Summary
여기에서, 우리는 통제된 탈산소 및 재산소화의 밑에 겸상적혈구 질병을 가진 환자에게서 견본에 있는 적혈구 변형성을 측정하는 산소 구배 ektacytometry, 신속하고 재현가능한 방법을 제시합니다. 이 기술은 적혈구 낫을 연구하고 겸상적혈구 치료 효능을 모니터링하는 방법을 제공합니다.
Abstract
겸상적혈구 (SCD)에서, 베타 글로빈을 코딩하는 유전자에 있는 단 하나 점 돌연변이는 이상한 헤모글로빈 S (HbS)의 생산을 일으키는 원인이 됩니다. 탈산소되면 HbS는 중합하여 헤모글로빈의 단단한 막대를 형성하여 적혈구 (RBC)의 병든 결과로 이어질 수 있습니다. 이 병든 RBC는 크게 변형성을 감소시켜 혈관 폐색을 일으켜 통증, 뇌졸중 및 장기 손상을 포함한 수많은 SCD 관련 임상 합병증을 유발합니다. RBC 변형은 또한 RBC 탈수에 의해 감소, 낫에 더 가능성이 조밀 한 적혈구의 결과. 현재까지, 질병 중증도를 예측하거나 신규한 비태아 헤모글로빈 유도 요법에 대한 치료 효과를 직접 모니터링할 수 있는 널리 이용 가능하고, 신속하고, 재현 가능한 실험실 분석실험은 존재하지 않는다. 본 연구에서, 우리는 SCD 환자에서 아픈 행동의 정량을 허용하는 pO2의 함수로 RBC 변형성을 측정하는 프로토콜을 기술한다. 산소 구배 ektacytometry는pO2의함수로서 신장 지수 (EI)로 표현된 RBC 변형성을 측정합니다. RBC는 탈산소 및 재산소화의 한 라운드 동안 30 Pa의 고정 전단 응력에 노출된다. 6개의 판독 매개변수가 생성됩니다. 이들 중, 최대 EI(EImax)가5% 감소를 나타내는 pO2로 정의된 병살지점(PoS)은 탈산소(EImin)동안 최소 EI가 가장 유익하며, 이는 개별 환자의 pO2를 반영하는 것입니다. 병이 시작되고 환자의 적혈구의 최소한의 변형성. PoS는 산소에 대한 개별 환자의 헤모글로빈 친화도와 관련이 있는 반면, EImin은 태아 헤모글로빈 수준과 강한 상관관계를 나타낸다. 우리는 산소 구배 ektacytometry가 임상 및 전임상 시험에서 항 병살제에 대한 바이오 마커로, SCD환자의 치료를 모니터링하는 유망한 기술이며, RBC의 아픈 행동을 연구하는 중요한 도구라고 결론지었습니다. SCD와 겸상적혈구 특성을 가진 개인.
Introduction
SCD에서, 단 하나 점 돌연변이는 탈산소시 중합할 수 있는 HbS의 생산을 초래합니다. HbS 중합은 RBC의 병든 을 일으키고 RBC 변형성을 감소시킵니다. 내피에 RBC 병살과 RBC 준수의 조합은 혈관 폐색 위기 (VOC), 뇌졸중, 장기 손상 및 만성 용혈성 빈혈을 포함한 다양한 SCD 합병증으로 이어집니다. 노르목 성 조건에서도, RBC 변형성은 SCD 환자에서 손상됩니다. 변형성은 낮은 산소 농도에서 더 감소된다. 노르목에서 변형성을 결정하는 주요 플레이어는 조밀 한 세포, 비가역적으로 병든 세포 (ISC) 및 탈수 된 세포이며, 모두 표면 대 부피 비율1,2,3이감소합니다.
Ektacytometry는 유전 용혈성 빈혈, 특히 membranopathies4의진단에 널리 사용되는 RBC 변형성을 측정하는 확립 된 방법입니다. 그것은 또한출혈학을공부하는 데 사용할 수 있습니다5,6,7,8,9. RBC 변형성이 삼투압의 지속적인 변화 동안 측정되는 삼투성 구배 ektacytometry는, 10 년 이상 을 위해 SCD를 연구하기 위하여 이용되었습니다10,11. 태아 헤모글로빈(HbF)의 백분율은 HbF 또는 이의 혼합 하이브리드 테트라머(2βSγ)가 deoxyHbS 중합상12상에진입할 수 없기 때문에 HbS 중합의 가장 강력한 억제제 중 하나이다. 최근 연구는 SCD 환자에서 HbF 수준을 증가시키면 표면 대 부피 비가 더 좋아지며, 따라서 수화 상태를 개선하고 따라서 비트랜스퓨우 환자에서 변형성을 향상시키는 것으로 나타났습니다11.
RBC 변형성은 SCD 합병증을 위한 바이오마커로 과거에 연구되었지만, 상충하는 결과를 가지고 있다. 단면및 정상 상태에서 수행된 연구에서, RBC 변형성의 상부를 가진 개인은 골괴사 및 더 많은 통증 위기의 더 높은 발생률을 가지고 있는 것으로 나타났다13,14,15. 이러한 사실 인정과는 대조적으로, 급성 VOC 동안의 정상 상태 값과 비교할 때, RBC 변형성은 동일한개인(16)내에서 종방향 연구에서 감소하였다. 이러한 불일치는 상이한 조건하에서 RBC 변형성을 연구한 결과일 수 있다(즉, VOC 대 정상 상태). 병에 걸린 세포의 백분율은 VOC의 시작에 높고 세포는 위기가 진행됨에 따라 급속하게 파괴되며, 이는 VOC 동안 얻은 정상 상태 단면 발생 률 데이터와 종방향 데이터의 차이를 설명할 수 있습니다. 그러나, 내피 표면에 RBC 하위 집단의 준수와 같은 다른 요인은, 또한 VOC의 발생에 중요 할 수있다. SCD에서, 탈산소 동안 변형성을 측정하는 것이 임상적으로 더 관련성이 높으며, 왜냐하면 혈관-폐색은 전형적으로 저산소 후 모세관 에서 발생하고 저산소 미세 모세관네트워크(17)에서일어나지 않기 때문이다. 추가적으로, ISC의 존재는 normoxia에 기형성을 측정하는 ektacytometer의 기능을 바꿀 수 있습니다. 회절 패턴의 왜곡은 흐름1,2,3동안 비정렬로 인해 발생하는 ISC에 의해 발생합니다.
VOC의 병리생리학을 연구하는 대체 접근법은 인공 표면18,단세포 전기 임피던스 미세 유량 세포측정19,정량적 결합미세유체 기반 모델에 대한 RBC 준수의 측정을 포함한다. 단세포투과(20)와레이저 유도중합(21)을가진 세포 병들기 및 병든 의 측정. 유망하지만 이러한 기술은 비용이 많이 들고 노동 집약적이며 광범위한 작업자 교육이 필요합니다. 또한, 형태기반의 세포학적 인 세포 행동을 연구할 수 있는 능력이 부족한, 기형과 같은, 산소 구배의 기능으로.
본 연구에서는, 우리는 ektacytometer로 수행된 신속하고 재현 가능한 기능성 분석방법을 기술한다. 이것은 탈산소(1,300초) 및 신속한 재산소(280초) 동안 EI로 표현된 RBC 변형성의 상이한 질적 측면을 측정하는 차세대 ektacytometry 측정이다. 이러한 시간 간격은 HbS 중합체 형성을 허용하고, 이에 의하여 형태학적 변화 및 회수의 발생을 허용한다. 탈산소는 질소 가스를 도입하여 발생하며, 이는 ektacytometer의 밥과 컵 사이의 간격에서 혈액 샘플의 산소 긴장을 서서히 감소시다. RBC 변형성은 지속적으로 측정되고 산소 장력은 컵의 벽에 존재하는작은 O 2-spot을 통해 20s마다 측정됩니다. 시험 기간 동안 약 80pO2 측정은 그 순간에 측정된 EI에 결합됩니다. 산소 압력은 탈산소 동안 20 mmHg 이하로 떨어지고, 재산소화는 주변 공기의 수동 확산에 의해 촉진된다. ektacytometer 및 산소 구배 ektacytometry 모듈의 실험 설정은 도 1 및 도 2에설명되어 있습니다. ektacytometry의 원리는 레이저 광선에서 빛의 RBC 유도된 산란에 근거를 둔다. 이렇게 하면 전단 응력이 동시에 가해지면 타원형 회절 패턴이 생성됩니다(그림1).
Protocol
모든 절차는 대학 의료 센터 위트레흐트의 윤리위원회에 의해 승인되었다 (UMCU) 헬싱키의 선언에 따라. 텍사스 아동 혈액학 센터 (TCHC)에 등록 된 환자는 현지 IRB와 헬싱키 선언에 따라 승인되었습니다.
1. 일반적인 고려 사항
- 밥과 컵을 데우기 위해 테스트 측정을 수행하여 시작합니다. 밥과 컵의 온도가 37 °C인지 확인하십시오. 이것은 좋은 재현성에 대 한 중요 한.
- 점성이 있는 폴리비닐피롤리돈(PVP) 용액이 실온(22°C)에서 삼투압(282-286 mOsm/kg), pH(7.35-7.45) 및 점도(27.5-32.5MPa)에 대한 엄격한 한계 내에 있는지 확인합니다.
참고: PVP는 실온에서 사용해야 합니다. 더 낮은 온도에서 보관하는 경우, 측정하기 전에 실온까지 예열되었는지 확인하십시오.
2. ektacytometer의 시작
- 컴퓨터와 ektacytometer를 뒤에서 켭게 전환하십시오. 컴퓨터에서 소프트웨어프로그램(재료 표)을시작합니다.
- 질소 실린더를 열어 시료를 탈산소할 수 있는지 확인합니다.
- 컵에 밥을 내리고 컵이 자유롭게 회전 할 수 있는지 확인하십시오. 이물질이 EI 측정을 방해할 수 있으므로 부드러운 천과 증류수로 컵을 내부와 외부로 청소하십시오.
- 소프트웨어 프로그램이 실행 중일 때 화면에서"가스 밸브가 열려 있는지 확인"을 클릭하고 확인을클릭합니다.
- ektacytometer가 화면에 나타나는 pO2 자체 검사 프로세스를 시작하는지 확인하십시오. 시작(enter)을선택합니다. 실패하면 하드웨어 검사를 클릭하여 자체 검사를 다시 실행 | pO2 | 셀프 확인.
참고: 자체 검사가 다시 실패하면 O2-spot을 교체하는 것이 좋습니다. O2-스팟은손가락으로 컵 안쪽에서 스팟을 부드럽게 밀어내면서 대체됩니다. 바깥쪽에서 컵으로 부드럽게 밀어 새로운 지점을 배치합니다. - 왼쪽에 나열된 다른 테스트에서 pO2 스캔을 선택합니다. 화면 오른쪽에서 설정을 선택하고 표 1에나열된 매개 변수에 따라 설정되었는지 확인합니다. 모든 측정에 대해 동일한 설정을 유지합니다.
- 이러한 설정을 저장하려면 확인을 누르세요 | 확인 .
참고: 기본 설정은 표 1에 나열되어 있지만 사용자 기본 설정 및 조사 목적에 따라 조정할 수 있습니다. 예를 들어, 병든 행동을 더 광범위하게 연구하기 위해 탈산소 속도와 지속 시간을 변경할 수 있습니다.
3. 견본 수집 및 준비
참고 : 기술의 검증을 위해, 에틸렌디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 치료 혈액 38 SCD 환자와 5 건강 한 대조군 대학 의료 센터 위트레흐트 또는 텍사스 어린이 혈액 학 센터에서 포함, 다른 임상 연구에서 ( 네덜란드 임상시험 등록부[NTR] 식별자, NTR 6779 및 NTR 6462), 외래 진료소를 방문했거나 입원한 환자로부터의 익명화된 남은 혈액 샘플이 사용되었다.
- EDTA를 포함하는 관에서 venipuncture (최소 300 μL / 샘플)에 의한 혈액 샘플을 수집합니다. 혈액이 4 °C에서 적어도 30 분 동안 저장되어 있지만 24 시간 이상은 보관되지 않았는지 확인하십시오.
참고: 구연산염 인산염 덱스트로스 아데닌(CPDA) 또는 헤파린도 사용할 수 있지만, 산소 구배 에대한 ektacytometry에 대하여 샘플 보존에 대한 이들 시약의 영향은 잘 알려져 있지 않다. - 균질화하기 위해 반전하여 샘플을 부드럽게 섞습니다. 샘플을 흔들지 마십시오. 측정 전에 샘플을 롤러 벤치의 실온까지 예열시키십시오.
참고: 4°C에서 1시간 이상 보관되는 샘플 튜브(9-10 mL)는 15분 동안 예열해야 합니다. 4 °C에서 1 시간 미만으로 보관하면 10 분 동안 예열해야합니다. 4°C에서 1시간 이상 보관되는 샘플 튜브(2-6 mL)는 10분 동안 예열되어야 합니다. 4 °C에서 1 시간 미만으로 보관하면 5 분 동안 예열해야합니다. - 혈액학 분석기에서 전체 혈액 수를 측정합니다. 이렇게 하려면 EDTA를 함유한 튜브에 20-200 μL의 전혈을 섭취하십시오. 튜브에 흡인 바늘을 놓고 혈액학 분석기의 바늘 뒤에 있는 버튼을 눌러 측정을 시작합니다.
참고: 전체 혈액 수에서 RBC 수는 측정되며, 이는 산소 구배 에탁토메트리 측정을 표준화하는 데 중요한 요소입니다. RBC 카운트는 유세포측정에 의해 전방 및 측면 산란에서 계산됩니다. 건강한 대조군에서 정상적인 RBC 수는 여성의 경우 3.7-5.0 x 1012/L이고 남성의 경우 4.2-5.5 x 1012/L입니다. SCD를 가진 환자에 있는 RBC 수는 일반적으로 감소됩니다. 일부 혈액학 분석기는 또한 개별 산소 구배 ektacytometry 곡선의 해석에 추가 값이 될 수 있는 % 조밀 한 적혈구 (% DRBC)를 측정할 것입니다. - 5 mL PVP (200 x 106 RbCs / 바이알)에서 200 x 106 RBC의 RBC 카운트로 전혈 샘플을 표준화하여 첨가 될 샘플의 양을 조정합니다. 총 RBC 수가 200 x 106보다 작으면 회절 패턴과 EI가 영향을 받습니다.
- 아래 방정식을 사용하여 계수를 수행합니다.
4.0/xx (x 1012/L) x 50 = yy μL 전혈/바이알 PVP
여기서 xx는 3.3단계에서 얻은 계산된 RBC 카운트이고 yy는 실제 측정에 필요한 전혈의 양이다. 빈혈및 RBC 수에 영향을 미치는 그밖 요인의 급료에 따라서, 요구되는 전혈의 양은 40-90 μL입니다.
- 아래 방정식을 사용하여 계수를 수행합니다.
4. 산소 그라데이션 ektacytometry 측정
- 계산된 시료 부피(yy μL)를 PVP내로 피펫하여 총 부피 5 mL을 얻었다. 혈액을 3배 부드럽게 재중단하여 팁을 미리 적어 주세요. RBC에 추가적인 스트레스를 피하기 위해 넓은 개구부가 있는 파이펫 팁을 사용하십시오.
참고: 공기 접촉을 피하기 위해 가능한 한 짧은 시간 동안 PVP 바이알을 엽니다. - 혈액/PVP 혼합물의 2.0 mL를 바늘없이 3 mL 주사기에 천천히 그립니다. 플런저를 눌러 눈에 보이는 기포와 과도한 샘플 용액을 1.5-1.8 mL이 주사기에 남을 때까지 (컵 볼륨에 따라 다름).
- 커넥터를 통해 밥에 총 샘플 볼륨을 천천히 고르게 주입합니다. 시료의 레벨이 산소 센서(분홍색 반점) 위와 작은 흡입 구멍 위에 있는지 확인합니다. 주사기안에 시료 용액을 두지 마십시오.
- 새로 를 클릭하고 PVP의 샘플 식별자, 비고, 기부 날짜 및 점도를 입력합니다. 확인을 클릭 | 흡인. 60초 가 지나면 컵이 회전하고 샘플을 15초 동안 흡인합니다. 회전이 멈출 때 확인을 클릭합니다. 기기 뚜껑을 닫습니다. 계속을 클릭합니다 | 산소 그라데이션 ektacytometry고정 이득으로 수행으로 지금 시작. 측정에는 약 28분이 소요됩니다.
- 측정 후 소프트웨어에서 자동으로 계산되는 곡선과 매개 변수를 보여 주는 보고서를 인쇄합니다. 원시 데이터가 설정의지정된 폴더에 자동으로 저장되어 있는지 확인합니다. 최대 EI(EI최대),최소 EI(EI분),pO2@95%EI(PoS) 및 영역(곡선 아래 영역)이 자동으로 계산되어 인쇄된 보고서 및 원시 데이터에 추가됩니다.
- EI최대값과 EI분간의 차이를 계산하여 수동으로 ΔEI를 획득합니다. 탈산소 전 평균 EI(pO2 100-120 mmHg)의 차이를 취하고 100-120 mmHg에서 재산소 화 중에 평균 EI 값을 사용하여 백분율 회수율을 계산합니다.
5. ektacytometer의 청소
- 시료 주사기를 제거하고 증류수 또는 탈이온수로 채워진 주사기로 교체합니다.
- 클린(Clean)을누르고 헹구는 동안 커넥터를 천천히 세척합니다. 양방향으로 플러시해야 합니다.
- 주사기를 제거하고 밥을 들어 올립니다. 밥, 컵, 커넥터를 부드러운 천으로 완전히 말립니다.
- 큰 주사기(10-50mL)를 사용하여 커넥터를 플러시하여 튜브와 밥에 남아 있는 물을 제거합니다. 밥의 하부 입구/출구를 차단하여 튜브의 역압을 제거하여 남은 물을 제거합니다.
- 컵에 밥을 낮춥습니다. 이제 기기가 다음 측정을 위해 준비되었습니다.
6. 기계의 종료
- 위에서 설명한 대로 마지막 측정 후에 기기가 제대로 헹김되었는지 확인하십시오. 적절한 튜브가 세척액과 관련이 있는지 확인합니다.
- 소프트웨어를 닫고 닫기를 누르고 시작을 눌러 하루 종일 정리 프로그램을 시작합니다.
- 전체 청소 프로그램을 완료 한 후, 주사기를 제거하고 밥을 들어 올립니다. 커넥터를 큰 주사기로 플러시합니다.
- 폐병을 비우고 부드러운 천으로 밥과 컵을 말립니다. 튜브와 밥에 남아있는 물을 제거하기 위해 커넥터를 플러시하십시오. 밥의 하부 입구/출구를 차단하여 튜브의 역압을 제거하여 남은 물을 제거합니다.
- 기기의 뚜껑을 닫습니다. 질소 실린더를 닫습니다. 컴퓨터와 기기를 끕니다.
Representative Results
산소 구배 ektacytometry는 SCD를 가진 환자에 있는 병든 행동을 특성화하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 연구에서는, 총 38명의 SCD 환자및 5개의 건강한 대조군에게서 혈액 샘플이 포함되었다. 건강한 컨트롤에서 회절 패턴은 휴식 시 원형이고 높은 전단 응력에서 타원형입니다4. 타원형 회절 패턴에서 연신율 지수(EI)는 회절 패턴의 높이와 폭을 기준으로 계산됩니다. 산소 구배 ektacytometry에서, 질소 가스에 의한 샘플의 느리고 지속적인 탈산소는 주변 공기에 의한 신속한 재산소로 이어진다. 이러한 조건하에서, RBC 병은 탈산소하에서 관찰될 수 있다. 이렇게 하면 아픈 적색 세포가 적용된 전단 응력 하에서 제대로 정렬되지 않기 때문에 회절 패턴이 왜곡됩니다. 따라서, 그들은 건강한 RBC(그림 2)와반대로 덜 변형 된 것으로 보인다.
그림 3A는 산소 구배 ektacytometry 동안 조건을 모방 한 탈산소시 낫 RBC의 모양이 어떻게 변하는지 보여 주지만, 변산소가없는 클리클 RBC는 모양의 변화를 보이지 않습니다. 이 과정은 산소 구배 ektacytometry 동안 회절 패턴의 왜곡을 초래하고, 따라서 EI의 감소. 그림 3B는 서로 다른 매개변수가 생성되는 다양한 회절 패턴을 보여줍니다.
ektacytometer에 의해 얻어진 대표적인 곡선은 도 3C에도시되어 있습니다. 6개의 파라미터는 RBC의 아픈 행동의 다른 특성을 반영합니다: EImax는 탈산소 전 측정시작 시 최대 EI입니다. 이 매개변수는 기준 위치를 나타내며 주변 공기에서 전체 RBC 집단의 전체 변형 가능성을 반영합니다. EI분은 탈산소 후 최소한의 변형성을 나타내는 최소 EI입니다. 이 매개변수는 탈산소 시 (낫) RBC의 모양과 방향의 변화를 반영합니다. ΔEI는 EImax와 EI분간의차이로, 한 번의 탈산소 를 통해 얼마나 많은 세포가 더클수 있는지를 나타냅니다. 5% 낫의 포인트 (PoS5%)는탈산소 동안 EI최대의 5% 감소를 측정하는 pO 2(mmHg)입니다. 이것은 병든 과정이 시작되는 산소 장력을 나타냅니다. 면적은 100mmHg와 pO2분(mmHg) 사이의 EI 및 pO 2측정의 적분 계산에 의해 결정되는 곡선 아래의 영역을 반영합니다. 이는 앞서 설명한 파라미터 EImax,EI분및 PoS. 회수는 기준선에서 EI에 비해 재산소화의 최종 부분 동안 EI의 차이를 나타낸다. 두 EI 값은 100-120 mmHg의 pO2로 측정됩니다. 이 매개변수는 탈산소 동안 낫이 재산소화(22)동안 낫을 역전시키는 RBC의 용량을 반영한다. 중복 측정의 파라미터는 일반적으로 변이 계수(CV)와 lt;5%(중앙값 1.83%)를 가집니다. CV > 5%가 얻어진 경우, 세 번째 측정이 수행되었다. 매개 변수 EI최대 및 복구는 중앙값 CV & lt;1%로 가장 재현할 수 있습니다.
건강한 대조군, HbS 형질(heterozygous HbS) 및 동형접합체 SCD 환자를 가진 환자들의 대표적인 곡선은 도 4A에나타내고 있다. HbSC 환자의 대표적인 곡선은 상이한 병들기 과정을 나타낼 수 있는 더 낮은 회복을나타낸다(그림 4B). 하이드록시우레아(HU) 및 수혈로 치료된 HbSS 환자의 대표적인 곡선은 도 4C 및 도4D에나타내고 있다. 분명히, HS 형질의 대표적인 곡선 (HbAS 세포) 및 HHBS 환자 (동형 자이클 (HbSS)와 동형 접합 정상 (HbAA) 세포의 혼합물로 구성된 HbSS 환자의 RbCs 사이에 큰 차이가 있습니다, 그림 4A ,D). 치료되지 않은 SCD 환자 및 HU 및 수혈 치료 환자의 곡선의 명확한 차이는 이 분석법의 유용성을 강조한다(도4C,D). HbF 및 HbS의 수준은 EI분과 크게 상관 관계가 있고, 더 적은 정도로, PoS(그림 5A–D). 이는 환자의 평가에 중요한 실험실 파라미터가 산소 구배 ektacytometry에도 반영된다는 것을 나타낸다. 노르목증에서 병든 세포의 수와 조밀 한 RBC (DRBC)의 백분율은 EImax 값에 크게 상관관계가 있기 때문에 EImax 값에 영향을 미칩니다(그림 5E–F)이는 EImax가 또 다른 중요한 요소를 반영한다는 것을 나타냅니다. 아픈 과정. 이러한 결과는 이러한 다른 특성이 %HbS, %HbF, 노르목디아의 병든 세포 및 %DRBC가 다른 매개 변수에 미치는 영향을 보여줍니다.
그림 1. ektacytometer의 개략적 설정. ektacytometer는 세포에 전단 응력적용을 하기 위하여 Couette 시스템을 이용합니다. 회전 외부 실린더(컵)와 정적 내부 실린더(bob)는 37°C에서 층류 흐름을 생성하여 전단 응력을 유도하는 데 사용됩니다. 밥과 컵 사이에는 혈액 현탁액이 주입되는 작은 간격이 있습니다. 레이저 빔은 혈액 현탁액을 통해 밥에서 빛나고 RBC의 존재에 의해 흩어져 있습니다. 회절 패턴은 카메라에 의해 투영되고 분석됩니다. 연동 지수(EI)는 회절패턴(4)의높이(a) 및 폭(b)으로 계산됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 산소 그라데이션 ektacytometry 모듈을 가진 ektacytometer의 개략적 설치. 질소 가스의 주입과 함께 혈액 현탁액의 탈산소를 천천히 보여주는 모듈의 개략도(N2). 산소 장력은 LED 섬유로부터 O 2-스팟으로 전송된 루미노폴레 신호의담금질 량에 의해 측정된다. 탈산소시, 낫 RBC는 낫을 시작, 그들의 변형이 감소할 것이다, 그들은 더 이상 타원형 RBC와 정렬되지 않습니다. 병에 걸린 RBC는 회절 패턴을 왜곡하여 타원에서 마름모꼴 또는 다이아몬드 모양으로 모양을 변경합니다. 이러한 회절 패턴의 모양변화는 EI의 감소를 초래한다. pO2 및 EI의 측정은 컵에서 동일한 높이에서 수행되지 않습니다. 이렇게 하면 탈산소 곡선과 재산소 곡선 간의 차별이 향상되고 따라서 곡선을 더 잘 해석할 수 있습니다. 이 그림은 Rab 등에서 수정되었습니다.22이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 대표적인 산소 그라데이션 ektacytometry 곡선 및 회절 패턴. (a)산소 구배 에탁토토메트리와 유사한 조건하에서 탈산소시, 낫 RBC가 고정되었다. 제어 낫 RBC에서, 동일한 조건이 사용되었다, 하지만 질소 가스없이. 탈산소 된 낫 RBC는 제어 RCC와 대조적으로 모양의 변화를 보여줍니다.(B)탈산소 및 전단 응력 (30 Pa) 시, 회절 패턴은 타원에서 마름모꼴로 변화한다. (C)산소 그라데이션 ektacytometry의 대표적인 곡선. 최대 신장 지수(EImax)는기준 위치를 나타내며 전체 RBC 모집단의 전체 변형가능성을 나타낸다. 최소 EI(EImin)는탈산소 시 RBC의 모양 과 방향의 변화로 인해 발생하는 최소한의 변형성을 나타냅니다. ΔEI (dEI, EImax와 EI분사이의 EI 차이)는 탈산소의 한 라운드 동안 얼마나 많은 세포가 낫을 할 수 있는지를 보여줍니다. 낫의 포인트 (PoS, pO2 에서 5% EI 감소) 첫 번째 RBC가 낫을 시작할 때 산소 장력을 보여줍니다. 곡선 아래의 영역(pO2min = 100mmHg)은 매개변수 영역에서 계산됩니다. 이 요약은 EI최대,EI분,그리고 PoS. 재산소화 중에 병에 걸린 세포의 용량은 매개 변수 복구 (재산소 동안 도달 한 EI최대의 백분율)에 표시됩니다. 해석을 돕기 위해 모든 데이터 요소가 모든 개별 실험에서 한 줄로 연결되어 결과를 그래픽으로 표시했습니다. 이 그림은 Rab 등에서 수정되었습니다.22이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 산소 구배 ektacytometry 매개 변수는 SCD를 가진 SCD 환자의 유전자형 및 처리 식이요법과 상관관계가 있습니다. (A)HbS 운반체(HbS 특성)의 RBC의 대표적인 그래프 및 치료되지 않은 HbSS 환자와 관련하여 건강한 대조군. (B)치료되지 않은 HbSS 환자와 관련하여 헤모글로빈 SC 질환(HbSC)을 가진 환자의 RBC의 대표적인 그래프. (C)하이드록시우레아의 RBC의 대표적인 그래프는 치료되지 않은 HbSS 환자와 관련하여 동형접합체 SCD 환자(HbSS HU)를 치료하였다. (D)치료되지 않은 HbSS 환자와 관련하여 수혈(HbSS) 수혈로 치료된 HbSS 환자의 RBC의 대표적인 그래프. 이 그림은 Rab 등에서 수정되었습니다.22이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 산소 구배 ektacytometry 매개 변수는 %HbF, %HbS, 노르목증에서 %sicked 세포 및 %%조밀 한 RBC와 연관됩니다. (a)최소 신장 률(EImin)및 15HbS 또는 HbS/β-thalassemia 환자의 %HbF의 선형 상관관계가 수혈되지 않습니다. (B)EI분및 %HbS의 선형 상관관계(C)PoS 및 %HbF의 선형 상관관계 (D)PoS 및 %HbS의 선형 상관관계(E) 최대 EI(EImax)의선형 상관관계 및 아픈 세포의 백분율 디지털 현미경으로 측정한 노르목시아. (F)HbSS를 가진 21명의 환자의 EI최대 및 백분율 조밀한 RBC(%DRBC)의 선형 상관관계. 이 그림은 Rab 등에서 수정되었습니다.22이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 설정 | ||
| 파일 | 스토리지 디렉토리 | |
| 일반 옵션 | 기본 매체 점도 | PVP의 점도 |
| pO2 스캔 | 최소 포인포타임(들) | 60 |
| pO2 스캔 전단 응력 (Pa) | 30 | |
| pO2 모든 결정 (S) | 20 | |
| 이동 평균 크기 | 2 | |
| pO2 스캔 단계; 편집 | 0 -OFF; 60 -ON; 1360 –OFF; 1640 -OFF | |
| Cal. 사이의 면적(mmHg) | 10 및 100 | |
| pO2 제어 | 꺼기(선택하지 않은) |
표 1. ektacytometer의 바람직한 설정.
Discussion
여기서 우리는 산소 구배 ektacytometry, 산소 농도의 범위에서 SCD 환자에서 적혈구의 병든 행동을 연구하는 데 사용할 수있는 방법을 설명합니다(그림 4 및 그림 5). 재현 가능한 결과를 얻으려면 결과에 영향을 미치는 요인을 식별하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 온도는 주로 점성 용액(PVP)의 두께에 미치는 영향으로 인해 RBC 변형성에 큰 영향을 미칩니다. 기계를 37°C로 철저히 가열하려면 하루 가 시작될 때 테스트 측정을 수행하는 것이 좋습니다. 이렇게 하면 결과의 재현성이 향상됩니다. 점성 용액의 삼투압은 좁은 범위 (PVP의 경우 282-286 mOsm / kg) 내에 있어야하는데, 삼투압은 수화 상태에 영향을 미치고 RBC 변형성에 영향을 미치기 때문입니다. PVP의 pH 및 점도또한 엄격하게 통제되어야 합니다. pH와 온도의 차이는 곡선에 극적으로 영향을 미칠 수 있습니다22. 또한 컵, 밥 및 튜브에 남아있는 물은 RBC의 용해를 유발하여 컵에 존재하는 손상되지 않은 RBC가 적기 때문에 잘못된 데이터를 초래할 수 있습니다.
산소 구배 ektacytometry를 수행하는 설정은 특정 조사 질문을 해결하기 위해 조정할 수 있습니다. 기본 설정은 표 1에나열되어 있습니다. 1,300s의 탈산소 시간은 대부분의 환자에 대한 낮은 EI분 귀착되지 않았다는 것을 보여주는 관찰에 근거하여 선택되었습니다. 대조적으로, 탈산소 시간을 단축하면 산소 그라데이션 ektacytometry의 차별적 힘을 방해할 것이다. 재산소 화 시 HbS 폴리머를 빠르게 분해하고, 탈산소 전에 측정된 값으로 EI의 수반되는 복원으로 인해 재산소 시간이 280s로 설정되었습니다. 전단 응력은 삼투성 그라데이션 ektacytometry와 유사한 30 Pa로 설정되었다. 이 매개 변수를 낮추면 차별적 힘을 방해할 수 있습니다. 탈산소 제어는 모든 환자 샘플에 탈산소 속도 집합이 적용되는 경우 사용할 수 있습니다. 우리의 바람직한 설정에서, 탈산소의 비율은 독특한 헤모글로빈 해리 곡선 때문에 환자 특정이기 때문에 이 선택권은 꺼졌습니다. 따라서, 탈산소 제어를 전환하면 분석에서 이러한 특성이 제거됩니다. 그러나, 산소 그라데이션 ektacytometry의이 기능은 아직 조사 중입니다.
몇몇 잘 알려진 요인은 산소 구배 ektacytometry 매개 변수, 즉 pH, 온도 및 삼투에 영향을 미칩니다. Ektacytometry, 특히 PoS는 2,3-디포스포글리세레이트(2,3-DPG)22의영향을 받습니다. 또한, %HbF와 EI분사이에 명확한 상관 관계가 있으며, 이하 의 PoS(그림 5A–D). EImax는 노르목증의 겸상 적혈구와 관련이 있으며, 이는 VOC 직후, 노르목디아(EImax)에서의RBC 변형성이 더 높다는 관측을 설명할 수 있습니다. 후자는 가장 아픈 세포의 파괴에 의해 발생, 따라서 VOC 동안 덜 변형 RBC16. 그림 5F에서볼 수 있듯이, 더 높은 % 조밀 한 RBC (헤모글로빈 농도가 있는 RBC로 정의 >1.11 mg/mL)는 낮은 EImax와강하게 상관관계가 있습니다. 이는 조밀한 세포가 노르목에서 RBC 변형성에 중요한 요소임을 나타내며, 이전에 보고된 결과1과유사합니다.
시료의 표준화는 재현 가능한 결과를 얻고 다른 유전자형과 치료법을 구별하는 데 매우 중요합니다. RBC 수가 회절 패턴의 강도에 영향을 미치기 때문에 RBC 개수에 대한 수정이 중요합니다. 낮은 RBC 숫자가 밥과 컵 사이의 간격에 있는 경우 곡선은 위쪽과 왼쪽으로 이동합니다. 또한 곡선이 변동하여 매개 변수, 특히 PoS의 정확한 계산을 방해합니다.
이 기술의 한계는 EI 값이 다른 하위 집단을 포함한 모든 셀의 평균을 나타낸다는 것입니다. SCD 환자에 있는 RBC 인구의 이질성 및 ektacytometry 측정에 그것의 영향은 집중적으로 공부되었습니다. 이는 RBC 카운트23,24에대해 보정된 대신 에 대한 회절 패턴의 크기가 고정값으로 조정되는 것을 여기서 표준화하는 결과를 초래했다. 이러한 표준화 방식이 산소 구배 에택티튜드 측정에도 적용되어야 하는지 여부는 현재 연구 중입니다.
저산소 조건하에서 RBC 변형성을 측정하는 몇 가지 기술은 ektacytometer25,26,27외부에서 일어난 탈산소 단계에 기초하여 개발되었다. 이러한 조건하에서, 세포 행동의 차이는 생리적 pH25하에서HbS 형질을 가진 환자 와 건강한 대조군 사이에서 관찰되지 않았다. 산소 구배 ektacytometry, 그러나, 명확하게 HbS 특성을 가진 개인에서 낮지만 명백한 PoS를 보여줍니다(그림 4A). 현재까지, 일상적인 임상 사례에서, 개별 환자의 RBC가 체외에서 낫을 하는 경향을 측정하는 유일한 대체 방법은 형태학 기반의 병든 분석법을 포함합니다: RBC는 HbS 중합을 촉진하는 조건하에서 배양됩니다. 낮은 산소 장력 또는 낮은 pH. 인큐베이션 후 고정제가 추가되고 병든 세포의 비율은 가벼운 현미경 검사법을 사용하여 수동으로 또는 디지털로 계산됩니다. 많은 전임상 및 초기 상 약리학 시험은 SCD28,29,30,31에서 임상 적 효능을 예측할 수 있도록 이차 결과 변수를 생성하기 위해 병들기분석기를사용합니다. ,32. 그러나, 시간이 많이 걸리고, 가변성이 높고, 민감도가 낮고, 기술이 자동화되지 않아 노동집약적이다. 더욱이, 병들기로 인한 형태학적 변화는 2차원 정적분석법2이기때문에 RBC 변형성과 같은 생리학적 파라미터와 잘 상관되지 않을 수 있다.
산소 그라데이션 ektacytometry는 신속하고 재현 가능한 병의 기능적인 분석기를 제공합니다. 이것은 내피 표면을 고려하지 않는 시험관 내 시험입니다. 그러나, 그것은 겸상적한 행동 및 RBC 특성의 기능적인 양상을 제공합니까, 겸상적혈구 연구 결과를 위한 유망한 기술 만들기. 기술의 미래 응용은 SCD 환자에 있는 처리 효험을 감시하고, 새로운 처리 전략에 대한 biomarker로 봉사하고, 겸상적인 행동을 공부하고, SCD에 있는 줄기 세포 이식 후에 키메라증을 감시하는 것을 포함합니다.
Disclosures
저자는 경쟁적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 유로 스타 그랜트 estar18105및 RR 메카트로닉스가 제공하는 무제한 교부금에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 저자는 시스토 헨드릭스와 얀 드 조에텐의 기술 지원에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADVIA 120 Hematology Analyzer | Siemens | 067-A004-14 | Instrument |
| Cell-Dyn Sapphire Hematology Analyzer | Abbott | 8H00-01 | Instrument |
| Lorrca | RR Mechatronics | LORC109230 or LORC109110 | Instrument |
| Lorrca Software version V5.08 | RR Mechatronics | - | Software |
| Nitrogen gas 4.8 or 5.0 | Local | - | |
| O2-spot | RR Mechatronics | PO2S020153 | O2 measurement |
| Oxygenscan module (pO2scan) | RR Mechatronics | PO2S109000 | Add-on |
| Oxy-ISO | RR Mechatronics | QRR 030905 | Viscous solution |
| X-Clean | RR Mechatronics | QRR 010946 | Cleaning solution Lorrca |
References
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