यहाँ, हम नियंत्रित deoxygenation और reoxygenation के तहत सिकल सेल रोग के साथ रोगियों से नमूनों में लाल रक्त कोशिका विकृति को मापने के लिए एक तेजी से और पुन: उत्पादन विधि ऑक्सीजन ढाल ektacytometry, एक तेजी से और पुन: उत्पादन योग्य विधि प्रस्तुत करते हैं। इस तकनीक लाल रक्त कोशिका sickling का अध्ययन करने के लिए और सिकल सेल रोग उपचार प्रभावकारिता की निगरानी करने के लिए एक रास्ता प्रदान करता है.
सिकल सेल रोग (एससीडी) में, बीटा-ग्लोबिन के लिए जीन कोडिंग में एक एकल बिंदु उत्परिवर्तन असामान्य हीमोग्लोबिन एस (एचबीएस) के उत्पादन का कारण बनता है। जब deoxygenated, HbS बहुलक कर सकते हैं, हीमोग्लोबिन की कठोर छड़ बनाने, लाल रक्त कोशिकाओं (RBCs) के sickling में जिसके परिणामस्वरूप. इन बीमार RBCs काफी विकृति कम हो गई है, vaso-occlusion के कारण, जो कई एससीडी से संबंधित नैदानिक जटिलताओं की ओर जाता है, दर्द सहित, स्ट्रोक, और अंग क्षति. आरबीसी विकृति भी आरबीसी निर्जलीकरण द्वारा कम है, घने लाल रक्त कोशिकाओं है कि सिकल की संभावना है और अधिक में जिसके परिणामस्वरूप. तारीख करने के लिए, वहाँ एक भी व्यापक रूप से उपलब्ध नहीं है, तेजी से, और reproduible प्रयोगशाला परख रोग गंभीरता की भविष्यवाणी करने में सक्षम है या सीधे उपन्यास के लिए उपचार प्रभाव की निगरानी, गैर-fetal हीमोग्लोबिन प्रेरक चिकित्सा. इस अध्ययन में, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए pO2 के एक समारोह है कि SCD रोगियों में sickling व्यवहार की मात्रा के लिए अनुमति देता है के रूप में आरबीसी विकृति को मापने के लिए. ऑक्सीजन प्रवणता एकादशमिति उपाय आरबीसी विकृति, को पी ओ2के एक समारोह के रूप में दीर्घीकरण सूचकांक (ईआई) के रूप में व्यक्त किया गया है। आरबीसी deoxygenation और reoxygenation के एक दौर के दौरान 30 पा की एक निश्चित कतरनी तनाव को उजागर कर रहे हैं. छह readout पैरामीटर का उत्पादन कर रहे हैं. इनमें से, sickling के बिंदु (पीओएस), पीओ2 के रूप में परिभाषित किया गया है जिस पर अधिकतम ईआई (ईआईअधिकतम) 5% कमी से पता चलता है, और deoxygenation के दौरान न्यूनतम EI (EIमिनट) सबसे जानकारीपूर्ण हैं, एक व्यक्ति रोगी के पीओ2 को दर्शाती है जिस पर sickling शुरू होता है और एक रोगी की लाल रक्त कोशिकाओं की न्यूनतम विकृति, क्रमशः. PoS ऑक्सीजन के लिए एक व्यक्ति के रोगी के हीमोग्लोबिन संबंध के साथ जुड़ा हुआ है, जबकि ईआईमिन भ्रूण हीमोग्लोबिन के स्तर के साथ एक मजबूत संबंध से पता चलता है. हम निष्कर्ष है कि ऑक्सीजन ढाल ektacytometry एससीडी के साथ रोगियों के उपचार की निगरानी करने के लिए एक आशाजनक तकनीक है, नैदानिक और पूर्व नैदानिक परीक्षणों में विरोधी बीमार एजेंटों के लिए एक biomarker के रूप में, और एक महत्वपूर्ण उपकरण से RBCs के sickling व्यवहार का अध्ययन करने के लिए एससीडी और सिकल सेल लक्षण के साथ व्यक्तियों.
एससीडी में, एचबीएस के उत्पादन में एक एकल बिंदु उत्परिवर्तन का परिणाम होता है, जो deoxygenation पर बहुलक कर सकते हैं। HbS बहुलकीकरण RBCs के sickling का कारण बनता है और आरबीसी विकृति कम कर देता है. एंडोथेलियम के आरबीसी बीमारऔर आरबीसी पालन के संयोजन विभिन्न एससीडी जटिलताओं की ओर जाता है, जिसमें वासो-ऑक्लूसिव संकट (वीओसी), स्ट्रोक, अंग क्षति, और क्रोनिक हेमोलिटिक एनीमिया शामिल हैं। यहां तक कि normoxic शर्तों पर, आरबीसी विकृति एससीडी के साथ रोगियों में समझौता किया है. कम ऑक्सीजन सांद्रता में विकृति में और कमी आई है। मुख्य खिलाड़ी जो नॉर्मोक्सिया में विकृति का निर्धारण करते हैं, वे घने कोशिकाएं, अपरिवर्तनीय रूप से बीमार कोशिकाएं (आईएससी) और निर्जलित कोशिकाएं होती हैं, जिनमें से सभी में सतह से मात्रा अनुपात1,2,3होता है।
एकात्मकता मिति आरबीसी विकृति को मापने के लिए एक स्थापित विधि है, व्यापक रूप से वंशानुगत हेमोलिटिक एनीमिया के निदान के लिए प्रयोग किया जाता है, विशेष रूप से झिल्ली पैथी4. इसका उपयोग हीमोरेय विज्ञान5,6,7,8,9 का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकताहै. परासरणी प्रवणता एकेटासाइटोमिति, जिसमें आरबीसी विकृति को अडमोलिटी में निरंतर परिवर्तन के दौरान मापा जाता है, का उपयोग एक दशकसेअधिक समय से एससीडी का अध्ययन करने के लिए किया गयाहै। भ्रूण हीमोग्लोबिन (HbF) का प्रतिशत HbS बहुलकीकरण के सबसे मजबूत inhibitors में से एक है क्योंकि न तो HbF और न ही इसके मिश्रित संकर tetramer ([2S]) deoxyHbS बहुलक चरण12में प्रवेश कर सकते हैं . हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि एससीडी रोगियों में एचबीएफ के स्तर में वृद्धि से सतह से मात्रा अनुपात बेहतर होता है, जिससे जलयोजन की स्थिति में सुधार होता है और इस प्रकार गैर-ट्रांसफ्यूजरोगियों में विकृति11होती है।
आरबीसी विकृति एससीडी जटिलताओं के लिए एक biomarker के रूप में अतीत में अध्ययन किया गया है, लेकिन परस्पर विरोधी परिणामों के साथ. अध्ययनों में क्रॉस-सेक्शनली और स्थिर अवस्था में, आरबीसी विकृति के उच्च स्तर वाले व्यक्तियों में ऑस्टियोनेक्रोसिस की अधिक घटनाएं पाई गई और अधिक दर्द संकट13,14,15पाया गया. इन निष्कर्षों के विपरीत, जब एक तीव्र VOC के दौरान स्थिर राज्य मूल्यों की तुलना में, आरबीसी विकृति एक ही व्यक्ति16के भीतर अनुदैर्घ्य अध्ययन में कमी आई थी. यह विसंगति विभिन्न परिस्थितियों (यानी स्थिर राज्य बनाम वीओसी के दौरान) के तहत आरबीसी विकृति का अध्ययन करने का परिणाम हो सकता है। बीमार कोशिकाओं का प्रतिशत एक वीओसी के शुरू में उच्च है और कोशिकाओं को तेजी से नष्ट कर रहे हैं के रूप में संकट की प्रगति, जो स्थिर राज्य पार अनुभागीय घटना डेटा और वीओसी के दौरान प्राप्त अनुदैर्घ्य डेटा के बीच अंतर की व्याख्या कर सकते हैं. हालांकि, अन्य कारकों, जैसे एंडोथेलियल सतह के लिए आरबीसी subpopulations के पालन के रूप में भी VOC की घटना में महत्वपूर्ण हो सकता है. एससीडी में, यह deoxygenation के दौरान विकृति को मापने के लिए और अधिक चिकित्सकीय प्रासंगिक है, क्योंकि vaso-occlusion आम तौर पर hypoxic postcapillary venules में होता है और कम hypoxic microcapillary नेटवर्क17में नहीं. इसके अतिरिक्त, ISCs की उपस्थिति normoxia में विकृति को मापने के लिए एक ektacytometer की क्षमता को बदल सकता है. विवर्तन पैटर्न का विरूपण आईएससी के कारण होता है, जिसका परिणाम प्रवाह1,2,3के दौरान गुट निरपेक्षता से होता है।
वीओसी के पैथोफिजियोलॉजी का अध्ययन करने के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण में एक कृत्रिम सतह18,एकल सेल विद्युत प्रतिबाधा माइक्रोफ्लो साइटोमेट्री19,माइक्रोफ्लूइडिक-आधारित मॉडल के संयोजन मात्रात्मक के लिए आरबीसी पालन की माप शामिल है एकल कोशिका rheology20,और लेजर प्रेरित बहुलकीकरण21के साथ sickling और unsickling सेल के माप. हालांकि वादा, इन तकनीकों महंगा कर रहे हैं, श्रम गहन, और व्यापक ऑपरेटर प्रशिक्षण की आवश्यकता है. इसके अलावा, परख है कि आकृति विज्ञान आधारित हैं सेलुलर व्यवहार का अध्ययन करने की क्षमता की कमी, इस तरह के विकृति के रूप में, एक ऑक्सीजन ढाल के एक समारोह के रूप में.
इस अध्ययन में, हम एक ektacytometer के साथ प्रदर्शन किया एक तेजी से और reproduible कार्यात्मक परख का वर्णन. यह एक अगली पीढ़ी के एक्टासाइटोमिति माप है जो डीऑक्सीजन (1,300 एस) और तेज पुनर्ऑक्सीजन (280 एस) के दौरान ईआई के रूप में व्यक्त आरबीसी विकृति के विभिन्न गुणात्मक पहलुओं को मापता है। इन समय अंतराल HbS बहुलक गठन के लिए अनुमति देते हैं, और इस तरह आकृतिक परिवर्तन और फिर वसूली की घटना. डाइऑक्सीजन नाइट्रोजन गैस शुरू करने से होता है, जो धीरे-धीरे एक्टासाइटोमीटर के बॉब और कप के बीच के अंतराल में रक्त नमूने में ऑक्सीजन तनाव को कम करता है। आरबीसी विकृति लगातार मापा जाता है, जबकि ऑक्सीजन तनाव कप की दीवार में मौजूद एक छोटे से ओ2स्पॉट के माध्यम से हर 20 s मापा जाता है। परीक्षण के दौरान, लगभग 80 PO2 माप उस पल में मापा ईआई करने के लिए युग्मित कर रहे हैं. ऑक्सीजन का दबाव deoxygenation के दौरान 20 mmHg नीचे चला जाता है, और reoxygenation परिवेश हवा के निष्क्रिय प्रसार द्वारा सुविधा है. एक्टासाइटोमीटर तथा ऑक्सीजन प्रवणता एक्टासाइटोमिति मॉड्यूल की प्रायोगिक स्थापना चित्र 1 और चित्र 2में वर्णित है। एक्टासाइटोमेट्री का सिद्धांत लेजर बीम से प्रकाश के आरबीसी-प्रेरित प्रकीर्णन पर आधारित है। जब एक ही समय में कतरनी प्रतिबल लागू किया जाता है तो इसका परिणाम दीर्घवृत्तीय विवर्तन प्रतिवर्तन होता है (चित्र 1)।
यहाँ हम ऑक्सीजन प्रवणता एक्टासाइटोमेट्री का वर्णन करते हैं, एक विधि जिसका उपयोग ऑक्सीजन सांद्रता की श्रेणी के अंतर्गत एससीडी रोगियों से लाल रक्त कोशिकाओं के रुग्ण व्यवहार का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है(चित्र 4 तथा चित्र 5)। पुन: उत्पादनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए, परिणामों को प्रभावित करने वाले कारकों की पहचान करना महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, तापमान आरबीसी विकृति पर एक बड़ा प्रभाव पड़ता है, ज्यादातर चिपचिपा समाधान (PVP) की मोटाई पर इसके प्रभाव के कारण. हम अच्छी तरह से 37 डिग्री सेल्सियस के लिए मशीन गर्मी करने के लिए दिन के शुरू में एक परीक्षण माप प्रदर्शन की सलाह देते हैं। यह परिणामों की पुन: उत्पादन क्षमता में सुधार होगा। चिपचिपा समाधान की osmolarity एक संकीर्ण सीमा के भीतर होना चाहिए (282-286 mOsm/kg PVP के लिए), क्योंकि osmolarity जलयोजन स्थिति को प्रभावित करती है, जो बारी में आरबीसी विकृति को प्रभावित करता है. पीवीपी के पीएच और चिपचिपापन को भी कसकर विनियमित किया जाना चाहिए। पीएच और तापमान में अंतर वक्रों को नाटकीय रूप से22तक प्रभावित कर सकता है। इसके अतिरिक्त, कप, बॉब, और ट्यूबों में शेष पानी, RBCs के lysis कारण हो सकता है, जिससे गलत डेटा में जिसके परिणामस्वरूप, क्योंकि कप में मौजूद कम बरकरार RBCs मापा जाएगा.
ऑक्सीजन प्रवणता ektacytometry प्रदर्शन करने के लिए सेटिंग्स विशिष्ट जांच प्रश्नों को संबोधित करने के लिए समायोजित किया जा सकता है। पसंदीदा सेटिंग्स तालिका 1में सूचीबद्ध हैं। 1,300 s के एक deoxygenation समय दिखा रहा है कि deoxygenation के विस्तार ज्यादातर रोगियों के लिए एक कम EIमिनट में परिणाम नहीं था टिप्पणियों के आधार पर चुना गया था. इसके विपरीत, विऑक्सीजन समय को कम करने से ऑक्सीजन प्रवणता एक्टैटोमेट्री की भेदभावकारी शक्ति बाधित हो जाती है। reoxygenation समय reoxygenation के दौरान तेजी से हल HbS पॉलिमर के कारण 280 s करने के लिए सेट किया गया था, और deoxygenation से पहले मापा मूल्यों की ओर ईआई के सहवर्ती बहाली. शीर तनाव को 30 पा पर सेट किया गया था, जो परासरणी प्रवणता एक्टासाइटोमेट्री के अनुरूप है। इस पैरामीटर को कम करने से भेदभाव की शक्ति बाधित हो सकती है। deoxygenation नियंत्रण इस्तेमाल किया जा सकता है अगर deoxygenation गति का एक सेट हर रोगी के नमूने के लिए लागू किया जाता है. हमारी पसंदीदा सेटिंग्स में, इस विकल्प को बंद कर दिया गया था क्योंकि विऑक्सीजन की दर अद्वितीय हीमोग्लोबिन वियोजन वक्र के कारण रोगी-विशिष्ट है। इसलिए, deoxygenation नियंत्रण पर स्विचन परख से इस विशेषता को खत्म होगा. तथापि, ऑक्सीजन प्रवणता एक्टासाइटोमेट्री की यह विशेषता अभी भी जांच के अधीन है।
कई प्रसिद्ध कारक ऑक्सीजन प्रवणता एक्टासाइटोमेट्री पैरामीटर को प्रभावित करते हैं, अर्थात् पीएच, तापमान, और अमोलता। एक्साइटोमेट्री, विशेष रूप से पीओएस, 2,3-डाइफॉस्फोग्लिसेरेट (2,3-डीपीजी)22से प्रभावित है। इसके अलावा, %HbF और EIमिनटके बीच एक स्पष्ट सहसंबंध है , और कुछ हद तक पीओएस (चित्र 5ए–डी) । ईआईअधिकतम normoxia पर सिकल कोशिकाओं के साथ जुड़ा हुआ है, जो अवलोकन की व्याख्या कर सकते हैं कि शीघ्र ही एक VOC के बाद, normoxia पर आरबीसी विकृति (ईआईअधिकतम),अधिक है. बाद में सबसे बीमार कोशिकाओं के विनाश के कारण होता है, और इसलिए वीओसी16के दौरान कम विकृत RBCs . जैसा कि चित्र 5चमें दर्शायागया है , उच्च %dense RBCs (एक हीमोग्लोबिन सांद्रता के साथ RBCs के रूप में परिभाषित किया गया है और 1.11 मिलीग्राम/एमएल) एक कम ईआईअधिकतमके साथ दृढ़ता से सहसंबंधित . यह इंगित करता है कि घने कोशिकाओं normoxia पर आरबीसी विकृति में एक महत्वपूर्ण कारक हैं, पहले की सूचना दी परिणाम1के समान .
नमूनों का मानकीकरण पुन: उत्पादनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए और विभिन्न जीनोटाइप और उपचार के बीच भेद करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। आरबीसी की संख्या विवर्तन पैटर्न की तीव्रता को प्रभावित करने के रूप में आरबीसी की संख्या के रूप में आरबीसी गिनती के लिए सही महत्वपूर्ण है। यदि बॉब और कप के बीच के अंतराल में कम आरबीसी संख्याएं मौजूद हैं, तो वक्र ऊपर की ओर और बाईं ओर खिसकाएगा। इसके अतिरिक्त, वक्र उतार चढ़ाव होगा, मानकों की सटीक गणना में बाधा, विशेष रूप से POS.
इस तकनीक की एक सीमा यह है कि EI मान सभी कोशिकाओं के एक औसत का प्रतिनिधित्व करता है, विभिन्न subpopulations सहित. एससीडी रोगियों में आरबीसी की आबादी की विषमता और एक्टासाइटोमेट्री माप पर इसके प्रभाव का गहन अध्ययन किया गया है। इसके परिणामस्वरूप मानकीकरण हुआ जिसमें विवर्तन पैटर्न के आकार को आरबीसी गणना23,24के लिए सही करने के बजाय एक निश्चित मान में समायोजित कर दिया जाता है . चाहे या नहीं मानकीकरण के इस तरह भी ऑक्सीजन ढाल ektacytotry माप करने के लिए लागू किया जाना चाहिए वर्तमान में अध्ययन के तहत है.
हाइपोक्सिक परिस्थितियों के तहत आरबीसी विकृति को मापने के लिए कई तकनीकों को एक्टीसाइटोमीटर25,26,27के बाहर हुए डिऑक्सीजन कदम के आधार पर विकसित किया गया . इन परिस्थितियों में, शारीरिक पीएच25के तहत एचबीएस लक्षण और स्वस्थ नियंत्रण वाले रोगियों के बीच सेलुलर व्यवहार में अंतर नहीं देखा गया। ऑक्सीजन प्रवणता एक्टासाइटोमेट्री, तथापि, स्पष्ट रूप से HbS लक्षण वाले व्यक्तियों में कम लेकिन स्पष्ट स्थिति दर्शाती है (चित्र 4क)। तारीख करने के लिए, नियमित नैदानिक अभ्यास में, केवल वैकल्पिक तरीकों इन विट्रो में सिकल के लिए एक व्यक्ति रोगी RBCs की प्रवृत्ति को मापने के लिए एक आकृति विज्ञान आधारित sickling परख शामिल हैं: RBCs शर्तों है कि HbS बहुलकीकरण को बढ़ावा देने के तहत incubated रहे हैं, जैसे कम ऑक्सीजन तनाव या कम पीएच. ऊष्मायन के बाद एक स्थिर जोड़ा जाता है और बीमार कोशिकाओं का प्रतिशत मैन्युअल रूप से या डिजिटल रूप से प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके गिना जाता है। कई पूर्व नैदानिक और प्रारंभिक चरण फार्माकोलॉजिक परीक्षण sickling परख का उपयोग करने के लिए एक माध्यमिक परिणाम चर उत्पन्न करने के लिए एससीडी28,29,30,31 में नैदानिक प्रभावकारिता की भविष्यवाणी करने में सक्षम हो ,32. हालांकि, यह समय लगता है, परिवर्तनशीलता उच्च है और संवेदनशीलता कम है, तकनीक स्वचालित नहीं है और, इसलिए, श्रम गहन. इसके अलावा, बीमार के कारण आकृतिपरिवर्तनीय परिवर्तन शारीरिक मापदंडों, जैसे आरबीसी विकृति के साथ अच्छी तरह से सहसंबंधित नहीं हो सकता है, क्योंकि यह एक 2-आयामी स्थैतिक परख2है।
ऑक्सीजन प्रवणता एक्टासाइटोमेट्री रुग्णों की एक कार्यात्मक परख प्रदान करती है जो तीव्र और पुनरुत्पाद्य होती है। यह एक इन विट्रो परीक्षण है जो एंडोथेलियल सतह पर विचार नहीं करता है। हालांकि, यह sickling व्यवहार और आरबीसी विशेषताओं के कार्यात्मक पहलुओं प्रदान करता है, यह सिकल सेल अध्ययन के लिए एक आशाजनक तकनीक बना रही है. तकनीक के भविष्य के अनुप्रयोगों SCD रोगियों में उपचार प्रभावकारिता की निगरानी शामिल, नए उपचार रणनीतियों के लिए एक biomarker के रूप में सेवारत, sickling व्यवहार का अध्ययन, और SCD में स्टेम सेल प्रत्यारोपण के बाद झंकार की निगरानी.
The authors have nothing to disclose.
यह काम भाग में एक Eurostars अनुदान estar18105 द्वारा और आरआर Mechatronics द्वारा प्रदान की एक अप्रतिबंधित अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. लेखक अपने तकनीकी सहायता के लिए Sisto Hendriks और जन डे zoeten धन्यवाद.
ADVIA 120 Hematology Analyzer | Siemens | 067-A004-14 | Instrument |
Cell-Dyn Sapphire Hematology Analyzer | Abbott | 8H00-01 | Instrument |
Lorrca | RR Mechatronics | LORC109230 or LORC109110 | Instrument |
Lorrca Software version V5.08 | RR Mechatronics | – | Software |
Nitrogen gas 4.8 or 5.0 | Local | – | |
O2-spot | RR Mechatronics | PO2S020153 | O2 measurement |
Oxygenscan module (pO2scan) | RR Mechatronics | PO2S109000 | Add-on |
Oxy-ISO | RR Mechatronics | QRR 030905 | Viscous solution |
X-Clean | RR Mechatronics | QRR 010946 | Cleaning solution Lorrca |