Summary
ここでは、酸素勾配エクタキトメトリー、制御脱酸素及び再酸素化下の鎌状赤血球疾患患者からの試料中の赤血球変形性を測定する迅速かつ再現性のある方法を提示する。この技術は、赤血球病欠を研究し、鎌状赤血球疾患の治療有効性を監視する方法を提供する。
Abstract
鎌状赤血球病(SCD)では、β-グロビンをコードする遺伝子における単一点突然変異が異常ヘモグロビンS(HbS)の産生を引き起こす。脱酸素されると、HbSは重合することができ、ヘモグロビンの硬い棒を形成し、赤血球(RBC)の鎌状赤血球をもたらす。これらの鎌状のRBCは変形性を著しく低下させ、血管閉塞を引き起こし、痛み、脳卒中、臓器損傷を含む多数のSCD関連の臨床合併症を引き起こす。RBC変形はRBC脱水によっても減少し、鎌を病する可能性が高い緻密な赤血球をもたらす。現在までに、疾患の重症度を予測したり、新規な非胎児ヘモグロビン誘導療法の治療効果を直接監視したりできる、広く利用可能で迅速かつ再現可能な実験室アッセイは1つもない。本研究では、SCD患者における病欠行動の定量を可能にするpO2の関数としてRBC変形性を測定するプロトコルを説明する。酸素勾配エクタキトメトリーはRBC変形性を測定し、伸長指数(EI)として表し、pO2の関数として表す。RBCは、脱酸素および再酸素化の1ラウンド中に30Paの固定せん断応力にさらされる。6 つの読み出しパラメーターが生成されます。このうち、最大EI(EImax)が5%の減少を示すpO2として定義される病欠(PoS)は、脱酸素中の最小EI(EImin)が最も有益であり、個々の患者のpO2を反映しています。病欠が始まり、患者の赤血球の最小限の変形性がそれぞれ始まる。PoSは酸素に対する個々の患者のヘモグロビン親和性に関連し、EIminは胎児ヘモグロビンレベルと強い相関関係を示す。我々は、酸素勾配エクタキトメトリーは、臨床および前臨床試験における抗病弱剤のバイオマーカーとして、SCD患者の治療を監視する有望な技術であり、RBCの病欠行動を研究するための重要なツールであると結論付ける。SCDと鎌状赤血球の形質を持つ個人.
Introduction
SCDでは、単一点突然変異はHbSの産生をもたらし、脱酸素時に重合することができる。HbS重合はRBCの病気を引き起こし、RBCの変形性を低下させる。内皮へのRBC病欠とRBCの付着の組み合わせは、血管閉塞性危機(VOC)、脳卒中、臓器損傷、および慢性血栓性貧血を含む様々なSCD合併症につながる。ノルモキシック条件でも、RbC変形性はSCD患者において損なわれる。低酸素濃度では変形性がさらに低下する。ノルモクシアでの変形性を決定する主要なプレーヤーは、緻密な細胞、不可逆的に病んだ細胞(ISC)、および脱水細胞であり、そのすべてが表面対体積比1、2、3の減少を有する。
エクタキトメトリーは、RBC変形性を測定する確立された方法であり、遺伝性血栓性麻酔薬、特にメムブラノ症4の診断に広く用いられている。また、ヘモロジー5、6、7、8、9を研究するために使用することができます。浸透図勾配エクタキトメトリーは、浸透モスラリティの連続的な変化の間にRBC変形性が測定され、10年10、11年以上にわたってSCDを研究するために使用されてきた。胎児ヘモグロビン(HbF)のパーセンテージは、HbFおよびその混合ハイブリッド四量体(△2βSγ)がデオキシHbSポリマー相12に入ることができないため、HbS重合の最も強い阻害剤の1つである。最近の研究は、SCD患者におけるHbFレベルの増加が、より良い表面対体積比につながり、それによって水和状態を改善し、したがって非トランスフューズされた患者11における変形性を示唆している。
RBC変形性は、SCD合併症のバイオマーカーとして過去に研究されてきたが、相反する結果を有する。断面的かつ安定した状態で行われた研究において、RBC変形性の高いレベルを有する個体は、骨壊死の発生率が高く、より多くの疼痛危機13、14、15を有することが判明した。これらの知見とは対照的に、急性VOC中の定常状態値と比較すると、RBC変形性は同一個体内の縦方向の研究において減少した16.この不一致は、異なる条件下(すなわち、定常状態対VOCの間)でRBC変形性を研究した結果である可能性がある。鎌状赤血球の割合はVOCの開始時に高く、危機が進むにつれて細胞は急速に破壊され、VOC中に得られた定常状態の断面発生データと縦方向のデータの違いを説明する可能性があります。しかしながら、内皮表面へのRBC部分集団の付着などの他の要因も、VOCの発生において重要であり得る。SCDでは、脱酸素中の変形性を測定することがより臨床的に関連しており、血管閉塞は典型的には低酸素後毛細血管静脈で起こり、低酸素性微小毛細管ネットワーク17では起こらない。さらに、ISCの存在は、ノルモクシアでの変形性を測定するエクタキトメーターの能力を変更する可能性があります。回折パターンの歪みは ISC によって引き起こされ、フロー1、2、3の間の非線形が原因です。
VOCの病態生理学を研究するための代替アプローチには、人工表面18へのRBC付着の測定、単一セル電気インピーダンスマイクロフローサイトメトリー19、定量を組み合わせたマイクロ流体ベースモデルが含まれる。単一細胞リヒロジー20との細胞病欠および非病欠の測定、およびレーザー誘導重合21。有望ですが、これらの技術はコストがかかり、労働集約的であり、広範なオペレータトレーニングを必要とします。また、形態に基づくアッセイには、酸素勾配の関数として、変形性などの細胞挙動を研究する能力が欠けている。
本研究では、エクタキトメータで行われる迅速かつ再現性の高い機能アッセイについて述べている。脱酸素時(1,300s)および迅速な再酸素化(280s)の間にEIとして表されるRBC変形性の異なる質的側面を測定する次世代エクタキトメトリー測定です。これらの時間間隔は、HbSポリマー形成を可能にし、それによって形態学的変化の発生および回復を可能にする。脱酸素は、エクタキトメーターのボブとカップの間の隙間で血液サンプル中の酸素張力をゆっくりと低下させる窒素ガスを導入することによって起こる。RBC変形性は、カップの壁に存在する小さなO2スポットによって酸素張力を20sごとに測定しながら連続的に測定されます。試験中、約80pO2測定がその時点で測定されたEIに結合されます。酸素圧力は脱酸素中に20mmHg以下に低下し、再酸素化は周囲の空気の受動的拡散によって促進される。エクタキトメータおよび酸素勾配エクタキ測定モジュールの実験的セットアップを図1および図2に記載する。エクタキトメトリーの原理は、レーザー光からの光のRBC誘発散乱に基づいています。この結果、せん断応力を同時に適用すると楕円回パターンが発生します(図1)。
Protocol
すべての手順は、大学医療センターユトレヒト(UMCU)の倫理委員会によって承認され、ヘルシンキ宣言に従って.テキサス小児血液学センター(TCHC)に在籍する患者は、現地のIRBによって承認され、ヘルシンキ宣言に従って承認されました。
1. 一般的な考慮事項
- まず、ボブとカップを温めるためにテスト測定を行います。ボブとカップの温度が37°Cであることを確認します。これは、再現性を高める上で重要です。
- 粘性ポリビニルピロリドン(PVP)溶液が浸透性(282~286mOsm/kg)、pH(7.35~7.45)、粘度(27.5~32.5 MPa)の室温(22°C)の厳しい範囲内に収まるようにしてください。
メモ:PVPは室温で使用する必要があります。より低い温度で保存する場合は、測定を行う前に室温まで温まされていることを確認してください。
2. エクタキトメーターの立ち上げ
- コンピュータと背面からエクタキトメーターの電源を入れます。コンピュータでソフトウェア プログラム (材料テーブル)を起動します。
- 窒素シリンダーを開いて、窒素が試料を脱酸素できることを確認します。
- カップのボブを下げ、カップが自由に回ることができることを確認します。破片がEI測定を妨げる可能性があるため、柔らかい布と蒸留水で内側と外側のカップを清掃してください。
- ソフトウェア プログラムが実行されている場合は、画面に次のメッセージが表示されていることを確認します。
- エクタキトメーターが、画面に表示されるpO2セルフチェックプロセスを開始することを確認します。[開始]を選択し(次のように入力します)。失敗した場合は、[ハードウェアチェック|pO2 |セルフチェック.
メモ:セルフチェックが再び失敗した場合は、O2-spotを交換することを検討してください。O2-spotは、指先でカップの内側からスポットをそっと押し出すことによって置き換えられます。外からカップにそっとスポットを押し込むことで、新しいスポットが配置されます。 - 左側に表示されているさまざまなテストからpO2スキャンを選択します。画面の右側にある[設定]を選択し、表 1に示すパラメータに従って設定されていることを確認します。すべての測定に同じ設定を保持します。
- これらの設定を保存するには、[OK] をクリックしてください。OK.
注: 推奨設定は表 1に示されていますが、ユーザーの好みや調査目的に応じて調整できます。例えば、病病の挙動をより広範囲に研究するために、脱酸素速度および持続時間を変更することができる。
3. サンプルの収集と準備
注:技術の検証のために、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)治療された血液38人のSCD患者と5つの健康なコントロールは、大学医療センターユトレヒトまたはテキサス小児血液学センターに含まれ、異なる臨床研究で(オランダ試験レジストリ[NTR]識別子、NTR 6779およびNTR 6462)ならびに外来診療所を訪問した患者または入院した患者からの匿名化された残った血液サンプルが使用された。
- EDTAを含むチューブ内の静脈穿刺(最低300μL/サンプル)で血液サンプルを採取します。血液が4°Cで少なくとも30分間保存されているが、24時間以内に保存されていることを確認してください。
注:クエン酸リン酸デキストロースアデニン(CPDA)またはヘパリンも使用できますが、酸素勾配エクタキトメトリーに関する試料保存に対するこれらの試薬の影響は知られていません。 - 均質化する反転によってサンプルを穏やかに混合する。サンプルを振らないで下します。測定前にローラーベンチの室温まで温めます。
注:4°Cで1時間以上保存されているサンプルチューブ(9~10 mL)は、15分間ウォームアップする必要があります。4°Cで1時間未満で保存する場合は、10分間ウォームアップする必要があります。4°Cで1時間以上保存されているサンプルチューブ(2~6mL)は、10分間ウォームアップする必要があります。4°Cで1時間未満で保存する場合は、5分間ウォームアップする必要があります。 - 血液分析装置の完全な血液数を測定する。これを行うには、EDTAを含むチューブに20〜200°Lの全血を取ります。吸引針をチューブに入れ、血液分析装置の針の後ろのボタンを押して測定を開始します。
注:完全な血液数では、RBC数が測定され、酸素勾配エクタキトメトリー測定を標準化するための重要な因子です。RBCカウントは、フローサイトメトリーによって前後散乱から計算される。正常なコントロールの通常の RBC 数は、女性の場合は 3.7 ~ 5.0 x 1012/L、男性の場合は 4.2 ~ 5.5 x10 12/L です。SCDを有する患者におけるRBC数は一般に減少する。一部の血液分析装置はまた、個々の酸素勾配エクタキトメトリー曲線の解釈において付加価値のある%高密度赤血球(%DRBC)を測定する。 - 追加するサンプルの体積を調整して、5 mL PVP (200 x 106 RBC/バイアル) で 200 x 106 RBC の RBC カウントに全血サンプルを標準化します。RBC の合計数が 200 x 106未満の場合、回折パターンと EI が影響を受けます。
- カウントを実行するには、次の式を使用します。
4.0/xx (x 1012/L) x 50 = yy μL 全血/バイアル PVP
ここで、xx はステップ 3.3 から得られた計算された RBC カウントで、yy は実際の測定に必要な全血の量です。貧血の等級およびRBCカウントに影響を与える他の要因に応じて、必要な全血の量は40〜90°Lである。
- カウントを実行するには、次の式を使用します。
4. 酸素勾配エクタキトメトリー測定
- 算出したサンプル体積(血のyyμL)をPVPにピペットし、総体積5mLを得た。血液3xを穏やかに再差し止めることで先端を前置きする。RBCに追加のストレスを避けるために、広い開口部を持つピペットチップを使用してください。
メモ:空気の接触を避けるために、できるだけ短い時間のためにPVPバイアルを開きます。 - ゆっくりと針なしで3 mLの注射器に血液/PVP混合物の2.0 mLを引きます。プランジャーを押して、目に見える気泡を取り除き、1.5~1.8 mL がシリンジに残るまで(カップの体積によって異なります)。
- コネクタを介してボブにサンプルボリュームの合計をゆっくりと均等に注入します。サンプルのレベルが酸素センサー(ピンクスポット)の上と小さな吸引穴の上であることを確認します。サンプル溶液を注射器に入れないでください。
- [新規]をクリックし、サンプル識別子、備考、寄付日、PVP の粘度を入力します。[OK] をクリックし、[OK] をクリック吸引.60sの後、カップは回転し、15 sのサンプルを吸引します。 マシンのふたを閉じます。[続行]をクリックし、[続行] をクリック酸素勾配エクタキトメトリーは固定ゲインで行われるので、今すぐ開始してください。測定には約28分かかります。
- 測定後、ソフトウェアによって自動的に計算される曲線とパラメータを示すレポートを印刷します。生データが[設定]の指定したフォルダに自動的に保存されるようにします。最大 EI (EI最大)、最小 EI (EImin)、pO2@95%EI (PoS)、および面積 (曲線の下の領域) が自動的に計算され、印刷されたレポートと生データに追加されます。
- EImaxと EI最小の差を計算して、手動で ΔEI を取得します。脱酸素前の平均EI(pO2 100~120 mmHg)と100~120mmHgでの再酸素化時のEI値の差を取って、回収率を計算します。
5. エクタキトメーターの洗浄
- サンプルシリンジを取り出し、蒸留水または脱イオン水で満たされた注射器に交換します。
- [クリーン]を押し、すり取り中にコネクタをゆっくりとフラッシュします。両方向にフラッシュしてください。
- 注射器を取り外し、ボブを持ち上げます。柔らかい布でボブ、カップ、コネクタを十分に乾かします。
- チューブとボブに残っている水を取り除くために、大きなシリンジ(10~50 mL)を使用してコネクタをフラッシュします。ボブの下入口/出口をふさいでチューブ内の圧力を取り戻し、残りの水を除去します。
- カップのボブを下ろします。これで、機械は次の測定の準備が整いました。
6. マシンのシャットダウン
- 上記のように、最後の測定後に機械が正しくすすがっていることを確認します。適切なチューブが洗浄液に関連していることを確認します。
- ソフトウェアを閉じて閉じ、[開始]を押して、終用のクリーニング プログラムを開始します。
- クリーニングプログラム全体を完了したら、注射器を取り外し、ボブを持ち上げます。コネクタを大きなシリンジで洗い流します。
- 廃棄物ボトルを空にし、柔らかい布でボブとカップを乾燥させます。チューブとボブに残っている水を取り除くためにコネクタをフラッシュします。ボブの下入口/出口をふさいでチューブ内の圧力を取り戻し、残りの水を取り除きます。
- 機械のふたを閉じます。窒素シリンダーを閉じます。コンピュータとコンピュータの電源を切ります。
Representative Results
酸素勾配エクタキトメトリーは、SCDを有する患者における病欠行動を特徴付けるために使用することができる。本研究では、合計38人のSCD患者と5人の健康なコントロールからの血液サンプルが含まれていた。健全なコントロールでは、回折パターンは、より高いせん断応力4で休息時と楕円形です。楕円回数パターンから、伸び指数(EI)は回折パターンの高さと幅に基づいて計算されます。酸素勾配エクタキトメトリーでは、窒素ガスによる試料のゆっくりと連続的な脱酸素が続き、周囲の空気による迅速な再酸素化が続く。これらの条件下では、RBC病欠は脱酸素下で観察することができる。これは、病気の赤い細胞が適用されたせん断応力の下で適切に整列しないため、回折パターンの歪みを引き起こします。したがって、正常なRBCとは対照的に、変形性が低いように見えます(図2)。
図3Aは、酸素勾配エクタキトメトリー中に条件を模倣した脱酸素時に鎌RBCがどのように形が変化するかを示す一方、脱酸素を伴わずに鎌状赤血球RBCは形状に変化を示さない。このプロセスは、酸素勾配エクタキトメトリー中の回折パターンの歪みをもたらし、したがって、EIの減少をもたらす。図3Bは、異なるパラメータが生成されるさまざまな回折パターンを示しています。
エクタキトメータによって得られた代表的な曲線を図3Cに示す。6つのパラメータは、RBCの病弱挙動作の異なる特性を反映する:EImaxは脱酸素前の測定開始時の最大EIである。このパラメータは、ベースライン位置を表し、周囲の空気における総 RBC 母集団の全体的な変形性を反映します。EIminは、脱酸素後の最小限の変形性を表す最小EIです。このパラメータは、脱酸素時の(鎌状赤血球)RBCの形状と向きの変化を反映します。ΔEIは、EImaxとEIminの差で、1ラウンドの脱酸素中に鎌を病むことができる細胞の数を示します。5% 鎌状赤面の点 (PoS5%) は、脱酸素中の EImaxの 5% 減少を測定する pO2 (mmHg) です。これは、病病プロセスが開始される酸素張力を表します。面積は曲線の下の面積を反映し、100 mmHg と pO2分 (mmHg) の間の EI および pO2測定値の積分計算によって決定されます。これは、前述のパラメータ EImax、EImin、および PoS の結果であり、リカバリは、ベースラインでの EI と比較した再酸素化の最終部分における EI の差を表します。両方の EI 値は、100 ~ 120 mmHg の pO2で測定されます。このパラメータは、脱酸素中に病欠して再酸素化22中に病欠するRBCの容量を反映する。重複した測定値のパラメータは、一般に変動係数(CV)<5%(中央値1.83%)を有していました。CV>5%が得られた場合には、第3の測定を行った。パラメータEI最大とリカバリは、中央値CV <1%で最も再現可能です。
健康なコントロールのRBCの代表的な曲線、HbS形質(ヘテロ接合HbS)を有する患者、およびホモ接合SCD患者を図4Aに示す。HbSC患者の代表的な曲線は、より低い回復を示し、これは異なる病欠プロセスを示す可能性がある(図4B)。ヒドロキシ尿素(HU)および輸血で治療されたHbSS患者の代表的な曲線を図4Cおよび図4Dに示す。明らかに、輸血で治療されたHbSS患者のHS形質(HbAS細胞)とRBCの代表的な曲線(ホモ接合鎌(HbSS)とホモ接合正常(HbAA)細胞の混合物からなる、図4Aの間に大きな違いがある、D)。未治療のSCD患者とHUおよび輸血治療患者の曲線の明確な違いは、このアッセイの有用性を強調する(図4C、D)。HbFおよびHbSのレベルはEI最小と有意に相関し、より少ない程度ではPoSと相関している(図5A-D)。これは、患者の評価に重要な実験室パラメータが酸素勾配エクタキトメトリーにも反映されることを示す。ノルモクシアの鎌状赤血球の数と高密度RBC(DRBC)の割合は、EImax値が有意に相関しているため(図5E–F)、EImaxがEImaxの別の重要な要因を反映していることを示すEImax値に影響を与えます。病気のプロセス。これらの結果は、このような異なる特性が%HbS、%HbF、ノルモクシアの鎌状赤血球、および%DRBCが異なるパラメータにどのように影響するかを示しています。
図 1.エクタキトメーターの概略設定。エクタキトメーターは、細胞にせん断応力を適用するためにクーエットシステムを使用しています。回転外筒(カップ)と静的内筒(ボブ)は、37°Cで層流を作成することによりせん断応力を誘発するために使用されます。ボブとカップの間には、血液懸濁液が注入される小さな隙間がある。レーザービームは、血液懸濁液を通してボブから輝き、RBCの存在によって散乱される。回折パターンはカメラで投影され、解析されます。伸び指数(EI)は、回折パターン4の高さ(a)と幅(b)で計算される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.酸素勾配エクタキトメトリーモジュールを用いたエクタキトメーターの概略セットアップ。窒素ガスの注入に伴ってゆっくりと血液懸濁液の脱酸素を示すモジュールの概略図(N2)。酸素張力は、LEDファイバからO2スポットに送られたルミノフォア信号の焼入れ量によって測定される。脱酸素すると鎌RBCは鎌状になり始め、変形性は低下し、楕円形RBCと整列しなくなります。病弱のRBCは回折パターンを歪め、楕円から菱形またはダイヤモンドのような形状に形状を変えます。この回折パターンの形状の変化は、EIの減少をもたらす。pO2とEIの測定は、カップ内の同じ高さで行われません。これは脱酸素および再酸素化曲線の間のよりよい差別を保障し、したがって、曲線のよりよい解釈を保障する。この図は Rab et al.22から変更されています この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.代表的な酸素勾配エクタキトメトリー曲線および回折パターン。(A)酸素勾配エクタキトメトリーと同様の条件下で脱酸素した場合、鎌状赤血球RBCを固定した。コントロール鎌RbCでは、窒素ガスなしで同じ条件が使用されました。脱酸素鎌状赤血球RBCは、脱酸素およびせん断応力(30Pa)の制御RBCとは対照的に形状の変化を示し、回折パターンは楕円から菱形に変化する。(C)酸素勾配エクタキトメトリーの代表的な曲線。最大伸び指数 (EImax)はベースライン位置を表し、総 RBC 母集団の全体的な変形性を示します。最小 EI (EImin)は、脱酸素時の RBC の形状と向きの変化によって引き起こされる最小限の変形性を表します。ΔEI(dEI、EImaxとEIminのEIの差)は、脱酸素の1ラウンド中に鎌を病むことができる細胞の数を示す。鎌状のポイント(PoS、5%EI減少時のpO2)は、最初のRBCが鎌をし始めるときの酸素張力を示す。曲線の下の面積(pO2min = 100 mmHg から)は、パラメータ領域で計算されます。これは、EIの最大値、EI最小、および PoS をまとめたものです。再酸素化中に鎌を取り消す鎌状赤血球の容量は、パラメータRecovery(再酸素化中に到達したEI最大の割合)で表される。解釈を支援するために、すべてのデータポイントは、結果をグラフィカルに表示するために、ラインによって個々の実験で接続されました。この図は Rab et al.22から変更されています この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.酸素勾配エクタキトメトリーパラメータは、SCD患者の遺伝子型および治療レジメンと相関する。(A)未治療のHbSS患者に関するHbSキャリア(HbS特性)および健全なコントロールのRBCの代表的なグラフ。(B)未治療のHbSS患者に関連するヘモグロビンSC疾患(HbSC)患者のRBCの代表グラフ。(C)未治療のHbSS患者に関連してホモ接合SCD患者(HbSS HU)を治療したヒドロキシ尿素のRBCの代表的なグラフ。(D)未治療のHbSS患者に対して輸血(HbSS輸血)で治療したHbSS患者のRBCの代表的なグラフ。この図は Rab et al.22から変更されています この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5.酸素勾配エクタキトメトリーパラメータは、ノルモクシアおよび%高密度RBCで%HbF、%HbS、%シック細胞に関連付けられています。(A)輸血のない15HbSSまたはHbS/β-サラセミア患者の最小伸長指数(EI分)と%HbFの線形相関。(B) EIminと %HbS の線形相関 (C) PoS と %HbF の線形相関 (D) PoS と %HbS の線形相関 (E) 最大 EI の線形相関 (EImax)および鎌状細胞の割合ノルモキシアは、デジタル顕微鏡で測定した。(F)HbSS患者21名のEI最大値と割合密度RbC(%DRBC)の線形相関。この図は Rab et al.22から変更されています この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 設定 | ||
| ファイル | ストレージ ディレクトリ | |
| 一般的なオプション | 既定の中粘度 | PVPの粘度 |
| pO2 スキャン | 最小吸引時間 (s) | 60 |
| pO2 スキャンせん断応力(Pa) | 30 | |
| pO2 を毎回決定する (S) | 20 | |
| 移動平均サイズ | 2 | |
| pO2 スキャン ステップ;編集 | 0 -オフ;60 -オン;1360 –オフ;1640 -オフ | |
| カル間面積 (mmHg) | 10 および 100 | |
| pO2制御 | オフ (オフ) |
表 1.エクタキトメータの好ましい設定。
Discussion
ここでは、酸素勾配エクタキトメトリー、酸素濃度の範囲下でSCD患者からの赤血球の病欠挙挙行動を研究するために使用できる方法を説明する(図4および図5)。再現性のある結果を得るためには、結果に影響を与える要因を特定することが重要です。例えば、温度はRBC変形性に大きな影響を与えますが、主に粘性溶液(PVP)の厚さに及ぼす影響によるものです。機械を37°Cに徹底的に加熱するには、1日の開始時に試験測定を行うことをお勧めします。これにより、結果の再現性が向上します。粘性溶液の浸透性は狭い範囲(PVPの場合は282~286 mOsm/kg)内にある必要があります。PVPのpHと粘度も厳しく調整する必要があります。pHと温度の違いは、曲線に劇的に影響を与えることができます22.さらに、カップ、ボブ、チューブ内の残りの水は、RBCのリシスを引き起こす可能性があり、それによって、カップ内に存在する無傷のRBCが少なく測定されるため、誤ったデータをもたらす。
酸素勾配エクタキトメトリーを実行するための設定は、特定の調査の質問に対処するために調整することができます。推奨される設定を表 1に示します。脱酸素の延長は、ほとんどの患者のために低いEI分をもたらさなかったことを示す観察に基づいて1,300sの脱酸素時間が選択された。対照的に、脱酸素時間の短縮は、酸素勾配エクタキトメトリーの判別力を妨げるであろう。再酸素化時間は、再酸素化時にHbSポリマーを急速に解決し、脱酸素前に測定された値に対するEIの併用回復のために280sに設定した。せん断応力は30Paに設定され、これは浸透勾配エクタキトメトリーに似ています。このパラメータを下げると、判別力が妨げられる可能性があります。脱酸素制御は、脱酸素速度のセットがすべての患者サンプルに適用される場合に使用することができる。我々の好ましい設定では、脱酸素の速度は独特なヘモグロビン解離曲線による患者特異的であるため、このオプションはオフになった。したがって、脱酸素制御をオンに切り替えると、アッセイからこの特性が排除されます。しかし、酸素勾配エクタキトメトリーのこの特徴はまだ調査中である。
いくつかのよく知られた因子は、酸素勾配エクタキトメトリーパラメータ、すなわちpH、温度、および浸透圧に影響を与えます。エクタキトメトリー、特にPoSは、2,3-ジホスホグリセリン酸(2,3-DPG)22の影響を受ける。また、%HbFとEIminとの間には明確な相関関係があり、PoSの程度は低い(図5A–D)。EImaxはノルモキシアの鎌状赤血球に関連しており、VOCの直後にノルモクシア(EImax)でRBC変形性が高いという観察を説明できる。後者は、最も鎌状の細胞の破壊によって引き起こされ、したがってVOC16の間に変形性の低いRBC.図 5Fに示すように、より高い %高密度 RBC (ヘモグロビン濃度を持つ RBC として定義されている >1.11 mg/mL) は、より低い EImaxと強く相関します。これは、緻密な細胞がノルモクシアにおけるRBC変形性において重要な因子であることを示し、以前に報告された結果1と同様である。
サンプルの標準化は、再現性の高い結果を得るために、および異なる遺伝子型と治療を区別するために非常に重要です。RBC の数が回折パターンの強度に影響を与えるため、RBC カウントの補正は重要です。ボブとカップの間のギャップに低いRBC番号が存在する場合、曲線は上方および左にシフトします。さらに、曲線は変動し、パラメータ、特にPoSの正確な計算を妨げる。
この手法の制限は、EI 値が異なる部分母集団を含むすべてのセルの平均を表すことです。SCD患者におけるRBC集団の不均一性とエクタキ測定への影響が集中的に研究されている。その結果、回折パターンのサイズがRBCカウント23、24に対して補正されるのではなく、固定値に調整されるという標準化が生じた。この標準化方法を酸素勾配エクタキ測定測定にも適用すべきかどうかは、現在検討中である。
低酸素条件下でRBC変形性を測定するいくつかの技術は、エクタキトメータ25、26、27の外で行われた脱酸素ステップに基づいて開発された。これらの条件下では、HbS形質を有する患者と生理学的pH25下での健全なコントロールとの間で細胞行動の違いは認められなかった。しかし、酸素勾配エクタキトメトリーは、HbS形質を有する個体においては、低いが明らかなPoSを明らかに示している(図4A)。現在までに、日常的な臨床現場では、個々の患者のRBCがインビトロで鎌状赤血球に対する傾向を測定する唯一の代替方法には、形態ベースの病病アッセイが含まれます:RBCは、HbS重合を促進する条件下でインキュベートされます。低酸素張力または低pH。固定剤はインキュベーション後に添加され、鎌状細胞の割合は光顕微鏡を用いて手動またはデジタルでカウントされます。多くの前期薬理学的試験は、SCD 28、29、30、31の臨床有効性を予測することができる二次的な結果変数を生成するために鎌状赤面アッセイを使用する、32.しかし、時間がかかり、ばらつきが高く感度が低く、技術は自動化されず、したがって、労働集約的である。また、鎌による形態学的変化は、RBC変形性などの生理学的パラメータとうまく相関しない場合があり、それは2次元静的アッセイ2である。
酸素勾配エクタキトメトリーは、迅速かつ再現可能なシリングの機能的アッセイを提供します。これは、内皮表面を考慮しないインビトロ試験です。しかし、それは鎌状赤血球研究のための有望な技術を作る鎌状赤血球の行動およびRBC特性の機能的側面を提供する。この技術の将来の応用には、SCD患者における治療効果のモニタリング、新しい治療戦略のバイオマーカーとしての役割、病欠行動の研究、SCDにおける幹細胞移植後のキメラリズムのモニタリングなどが含まれる。
Disclosures
著者らは競合する財政的利益を宣言しない。
Acknowledgments
この作品は、ユーロスターズの助成金estar18105とRRメカトロニクスが提供する無制限の助成金によって部分的にサポートされました。著者たちは、シスト・ヘンドリックスとヤン・デ・ゾエテンの技術サポートに感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADVIA 120 Hematology Analyzer | Siemens | 067-A004-14 | Instrument |
| Cell-Dyn Sapphire Hematology Analyzer | Abbott | 8H00-01 | Instrument |
| Lorrca | RR Mechatronics | LORC109230 or LORC109110 | Instrument |
| Lorrca Software version V5.08 | RR Mechatronics | - | Software |
| Nitrogen gas 4.8 or 5.0 | Local | - | |
| O2-spot | RR Mechatronics | PO2S020153 | O2 measurement |
| Oxygenscan module (pO2scan) | RR Mechatronics | PO2S109000 | Add-on |
| Oxy-ISO | RR Mechatronics | QRR 030905 | Viscous solution |
| X-Clean | RR Mechatronics | QRR 010946 | Cleaning solution Lorrca |
References
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