Summary
Hier presenteren we zuurstof gradiënt ektacytometrie, een snelle en reproduceerbare methode om de vervormbaarheid van rode bloedcellen in monsters te meten van patiënten met sikkelcelziekte onder gecontroleerde deoxygenatie en reoxygenatie. Deze techniek biedt een manier om te bestuderen van de rode bloedcel ziekten en om te controleren sikkelcelziekte behandeling werkzaamheid.
Abstract
Bij sikkelcelziekte (SCD) veroorzaakt een enkelvoudige mutatie in de gen-codering voor bèta-globine de productie van abnormale hemoglobine S (HbS). Wanneer deoxygenated, HbS kunnen polymeriseren, vormen van stijve staven van hemoglobine, resulterend in de zieling van rode bloedcellen (Rbc's). Deze ziekende Rbc's hebben de vervormbaarheid aanzienlijk verminderd, waardoor vaso-occlusie ontstaat, wat leidt tot tal van SCD-gerelateerde klinische complicaties, waaronder pijn, beroerte en orgaan beschadiging. RBC vervormbaarheid wordt ook verlaagd door RBC uitdroging, resulterend in dichte rode bloedcellen die meer kans op sikkel hebben. Tot op heden is er geen enkele wijdverbreide, snelle en reproduceerbare laboratoriumtest die in staat is de ernst van de ziekte te voorspellen of de behandelingseffecten voor nieuwe, niet-foetale hemoglobine inducerende therapieën direct te monitoren. In deze studie beschrijven we een protocol om de RBC-vervormbaarheid te meten als een functie van pO2 , die het mogelijk maakt om het sissende gedrag bij scd-patiënten te Kwantificeer. Zuurstof gradiënt ektacytometrie meet RBC deformability, uitgedrukt als de rek-index (EI), als functie van pO2. Rbc's worden blootgesteld aan een vaste shear stress van 30 pa tijdens een ronde van deoxygenatie en reoxygenatie. Er worden zes uitlezen parameters geproduceerd. Van deze, het punt van de sickling (PoS), gedefinieerd als de pO2 waarbij maximale EI (eiMax) toont een 5% afname, en minimale ei tijdens DEOXYGENATIE (eimin) zijn de meest informatieve, weerspiegelen een individuele patiënt pO2 waarbij sissende starts en de minimale vervormbaarheid van de rode bloedcellen van een patiënt, respectievelijk. PoS wordt geassocieerd met een individuele patiënt hemoglobine affiniteit voor zuurstof, terwijl EImin vertoont een sterke correlatie met foetale hemoglobine niveaus. We concluderen dat zuurstof gradiënt ektacytometrie een veelbelovende techniek is om de behandeling van patiënten met SCD te monitoren, als biomarker voor anti-sissende middelen in klinisch en preklinische studies, en een belangrijk hulpmiddel om het ziekelijk gedrag van Rbc's te bestuderen uit individuen met SCD en sikkelceleigenschappen.
Introduction
In SCD resulteert een enkelvoudige mutatie in de productie van HbS, die kan polymeriseren op deoxygenatie. HbS polymerisatie veroorzaakt een zieling van Rbc's en vermindert de RBC deformability. De combinatie van RBC sickling en RBC-hechting op het endotheel leidt tot verschillende SCD-complicaties, waaronder vaso-occlusieve crises (VOC), beroerte, orgaan beschadiging en chronische hemolytische anemie. Zelfs bij normoxische omstandigheden is de RBC vervormbaarheid gecompromitteerd bij patiënten met SCD. De vervormbaarheid wordt verder verlaagd bij lage zuurstofconcentraties. Belangrijke spelers die de vervormbaarheid bij normoxia bepalen, zijn dichte cellen, onomkeerbare siledcellen (ISC) en gedehydrateerde cellen, die allemaal een verminderde oppervlakte-tot-volume verhouding1,2,3hebben.
Ektacytometry is een vaste methode voor het meten van de RBC-vervormbaarheid, die op grote schaal wordt gebruikt voor de diagnose van erfelijke hemolytische anemias, met name membranopathieën4. Het kan ook worden gebruikt voor het bestuderen van de hemorheologie5,6,7,8,9. Osmotische gradiënt ektacytometrie, waarin RBC vervormbaarheid wordt gemeten tijdens een continue verandering in osmolaliteit, is gebruikt om scd meer dan tien jaar10,11te bestuderen. Het percentage foetale hemoglobine (HbF) is een van de sterkste remmers van HbS-polymerisatie omdat noch HbF noch haar gemengde hybride tetrameer (∝ 2βSγ) de deoxyHbS polymeer fase12kan betreden. Recente studies suggereren dat het verhogen van de HbF in SCD-patiënten leidt tot een betere oppervlakte-volume verhouding, waardoor de hydratatie toestand wordt verbeterd en dus de vervormbaarheid bij niet-getransfuseerde patiënten11.
RBC vervormbaarheid is in het verleden bestudeerd als biomarker voor scd-complicaties, maar met conflicterende resultaten. In studies die cross-sectioneel werden uitgevoerd en in een stabiele toestand bleken personen met hogere niveaus van RBC vervormbaarheid een hogere incidentie van osteonecrose en meer pijn crises13,14,15te hebben. In tegenstelling tot deze bevindingen, in vergelijking met de steady state waarden tijdens een acute VOC, werd de RBC vervormbaarheid verlaagd in longitudinale studies binnen dezelfde individuen16. Deze discrepantie kan het gevolg zijn van het bestuderen van RBC vervormbaarheid onder verschillende omstandigheden (d.w.z. tijdens de steady state versus VOC). Het percentage van de zieke cellen is hoog bij het begin van een VOC en de cellen worden snel vernietigd naarmate de crisis vordert, wat het verschil kan verklaren tussen de steady state cross-sectionele incidentie gegevens en longitudinale gegevens verkregen tijdens de VOC. Andere factoren, zoals de hechting van RBC subpopulaties op het endotheel oppervlak, kunnen echter ook belangrijk zijn bij het optreden van VOC. In scd is het meer klinisch relevant om de vervormbaarheid tijdens de deoxygenatie te meten, omdat vaso-occlusie meestal optreedt in de hypoxische postcapillaire venulen en niet in het minder hypoxische microcapillaire netwerk17. Bovendien kan de aanwezigheid van Isc's het vermogen van een ektacytometer wijzigen om de vervormbaarheid bij normoxia te meten. Vervorming van het diffractie-patroon wordt veroorzaakt door isc's, wat voortvloeit uit de niet-uitlijning tijdens de stroom1,2,3.
Alternatieve benaderingen voor het bestuderen van de pathofysiologie van VOC zijn metingen van RBC-hechting op een kunstmatig oppervlak18, eencellige elektrische impedantie micro flowcytometrieonderzoeken19, microfluïdische modellen met een combinatie van kwantitatieve metingen van de celziekten en de onsickling met reologie van één cel20, en laser-geïnduceerde polymerisatie21. Hoewel veelbelovend, deze technieken zijn kostbaar, arbeidsintensieve, en vereisen uitgebreide operator training. Bovendien, de assays die morfologie gebaseerde gebrek aan de mogelijkheid om cellulaire gedrag te bestuderen, zoals vervormbaarheid, als een functie van een zuurstof gradiënt.
In deze studie beschrijven we een snelle en reproduceerbare functionele assay uitgevoerd met een ektacytometer. Dit is een volgende generatie ektacytometrie meting die de verschillende kwalitatieve aspecten van de RBC vervormbaarheid meet, uitgedrukt als de ei tijdens deoxygenatie (1.300 s) en snelle reoxygenatie (280 s). Deze tijdsintervallen maken HbS-polymeer vorming mogelijk, en daarmee het optreden van morfologische veranderingen en vervolgens herstel. Deoxygenatie ontstaat door het introduceren van stikstofgas, dat de zuurstofspanning in het bloedmonster langzaam verlaagt in de kloof tussen de Bob en de Beker van de ektacytometer. De RBC vervormbaarheid wordt continu gemeten terwijl de zuurstofspanning om de 20 s wordt gemeten door middel van een kleine O2-spot aanwezig in de wand van de beker. Tijdens de test worden ongeveer 80 pO2 metingen gekoppeld aan de ei gemeten op dat moment. De zuurstofdruk daalt onder 20 mmHg tijdens de deoxygenatie, en reoxygenatie wordt vergemakkelijkt door de passieve diffusie van de omgevingslucht. De experimentele opstelling van de ektacytometer-en zuurstofgradiënt ektacytometrie module wordt beschreven in Figuur 1 en Figuur 2. Het principe van ektacytometrie is gebaseerd op RBC-geïnduceerde verstrooiing van licht van een laserstraal. Dit resulteert in een elliptisch diffractie patroon wanneer shear stress tegelijkertijd wordt toegepast (Figuur 1).
Protocol
Alle procedures werden goedgekeurd door de ethische commissie van het Universitair Medisch Centrum Utrecht (UMCU) en in overeenstemming met de verklaring van Helsinki. Patiënten die deelnamen aan het Texas Children's Hematology Center (TCHC) werden goedgekeurd door de lokale IRB en in overeenstemming met de verklaring van Helsinki.
1. Algemene overwegingen
- Begin met het uitvoeren van een test meting om de Bob en beker op te warmen. Zorg ervoor dat de temperatuur van de Bob en de beker 37 °C is. Dit is belangrijk voor een goede reproduceerbaarheid.
- Zorg ervoor dat de visceuze Polyvinylpyrrolidon (PVP) oplossing binnen de strikte grenzen van osmolariteit (282 – 286 mOsm/kg), pH (7.35 – 7.45) en viscositeit (27.5 – 32,5 MPa) bij kamertemperatuur (22 °C) valt.
Opmerking: de PVP moet bij kamertemperatuur worden gebruikt. Indien bewaard bij een lagere temperatuur, zorg ervoor dat het is opgewarmd tot kamertemperatuur voorafgaand aan het nemen van eventuele metingen.
2. opstarten van de ektacytometer
- Zet de computer en de ektacytometer aan de achterzijde aan. Start het softwareprogramma (tabel met materialen) op de computer.
- Zorg ervoor dat de stikstof beschikbaar is voor deoxygenate het monster door het openen van de stikstof cilinder.
- Verlaag de Bob in de beker en zorg ervoor dat de beker vrij kan draaien. Reinig de beker aan de binnen-en buitenkant met een zachte doek en gedestilleerd water, omdat vuil de EI-metingen kan belemmeren.
- Wanneer het softwareprogramma wordt uitgevoerd, controleert u het volgende bericht op het scherm: "Zorg ervoor dat de gasklep open is" en klik op OK.
- Zorg ervoor dat de ektacytometer het pO2 zelfcontrole proces start dat op het scherm verschijnt. Selecteer Start (Enter). Als dit mislukt, voert u de zelfcontrole opnieuw uit door te klikken op Hardware check | pO2 | Zelfcontrole.
Opmerking: als de zelfcontrole opnieuw mislukt, overweeg dan om de O2-spot te vervangen. De O2-spot wordt vervangen door de spot voorzichtig te duwen van de binnenkant van de beker met een vingertop. Een nieuwe plek wordt geplaatst door de plek zachtjes van buitenaf naar de beker te duwen. - Kies pO2 scan uit de verschillende tests die aan de linkerzijde worden vermeld. Kies instellingen aan de rechterkant van het scherm en zorg ervoor dat ze zijn ingesteld volgens de parameters die worden vermeld in tabel 1. Houd dezelfde instellingen voor elke meting.
- Als u deze instellingen wilt opslaan, drukt u op OK | OK.
Opmerking: voorkeursinstellingen worden weergegeven in tabel 1 , maar kunnen worden aangepast aan de gebruikersvoorkeuren en onderzoeksdoeleinden. Bijvoorbeeld, om het ziekende gedrag uitgebreider te bestuderen, kunnen deoxygenatie snelheid en duur worden gewijzigd.
3. monsterverzameling en voorbereiding
Opmerking: voor de validatie van de techniek, ethyleendiamine tetraazijnzuur (EDTA)-behandeld bloed van 38 SCD-patiënten en 5 gezonde controles opgenomen in het Universitair Medisch Centrum Utrecht of Texas Children's hematologie Center, in verschillende klinische studies ( Het Nederlandse proef register [NTR] Identifier, NTR 6779 en NTR 6462), evenals geanonimiseerde overgebleven bloedmonsters van patiënten die de polikliniek bezochten of in het zieken land werden opgenomen, werden gebruikt.
- Verzamel bloedmonsters met venipunctie (minimaal 300 μL/monster) in een buisje met EDTA. Zorg ervoor dat het bloed gedurende ten minste 30 minuten bij 4 °C is bewaard, maar niet langer dan 24 uur.
Opmerking: citraat fosfaat dextrose adenine (CPDA) of heparine kan ook worden gebruikt, maar de invloed van deze reagentia op het behoud van het monster met betrekking tot de zuurstof gradiënt ektacytometrie is niet bekend. - Meng het monster voorzichtig door inversie om te homogeniseren. Schud het monster niet. Laat het monster vóór de meting opwarmen tot kamertemperatuur op een rollerbank.
Opmerking: een monsterbuis (9 – 10 mL) die gedurende meer dan 1 uur bij 4 °C wordt bewaard, moet 15 minuten opwarmen. Bij een opslag van minder dan 1 uur bij 4 °C, moet het gedurende 10 minuten opwarmen. Een monsterbuis (2 – 6 mL) die gedurende meer dan 1 uur bij 4 °C wordt bewaard, moet gedurende 10 minuten opwarmen. Bij een opslag van minder dan 1 uur bij 4 °C, moet het opwarmen gedurende 5 minuten. - Meet de volledige bloedtelling op een hematologie Analyzer. Neem hiervoor 20 – 200 μL volbloed in een buisje met EDTA. Plaats de aspiratie naald in de buis en druk op de knop achter de naald van de hematologie Analyzer om de meting te starten.
Opmerking: in het volledige bloed getal wordt het RBC-nummer gemeten, wat een belangrijke factor is voor het standaardiseren van de zuurstof gradiënt ektacytometrie-metingen. Het aantal RBC wordt berekend op basis van voorwaartse en zijwaartse Scatter door flow Cytometry. Normale RBC-telling bij gezonde controles is 3,7 – 5,0 x 1012/l voor vrouwtjes en 4,2 – 5,5 x 1012/l voor mannen. Het aantal RBC bij patiënten met SCD is over het algemeen afgenomen. Sommige hematologie analyzers zal ook meten percentage dichte rode bloedcellen (% DRBC) die van extra waarde in de interpretatie van individuele zuurstof gradiënt ektacytometrie curven kunnen zijn. - Standaardiseer het volledige bloedmonster tot een RBC-telling van 200 x 106 rbc's in 5 ml PVP (200 x 106 rbc's/injectieflacon) door het volume van het monster dat wordt toegevoegd aan te passen. Als het totale aantal RBC minder is dan 200 x 106, wordt het diffractie-patroon en de ei beïnvloed.
- Gebruik de onderstaande vergelijking om de telling uit te voeren.
4,0/XX (x 1012/l) x 50 = YY μL volbloed/INJECTIEflacon PvP
waarbij XX de berekende RBC-telling is die is verkregen uit stap 3,3 en yy de hoeveelheid volbloed is die nodig is voor de werkelijke meting. Afhankelijk van de graad van anemie en andere factoren die van invloed zijn op de RBC-tellingen, is de benodigde hoeveelheid volbloed 40 – 90 μL.
- Gebruik de onderstaande vergelijking om de telling uit te voeren.
4. zuurstof gradiënt ektacytometrie meting
- Pipetteer het berekende monstervolume (YY μL bloed) in PVP om een totaal volume van 5 mL te verkrijgen. Bevochtig de tip door het bloed 3x zachtjes te suspentiteren. Gebruik een pipetpunt met een brede opening om extra stress op de Rbc's te voorkomen. Meng het monster voorzichtig handmatig door de inversie totdat het homogeen is.
Opmerking: Open de PVP-injectieflacon zo kort mogelijk om lucht contact te vermijden. - Trek langzaam 2,0 mL van het bloed/PVP-mengsel in een 3 mL spuit zonder naald. Duw de zuiger om eventuele zichtbare luchtbellen en overmatige monsteroplossing te verwijderen tot 1,5 – 1,8 mL in de spuit (afhankelijk van het cupvolume).
- Injecteer het totale monstervolume langzaam en gelijkmatig in de Bob door de connector. Zorg ervoor dat het niveau van het monster hoger is dan de zuurstofsensor (roze vlek) en boven het kleine zuig gat. Laat geen monsteroplossing in de spuit achter.
- Klik op Nieuw en vul de voorbeeld-id, opmerkingen, datum van donatie en VISCOSITEIT van PvP in. Klik op OK | Aspirate. Na 60 s, zal de beker draaien en aspireren het monster voor 15 s. Klik op OK wanneer de rotatie stopt. Sluit het deksel van de machine. Klik op Doorgaan | Begin nu, als zuurstof gradiënt ektacytometry wordt gedaan met een vaste winst. De meting duurt ongeveer 28 minuten.
- Druk na de meting het rapport af dat de curve en de parameters weergeeft die automatisch door de software worden berekend. Zorg ervoor dat de onbewerkte gegevens automatisch worden opgeslagen in de opgegeven map in instellingen. Maximale EI (EIMax), minimum EI (eimin), pO2@ 95% ei (PoS), en gebied (gebied onder de curve) worden automatisch berekend en toegevoegd aan het afgedrukte rapport en de onbewerkte gegevens.
- Handmatig verkrijgen van ΔEI door het berekenen van het verschil tussen EIMax en eimin. Bereken het procentuele herstel door het verschil in gemiddelde EI te nemen vóór deoxygenatie (pO2 100 – 120 mmHg) en gemiddelde ei-waarden tijdens reoxygenatie bij 100 – 120 mmHg.
5. reiniging van de ektacytometer
- Verwijder de monster spuit en vervang deze door een spuit gevuld met gedestilleerd water of gedeïoniseerd water.
- Druk op cleanen spoel de connector langzaam door tijdens het spoelen. Zorg ervoor dat u in beide richtingen spoelt.
- Verwijder de spuit en til de Bob op. Droog de Bob, beker en connector grondig met een zachte doek.
- Gebruik een grote spuit (10 – 50 mL) om de connector te spoelen om eventueel in de buizen en Bob achtergebleven water te verwijderen. Blokkeer de onderste inlaat/uitlaat van de Bob om de druk in de buizen terug te krijgen, waardoor het resterende water wordt verwijderd.
- Verlaag de Bob in de beker. De machine is nu klaar voor de volgende meting.
6. afsluiten van de machine
- Zorg ervoor dat de machine na de laatste meting goed is gespoeld, zoals hierboven beschreven. Zorg ervoor dat de juiste buizen betrekking hebben op de reinigingsoplossing.
- Sluit de software, druk op sluiten en druk op Start om het einde van de dag te beginnen met schoonmaken.
- Na het voltooien van het hele reinigingsprogramma, verwijder de spuit en til de Bob. Spoel de connector met een grote spuit.
- Maak de afval fles leeg en droog de Bob en de beker met een zachte doek. Spoel de connector om het water dat overblijft in de buizen en Bob te verwijderen. Blokkeer de onderste inlaat/uitlaat van de Bob om de druk in de buizen terug te krijgen, waardoor het resterende water wordt verwijderd.
- Sluit de deksel van de machine. Sluit de stikstof cilinder. Schakel de computer en het apparaat uit.
Representative Results
Zuurstof gradiënt ektacytometrie kan worden gebruikt voor het karakteriseren van het sissende gedrag bij patiënten met SCD. In deze studie werden bloedmonsters van een totaal van 38 SCD-patiënten en vijf gezonde controles opgenomen. Bij gezonde controles is het diffractie patroon circulair in rust en elliptisch bij hogere shear stress4. Uit het elliptische diffractie-patroon wordt de rekindex (EI) berekend op basis van de hoogte en breedte van het diffractie-patroon. In de zuurstof gradiënt ektacytometrie wordt de langzame en continue deoxygenatie van het monster door stikstofgas gevolgd door snelle reoxygenatie door de omgevingslucht. Onder deze omstandigheden kan RBC sickling worden waargenomen onder deoxygenatie. Dit zal leiden tot een vervorming van het diffractie patroon omdat siled's rode cellen niet goed uitgelijnd onder de toegepaste shear stress. Vandaar, ze lijken te zijn minder vervormbare in tegenstelling tot gezonde Rbc's (Figuur 2).
Figuur 3A laat zien hoe sikkelen rbc's in vorm veranderen na deoxygenatie, die voorwaarden nabootsen tijdens zuurstof gradiënt ektacytometrie, terwijl controle sikkel rbc's zonder deoxygenatie geen verandering in vorm vertonen. Dit proces resulteert in vervorming van het diffractie patroon tijdens de zuurstof gradiënt ektacytometrie, en dus in een afname van de EI. Figuur 3B toont de verschillende diffractie patronen waaruit verschillende parameters worden gegenereerd.
Een representatieve kromme die door de ektacytometer wordt verkregen, wordt weergegeven in Figuur 3C. Zes parameters weerspiegelen verschillende kenmerken van het ziekende gedrag van Rbc's: EIMax is de maximale ei aan het begin van de meting vóór deoxygenatie. Deze parameter vertegenwoordigt de basislijnpositie en weerspiegelt de algehele vervormbaarheid van de totale RBC-populatie in de omgevingslucht. EImin is de minimale ei, die minimale vervormbaarheid na deoxygenatie vertegenwoordigt. Deze parameter weerspiegelt veranderingen in de vorm en oriëntatie van (sikkelen) Rbc's bij deoxygenatie. ΔEI is het verschil tussen EIMax en eimin, wat aangeeft hoeveel cellen kunnen sikkelen tijdens een ronde van deoxygenatie. 5% punt van Sickling (PoS5%) is de pO2 (mmHg) waarbij een 5% afname van eiMax tijdens deoxygenatie wordt gemeten. Dit geeft de zuurstofspanning aan waar het ziekende proces begint. Gebied weerspiegelt het gebied onder de curve, die wordt bepaald door een integrale berekening van EI en pO2 metingen tussen 100 mmHg en po2min (mmHg). Dit is het resultaat van eerder beschreven parameters EIMax, eimin, en PoS. Recovery vertegenwoordigt het verschil van ei tijdens het laatste deel van reoxygenatie in vergelijking met ei bij Baseline. Beide EI-waarden worden gemeten bij een pO2 van 100 – 120 mmHg. Deze parameter weerspiegelt de capaciteit van Rbc's die sikkelen tijdens deoxygenatie om de zieking te keren tijdens reoxygenatie22. Parameters van dubbele metingen hadden over het algemeen een variatiecoëfficiënt (CV) < 5% (mediaan 1,83%). Indien een CV > 5% werd verkregen, werd een derde meting uitgevoerd. De parameters EIMax en Recovery zijn de meest reproduceerbare met mediaan CVS < 1%.
Representatieve curven van Rbc's van gezonde controles, patiënten met HbS-eigenschappen (heterozygoot HbS) en een homozygoot SCD-patiënt worden weergegeven in Figuur 4a. De representatieve curve van de HbSC-patiënt vertoont een lager herstel, wat kan duiden op een ander ziedingproces (Figuur 4B). De representatieve curven van HBSS-patiënten behandeld met hydroxyureum (HU) en transfusie worden weergegeven in Figuur 4C en Figuur 4D. Het is duidelijk dat er een groot verschil is tussen de representatieve curven van HS-eigenschappen (HbAS-cellen) en Rbc's van HbSS-patiënten die worden behandeld met transfusie (bestaande uit een mengsel van homozygoot sikkel (HbSS) en homozygoot normale (HbAA) cellen, Figuur 4a ,D). De duidelijke verschillen in de rondingen van de onbehandelde scd-patiënt en de door de HU en met transfusie behandelde patiënten benadrukt het nut van deze test (Figuur 4C,D). De niveaus van HbF en HbS correleerde significant met EImin en, in mindere mate, met PoS (Figuur 5a–D). Dit geeft aan dat die laboratoriumparameters die belangrijk zijn bij de evaluatie van de patiënt ook worden weerspiegeld in de zuurstof gradiënt ektacytometrie. Het aantal zieke cellen bij normoxia en het percentage van dichte Rbc's (DRBCs) beïnvloeden beide EImax-waarden, omdat ze significant gecorreleerd zijn (Figuur 5E-F), wat aangeeft dat eimax een andere belangrijke factor weerspiegelt in de sissende proces. Deze resultaten tonen aan hoe verschillende kenmerken zoals% HbS,% HbF, siledcellen bij normoxia en% DRBCs verschillende parameters beïnvloeden.
Figuur 1. Schematische opstelling van de ektacytometer. De ektacytometer maakt gebruik van een couette systeem om shear stress op de cellen toe te passen. Een buitenste cilinder van de rotatie (beker) en een statische binnencilinder (Bob) worden gebruikt voor het opwekken van shear stress door het creëren van laminaire stroming bij 37 °C. Tussen de Bob en de beker is er een kleine opening waarin de bloed suspensie wordt geïnjecteerd. Een laserstraal schijnt van de Bob door de bloed suspensie en wordt verspreid door de aanwezigheid van Rbc's. Het diffractie-patroon wordt geprojecteerd en geanalyseerd door een camera. De rekindex (EI) wordt berekend met de hoogte (a) en de breedte (b) van het diffractie-patroon4. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2. Schematische opstelling van de ektacytometer met zuurstofgradiënt ektacytometrie module. Schematisch diagram van de module die de deoxygenatie van de bloed suspensie langzaam laat zien met de infusie van stikstofgas (N2). De zuurstofspanning wordt gemeten door de hoeveelheid afschrikken van het luminophore signaal dat van de LED-Fiber naar de O2-spot wordt gestuurd. Na deoxygenatie zullen sikkel Rbc's beginnen te sikkel, hun vervormbaarheid zal afnemen, en ze zullen niet meer overeenkomen met elliptische Rbc's. De sikkelde Rbc's verstoren het diffractie patroon door de vorm van een ellips te veranderen in een rhomboïde of diamantachtige vorm. Deze verandering in de vorm van het diffractie patroon resulteert in een afname van de EI. Metingen van pO2 en ei worden niet op dezelfde hoogte in de beker uitgevoerd. Dit zorgt voor een betere discriminatie tussen de deoxygenatie en reoxygenatie curven en, vandaar, een betere interpretatie van de curve. Dit cijfer is gewijzigd van Rab et al.22Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3. Representatieve zuurstof gradiënt ektacytometrie curve en diffractie patronen. A) bij deoxygenatie onder omstandigheden die vergelijkbaar zijn met de zuurstofgradiënt ektacytometrie, werden sikkel rbc's vastgesteld. In de controle sikkel RBCs, dezelfde voorwaarden werden gebruikt, maar zonder stikstofgas. Deoxygenated sikkel Rbc's vertonen een verandering in de vorm in tegenstelling tot de controle Rbc's.B) bij deoxygenatie en shear stress (30 PA) verandert het diffractie patroon van een ellips op een rhomboïde. C) representatieve kromme van zuurstofgradiënt ektacytometrie. De maximale rek-index (EIMax) staat voor de baseline positie en toont een algehele vervormbaarheid van de totale RBC populatie. Minimale EI (EImin) vertegenwoordigt minimale vervormbaarheid, die wordt veroorzaakt door de verandering in vorm en oriëntatie van rbc's bij deoxygenatie. ΔEI (dEI, het verschil in EI tussen EIMax en eimin) toont hoeveel cellen kunnen sikkelen tijdens een ronde van deoxygenatie. Punt van zieling (PoS, pO2 bij 5% ei afname) toont de zuurstofspanning wanneer de eerste rbc's beginnen te sikkel. Het gebied onder de curve (van pO2min = 100 mmHg) wordt berekend in het parameter gebied. Dit vat EIMax, eiminen PoS samen. De capaciteit van sikkel cellen om te unsikkelen tijdens reoxygenatie wordt weergegeven in de parameter herstel (percentage van EIMax bereikt tijdens reoxygenatie). Om de interpretatie te helpen, werden alle gegevenspunten in elk individueel experiment met een lijn verbonden om de resultaten grafisch te presenteren. Dit cijfer is gewijzigd van Rab et al.22Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4. Zuurstof gradiënt ektacytometrie parameters correleren met genotype en behandelingsregimes van SCD-patiënten met SCD. (A) representatieve grafiek van rbc's van HBS-dragers (HBS-Trait) en gezonde controles met betrekking tot onbehandelde HbSS-patiënten. (B) representatieve grafiek van rbc's van patiënten met hemoglobine SC-ziekte (HBSC) in verband met onbehandelde HbSS-patiënten. C) representatieve grafiek van rbc's van met hydroxyureum behandelde homozygoot scd-patiënten (HBSS HU) in verband met onbehandelde HBSS-patiënten. D) representatieve grafiek van rbc's van HBSS-patiënten behandeld met bloedtransfusie (HBSS-transfusie) met betrekking tot onbehandelde HBSS-patiënten. Dit cijfer is gewijzigd van Rab et al.22Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5. Zuurstof gradiënt ektacytometrie parameters worden geassocieerd met% HbF,% HbS,% sickled cellen bij normoxia en% dichte Rbc's. A) lineaire correlatie van de minimum REKINDEX (eimin) en% HBF van 15 HBSS-of HBS/β-thalassemie-patiënten zonder transfusie. B) lineaire correlatie van eimin en% HBS.C) lineaire correlatie van POS en% HBF.D) lineaire correlatie van POS en% HBS.E) lineaire correlatie van maximum ei (eiMax) en percentage van de siledcellen op normoxia gemeten met digitale microscopie. F) lineaire correlatie van eiMax en percentage dichte Rbc's (% drbcs) van 21 patiënten met HBSS. Dit cijfer is gewijzigd van Rab et al.22Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Instellingen | ||
| Bestanden | Opslagmap | |
| Algemene opties | Standaard gemiddelde viscositeit | Viscositeit van PVP |
| pO2 scan | Minimale aspiratie tijd (en) | 60 |
| pO2 scan shear stress (PA) | 30 | |
| Bepalen van pO2 elke (S) | 20 | |
| Zwevend gemiddelde grootte | 2 | |
| pO2 scan stap; Bewerken | 0-UIT; 60-AAN; 1360 – UIT; 1640-KORTING | |
| CAL. gebied tussen (mmHg) | 10 en 100 | |
| pO2 controle | Uit (uitgeschakeld) |
Tabel 1. De voorkeursinstelling van de ektacytometer.
Discussion
Hier beschrijven we zuurstofgradiënt ektacytometrie, een methode die kan worden gebruikt om het ziekende gedrag van rode bloedcellen van SCD-patiënten onder een reeks zuurstofconcentraties te bestuderen (Figuur 4 en Figuur 5). Om reproduceerbare resultaten te verkrijgen, is het belangrijk om de factoren te identificeren die van invloed zijn op de resultaten. Temperatuur heeft bijvoorbeeld een grote invloed op de RBC-vervormbaarheid, voornamelijk vanwege de effecten op de dikte van de visceuze oplossing (PVP). We raden aan om aan het begin van de dag een test meting uit te voeren om de machine grondig te verwarmen tot 37 °C. Dit zal de reproduceerbaarheid van de resultaten verbeteren. De osmolariteit van de viskeuze oplossing moet binnen een smal bereik liggen (282 – 286 mOsm/kg voor PVP), omdat osmolariteit invloed heeft op de hydratatie status, wat op zijn beurt de RBC deformability beïnvloedt. De pH en viscositeit van PVP moeten ook strak worden gereguleerd. Verschillen in pH en temperatuur kunnen de bochten dramatisch beïnvloeden22. Bovendien kan het resterende water in de beker, Bob en buizen de lysis van Rbc's veroorzaken, wat resulteert in onjuiste gegevens, omdat er minder intacte Rbc's in de beker worden gemeten.
Instellingen voor het uitvoeren van zuurstof gradiënt ektacytometry kan worden aangepast om specifieke onderzoeksvragen aan te pakken. Voorkeursinstellingen worden weergegeven in tabel 1. Een deoxygenatie tijd van 1.300 s werd gekozen op basis van waarnemingen waaruit blijkt dat de verlenging van deoxygenatie niet heeft resulteren in een lagere EI-min voor de meeste patiënten. Inkorten van de deoxygenatie tijd zou daarentegen de discriminatieve kracht van de zuurstof gradiënt ektacytometrie belemmeren. De reoxygenatie tijd werd ingesteld op 280 s als gevolg van het snel oplossen van HbS polymeren tijdens reoxygenatie, en gelijktijdige restauratie van EI naar waarden gemeten vóór de deoxygenatie. Shear stress werd ingesteld op 30 PA, die analoog is aan de osmotische gradiënt ektacytometry. Het verlagen van deze parameter kan de discriminatieve kracht belemmeren. Deoxygenatie controle kan worden gebruikt als een set deoxygenatie snelheid wordt toegepast op elk patiënt monster. In onze voorkeursinstellingen werd deze optie uitgeschakeld omdat de snelheid van deoxygenatie patiëntspecifiek is vanwege de unieke dissociatie curve van hemoglobine. Daarom zou het inschakelen van de deoxygenatie controle dit kenmerk van de test elimineren. Echter, deze functie van zuurstof gradiënt ektacytometry is nog steeds onderzocht.
Verschillende bekende factoren beïnvloeden zuurstof gradiënt ektacytometrie parameters, namelijk pH, temperatuur, en osmolariteit. Ektacytometrie, vooral PoS, wordt beïnvloed door 2, 3-difosfoglycerate (2, 3-DPG)22. Ook is er een duidelijke correlatie tussen% HbF en de EImin, en in mindere mate PoS (Figuur 5a–D). EIMax wordt geassocieerd met sikkelcellen bij normoxia, die de waarneming kunnen verklaren dat kort na een VOC, RBC verformability bij normoxia (eiMax), hoger is. De laatste wordt veroorzaakt door de vernietiging van de meest zieke cellen, en dus minder vervormbare Rbc's tijdens VOC16. Zoals in Figuur 5Fwordt getoond, correleren hogere% dichte rbc's (gedefinieerd als rbc's met een hemoglobineconcentratie ≫ 1.11 mg/ml) sterk met een lagere eiMax. Dit geeft aan dat dichte cellen een belangrijke factor zijn in RBC vervormbaarheid bij normoxia, vergelijkbaar met eerder gerapporteerde resultaten1.
Standaardisatie van monsters is zeer belangrijk voor het verkrijgen van reproduceerbare resultaten en voor het onderscheiden van verschillende genotypen en behandelingen. Het corrigeren van RBC-telling is belangrijk, omdat het aantal Rbc's de intensiteit van het diffractie-patroon beïnvloedt. Als er lagere RBC-nummers aanwezig zijn in de kloof tussen de Bob en de beker, verschuift de curve naar boven en naar links. Bovendien zal de curve fluctueren, wat de nauwkeurige berekening van de parameters belemmert, met name het PoS.
Een beperking van deze techniek is dat de EI-waarde een gemiddelde van alle cellen vertegenwoordigt, inclusief verschillende subpopulaties. Heterogeniteit van RBC-populaties in SCD-patiënten en de invloed ervan op ektacytometrie meting is intensief bestudeerd. Dit resulteerde in standaardisatie waarbij de grootte van het diffractie patroon wordt aangepast aan een vaste waarde in plaats van gecorrigeerd voor de RBC Count23,24. Of deze manier van standaardisatie ook moet worden toegepast op zuurstof gradiënt ektacytometrie metingen worden momenteel bestudeerd.
Verschillende technieken voor het meten van de RBC vervormbaarheid onder hypoxische condities werden ontwikkeld op basis van een deoxygenatie stap die plaatsvond buiten de ektacytometer25,26,27. Onder deze omstandigheden werden verschillen in cellulair gedrag niet waargenomen tussen patiënten met HbS-eigenschappen en gezonde controles onder fysiologische pH25. Zuurstof gradiënt ektacytometrie toont echter duidelijk een laag, maar evident PoS bij individuen met HbS-eigenschappen (Figuur 4a). Tot op heden omvatten de enige alternatieve methoden voor het meten van de neiging van de Rbc's van een individuele patiënt tot sikkel in vitro in de routinematige klinische praktijk een op morfologie gebaseerde ziekte test: Rbc's worden geïnineerd onder omstandigheden die HbS-polymerisatie bevorderen, zoals lage zuurstofspanning of lage pH. Na incubatie wordt een fixeermiddel toegevoegd en het percentage van de sierige cellen wordt manueel of digitaal geteld met behulp van Lichtmicroscopie. Veel preklinische en vroege fase-farmacologische onderzoeken gebruiken de sissende assay om een secundaire uitkomstvariabele te genereren om de klinische werkzaamheid in scd te kunnen voorspellen28,29,30,31 ,32. Echter, het is tijdrovend, variabiliteit is hoog en de gevoeligheid is laag, de techniek is niet geautomatiseerd en, daarom, arbeidsintensief. Bovendien kunnen morfologische veranderingen als gevolg van ziekten niet goed correleren met fysiologische parameters, zoals RBC deformability, omdat het een 2-dimensionale statische assay2is.
Zuurstof gradiënt ektacytometrie biedt een functionele assay van ziekten die snel en reproduceerbaar zijn. Dit is een in vitro test die het endotheliale oppervlak niet beschouwt. Het biedt echter functionele aspecten van het ziekende gedrag en RBC-kenmerken, waardoor het een veelbelovende techniek is voor sikkelcelstudies. Toekomstige toepassingen van de techniek omvatten het monitoren van de werkzaamheid van de behandeling bij SCD-patiënten, het dienen als een biomarker voor nieuwe behandelingsstrategieën, het bestuderen van het ziekende gedrag en het monitoren van het chimerisme na de stamceltransplantatie in SCD.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd deels ondersteund door een Eurostars Grant estar18105 en door een onbeperkte subsidie van RR Mechatronics. De auteurs bedanken Sisto Hendriks en Jan de zoeten voor hun technische ondersteuning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADVIA 120 Hematology Analyzer | Siemens | 067-A004-14 | Instrument |
| Cell-Dyn Sapphire Hematology Analyzer | Abbott | 8H00-01 | Instrument |
| Lorrca | RR Mechatronics | LORC109230 or LORC109110 | Instrument |
| Lorrca Software version V5.08 | RR Mechatronics | - | Software |
| Nitrogen gas 4.8 or 5.0 | Local | - | |
| O2-spot | RR Mechatronics | PO2S020153 | O2 measurement |
| Oxygenscan module (pO2scan) | RR Mechatronics | PO2S109000 | Add-on |
| Oxy-ISO | RR Mechatronics | QRR 030905 | Viscous solution |
| X-Clean | RR Mechatronics | QRR 010946 | Cleaning solution Lorrca |
References
- Clark, M. R., Mohandas, N., Shohet, S. B. Deformability of oxygenated irreversibly sickled cells. Journal of Clinical Investigation. 65 (1), 189-196 (1980).
- Smith, C., Kuettner, J., Tukey, D., White, J. Variable Deformability of Irreversibly Sickled Erythrocytes. Blood. 58 (1), 71-78 (1981).
- Clark, M., Mohandas, N., Embury, S., Lubin, B. A simple laboratory alternative to irreversibly sickled (ISC) counts. Blood. 60 (3), 659-663 (1982).
- DaCosta, L., et al. Diagnostic tool for red blood cell membrane disorders Assessment of a new generation ektacytometer. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 56 (1), 9-22 (2016).
- Rabai, M., et al. Deformability analysis of sickle blood using ektacytometry. Biorheology. 51 (2-3), 159-170 (2014).
- Ballas, S. K., Mohandas, N. Sickle red cell microrheology and sickle blood rheology. Microcirculation. 11 (2), 209-225 (2004).
- Connes, P., Alexy, T., Detterich, J., Romana, M., Hardy-Dessources, M. D., Ballas, S. K. The role of blood rheology in sickle cell disease. Blood Reviews. 30 (2), 111-118 (2015).
- Hierso, R., et al. Effects of oxidative stress on red blood cell rheology in sickle cell patients. British Journal of Haematology. 166 (4), 601-606 (2014).
- Mozar, A., et al. Red blood cell nitric oxide synthase modulates red blood cell deformabilityin sickle cell anemia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (1), 47-53 (2016).
- Clark, M. R., Mohandas, N., Shohet, S. B. Osmotic Gradient Ektacytometry: Comprehensive Characterization of Red Cell Volume and Surface Maintenance. Blood. 61 (5), 899-911 (1983).
- Parrow, N. L., et al. Measurements of red cell deformability and hydration reflect HbF and HbA2in blood from patients with sickle cell anemia. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 65, 41-50 (2017).
- Steinberg, M. H., Chui, D. H. K., Dover, G. J., Sebastiani, P., Alsultan, A. Fetal hemoglobin in sickle cell anemia: A glass half full. Blood. 123 (4), 481-485 (2014).
- Ballas, S. K., Larner, J., Smith, E. D., Surrey, S., Schwartz, E., Rappaport, E. F. Rheologic predictors of the severity of the painful sickle cell crisis. Blood. 72 (4), 1216-1223 (1988).
- Lande, W. M., et al. The Incidence of Painful Crisis in Homozygous Sickle Cell Disease: Correlation with Red Cell Deformability. Blood. 72 (6), 2056-2059 (1988).
- Lemonne, N., et al. Does increased red blood cell deformability raise the risk for osteonecrosis in sickle cell anemia. Blood. 121 (15), 3054-3057 (2013).
- Ballas, S. K., Smith, E. D. Red blood cell changes during the evolution of the sickle cell painful crisis. Blood. 79 (8), 2154-2163 (1992).
- Telen, M. Cellular adhesion and the endothelium: E-selectin, L-selectin, and pan-selectin inhibitors. Hematology/Oncology Clinics of North America. 28 (2), 341-354 (2014).
- Papageorgiou, D. P., et al. Simultaneous polymerization and adhesion under hypoxia in sickle cell disease. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (38), 201807405 (2018).
- Liu, J., Qiang, Y., Alvarez, O., Du, E. Electrical impedance microflow cytometry with oxygen control for detection of sickle cells. Sensors and Actuators, B: Chemical. 255, 2392-2398 (2018).
- Du, E., Diez-Silva, M., Kato, G. J., Dao, M., Suresh, S. Kinetics of sickle cell biorheology and implications for painful vasoocclusive crisis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (5), 1422-1427 (2015).
- Li, Q., et al. Kinetic assay shows that increasing red cell volume could be a treatment for sickle cell disease. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (5), 689-696 (2017).
- Rab, M. A. E., et al. Rapid and reproducible characterization of sickling during automated deoxygenation in sickle cell disease patients. American Journal of Hematology. 94, February 575-584 (2019).
- Renoux, C., et al. Importance of methodological standardization of ektacytometric measures of red blood cell deformability in sickle cell anemia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 62 (2), 173-179 (2016).
- Parrow, N. L., et al. Measuring Deformability and Red Cell Heterogeneity in Blood by Ektacytometry. Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).
- Bessis, M., Feo, C., Jones, E. Quantitation of red cell deformability during progressive deoxygenation and oxygenation in sickling disorders (the use of an automated Ektacytometer). Blood Cells. 8 (1), 17-28 (1982).
- Sorette, M. P., Lavenant, M. G., Clark, M. R. Ektacytometric measurement of sickle cell deformability as a continuous function of oxygen tension. Blood. 67 (6), 1600-1606 (1987).
- Huang, Z., Hearne, L., Irby, C. E., King, S. B., Ballas, S. K., Kim-Shapiro, D. B. Kinetics of increased deformability of deoxygenated sickle cells upon oxygenation. Biophysical journal. 85 (4), 2374-2383 (2003).
- Antoniani, C., et al. Induction of fetal hemoglobin synthesis by CRISPR/Cas9-mediated editing of the human β-globin locus. Blood. 131 (17), 1960-1973 (2018).
- Abdulmalik, O., et al. Crystallographic analysis of human hemoglobin elucidates the structural basis of the potent and dual antisickling activity of pyridyl derivatives of vanillin. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (12), 1076 (2011).
- Oder, E., Safo, M. K., Abdulmalik, O., Kato, G. J., Discovery, D. New Developments in Anti-Sickling Agents: Can Drugs Directly Prevent the Polymerization of Sickle Haemoglobin In Vivo. British Journal of Haematology. 175 (1), 24-30 (2016).
- Oksenberg, D., et al. GBT440 increases haemoglobin oxygen affinity, reduces sickling and prolongs RBC half-life in a murine model of sickle cell disease. British Journal of Haematology. 175 (1), 141-153 (2016).
- Xu, G. G., et al. Synthesis, and Biological Evaluation of Ester and Ether Derivatives of Antisickling Agent 5-HMF for the Treatment of Sickle Cell Disease. Molecular Pharmaceutics. 14 (10), 3499-3511 (2017).
