Ici, nous présentons l’ektacytométrie de gradient d’oxygène, une méthode rapide et reproductible pour mesurer la déformation rouge de globule seux dans des échantillons des patients présentant la maladie de drépanocytose sous la déoxygénation et la réoxygénation contrôlées. Cette technique fournit un moyen d’étudier la drépanocytose des globules rouges et de surveiller l’efficacité du traitement des drépanocytoses.
Dans la drépanocytose (SCD), une mutation ponctuelle unique dans le codage génétique de la bêta-globine provoque la production d’hémoglobine anormale S (HbS). Une fois désoxygéné, HbS peut polymériser, formant des tiges rigides d’hémoglobine, ayant pour résultat le faucillage des globules rouges (RBCs). Ces RBCs faucillés ont sensiblement réduit la déformabilité, causant la vaso-occlusion, qui mène à de nombreuses complications cliniques SCD-connexes, y compris la douleur, la course, et des dommages d’organe. La déformation de RBC est également réduite par la déshydratation de RBC, ce qui entraîne des globules rouges denses qui sont plus susceptibles de faucille. À ce jour, il n’existe pas un seul test de laboratoire largement disponible, rapide et reproductible capable de prédire la gravité de la maladie ou de surveiller directement les effets du traitement des nouvelles thérapies induisantes par l’hémoglobine non fœtale. Dans cette étude, nous décrivons un protocole pour mesurer la déformation de RBC en fonction du pO2 qui tient compte de la quantitation du comportement de faucillage dans les patients de SCD. L’ektacytométrie de gradient d’oxygène mesure la déformation de RBC, exprimée comme l’indice d’allongement (IE), en fonction du pO2. Les RBC sont exposés à un stress de cisaillement fixe de 30 Pa au cours d’une série de désoxygénation et de réoxygénation. Six paramètres de lecture sont produits. Parmi ceux-ci, le point de faucille (PoS), défini comme le pO2 à laquelle l’IE maximale (EImax) montre une diminution de 5 %, et l’ie chômage minimum pendant la désoxygénation (EImin) sont les plus instructifs, reflétant le pO2 d’un patient individuel à laquelle la dilération commence et la déformation minimale des globules rouges d’un patient, respectivement. Le PoS est associé à l’affinité d’hémoglobine d’un patient individuel pour l’oxygène, tandis que lemin d’Ie montre une forte corrélation avec des niveaux foetaux d’hémoglobine. Nous concluons que l’ektacytométrie de gradient d’oxygène est une technique prometteuse pour surveiller le traitement des patients présentant SCD, comme biomarqueur pour des agents anti-sickling dans les essais cliniques et précliniques, et un outil important pour étudier le comportement de faucillement des RBCs de personnes atteintes de DSP et de drépanocytose.
Dans SCD, une mutation de point simple a comme conséquence la production de HbS, qui peut polymériser sur la désoxygénation. La polymérisation hbS provoque la dilémissement des RBC et réduit la déformation de RBC. La combinaison de la dilencelle RBC et de l’adhésion de RBC à l’endothélium mène à diverses complications de DSC, y compris les crises vaso-occlusives (COV), les accidents vasculaires cérébraux, les dommages aux organes et l’anémie hémolytique chronique. Même dans des conditions normoxiques, la déformation de RBC est compromise dans les patients présentant SCD. La déformation est encore diminuée à de faibles concentrations d’oxygène. Les principaux acteurs qui déterminent la déformation à la normoxie sont les cellules denses, les cellules irréversiblement diléléminées (ISC), et les cellules déshydratées, qui ont toutes une diminution du rapport surface-volume1,2,3.
L’ektacytométrie est une méthode établie pour mesurer la déformation de RBC, largement utilisée pour le diagnostic des anémies hémolytiques héréditaires, en particulier les membranopathies4. Il peut également être utilisé pour étudier l’hémoréologie5,6,7,8,9. L’ektacytométrie de gradient osmotique, dans laquelle la déformation de RBC est mesurée pendant un changement continu dans l’osmolalité, a été employée pour étudier SCD pendant plus d’une décennie10,11. Le pourcentage d’hémoglobine fœtale (HbF) est l’un des inhibiteurs les plus forts de la polymérisation HbS parce que ni HbF ni son tétramer hybride mixte (2 ‘S) ne peuvent entrer dans la phase12du polymère deoxyHbS. Des études récentes suggèrent que l’augmentation des niveaux de HbF chez les patients atteints de SCD conduit à un meilleur rapport surface-volume, améliorant ainsi l’état d’hydratation et donc la déformation chez les patients non transfusés11.
La déformation de RBC a été étudiée dans le passé comme biomarqueur pour les complications de DSC, mais avec des résultats contradictoires. Dans les études effectuées transversalement et à un état stable, les individus avec des niveaux plus élevés de déformation RBC se sont avérés pour avoir une incidence plus élevée de l’ostéonécrose et plus de crises de douleur13,14,15. Contrairement à ces résultats, par rapport aux valeurs d’état stables au cours d’un COV aigu, la déformation de RBC a été diminuée dans les études longitudinales chez les mêmes individus16. Cet écart peut être le résultat de l’étude de la déformation de RBC dans des conditions différentes (c.-à-d. pendant l’état stable par rapport au COV). Le pourcentage de cellules faucillées est élevé au début d’un COV et les cellules sont rapidement détruites au fur et à mesure que la crise progresse, ce qui peut expliquer la différence entre les données d’incidence transversale de l’état stable et les données longitudinales obtenues pendant le COV. Cependant, d’autres facteurs, comme l’adhésion des sous-populations de RBC à la surface endothéliale, peuvent également être importants dans l’occurrence des COV. Dans SCD, il est plus cliniquement pertinent de mesurer la déformation pendant la désoxygénation, parce que vaso-occlusion se produit typiquement dans les venules post-capillaires hypoxiques et pas dans le réseau microcapillary moins hypoxique17. En outre, la présence d’ISC peut modifier la capacité d’un ektacytomètre à mesurer la déformation à la normoxie. La distorsion du modèle de diffraction est causée par les ISC, qui résulte du non-alignement pendant le flux1,2,3.
Les approches alternatives pour étudier la pathophysiologie des COV comprennent des mesures de l’adhérence de RBC à une surface artificielle18, cytométrie de micro-flux d’impédance électrique à cellule unique19, modèles microfluidiques combinant des modèles quantitatifs mesures de la dilélitance cellulaire et le malaise avec la rhéologie à cellule unique20, et la polymérisation induite par laser21. Bien que prometteuses, ces techniques sont coûteuses, à forte intensité de main-d’œuvre et nécessitent une formation approfondie de l’opérateur. En outre, les essais qui sont basés sur la morphologie n’ont pas la capacité d’étudier le comportement cellulaire, comme la déformation, en fonction d’un gradient d’oxygène.
Dans cette étude, nous décrivons un test fonctionnel rapide et reproductible exécuté avec un ektacytomètre. Il s’agit d’une mesure de l’ektacytométrie de prochaine génération qui mesure les différents aspects qualitatifs de la déformation de RBC exprimés en tant qu’IE pendant la désoxygénation (1 300 s) et la réoxygénation rapide (280 s). Ces intervalles de temps permettent la formation de polymères HbS, et donc l’occurrence de changements morphologiques, puis la récupération. La désoxygénation se produit en introduisant le gaz azoté, qui diminue lentement la tension d’oxygène dans l’échantillon de sang dans l’écart entre le bob et la tasse de l’ektacytomètre. La déformation de RBC est mesurée en permanence tandis que la tension d’oxygène est mesurée tous les 20 s au moyen d’un petit O2-spotprésent dans la paroi de la tasse. Au cours de l’essai, environ 80 mesures pO2 sont couplées à l’IE mesurée à ce moment-là. La pression d’oxygène descend en dessous de 20 mmHg pendant la désoxygénation, et la réoxygénation est facilitée par la diffusion passive de l’air ambiant. La configuration expérimentale du module d’ektacytomètre et de gradient d’oxygène est décrite dans la figure 1 et la figure 2. Le principe de l’ektacytométrie est basé sur la diffusion de la lumière induite par RBC à partir d’un faisceau laser. Il en résulte un modèle de diffraction elliptique lorsque le stress de cisaillement est appliqué en même temps (figure 1).
Ici, nous décrivons l’ektacytométrie de gradient d’oxygène, une méthode qui peut être employée pour étudier le comportement de faucille des globules rouges des patients de SCD sous une gamme des concentrations d’oxygène(figure 4 et figure 5). Afin d’obtenir des résultats reproductibles, il est important d’identifier les facteurs qui influencent les résultats. Par exemple, la température a un impact important sur la déformation de RBC, principalement en raison de ses effets sur l’épaisseur de la solution visqueuse (PVP). Nous vous recommandons d’effectuer une mesure d’essai en début de journée pour chauffer complètement la machine à 37 oC. Cela permettra d’améliorer la reproductibilité des résultats. L’osmolarité de la solution visqueuse devrait être dans une plage étroite (282-286 mOsm/kg pour PVP), parce que l’osmolarité influence l’état d’hydratation, qui à son tour affecte la déformation RBC. Le pH et la viscosité du PVP devraient également être étroitement réglementés. Les différences de pH et de température peuvent influencer les courbes de façon spectaculaire22. En outre, l’eau restante dans la tasse, le bob, et les tubes, peut causer la lyse des RBCs, ayant de ce fait en conséquence des données incorrectes, parce que moins de RBC intacts présents dans la tasse seront mesurés.
Les paramètres pour effectuer l’ektacytométrie de gradient d’oxygène peuvent être ajustés pour répondre à des questions d’investigation spécifiques. Les paramètres privilégiés sont énumérés dans le tableau 1. Un temps de désoxygénation de 1.300 s a été choisi basé sur des observations montrant que l’extension de la désoxygénation n’a pas eu comme conséquence uneminute inférieure d’Ie pour la plupart des patients. En revanche, le raccourcissement du temps de désoxygénation entraverait la puissance discriminative de l’ektacytométrie de gradient d’oxygène. Le temps de réoxygénation a été fixé à 280 s en raison de la résolution rapide des polymères HbS pendant la réoxygénation, et la restauration concomitante de l’IE vers des valeurs mesurées avant la désoxygénation. Le stress de cisaillement a été réglé à 30 Pa, qui est analogue à l’ektacytométrie de gradient osmotique. L’abaissement de ce paramètre pourrait entraver la puissance discriminative. Le contrôle de la désoxygénation peut être utilisé si un ensemble de vitesse de désoxygénation est appliqué à chaque échantillon de patient. Dans nos arrangements préférés, cette option a été éteinte parce que le taux de désoxygénation est patient-spécifique dû à la courbe unique de dissociation d’hémoglobine. Par conséquent, l’allumage du contrôle de désoxygénation éliminerait cette caractéristique de l’assay. Cependant, cette caractéristique de l’ektacytométrie de gradient d’oxygène est toujours à l’étude.
Plusieurs facteurs bien connus influencent les paramètres d’ektacytométrie du gradient d’oxygène, à savoir le pH, la température et l’osmolarité. L’ektacytométrie, en particulier le PoS, est influencée par 2,3-diphosphoglycérisat (2,3-DPG)22. En outre, il existe une corrélation claire entre le %HbF et leminde l’IE , et dans une moindre mesure PoS (Figure 5A–D). L’Iemax est associée à des cellules faucille à la normoxie, ce qui peut expliquer l’observation que peu de temps après un COV, la déformation RBC à la normoxie (EImax), est plus élevée. Ce dernier est causé par la destruction des cellules les plus faucillées, et donc moins de RBC sifformables pendant le COV16. Comme le montre la figure 5F, les RBC plus denses en % (définis comme des RBC avec une concentration d’hémoglobine à 1,11 mg/mL) sont fortement corrélés avec un taux d’e-imaxinférieur. Cela indique que les cellules denses sont un facteur important dans la déformation de RBC à la normoxie, semblable aux résultats précédemment rapportés1.
La normalisation des échantillons est très importante pour obtenir des résultats reproductibles et pour distinguer les différents génotypes et traitements. Il est important de corriger le nombre de RBC, car le nombre de RBC influence l’intensité du modèle de diffraction. Si des nombres de RBC plus faibles sont présents dans l’écart entre le bob et la tasse, la courbe se déplacera vers le haut et vers la gauche. En outre, la courbe fluctue, ce qui entrave le calcul précis des paramètres, en particulier le PoS.
Une limitation de cette technique est que la valeur de l’IE représente une moyenne de toutes les cellules, y compris les différentes sous-populations. L’hétérogénéité des populations de RBC chez les patients atteints de SCD et son influence sur la mesure de l’ektacytométrie ont été étudiées de façon intensive. Il en est résulté une normalisation dans laquelle la taille du modèle de diffraction est ajustée à une valeur fixe au lieu d’être corrigée pour le compteRBC 23,24. La question de savoir si ce mode de normalisation devrait également être appliqué aux mesures d’ektacytométrie du gradient d’oxygène est actuellement à l’étude.
Plusieurs techniques pour mesurer la déformation de RBC dans des conditions hypoxiques ont été développées basées sur une étape de désoxygénation qui a eu lieu en dehors de l’ektacytomètre25,26,27. Dans ces conditions, des différences dans le comportement cellulaire n’ont pas été observées entre les patients présentant des traits de HbS et des contrôles sains sous le pH physiologique25. L’ektacytométrie de gradient d’oxygène, cependant, montre clairement un PoS faible mais évident chez les individus avec des traits de HbS (Figure 4A). À ce jour, dans la pratique clinique courante, les seules méthodes alternatives pour mesurer la tendance des RBC d’un patient individuel à la faucille in vitro comprennent un essai de faucille basé sur la morphologie : les RBC sont incubés dans des conditions qui favorisent la polymérisation hbS, telles que faible tension d’oxygène ou faible pH. Un fixatif est ajouté après l’incubation et le pourcentage de cellules faucillées est compté manuellement ou numériquement à l’aide de la microscopie légère. Beaucoup d’essais pharmacologiques précliniques et de phase précoce emploient l’essai de faucillage pour produire une variable secondaire de résultat pour pouvoir prévoir l’efficacité clinique dans SCD28,29,30,31 ,32. Cependant, il prend du temps, la variabilité est élevée et la sensibilité est faible, la technique n’est pas automatisée et, par conséquent, la main-d’œuvre intensive. De plus, les changements morphologiques dus à la faucille pourraient ne pas être corrélés avec les paramètres physiologiques, comme la déformation de RBC, parce qu’il s’agit d’un analyse statique en deux dimensions2.
L’ektacytométrie de gradient d’oxygène fournit un essai fonctionnel de faucille qui est rapide et reproductible. Il s’agit d’un test in vitro qui ne tient pas compte de la surface endothéliale. Cependant, il fournit des aspects fonctionnels du comportement de drépanocytose et des caractéristiques de RBC, ce qui en fait une technique prometteuse pour les études de drépanocytose. Les applications futures de la technique incluent la surveillance de l’efficacité du traitement chez les patients atteints de MTS, servir de biomarqueur pour de nouvelles stratégies de traitement, l’étude du comportement décenséens, et la surveillance du chimérisme après la transplantation de cellules souches dans SCD.
The authors have nothing to disclose.
Ces travaux ont été soutenus en partie par une subvention Eurostars estar18105 et par une subvention sans restriction fournie par RR Mechatronics. Les auteurs remercient Sisto Hendriks et Jan de Zoeten pour leur soutien technique.
ADVIA 120 Hematology Analyzer | Siemens | 067-A004-14 | Instrument |
Cell-Dyn Sapphire Hematology Analyzer | Abbott | 8H00-01 | Instrument |
Lorrca | RR Mechatronics | LORC109230 or LORC109110 | Instrument |
Lorrca Software version V5.08 | RR Mechatronics | – | Software |
Nitrogen gas 4.8 or 5.0 | Local | – | |
O2-spot | RR Mechatronics | PO2S020153 | O2 measurement |
Oxygenscan module (pO2scan) | RR Mechatronics | PO2S109000 | Add-on |
Oxy-ISO | RR Mechatronics | QRR 030905 | Viscous solution |
X-Clean | RR Mechatronics | QRR 010946 | Cleaning solution Lorrca |