Formation and material properties of giant liquid crystal polymersomes. Soft Matter. 5, 1870-1878 (2009).
- Henriksen, J., et al. Universal behavior of membranes with sterols. Biophysical Journal. 90 (5), 1639-1649 (2006).
- Ly, H. V., Block, D. E., Longo, M. L. Interfacial Tension Effect of Ethanol on Lipid Bilayer Rigidity, Stability, and Area/Molecule: A Micropipet Aspiration Approach. Langmuir. 18 (23), 8988-8995 (2002).
- Bermudez, H., Hammer, D. A., Discher, D. E. Effect of Bilayer Thickness on Membrane Bending Rigidity. Langmuir. 20, 540-543 (2004).
