Hier presenteren we zuurstof gradiënt ektacytometrie, een snelle en reproduceerbare methode om de vervormbaarheid van rode bloedcellen in monsters te meten van patiënten met sikkelcelziekte onder gecontroleerde deoxygenatie en reoxygenatie. Deze techniek biedt een manier om te bestuderen van de rode bloedcel ziekten en om te controleren sikkelcelziekte behandeling werkzaamheid.
Bij sikkelcelziekte (SCD) veroorzaakt een enkelvoudige mutatie in de gen-codering voor bèta-globine de productie van abnormale hemoglobine S (HbS). Wanneer deoxygenated, HbS kunnen polymeriseren, vormen van stijve staven van hemoglobine, resulterend in de zieling van rode bloedcellen (Rbc’s). Deze ziekende Rbc’s hebben de vervormbaarheid aanzienlijk verminderd, waardoor vaso-occlusie ontstaat, wat leidt tot tal van SCD-gerelateerde klinische complicaties, waaronder pijn, beroerte en orgaan beschadiging. RBC vervormbaarheid wordt ook verlaagd door RBC uitdroging, resulterend in dichte rode bloedcellen die meer kans op sikkel hebben. Tot op heden is er geen enkele wijdverbreide, snelle en reproduceerbare laboratoriumtest die in staat is de ernst van de ziekte te voorspellen of de behandelingseffecten voor nieuwe, niet-foetale hemoglobine inducerende therapieën direct te monitoren. In deze studie beschrijven we een protocol om de RBC-vervormbaarheid te meten als een functie van pO2 , die het mogelijk maakt om het sissende gedrag bij scd-patiënten te Kwantificeer. Zuurstof gradiënt ektacytometrie meet RBC deformability, uitgedrukt als de rek-index (EI), als functie van pO2. Rbc’s worden blootgesteld aan een vaste shear stress van 30 pa tijdens een ronde van deoxygenatie en reoxygenatie. Er worden zes uitlezen parameters geproduceerd. Van deze, het punt van de sickling (PoS), gedefinieerd als de pO2 waarbij maximale EI (eiMax) toont een 5% afname, en minimale ei tijdens DEOXYGENATIE (eimin) zijn de meest informatieve, weerspiegelen een individuele patiënt pO2 waarbij sissende starts en de minimale vervormbaarheid van de rode bloedcellen van een patiënt, respectievelijk. PoS wordt geassocieerd met een individuele patiënt hemoglobine affiniteit voor zuurstof, terwijl EImin vertoont een sterke correlatie met foetale hemoglobine niveaus. We concluderen dat zuurstof gradiënt ektacytometrie een veelbelovende techniek is om de behandeling van patiënten met SCD te monitoren, als biomarker voor anti-sissende middelen in klinisch en preklinische studies, en een belangrijk hulpmiddel om het ziekelijk gedrag van Rbc’s te bestuderen uit individuen met SCD en sikkelceleigenschappen.
In SCD resulteert een enkelvoudige mutatie in de productie van HbS, die kan polymeriseren op deoxygenatie. HbS polymerisatie veroorzaakt een zieling van Rbc’s en vermindert de RBC deformability. De combinatie van RBC sickling en RBC-hechting op het endotheel leidt tot verschillende SCD-complicaties, waaronder vaso-occlusieve crises (VOC), beroerte, orgaan beschadiging en chronische hemolytische anemie. Zelfs bij normoxische omstandigheden is de RBC vervormbaarheid gecompromitteerd bij patiënten met SCD. De vervormbaarheid wordt verder verlaagd bij lage zuurstofconcentraties. Belangrijke spelers die de vervormbaarheid bij normoxia bepalen, zijn dichte cellen, onomkeerbare siledcellen (ISC) en gedehydrateerde cellen, die allemaal een verminderde oppervlakte-tot-volume verhouding1,2,3hebben.
Ektacytometry is een vaste methode voor het meten van de RBC-vervormbaarheid, die op grote schaal wordt gebruikt voor de diagnose van erfelijke hemolytische anemias, met name membranopathieën4. Het kan ook worden gebruikt voor het bestuderen van de hemorheologie5,6,7,8,9. Osmotische gradiënt ektacytometrie, waarin RBC vervormbaarheid wordt gemeten tijdens een continue verandering in osmolaliteit, is gebruikt om scd meer dan tien jaar10,11te bestuderen. Het percentage foetale hemoglobine (HbF) is een van de sterkste remmers van HbS-polymerisatie omdat noch HbF noch haar gemengde hybride tetrameer (∝ 2βSγ) de deoxyHbS polymeer fase12kan betreden. Recente studies suggereren dat het verhogen van de HbF in SCD-patiënten leidt tot een betere oppervlakte-volume verhouding, waardoor de hydratatie toestand wordt verbeterd en dus de vervormbaarheid bij niet-getransfuseerde patiënten11.
RBC vervormbaarheid is in het verleden bestudeerd als biomarker voor scd-complicaties, maar met conflicterende resultaten. In studies die cross-sectioneel werden uitgevoerd en in een stabiele toestand bleken personen met hogere niveaus van RBC vervormbaarheid een hogere incidentie van osteonecrose en meer pijn crises13,14,15te hebben. In tegenstelling tot deze bevindingen, in vergelijking met de steady state waarden tijdens een acute VOC, werd de RBC vervormbaarheid verlaagd in longitudinale studies binnen dezelfde individuen16. Deze discrepantie kan het gevolg zijn van het bestuderen van RBC vervormbaarheid onder verschillende omstandigheden (d.w.z. tijdens de steady state versus VOC). Het percentage van de zieke cellen is hoog bij het begin van een VOC en de cellen worden snel vernietigd naarmate de crisis vordert, wat het verschil kan verklaren tussen de steady state cross-sectionele incidentie gegevens en longitudinale gegevens verkregen tijdens de VOC. Andere factoren, zoals de hechting van RBC subpopulaties op het endotheel oppervlak, kunnen echter ook belangrijk zijn bij het optreden van VOC. In scd is het meer klinisch relevant om de vervormbaarheid tijdens de deoxygenatie te meten, omdat vaso-occlusie meestal optreedt in de hypoxische postcapillaire venulen en niet in het minder hypoxische microcapillaire netwerk17. Bovendien kan de aanwezigheid van Isc’s het vermogen van een ektacytometer wijzigen om de vervormbaarheid bij normoxia te meten. Vervorming van het diffractie-patroon wordt veroorzaakt door isc’s, wat voortvloeit uit de niet-uitlijning tijdens de stroom1,2,3.
Alternatieve benaderingen voor het bestuderen van de pathofysiologie van VOC zijn metingen van RBC-hechting op een kunstmatig oppervlak18, eencellige elektrische impedantie micro flowcytometrieonderzoeken19, microfluïdische modellen met een combinatie van kwantitatieve metingen van de celziekten en de onsickling met reologie van één cel20, en laser-geïnduceerde polymerisatie21. Hoewel veelbelovend, deze technieken zijn kostbaar, arbeidsintensieve, en vereisen uitgebreide operator training. Bovendien, de assays die morfologie gebaseerde gebrek aan de mogelijkheid om cellulaire gedrag te bestuderen, zoals vervormbaarheid, als een functie van een zuurstof gradiënt.
In deze studie beschrijven we een snelle en reproduceerbare functionele assay uitgevoerd met een ektacytometer. Dit is een volgende generatie ektacytometrie meting die de verschillende kwalitatieve aspecten van de RBC vervormbaarheid meet, uitgedrukt als de ei tijdens deoxygenatie (1.300 s) en snelle reoxygenatie (280 s). Deze tijdsintervallen maken HbS-polymeer vorming mogelijk, en daarmee het optreden van morfologische veranderingen en vervolgens herstel. Deoxygenatie ontstaat door het introduceren van stikstofgas, dat de zuurstofspanning in het bloedmonster langzaam verlaagt in de kloof tussen de Bob en de Beker van de ektacytometer. De RBC vervormbaarheid wordt continu gemeten terwijl de zuurstofspanning om de 20 s wordt gemeten door middel van een kleine O2-spot aanwezig in de wand van de beker. Tijdens de test worden ongeveer 80 pO2 metingen gekoppeld aan de ei gemeten op dat moment. De zuurstofdruk daalt onder 20 mmHg tijdens de deoxygenatie, en reoxygenatie wordt vergemakkelijkt door de passieve diffusie van de omgevingslucht. De experimentele opstelling van de ektacytometer-en zuurstofgradiënt ektacytometrie module wordt beschreven in Figuur 1 en Figuur 2. Het principe van ektacytometrie is gebaseerd op RBC-geïnduceerde verstrooiing van licht van een laserstraal. Dit resulteert in een elliptisch diffractie patroon wanneer shear stress tegelijkertijd wordt toegepast (Figuur 1).
Hier beschrijven we zuurstofgradiënt ektacytometrie, een methode die kan worden gebruikt om het ziekende gedrag van rode bloedcellen van SCD-patiënten onder een reeks zuurstofconcentraties te bestuderen (Figuur 4 en Figuur 5). Om reproduceerbare resultaten te verkrijgen, is het belangrijk om de factoren te identificeren die van invloed zijn op de resultaten. Temperatuur heeft bijvoorbeeld een grote invloed op de RBC-vervormbaarheid, voornamelijk vanwege de effecten op de dikte van de visceuze oplossing (PVP). We raden aan om aan het begin van de dag een test meting uit te voeren om de machine grondig te verwarmen tot 37 °C. Dit zal de reproduceerbaarheid van de resultaten verbeteren. De osmolariteit van de viskeuze oplossing moet binnen een smal bereik liggen (282 – 286 mOsm/kg voor PVP), omdat osmolariteit invloed heeft op de hydratatie status, wat op zijn beurt de RBC deformability beïnvloedt. De pH en viscositeit van PVP moeten ook strak worden gereguleerd. Verschillen in pH en temperatuur kunnen de bochten dramatisch beïnvloeden22. Bovendien kan het resterende water in de beker, Bob en buizen de lysis van Rbc’s veroorzaken, wat resulteert in onjuiste gegevens, omdat er minder intacte Rbc’s in de beker worden gemeten.
Instellingen voor het uitvoeren van zuurstof gradiënt ektacytometry kan worden aangepast om specifieke onderzoeksvragen aan te pakken. Voorkeursinstellingen worden weergegeven in tabel 1. Een deoxygenatie tijd van 1.300 s werd gekozen op basis van waarnemingen waaruit blijkt dat de verlenging van deoxygenatie niet heeft resulteren in een lagere EI-min voor de meeste patiënten. Inkorten van de deoxygenatie tijd zou daarentegen de discriminatieve kracht van de zuurstof gradiënt ektacytometrie belemmeren. De reoxygenatie tijd werd ingesteld op 280 s als gevolg van het snel oplossen van HbS polymeren tijdens reoxygenatie, en gelijktijdige restauratie van EI naar waarden gemeten vóór de deoxygenatie. Shear stress werd ingesteld op 30 PA, die analoog is aan de osmotische gradiënt ektacytometry. Het verlagen van deze parameter kan de discriminatieve kracht belemmeren. Deoxygenatie controle kan worden gebruikt als een set deoxygenatie snelheid wordt toegepast op elk patiënt monster. In onze voorkeursinstellingen werd deze optie uitgeschakeld omdat de snelheid van deoxygenatie patiëntspecifiek is vanwege de unieke dissociatie curve van hemoglobine. Daarom zou het inschakelen van de deoxygenatie controle dit kenmerk van de test elimineren. Echter, deze functie van zuurstof gradiënt ektacytometry is nog steeds onderzocht.
Verschillende bekende factoren beïnvloeden zuurstof gradiënt ektacytometrie parameters, namelijk pH, temperatuur, en osmolariteit. Ektacytometrie, vooral PoS, wordt beïnvloed door 2, 3-difosfoglycerate (2, 3-DPG)22. Ook is er een duidelijke correlatie tussen% HbF en de EImin, en in mindere mate PoS (Figuur 5a–D). EIMax wordt geassocieerd met sikkelcellen bij normoxia, die de waarneming kunnen verklaren dat kort na een VOC, RBC verformability bij normoxia (eiMax), hoger is. De laatste wordt veroorzaakt door de vernietiging van de meest zieke cellen, en dus minder vervormbare Rbc’s tijdens VOC16. Zoals in Figuur 5Fwordt getoond, correleren hogere% dichte rbc’s (gedefinieerd als rbc’s met een hemoglobineconcentratie ≫ 1.11 mg/ml) sterk met een lagere eiMax. Dit geeft aan dat dichte cellen een belangrijke factor zijn in RBC vervormbaarheid bij normoxia, vergelijkbaar met eerder gerapporteerde resultaten1.
Standaardisatie van monsters is zeer belangrijk voor het verkrijgen van reproduceerbare resultaten en voor het onderscheiden van verschillende genotypen en behandelingen. Het corrigeren van RBC-telling is belangrijk, omdat het aantal Rbc’s de intensiteit van het diffractie-patroon beïnvloedt. Als er lagere RBC-nummers aanwezig zijn in de kloof tussen de Bob en de beker, verschuift de curve naar boven en naar links. Bovendien zal de curve fluctueren, wat de nauwkeurige berekening van de parameters belemmert, met name het PoS.
Een beperking van deze techniek is dat de EI-waarde een gemiddelde van alle cellen vertegenwoordigt, inclusief verschillende subpopulaties. Heterogeniteit van RBC-populaties in SCD-patiënten en de invloed ervan op ektacytometrie meting is intensief bestudeerd. Dit resulteerde in standaardisatie waarbij de grootte van het diffractie patroon wordt aangepast aan een vaste waarde in plaats van gecorrigeerd voor de RBC Count23,24. Of deze manier van standaardisatie ook moet worden toegepast op zuurstof gradiënt ektacytometrie metingen worden momenteel bestudeerd.
Verschillende technieken voor het meten van de RBC vervormbaarheid onder hypoxische condities werden ontwikkeld op basis van een deoxygenatie stap die plaatsvond buiten de ektacytometer25,26,27. Onder deze omstandigheden werden verschillen in cellulair gedrag niet waargenomen tussen patiënten met HbS-eigenschappen en gezonde controles onder fysiologische pH25. Zuurstof gradiënt ektacytometrie toont echter duidelijk een laag, maar evident PoS bij individuen met HbS-eigenschappen (Figuur 4a). Tot op heden omvatten de enige alternatieve methoden voor het meten van de neiging van de Rbc’s van een individuele patiënt tot sikkel in vitro in de routinematige klinische praktijk een op morfologie gebaseerde ziekte test: Rbc’s worden geïnineerd onder omstandigheden die HbS-polymerisatie bevorderen, zoals lage zuurstofspanning of lage pH. Na incubatie wordt een fixeermiddel toegevoegd en het percentage van de sierige cellen wordt manueel of digitaal geteld met behulp van Lichtmicroscopie. Veel preklinische en vroege fase-farmacologische onderzoeken gebruiken de sissende assay om een secundaire uitkomstvariabele te genereren om de klinische werkzaamheid in scd te kunnen voorspellen28,29,30,31 ,32. Echter, het is tijdrovend, variabiliteit is hoog en de gevoeligheid is laag, de techniek is niet geautomatiseerd en, daarom, arbeidsintensief. Bovendien kunnen morfologische veranderingen als gevolg van ziekten niet goed correleren met fysiologische parameters, zoals RBC deformability, omdat het een 2-dimensionale statische assay2is.
Zuurstof gradiënt ektacytometrie biedt een functionele assay van ziekten die snel en reproduceerbaar zijn. Dit is een in vitro test die het endotheliale oppervlak niet beschouwt. Het biedt echter functionele aspecten van het ziekende gedrag en RBC-kenmerken, waardoor het een veelbelovende techniek is voor sikkelcelstudies. Toekomstige toepassingen van de techniek omvatten het monitoren van de werkzaamheid van de behandeling bij SCD-patiënten, het dienen als een biomarker voor nieuwe behandelingsstrategieën, het bestuderen van het ziekende gedrag en het monitoren van het chimerisme na de stamceltransplantatie in SCD.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd deels ondersteund door een Eurostars Grant estar18105 en door een onbeperkte subsidie van RR Mechatronics. De auteurs bedanken Sisto Hendriks en Jan de zoeten voor hun technische ondersteuning.
ADVIA 120 Hematology Analyzer | Siemens | 067-A004-14 | Instrument |
Cell-Dyn Sapphire Hematology Analyzer | Abbott | 8H00-01 | Instrument |
Lorrca | RR Mechatronics | LORC109230 or LORC109110 | Instrument |
Lorrca Software version V5.08 | RR Mechatronics | – | Software |
Nitrogen gas 4.8 or 5.0 | Local | – | |
O2-spot | RR Mechatronics | PO2S020153 | O2 measurement |
Oxygenscan module (pO2scan) | RR Mechatronics | PO2S109000 | Add-on |
Oxy-ISO | RR Mechatronics | QRR 030905 | Viscous solution |
X-Clean | RR Mechatronics | QRR 010946 | Cleaning solution Lorrca |