Hier präsentieren wir Sauerstoffgradientenektacytometrie, eine schnelle und reproduzierbare Methode zur Messung der Deformierbarkeit roter Blutkörperchen in Proben von Patienten mit Sichelzellerkrankungen unter kontrollierter Deoxygenierung und Reoxygenierung. Diese Technik bietet eine Möglichkeit, rote Blutkörperchen Sichel zu studieren und Dieelzell-Krankheit Behandlung Wirksamkeit zu überwachen.
Bei der Sichelzellerkrankung (SCD) verursacht eine Einzelpunktmutation im Gen, das für Beta-Globin kodiert, die Produktion von abnormalem Hämoglobin S (HbS). Wenn hbS deoxygeniert ist, kann es polymerisieren und starre Hämoglobinstäbe bilden, was zum Sicheln roter Blutkörperchen (RBCs) führt. Diese gekränkten RBCs haben die Verformbarkeit deutlich reduziert und vaso-okklusion verursacht, was zu zahlreichen SCD-bedingten klinischen Komplikationen führt, einschließlich Schmerzen, Schlaganfall und Organschäden. RBC-Deformierbarkeit wird auch durch RBC-Dehydrierung reduziert, was zu dichten roten Blutkörperchen führt, die eher Sichel sind. Bis heute gibt es keinen einzigen allgemein verfügbaren, schnellen und reproduzierbaren Labortest, der in der Lage ist, den Schweregrad der Erkrankung vorherzusagen oder die Behandlungseffekte für neuartige, nicht-fetale Hämoglobin-induzierende Therapien direkt zu überwachen. In dieser Studie beschreiben wir ein Protokoll zur Messung der RBC-Deformierbarkeit als Funktion von pO2, das die Quantifizierung des Sövrierungsverhaltens bei SCD-Patienten ermöglicht. Sauerstoffgradientektacytometrie misst rBC-Deformierbarkeit, ausgedrückt als Dehnungsindex (EI), in Abhängigkeit von pO2. RBCs sind während einer Runde der Deoxygenierung und Reoxygenierung einer festen Scherspannung von 30 Pa ausgesetzt. Es werden sechs Ausleseparameter erstellt. Von diesen ist der Als pO 2 definierter Sövrierungspunkt (PO2), bei dem die maximale EI (EImax)eine Abnahme von 5 % und die minimale EI während der Deoxygenierung (EImin) am informativsten ist und das pO2 eines einzelnen Patienten widerspiegelt, bei dem Die Sichelbildung beginnt und die minimale Verformbarkeit der roten Blutkörperchen eines Patienten. PoS ist mit der Hämoglobinaffinität eines einzelnen Patienten für Sauerstoff verbunden, während EImin eine starke Korrelation mit fetalen Hämoglobinspiegeln zeigt. Wir kommen zu dem Schluss, dass die Sauerstoffgradientenektacytometrie eine vielversprechende Technik zur Überwachung der Behandlung von Patienten mit SCD ist, als Biomarker für Anti-Sickling-Erreger in klinischen und präklinischen Studien und ein wichtiges Werkzeug zur Untersuchung des Sickling-Verhaltens von RBCs von Personen mit SCD- und Sichelzellmerkmalen.
In SCD führt eine Einzelpunktmutation zur Produktion von HbS, das bei Deoxygenierung polymerisieren kann. HbS-Polymerisation verursacht Daskling von RBCs und reduziert die RBC-Verformbarkeit. Die Kombination von RBC-Sickling und RBC-Bindung an das Endothel führt zu verschiedenen SCD-Komplikationen, einschließlich vaso-okklusive Krisen (VOC), Schlaganfall, Organschäden und chronische hämolytische Anämie. Selbst bei normoxischen Bedingungen ist die RBC-Deformierbarkeit bei Patienten mit SCD beeinträchtigt. Die Verformbarkeit wird bei niedrigen Sauerstoffkonzentrationen weiter verringert. Schlüsselakteure, die die Verformbarkeit bei Normoxia bestimmen, sind dichte Zellen, irreversibel gesickerte Zellen (ISC) und dehydrierte Zellen, die alle ein verringertes Oberflächen-Volumen-Verhältnishaben 1,2,3.
Ektacytometrie ist eine etablierte Methode zur Messung der RBC-Deformierbarkeit, weit verbreitet für die Diagnose von erblichen hämolytischen Anämien, insbesondere Membranopathien4. Es kann auch verwendet werden, um Hämorheologie5,6,7,8,9zu studieren. Osmottische Gradientektacytometrie, in der Die RBC-Deformierbarkeit während einer kontinuierlichen Veränderung der Osmolalität gemessen wird, wurde verwendet, um SCD seit über einem Jahrzehnt zu untersuchen10,11. Der Anteil des fetalen Hämoglobins (HbF) ist einer der stärksten Inhibitoren der HbS-Polymerisation, da weder HbF noch sein gemischter Hybridtetramer in die DesoxyHbS-Polymerphase12eintreten können. Jüngste Studien deuten darauf hin, dass eine Erhöhung des HbF-Spiegels bei SCD-Patienten zu einem besseren Oberflächen-Volumen-Verhältnis führt, wodurch der Hydratationszustand und damit die Verformbarkeit bei nicht transfundierten Patienten11verbessert wird.
RBC-Deformierbarkeit wurde in der Vergangenheit als Biomarker für SCD-Komplikationen untersucht, jedoch mit widersprüchlichen Ergebnissen. In Studien, die querschnittsvoll und in einem stabilen Zustand durchgeführt wurden, wurden Personen mit höherer RBC-Deformierbarkeit eine höhere Inzidenz von Osteonekrose und mehr Schmerzkrisen13,14,15” festgestellt. Im Gegensatz zu diesen Befunden wurde im Vergleich zu den konstanten Zustandswerten während eines akuten VOC die RBC-Deformierbarkeit in Längsschnittstudien bei denselben Individuen 16 verringert16. Diese Diskrepanz kann das Ergebnis der Untersuchung der RBC-Verformbarkeit unter verschiedenen Bedingungen sein (d. h. während des stationären Zustands im Vergleich zu VOC). Der Anteil der gekränkten Zellen ist zu Beginn eines VOC hoch und die Zellen werden im Verlauf der Krise schnell zerstört, was den Unterschied zwischen den Daten der stationären Querschnittsinzidenz und den während des VOC erhaltenen Längsschnittdaten erklären kann. Andere Faktoren, wie die Adhärenz von RBC-Subpopulationen an der endotheliale Oberfläche, können jedoch auch für das Auftreten von VOC von Bedeutung sein. Bei SCD ist es klinisch relevanter, die Verformbarkeit während der Deoxygenierung zu messen, da Vaso-Okklusion typischerweise in den hypoxischen postkapillaren Venulen auftritt und nicht im weniger hypoxischen Mikrokapillarnetz17. Darüber hinaus kann das Vorhandensein von ISCs die Fähigkeit eines Ektacytometers verändern, die Verformbarkeit bei Normoxia zu messen. Die Verzerrung des Beugungsmusters wird durch ISCs verursacht, die sich aus der Blockfreiheit während des Durchflusses1,2,3ergeben.
Alternative Ansätze zur Untersuchung der Pathophysiologie von VOC umfassen Messungen der RBC-Haftung an einer künstlichen Oberfläche18, einzellige elektrische Impedanz-Mikroflusszytometrie19, mikrofluidische Modelle, die quantitative Messungen der Zellsickling und Unsickling mit einzelliger Rheologie20und laserinduzierter Polymerisation21. Obwohl vielversprechend, sind diese Techniken kostspielig, arbeitsintensiv und erfordern eine umfassende Bedienerschulung. Darüber hinaus fehlt den Morphologie-basierten Assays die Fähigkeit, das zelluläre Verhalten, wie z. B. die Verformbarkeit, als Funktion eines Sauerstoffgradienten zu untersuchen.
In dieser Studie beschreiben wir einen schnellen und reproduzierbaren funktionellen Test, der mit einem Ektacytometer durchgeführt wird. Dies ist eine Ektacytometrie-Messung der nächsten Generation, die die verschiedenen qualitativen Aspekte der RBC-Deformierbarkeit misst, ausgedrückt als EI während der Deoxygenierung (1.300 s) und der schnellen Reoxygenierung (280 s). Diese Zeitintervalle ermöglichen die HbS-Polymerbildung und damit das Auftreten morphologischer Veränderungen und dann die Rückgewinnung. Die Deoxygenierung erfolgt durch die Einführung von Stickstoffgas, das langsam die Sauerstoffspannung in der Blutprobe in der Lücke zwischen dem Bob und dem Becher des Ektacytometers verringert. Die RBC-Verformbarkeit wird kontinuierlich gemessen, während die Sauerstoffspannung alle 20 s mit Hilfe eines kleinenO2-Spotsgemessen wird, der in der Wand des Bechers vorhanden ist. Während des Tests werden ca. 80pO2-Messungen an die in diesem Moment gemessene EI gekoppelt. Der Sauerstoffdruck sinkt während der Deoxygenierung unter 20 mmHg, und die Reoxygenierung wird durch die passive Diffusion der Umgebungsluft erleichtert. Der versuchsweise Aufbau des Ektacytometers und des Moduls Ektacytometrie des Sauerstoffgradienten ist in Abbildung 1 und Abbildung 2beschrieben. Das Prinzip der Ektacytometrie basiert auf der RBC-induzierten Streuung von Licht von einem Laserstrahl. Dies führt zu einem elliptischen Beugungsmuster, wenn gleichzeitig Scherspannung angewendet wird (Abbildung 1).
Hier beschreiben wir die Sauerstoffgradientenektacytometrie, eine Methode, die verwendet werden kann, um das Sichelverhalten roter Blutkörperchen von SCD-Patienten unter einer Reihe von Sauerstoffkonzentrationen zu untersuchen (Abbildung 4 und Abbildung 5). Um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen, ist es wichtig, die Faktoren zu identifizieren, die die Ergebnisse beeinflussen. Zum Beispiel hat die Temperatur einen großen Einfluss auf die RBC-Verformbarkeit, vor allem aufgrund ihrer Auswirkungen auf die Dicke der viskosen Lösung (PVP). Wir empfehlen, zu Beginn des Tages eine Testmessung durchzuführen, um die Maschine gründlich auf 37 °C zu erhitzen. Dadurch wird die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse verbessert. Die Osmolarität der viskosen Lösung sollte innerhalb eines engen Bereichs liegen (282–286 mOsm/kg für PVP), da die Osmolarität den Hydratationsstatus beeinflusst, was wiederum die RBC-Deformierbarkeit beeinflusst. Der pH-Wert und die Viskosität von PVP sollten ebenfalls streng reguliert werden. Unterschiede in pH und Temperatur können Kurven dramatisch beeinflussen22. Darüber hinaus kann das verbleibende Wasser im Becher, Bob und Röhren die Lyse von RBCs verursachen, was zu falschen Daten führt, da weniger intakte RBCs im Becher gemessen werden.
Einstellungen zur Durchführung der Sauerstoffgradientenektacytometrie können angepasst werden, um spezifische Prüffragen zu beantworten. Bevorzugte Einstellungen sind in Tabelle 1aufgeführt. Eine Deoxygenierungszeit von 1.300 s wurde auf der Grundlage von Beobachtungen gewählt, die zeigten, dass die Verlängerung der Deoxygenierung bei den meisten Patienten nicht zu einem niedrigerenEI-Min. geführt hat. Im Gegensatz dazu würde eine Verkürzung der Deoxygenierungszeit die Diskriminationskraft der Sauerstoffgradientenektacytometrie behindern. Die Reoxygenierungszeit wurde aufgrund der sich schnell auflösenden HbS-Polymere während der Reoxygenierung auf 280 s und die gleichzeitige Wiederherstellung von EI in Richtung der wertegemessenen Werte vor der Deoxygenierung eingestellt. Die Scherspannung wurde auf 30 Pa eingestellt, was der osmotischen Gradientenektacytometrie entspricht. Das Senken dieses Parameters könnte die Diskriminative Leistung beeinträchtigen. Die Deoxygenierungskontrolle kann verwendet werden, wenn eine Reihe von Deoxygenierungsgeschwindigkeiten auf jede Patientenprobe angewendet wird. In unseren bevorzugten Einstellungen wurde diese Option deaktiviert, da die Deoxygenierungsrate aufgrund der einzigartigen Hämoglobin-Dissoziationskurve patientenspezifisch ist. Daher würde das Einschalten der Deoxygenierungskontrolle diese Eigenschaft aus dem Test eliminieren. Diese Funktion der Sauerstoffgradientenektacytometrie wird jedoch noch untersucht.
Mehrere bekannte Faktoren beeinflussen die Parameter der Sauerstoffgradientenektacytometrie, nämlich pH,, Temperatur und Osmolarität. Ektacytometrie, insbesondere PoS, wird durch 2,3-Diphosphoglycerat (2,3-DPG)22beeinflusst. Außerdem besteht eine klare Korrelation zwischen %HbF und dem EIminund in geringerem Maße PoS (Abbildung 5A–D). EImax ist mit Sichelzellen bei Normoxia assoziiert, was die Beobachtung erklären kann, dass kurz nach einem VOC die RBC-Deformierbarkeit bei Normoxia (EImax)höher ist. Letzteres wird durch die Zerstörung der am meisten gekränkten Zellen verursacht, und damit weniger verformbare RBCs während VOC16. Wie in Abbildung 5Fdargestellt, korrelieren höher %dichte RBCs (definiert als RBCs mit einer Hämoglobinkonzentration >1,11 mg/ml) stark mit einem niedrigeren EImax. Dies deutet darauf hin, dass dichte Zellen ein wichtiger Faktor bei der RBC-Deformierbarkeit bei Normoxia sind, ähnlich wie zuvor gemeldete Ergebnisse1.
Die Standardisierung von Proben ist sehr wichtig, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten und um zwischen verschiedenen Genotypen und Behandlungen zu unterscheiden. Die Korrektur der RBC-Anzahl ist wichtig, da die Anzahl der RBCs die Intensität des Beugungsmusters beeinflusst. Wenn niedrigere RBC-Zahlen in der Lücke zwischen Bob und Cup vorhanden sind, verschiebt sich die Kurve nach oben und nach links. Darüber hinaus schwankt die Kurve, was die genaue Berechnung der Parameter, insbesondere des PoS, erschwert.
Eine Einschränkung dieser Technik besteht darin, dass der EI-Wert einen Durchschnitt aller Zellen darstellt, einschließlich verschiedener Subpopulationen. Die Heterogenität der RBC-Populationen bei SCD-Patienten und ihr Einfluss auf die Ektacytometrie-Messung wurden intensiv untersucht. Dies führte zu einer Standardisierung, bei der die Größe des Beugungsmusters auf einen festen Wert angepasst wird, anstatt für die RBC-Anzahl23,24zu korrigieren. Ob diese Art der Standardisierung auch auf Messungen der Sauerstoffgradientenektacytometrie angewendet werden soll, wird derzeit geprüft.
Mehrere Techniken zur Messung der RBC-Deformierbarkeit unter hypoxischen Bedingungen wurden auf der Grundlage eines Deoxygenierungsschritts entwickelt, der außerhalb des Ektacytometers25,26,27stattfand. Unter diesen Bedingungen wurden keine Unterschiede im zellulären Verhalten zwischen Patienten mit HbS-Merkmalen und gesunden Kontrollen unter physiologischem pH25beobachtet. Die Sauerstoffgradientenektacytometrie zeigt jedoch deutlich ein niedriges, aber offensichtliches PoS bei Personen mit HbS-Merkmalen (Abbildung 4A). Bis heute sind in der klinischen Routinepraxis die einzigen alternativen Methoden zur Messung der Tendenz der RBCs eines einzelnen Patienten zur Sichel in vitro: RbCs werden unter Bedingungen inkubiert, die die HbS-Polymerisation fördern, wie z. B. geringe Sauerstoffspannung oder niedrigen pH-Wert. Nach der Inkubation wird ein Fixativ hinzugefügt und der Prozentsatz der gekränkten Zellen wird manuell oder digital mittels Lichtmikroskopie gezählt. Viele präklinische und frühe Phase pharmakologische Studien verwenden den Sichel-Assay, um eine sekundäre Ergebnisvariable zu generieren, um die klinische Wirksamkeit in SCD28,29,30,31 vorherzusagen ,32. Es ist jedoch zeitaufwändig, die Variabilität ist hoch und die Empfindlichkeit ist gering, die Technik ist nicht automatisiert und daher arbeitsintensiv. Darüber hinaus können morphologische Veränderungen aufgrund von Sicheln nicht gut mit physiologischen Parametern korrelieren, wie z. B. RBC-Deformierbarkeit, da es sich um einen 2-dimensionalen statischen Assay2handelt.
Sauerstoffgradientektacytometrie bietet einen funktionellen Assay des Sichlings, der schnell und reproduzierbar ist. Dies ist ein In-vitro-Test, der die endotheliale Oberfläche nicht berücksichtigt. Jedoch, Es bietet funktionelle Aspekte des Sichling Stuttierverhaltens und RBC-Eigenschaften, so dass es eine vielversprechende Technik für Sichelzellstudien. Zukünftige Anwendungen der Technik umfassen die Überwachung der Behandlungswirksamkeit bei SCD-Patienten, die Als Biomarker für neue Behandlungsstrategien, die Untersuchung des Sichelverhaltens und die Überwachung von Chimären nach der Stammzelltransplantation bei SCD.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde zum Teil durch einen Eurostars-Zuschuss estar18105 und durch einen uneingeschränkten Zuschuss von RR Mechatronics unterstützt. Die Autoren danken Sisto Hendriks und Jan de Zoeten für ihre technische Unterstützung.
ADVIA 120 Hematology Analyzer | Siemens | 067-A004-14 | Instrument |
Cell-Dyn Sapphire Hematology Analyzer | Abbott | 8H00-01 | Instrument |
Lorrca | RR Mechatronics | LORC109230 or LORC109110 | Instrument |
Lorrca Software version V5.08 | RR Mechatronics | – | Software |
Nitrogen gas 4.8 or 5.0 | Local | – | |
O2-spot | RR Mechatronics | PO2S020153 | O2 measurement |
Oxygenscan module (pO2scan) | RR Mechatronics | PO2S109000 | Add-on |
Oxy-ISO | RR Mechatronics | QRR 030905 | Viscous solution |
X-Clean | RR Mechatronics | QRR 010946 | Cleaning solution Lorrca |