Summary
Aquí, presentamos ektacytometry de gradiente de oxígeno, un método rápido y reproducible para medir la deformabilidad de los glóbulos rojos en muestras de pacientes con enfermedad de células falciformes bajo desoxigenación controlada y reoxigenación. Esta técnica proporciona una manera de estudiar la enfermedad de los glóbulos rojos y controlar la eficacia del tratamiento de la enfermedad de células falciformes.
Abstract
En la enfermedad de células falciformes (SCD), una mutación de un solo punto en la codificación genética de la betaglobina provoca la producción de hemoglobina S anormal (HbS). Cuando se desoxigena, HbS puede polimerizarse, formando varillas rígidas de hemoglobina, lo que resulta en la homiza de los glóbulos rojos (RBR). Estos glóbulos rojos enfermos han reducido significativamente la deformabilidad, causando vaso-oclusión, lo que conduce a numerosas complicaciones clínicas relacionadas con la SCD, incluyendo dolor, accidente cerebrovascular, y daño a los órganos. La deformabilidad del RBC también se reduce por la deshidratación del RBC, lo que resulta en glóbulos rojos densos que son más propensos a la hoz. Hasta la fecha, no existe un solo ensayo de laboratorio ampliamente disponible, rápido y reproducible capaz de predecir la gravedad de la enfermedad o monitorear directamente los efectos del tratamiento de nuevas terapias inductoras de hemoglobina no fetal. En este estudio, describimos un protocolo para medir la deformabilidad de RBC en función de pO2 que permite la cuantificación del comportamiento enfermizo en pacientes con SCD. La ektacytometría de gradiente de oxígeno mide la deformabilidad del RBC, expresada como el índice de alargamiento (EI), en función de pO2. Los glóbulos rojos están expuestos a una tensión de cizallamiento fija de 30 Pa durante una ronda de desoxigenación y reoxigenación. Se producen seis parámetros de lectura. De ellos, el punto de enfermedad (PoS), definido como la pO2 en la que el EI máximo (EImax)muestra una disminución del 5%, y el EI mínimo durante la desoxigenación (EImin) son los más informativos, reflejando lap/s p 2 de un paciente individual en la que comienza la enfermiza y la mínima deformabilidad de los glóbulos rojos de un paciente, respectivamente. PoS se asocia con la afinidad de hemoglobina de un paciente individual por el oxígeno, mientras que EImin muestra una fuerte correlación con los niveles de hemoglobina fetal. Concluimos que la ektacytometría de gradiente de oxígeno es una técnica prometedora para monitorear el tratamiento de pacientes con SCD, como biomarcador de agentes anti-enfermos en ensayos clínicos y preclínicos, y una herramienta importante para estudiar el comportamiento enfermizo de los glóbulos rojos individuos con SCD y rasgos celulares de hoz.
Introduction
En la SCD, una mutación de un solo punto resulta en la producción de HbS, que puede polimerizarse tras la desoxigenación. La polimerización de HbS causa la enfermedad de los glóbulos rojos y reduce la deformabilidad del RBC. La combinación de la enfermedad de RBC y la adherencia del RBC al endotelio conduce a varias complicaciones de la SCD, incluyendo crisis vaso-oclusivas (COV), accidente cerebrovascular, daño a los órganos, y anemia hemolítica crónica. Incluso en condiciones normoxic, la deformabilidad del RBC se ve comprometida en pacientes con SCD. La deformabilidad se reduce aún más a bajas concentraciones de oxígeno. Los actores clave que determinan la deformabilidad en normoxia son las células densas, las células enfermas irreversiblemente (ISC) y las células deshidratadas, todas las cuales tienen una relación superficie-volumen disminuida1,2,3.
La ektacittometría es un método establecido para medir la deformidad del RBC, ampliamente utilizado para el diagnóstico de anemias hemolíticas hereditarias, particularmente membranopatías4. También se puede utilizar para estudiar hemorreología5,6,7,8,9. La ektacytometría de gradiente osmótico, en la que la deformabilidad del RBC se mide durante un cambio continuo en la osmolalidad, se ha utilizado para estudiar SCD durante más de una década10,11. El porcentaje de hemoglobina fetal (HbF) es uno de los inhibidores más fuertes de la polimerización de HbS, ya que ni el HbF ni su tetramero híbrido mixto (2o) pueden entrar en la fase de polímero desoxiHbS12. Estudios recientes sugieren que el aumento de los niveles de HbF en pacientes con SCD conduce a una mejor relación superficie-volumen, mejorando así el estado de hidratación y, por lo tanto, la deformabilidad en pacientes no transfundidos11.
La deformabilidad del RBC se ha estudiado en el pasado como un biomarcador para complicaciones de la SCD, pero con resultados contradictorios. En estudios realizados transversalmente y en estado estacionario, se encontró que los individuos con mayores niveles de deformabilidad del RBC tenían una mayor incidencia de osteonecrosis y más crisis de dolor13,14,15. En contraste con estos hallazgos, en comparación con los valores de estado estacionario durante un COV agudo, la deformabilidad de RBC se redujo en estudios longitudinales dentro de los mismos individuos16. Esta discrepancia puede ser el resultado del estudio de la deformabilidad del RBC en diferentes condiciones (es decir, durante el estado estacionario frente al COV). El porcentaje de células enfermas es alto al inicio de un COV y las células se destruyen rápidamente a medida que avanza la crisis, lo que puede explicar la diferencia entre los datos de incidencia transversal en estado estacionario y los datos longitudinales obtenidos durante el COV. Sin embargo, otros factores, como la adherencia de las subpoblaciones de RBC a la superficie endotelial, también pueden ser importantes en la aparición de COV. En sCD, es más clínicamente relevante medir la deformabilidad durante la desoxigenación, ya que la vaso-oclusión se produce típicamente en los venulos postcapilares hipóxicos y no en la red microcapilar menos hipóxica17. Además, la presencia de ISC puede alterar la capacidad de un ektacitómetro para medir la deformabilidad en normoxia. La distorsión del patrón de difracción es causada por ISC, que resulta de la no alineación durante el flujo1,2,3.
Los enfoques alternativos para estudiar la fisiopatología del COV incluyen mediciones de la adherencia del RBC a una superficie artificial18,citometría de microflujo de impedancia eléctrica de una sola célula19,modelos basados en microfluidos que combinan modelos cuantitativos mediciones de la enfermedad celular y desafiado con reología de una sola célula20,y polimerización inducida por láser21. Aunque prometedoras, estas técnicas son costosas, intensivas en mano de obra y requieren una amplia capacitación de los operadores. Además, los ensayos basados en morfología carecen de la capacidad de estudiar el comportamiento celular, como la deformabilidad, en función de un gradiente de oxígeno.
En este estudio, describimos un ensayo funcional rápido y reproducible realizado con un ektacitómetro. Se trata de una medición de ektacytometry de próxima generación que mide los diferentes aspectos cualitativos de la deformabilidad de RBC expresados como EI durante la desoxigenación (1.300 s) y la reoxigenación rápida (280 s). Estos intervalos de tiempo permiten la formación de polímeros HbS, y por lo tanto la aparición de cambios morfológicos y luego la recuperación. La desoxigenación se produce mediante la introducción de gas nitrógeno, que disminuye lentamente la tensión de oxígeno en la muestra de sangre en la brecha entre el bob y la copa del ektacitómetro. La deformabilidad del RBC se mide continuamente mientras que la tensión de oxígeno se mide cada 20 s por medio de un pequeño punto O2presente en la pared de la copa. Durante la prueba, aproximadamente 80 pO2 mediciones se acoplan a la EI medida en ese momento. La presión de oxígeno cae por debajo de 20 mmHg durante la desoxigenación, y la reoxigenación se facilita por la difusión pasiva del aire ambiente. La configuración experimental del módulo de ektacittómetro y ektacytometry de gradiente de oxígeno se describe en la Figura 1 y la Figura 2. El principio de la ektacytometry se basa en la dispersión de la luz inducida por El RBC de un rayo láser. Esto da como resultado un patrón de difracción elíptica cuando se aplica tensión de cizallamiento al mismo tiempo(Figura 1).
Protocol
Todos los procedimientos fueron aprobados por el comité ético del University Medical Center Utrecht (UMCU) y de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Los pacientes inscritos en el Centro de Hematología Infantil de Texas (TCHC, por sus otros) fueron aprobados por el IRB local y de acuerdo con la Declaración de Helsinki.
1. Consideraciones generales
- Comience por realizar una medición de prueba para calentar el bob y la taza. Asegúrese de que la temperatura del bob y la copa es de 37 oC. Esto es importante para una buena reproducibilidad.
- Asegúrese de que la solución viscosa de polivinilpirrolidona (PVP) esté dentro de los límites estrictos de osmolaridad (282–286 mOsm/kg), pH (7,35–7,45) y viscosidad (27,5–32,5 MPa) a temperatura ambiente (22 oC).
NOTA: El PVP debe utilizarse a temperatura ambiente. Si se almacena a una temperatura más baja, asegúrese de que se haya calentado a temperatura ambiente antes de tomar cualquier medida.
2. Puesta en marcha del ektacitómetro
- Encienda el ordenador y el ektacytómetro desde atrás. Inicie el programa de software(Tabla de materiales)en el ordenador.
- Asegúrese de que el nitrógeno está disponible para desoxigenar la muestra abriendo el cilindro de nitrógeno.
- Baje el bob en la taza y asegúrese de que la copa puede girar libremente. Limpie la taza en el interior y en el exterior con un paño suave y agua destilada, ya que los desechos pueden obstaculizar las mediciones de EI.
- Cuando el programa de software se esté ejecutando, compruebe el siguiente mensaje en la pantalla:"Asegúrese de que la válvula de gas está abierta" y haga clic en Aceptar.
- Asegúrese de que el ektacytometer inicie el proceso de autocomprobación pO2 que aparecerá en la pantalla. Seleccione Inicio (escriba). Si se produce un error, vuelva a ejecutar la autocomprobación haciendo clic en Comprobación de hardware . pO2 ? Autocomprobación.
NOTA: Si la autocomprobación falla de nuevo, considere la posibilidad de reemplazar el punto O2. El O2-spotse reemplaza empujando suavemente el punto hacia fuera desde el interior de la copa con una yema del dedo. Se coloca un nuevo punto empujando suavemente el punto desde el exterior hacia la copa. - Elija pO2 scan de las diferentes pruebas enumeradas a la izquierda. Elija Configuración a la derecha de la pantalla y asegúrese de que se establecen según los parámetros enumerados en la Tabla 1. Mantenga la misma configuración para cada medición.
- Para guardar estos ajustes, pulse OK ? OK.
NOTA: Los ajustes preferidos se enumeran en la Tabla 1, pero se pueden ajustar de acuerdo con las preferencias del usuario y los propósitos de investigación. Por ejemplo, para estudiar el comportamiento de enfermiza más ampliamente, la velocidad y la duración de la desoxigenación pueden ser alteradas.
3. Recogida y preparación de muestras
NOTA: Para la validación de la técnica, la sangre tratada con ácido tetraacético de etilendiamina (EDTA) de 38 pacientes con SCD y 5 controles saludables incluidos en el Centro Médico Universitario de Utrecht o en el Centro de Hematología Infantil de Texas, en diferentes estudios clínicos ( Se utilizaron muestras de sangre anónimas del Registro de ensayos neerlandeses [NTR], NTR 6779 y NTR 6462), así como muestras de sangre sobrantes anónimas de pacientes que visitaron la clínica ambulatoria o fueron hospitalizados.
- Recoger muestras de sangre por venopunción (un mínimo de 300 l/muestra) en un tubo que contenga EDTA. Asegúrese de que la sangre se ha almacenado durante al menos 30 minutos a 4 oC, pero no más de 24 h.
NOTA: También se puede utilizar la dextrosa de fosfato de citrato (CPDA) o la heparina, pero la influencia de estos reactivos en la preservación de la muestra con respecto a la ektacytometría de gradiente de oxígeno no es bien conocida. - Mezclar la muestra suavemente mediante la inversión para homogeneizar. No agite la muestra. Deje que la muestra se caliente a temperatura ambiente en un banco de rodillos antes de la medición.
NOTA: Un tubo de muestra (9-10 ml) que se almacena durante más de 1 h a 4 oC debe calentarse durante 15 minutos. Cuando se almacena durante menos de 1 h a 4 oC, debe calentarse durante 10 minutos. Un tubo de muestra (2-6 ml) que se almacena durante más de 1 h a 4 oC debe calentarse durante 10 minutos. Cuando se almacena durante menos de 1 h a 4 oC, debe calentarse durante 5 minutos. - Mida el recuento sanguíneo completo de un analizador de hematología. Para ello, tome de 20 a 200 ml de sangre entera en un tubo que contenga EDTA. Coloque la aguja de aspiración en el tubo y presione el botón detrás de la aguja del analizador de hematología para iniciar la medición.
NOTA: En el hemograma completo, se mide el número de RBC, que es un factor importante para estandarizar las mediciones de ektacytometry de gradiente de oxígeno. El recuento de RBC se calcula a partir de la dispersión hacia delante y hacia los lados por citometría de flujo. El recuento normal de Glóbulos rojos en los controles saludables es de 3.7–5.0 x 1012/L para las mujeres y 4.2–5.5 x 1012/L para los machos. El recuento de Glóbulos rojos en pacientes con SCD generalmente disminuye. Algunos analizadores de hematología también medirán el porcentaje de glóbulos rojos densos (% DRBC) que pueden ser de valor adicional en la interpretación de curvas individuales de ektacytometría de gradiente de oxígeno. - Estandarizar la muestra de sangre completa a un recuento de Glóbulos rojos de 200 x 106 glóbulos rojos en PVP de 5 ml (200 x 106 Glóbulos Rojos/vial) ajustando el volumen de la muestra que se añadirá. Si el recuento total de Glóbulos rojos es inferior a 200 x 106, el patrón de difracción y la EI se verán afectados.
- Utilice la ecuación siguiente para realizar el recuento.
4.0/xx (x 1012/L) x 50o a yy -L sangre entera/vial PVP
donde xx es el recuento calculado de Glóbulos rojos obtenido del paso 3.3 y aa es la cantidad de sangre entera que se requiere para la medición real. Dependiendo del grado de anemia y otros factores que influyen en los recuentos de glóbulos rojos, la cantidad de sangre entera requerida es de 40 a 90 l.
- Utilice la ecuación siguiente para realizar el recuento.
4. Medición de ektacytometry de gradiente de oxígeno
- Pipetear el volumen de la muestra calculado (yy-L de sangre) en PVP para obtener un volumen total de 5 ml. Humedezca la punta reemplazando suavemente la sangre 3veces. Utilice una punta de pipeta con una abertura ancha para evitar tensiones adicionales en los RCO. Mezcle suavemente la muestra manualmente por inversión hasta que sea homogénea.
NOTA: Abra el vial de PVP durante el menor tiempo posible para evitar el contacto con el aire. - Dibuje lentamente 2,0 ml de la mezcla de sangre/PVP en una jeringa de 3 ml sin la aguja. Empuje el émbolo para eliminar las burbujas de aire visibles y la solución excesiva de la muestra hasta que queden 1,5–1,8 ml en la jeringa (dependiendo del volumen de la copa).
- Inyecte el volumen total de la muestra lenta y uniformemente en el bob a través del conector. Asegúrese de que el nivel de la muestra esté por encima del sensor de oxígeno (punto rosado) y por encima del pequeño orificio de aspiración. No deje ninguna solución de muestra en la jeringa.
- Haga clic en Nuevo y rellene el identificador de muestra, las observaciones, la fecha de donación y la viscosidad de PVP. Haga clic en Aceptar ( OK) Aspirar. Después de 60 s, la copa girará y aspirará la muestra durante 15 s. Haga clic en Aceptar cuando se detenga la rotación. Cierre la tapa de la máquina. Haga clic en Continuar . Comience ahora,ya que la ektacytometría de gradiente de oxígeno se realiza con una ganancia fija. La medida tomará unos 28 minutos.
- Después de la medición, imprima el informe que muestra la curva y los parámetros que el software calcula automáticamente. Asegúrese de que los datos sin procesar se almacenan automáticamente en la carpeta designada en Configuración. El EI máximo (EImax),el EI mínimo (EImin),el pO2a 95% EI (PoS) y el área (área bajo la curva) se calculan automáticamente y se añaden al informe impreso y a los datos sin procesar.
- Obtenga manualmente el valor de EI calculando la diferencia entre EImax y EImin. Calcule el porcentaje de recuperación tomando la diferencia en EI medio antes de la desoxigenación (pO2 100–120 mmHg) y valores medios de EI durante la reoxigenación a 100–120 mmHg.
5. Limpieza del ektacitómetro
- Retire la jeringa de muestra y reemplácela con una jeringa llena de agua destilada o agua desionizada.
- Pulse Limpiar, descargando lentamente el conector durante el enjuague. Asegúrese de lavar en ambas direcciones.
- Retire la jeringa y levante el bob. Seque bien el bob, la taza y el conector con un paño suave.
- Utilice una jeringa grande (10–50 ml) para lavar el conector con el fin de eliminar el agua que quede en los tubos y bob. Bloquee la entrada/salida inferior del bob para recuperar la presión en los tubos, eliminando así el agua restante.
- Baja el bob en la taza. La máquina ya está lista para la siguiente medición.
6. Apagado de la máquina
- Asegúrese de que la máquina esté bien enjuagada después de la última medición, como se ha descrito anteriormente. Asegúrese de que los tubos adecuados se relacionen con la solución de limpieza.
- Cierre el software, pulse Cerrar y pulse Iniciar para iniciar el programa de limpieza al final del día.
- Después de completar todo el programa de limpieza, retire la jeringa y levante el bob. Enjuague el conector con una jeringa grande.
- Vacíe la botella de residuos y seque el bob y la taza con un paño suave. Enjuague el conector para eliminar el agua restante en los tubos y bob. Bloquee la entrada/salida inferior del bob para recuperar la presión en los tubos, eliminando así el agua restante.
- Cierre la tapa de la máquina. Cierre el cilindro de nitrógeno. Apague el ordenador y la máquina.
Representative Results
La ektacytometría de gradiente de oxígeno se puede utilizar para caracterizar el comportamiento enfermizo en pacientes con SCD. En este estudio, se incluyeron muestras de sangre de un total de 38 pacientes con SCD y cinco controles saludables. En los controles saludables, el patrón de difracción es circular en reposo y elíptico con mayor tensión de cizallamiento4. A partir del patrón de difracción elíptica, el índice de alargamiento (EI) se calcula en función de la altura y la anchura del patrón de difracción. En la ektacytometría de gradiente de oxígeno, la desoxigenación lenta y continua de la muestra por gas nitrógeno es seguida por una rápida reoxigenación por aire ambiente. En estas condiciones, se puede observar la hosión de RBC bajo desoxigenación. Esto provocará una distorsión del patrón de difracción porque las células rojas enfermas no se alinearán correctamente bajo la tensión de cizallamiento aplicada. Por lo tanto, parecen ser menos deformables en comparación con los glóbulos rojos sanos(Figura 2).
La Figura 3A muestra cómo los glóbulos rojos de hoz cambian de forma al desoxigenar, qué condiciones imitadas durante la ektacytometría de gradiente de oxígeno, mientras que los Glóbulos rojos de hoz de enfermedad sin desoxigenación no muestran ningún cambio en la forma. Este proceso da como resultado una distorsión del patrón de difracción durante la ektacytometría de gradiente de oxígeno, y por lo tanto en una disminución en EI. La Figura 3B muestra los diferentes patrones de difracción a partir de los cuales se generan diferentes parámetros.
En la Figura 3Cse muestra una curva representativa obtenida por el ektacittómetro. Seis parámetros reflejan diferentes características del comportamiento enfermizo de los glóbulos rojos: EImax es la EI máxima al inicio de la medición antes de la desoxigenación. Este parámetro representa la posición de línea base y refleja la deformabilidad total de la población total de RBC en el aire ambiente. EImin es la EI mínima, que representa una deformabilidad mínima después de la desoxigenación. Este parámetro refleja los cambios en la forma y la orientación de los RBR (sickle) al desoxigenación. EI es la diferencia entre EImax y EImin, lo que indica cuántas células pueden hojar durante una ronda de desoxigenación. 5% Punto de Sickling (PoS5%) es la pO2 (mmHg) en la que se mide una disminución del 5% de EImáx. durante la desoxigenación. Esto representa la tensión de oxígeno donde comienza el proceso de enfermiza. El área refleja el área bajo la curva, que se determina mediante un cálculo integral de las mediciones EI y pO2 entre 100 mmHg y pO2min (mmHg). Este es el resultado de los parámetros descritos anteriormente EImax, EIminy PoS. Ambos valores de EI se miden en un pO2 de 100–120 mmHg. Este parámetro refleja la capacidad de los glóbulos rojos que se enferman durante la desoxigenación para revertir la hogenación durante la reoxigenación22. Los parámetros de mediciones duplicadas generalmente tenían un coeficiente de variación (CV) <5% (mediana 1,83%). En caso de que se obtuviera un CV > 5%, se realizó una tercera medición. Los parámetros EImax y Recovery son los más reproducibles con CV medios <1%.
En la Figura 4Ase muestran curvas representativas de glóbulos rojos de controles saludables, pacientes con rasgos de HbS (HbS heterocigoto) y un paciente homocigoto con SCD. La curva representativa del paciente de HbSC muestra una recuperación más baja, lo que podría indicar un proceso de enfermizo diferente(Figura 4B). Las curvas representativas de los pacientes con HbSS tratados con hidroxiurea (HU) y transfusión se muestran en la Figura 4C y en la Figura 4D. Claramente, hay una gran diferencia entre las curvas representativas de los rasgos del SA (células HbAS) y los glóbulos rojos de los pacientes con HbSS tratados con transfusión (que consiste en una mezcla de células homocigotas de hoz (HbSS) y células normales homocigotas (HbAA), Figura 4A ,D). Las claras diferencias en las curvas del paciente sin tratamiento y los pacientes tratados con HU y transfusiones ponen de relieve la utilidad de este ensayo(Figura 4C,D). Los niveles de HbF y HbS se correlacionaron significativamente con EImin y, en menor medida, con PoS(Figura 5A–D). Esto indica que los parámetros de laboratorio que son importantes en la evaluación del paciente también se reflejan en la ektacittometría de gradiente de oxígeno. El número de células enfermas en normoxia y el porcentaje de glóbulos rojos densos (DRBC) influyen en los valores EImax, ya que están significativamente correlacionados(Figura 5E–F), lo que indica que EImax refleja otro factor importante en el proceso de enfermizo. Estos resultados muestran cómo las diferentes características como las que tiene %HbS, %HbF, células enfermas en normoxia y %DRBCs influyen en diferentes parámetros.
Figura 1. Configuración esquemática del ektacitómetro. El ektacitómetro utiliza un sistema Couette para aplicar tensión de cizallamiento en las células. Un cilindro exterior de rotación (copa) y un cilindro interno estático (bob) se utilizan para inducir la tensión de cizallamiento mediante la creación de flujo laminar a 37 oC. Entre el bob y la copa hay un pequeño hueco en el que se inyecta la suspensión de sangre. Un rayo láser brilla desde el bob a través de la suspensión de sangre y se dispersa por la presencia de glóbulos rojos. El patrón de difracción es proyectado y analizado por una cámara. El índice de alargamiento (EI) se calcula con la altura (a) y la anchura (b) del patrón de difracción4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Configuración esquemática del ektacitómetro con módulo de ektacytometry de gradiente de oxígeno. Diagrama esquemático del módulo que muestra lentamente la desoxigenación de la suspensión sanguínea con la infusión de gas nitrógeno (N2). La tensión de oxígeno se mide por la cantidad de enfriamiento de la señal de luminóforo enviada desde la fibra LED al punto O2. Tras la desoxigenación, los glóbulos rojos de hoz comenzarán a enfermarse, su deformabilidad disminuirá y ya no se alinearán con los glóbulos rojos elípticos. Los rBR enfermos distorsionarán el patrón de difracción, cambiando su forma de una elipse a una forma romboide o similar a un diamante. Este cambio en la forma del patrón de difracción da como resultado una disminución de EI. Las mediciones de pO2 y EI no se realizan a la misma altura en la copa. Esto garantiza una mejor discriminación entre las curvas de desoxigenación y reoxigenación y, por lo tanto, una mejor interpretación de la curva. Esta figura ha sido modificada de Rab et al.22Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Curva representativa de ektacytometría de degradado de oxígeno y patrones de difracción. (A) Tras la desoxigenación en condiciones similares a la ektacytometría de gradiente de oxígeno, se fijaron los glóbulos rojos de hoz. En el control de los glóbulos rojos de la hoz, se utilizaron las mismas condiciones, pero sin gas nitrógeno. Los glóbulos rojos desoxigenados muestran un cambio de forma en contraste con el control de los glóbulos rojos. (B) Tras la desoxigenación y la tensión de cizallamiento (30 Pa), el patrón de difracción cambia de una elipse a un rommboide. (C) Curva representativa de la ektacytometría del gradiente de oxígeno. El índice de alargamiento máximo (EImax) representa la posición de línea base y muestra una deformabilidad general de la población total de RBC. EI mínimo (EImin) representa una deformabilidad mínima, que es causada por el cambio de forma y orientación de los RDC al desoxigenar. La EI (dEI, la diferencia de EI entre EImax y EImin)muestra cuántas células pueden hoz durante una ronda de desoxigenación. El punto de enfermedad (PoS, pO2 a una disminución del 5% de EI) muestra la tensión de oxígeno cuando los primeros glóbulos rojos comienzan a enfermarse. El área debajo de la curva (de pO2min a 100 mmHg) se calcula en el área de parámetros. Esto resume EImax, EIminy PoS. La capacidad de las células enfermas para que no se cansen durante la reoxigenación se representa en el parámetro Recuperación (porcentaje de EImáximo alcanzado durante la reoxigenación). Para ayudar en la interpretación, todos los puntos de datos se conectaron en cada experimento individual por una línea para presentar gráficamente los resultados. Esta figura ha sido modificada de Rab et al.22Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Los parámetros de ektacytometría de gradiente de oxígeno se correlacionan con los regímenes de genotipo y tratamiento de los pacientes con SCD con SCD. (A) Gráfico representativo de los glóbulos rojos de los portadores de HbS (rasgo HbS) y controles saludables en relación con pacientes con HbSS no tratados. (B) Gráfico representativo de los glóbulos rojos de los pacientes con enfermedad de hemoglobina (HbSC) en relación con los pacientes con HbSS no tratados. (C) Gráfico representativo de los glóbulos rojos de pacientes con SCD homocigoto tratados con hidroxiurea (HBSS HU) en relación con pacientes con HbSS no tratados. (D) Gráfico representativo de los glóbulos rojos de pacientes con HbSS tratados con transfusión de sangre (transfusión de HbSS) en relación con pacientes con HbSS no tratados. Esta figura ha sido modificada de Rab et al.22Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Los parámetros de ektacytometry de gradiente de oxígeno están asociados con %HbF, %HbS, %células enfermas en normoxia y %rQUE densos. (A) Correlación lineal del índice mínimo de alargamiento (EImin) y %HbF de 15 pacientes con HbSS o HbS/talasemia sin transfusión. (B) Correlación lineal de EImin y %HbS. (C) Correlación lineal de PoS y %HbF. (D) Correlación lineal de PoS y %HbS. (E) Correlación lineal de EI máximo (EImáx.)y porcentaje de células enfermas en células enfermas en normaoxis medida con microscopía digital. (F) Correlación lineal de RDC de EImax y porcentaje denso (%DRBCs) de 21 pacientes con HbSS. Esta figura ha sido modificada de Rab et al.22Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Configuración | ||
| Archivos | Directorio de almacenamiento | |
| Opciones generales | Viscosidad media predeterminada | Viscosidad de PVP |
| escaneo pO2 | Tiempo mínimo de aspiración (s) | 60 |
| PO2 escanee la tensión de cizallamiento (Pa) | 30 | |
| Determinar pO2 cada (S) | 20 | |
| Tamaño de la media móvil | 2 | |
| pO2 paso de exploración; Editar | 0 -OFF; 60 -ON; 1360 –APAGADO; 1640 -OFF | |
| Cal. Area entre (mmHg) | 10 y 100 | |
| control pO2 | Desactivado (sin marcar) |
Tabla 1. El ajuste preferido del ektacitómetro.
Discussion
Aquí describimos la ektacytometría de gradiente de oxígeno, un método que se puede utilizar para estudiar el comportamiento enfermizo de los glóbulos rojos de los pacientes con SCD bajo una serie de concentraciones de oxígeno(Figura 4 y Figura 5). Para obtener resultados reproducibles, es importante identificar los factores que influyen en los resultados. Por ejemplo, la temperatura tiene un gran impacto en la deformabilidad de RBC, principalmente debido a sus efectos en el espesor de la solución viscosa (PVP). Recomendamos realizar una medición de prueba al inicio del día para calentar a fondo la máquina a 37 oC. Esto mejorará la reproducibilidad de los resultados. La osmolaridad de la solución viscosa debe estar dentro de un rango estrecho (282–286 mOsm/kg para PVP), porque la osmolaridad influye en el estado de hidratación, lo que a su vez afecta a la deformabilidad del RBC. El pH y la viscosidad de la PVP también deben estar estrictamente regulados. Las diferencias en el pH y la temperatura pueden influir en las curvas dramáticamente22. Además, el agua restante en la taza, bob y tubos, puede causar la lisis de los glóbulos rojos, lo que resulta en datos incorrectos, porque se medirán menos glóbulos rojos intactos presentes en la copa.
Los ajustes para realizar la ektacytometría de gradiente de oxígeno se pueden ajustar para abordar preguntas de investigación específicas. La configuración preferida se muestra en la Tabla 1. Se eligió un tiempo de desoxigenación de 1.300 s sobre la base de observaciones que muestran que la extensión de la desoxigenación no dio lugar a unmínimo de EI inferior para la mayoría de los pacientes. Por el contrario, el acortamiento del tiempo de desoxigenación obstaculizaría el poder discriminatorio de la ektacytometría del gradiente de oxígeno. El tiempo de reoxigenación se estableció en 280 s debido a la rápida resolución de polímeros HbS durante la reoxigenación, y la restauración concomitante de EI hacia los valores medidos antes de la desoxigenación. La tensión de cizallamiento se estableció en 30 Pa, lo que es análogo a la ektacytometría de gradiente osmótico. Bajar este parámetro podría obstaculizar el poder discriminatorio. El control de desoxigenación se puede utilizar si se aplica un conjunto de velocidad de desoxigenación a cada muestra de paciente. En nuestros ajustes preferidos, esta opción se apagó porque la tasa de desoxigenación es específica del paciente debido a la curva de disociación de hemoglobina única. Por lo tanto, encender el control de desoxigenación eliminaría esta característica del ensayo. Sin embargo, esta característica de la ektacytometría de gradiente de oxígeno todavía está bajo investigación.
Varios factores conocidos influyen en los parámetros de ektacytometry del gradiente de oxígeno, a saber, el pH, la temperatura y la osmolaridad. La ektacittometría, especialmente PoS, está influenciada por 2,3-difosfogliceo (2,3-DPG)22. Además, existe una clara correlación entre %HbF y elEI miny, en menor medida, PoS(Figura 5A–D). EImax se asocia con células falciformes en normoxia, lo que puede explicar la observación de que poco después de un COV, la deformabilidad de RBC en normoxia (EImax),es mayor. Este último es causado por la destrucción de las células más enfermas, y por lo tanto menos deformable sr. durante VOC16. Como se muestra en la Figura 5F, los Glóbulos Rojos más densos (definidos como RCC con una concentración de hemoglobina >1.11 mg/ml) se correlacionan fuertemente con unEI menor máx. Esto indica que las células densas son un factor importante en la deformabilidad del RBC en normoxia, similar a los resultados notificados anteriormente1.
La estandarización de muestras es muy importante para obtener resultados reproducibles y para distinguir entre diferentes genotipos y tratamientos. La corrección para el recuento de RBC es importante, ya que el número de Glóbulos rojos influye en la intensidad del patrón de difracción. Si los números de RBC más bajos están presentes en el espacio entre el bob y la copa, la curva se desplazará hacia arriba y hacia la izquierda. Además, la curva fluctuará, obstaculizando el cálculo preciso de los parámetros, especialmente el PoS.
Una limitación de esta técnica es que el valor EI representa un promedio de todas las celdas, incluidas las diferentes subpoblaciones. Se ha estudiado intensamente la heterogeneidad de las poblaciones de RBC en pacientes con SCD y su influencia en la medición de la ektacittometría. Esto dio lugar a la estandarización en la que el tamaño del patrón de difracción se ajusta a un valor fijo en lugar de corregido para el recuento de RBC23,24. Actualmente se está estudiando si esta forma de estandarización también debe aplicarse a las mediciones de ektacytometría de gradiente de oxígeno.
Se desarrollaron varias técnicas para medir la deformabilidad del RBC en condiciones hipoxiticas basadas en un paso de desoxigenación que tuvo lugar fuera del ektacitómetro25,26,27. En estas condiciones, no se observaron diferencias en el comportamiento celular entre pacientes con rasgos de HbS y controles saludables bajo pH fisiológico25. Sin embargo, la ektacytometría de gradiente de oxígeno muestra claramente un PoS bajo pero evidente en individuos con rasgos de HbS(Figura 4A). Hasta la fecha, en la práctica clínica de rutina, los únicos métodos alternativos para medir la tendencia de los glóbulos rojos de un paciente individual a hoz in vitro incluyen un ensayo de hoz basado en morfología: los glóbulos rojos se incuban en condiciones que promueven la polimerización de HbS, como la polimerización de HbS, como la polimerización de HbS, como la polimerización de HbS, como baja tensión de oxígeno o pH bajo. Se añade un fijador después de la incubación y el porcentaje de células enfermas se cuenta manualmente o digitalmente mediante microscopía de luz. Muchos ensayos farmacológicos preclínicos y de fase temprana utilizan el ensayo de hoz para generar una variable de resultado secundario para poder predecir la eficacia clínica en SCD28,29,30,31 ,32. Sin embargo, consume mucho tiempo, la variabilidad es alta y la sensibilidad es baja, la técnica no está automatizada y, por lo tanto, requiere mucha mano de obra. Además, los cambios morfológicos debidos a la hoz podrían no estar bien relacionados con parámetros fisiológicos, como la deformabilidad de RBC, ya que es un ensayo estático de 2 dimensiones2.
La ektacytometría de gradiente de oxígeno proporciona un ensayo funcional de enfermizo que es rápido y reproducible. Se trata de una prueba in vitro que no tiene en cuenta la superficie endotelial. Sin embargo, proporciona aspectos funcionales del comportamiento enfermizo y características del RBC, por lo que es una técnica prometedora para los estudios de células falciformes. Las aplicaciones futuras de la técnica incluyen el seguimiento de la eficacia del tratamiento en pacientes con SCD, sirviendo como biomarcador para nuevas estrategias de tratamiento, el estudio del comportamiento enfermizo y el seguimiento del chimerismo después del trasplante de células madre en la SCD.
Disclosures
Los autores no declaran intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por una beca Eurostars estar18105 y por una subvención sin restricciones otorgada por RR Mechatronics. Los autores agradecen a Sisto Hendriks y Jan de Zoeten por su apoyo técnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADVIA 120 Hematology Analyzer | Siemens | 067-A004-14 | Instrument |
| Cell-Dyn Sapphire Hematology Analyzer | Abbott | 8H00-01 | Instrument |
| Lorrca | RR Mechatronics | LORC109230 or LORC109110 | Instrument |
| Lorrca Software version V5.08 | RR Mechatronics | - | Software |
| Nitrogen gas 4.8 or 5.0 | Local | - | |
| O2-spot | RR Mechatronics | PO2S020153 | O2 measurement |
| Oxygenscan module (pO2scan) | RR Mechatronics | PO2S109000 | Add-on |
| Oxy-ISO | RR Mechatronics | QRR 030905 | Viscous solution |
| X-Clean | RR Mechatronics | QRR 010946 | Cleaning solution Lorrca |
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