ここでは、酸素勾配エクタキトメトリー、制御脱酸素及び再酸素化下の鎌状赤血球疾患患者からの試料中の赤血球変形性を測定する迅速かつ再現性のある方法を提示する。この技術は、赤血球病欠を研究し、鎌状赤血球疾患の治療有効性を監視する方法を提供する。
鎌状赤血球病(SCD)では、β-グロビンをコードする遺伝子における単一点突然変異が異常ヘモグロビンS(HbS)の産生を引き起こす。脱酸素されると、HbSは重合することができ、ヘモグロビンの硬い棒を形成し、赤血球(RBC)の鎌状赤血球をもたらす。これらの鎌状のRBCは変形性を著しく低下させ、血管閉塞を引き起こし、痛み、脳卒中、臓器損傷を含む多数のSCD関連の臨床合併症を引き起こす。RBC変形はRBC脱水によっても減少し、鎌を病する可能性が高い緻密な赤血球をもたらす。現在までに、疾患の重症度を予測したり、新規な非胎児ヘモグロビン誘導療法の治療効果を直接監視したりできる、広く利用可能で迅速かつ再現可能な実験室アッセイは1つもない。本研究では、SCD患者における病欠行動の定量を可能にするpO2の関数としてRBC変形性を測定するプロトコルを説明する。酸素勾配エクタキトメトリーはRBC変形性を測定し、伸長指数(EI)として表し、pO2の関数として表す。RBCは、脱酸素および再酸素化の1ラウンド中に30Paの固定せん断応力にさらされる。6 つの読み出しパラメーターが生成されます。このうち、最大EI(EImax)が5%の減少を示すpO2として定義される病欠(PoS)は、脱酸素中の最小EI(EImin)が最も有益であり、個々の患者のpO2を反映しています。病欠が始まり、患者の赤血球の最小限の変形性がそれぞれ始まる。PoSは酸素に対する個々の患者のヘモグロビン親和性に関連し、EIminは胎児ヘモグロビンレベルと強い相関関係を示す。我々は、酸素勾配エクタキトメトリーは、臨床および前臨床試験における抗病弱剤のバイオマーカーとして、SCD患者の治療を監視する有望な技術であり、RBCの病欠行動を研究するための重要なツールであると結論付ける。SCDと鎌状赤血球の形質を持つ個人.
SCDでは、単一点突然変異はHbSの産生をもたらし、脱酸素時に重合することができる。HbS重合はRBCの病気を引き起こし、RBCの変形性を低下させる。内皮へのRBC病欠とRBCの付着の組み合わせは、血管閉塞性危機(VOC)、脳卒中、臓器損傷、および慢性血栓性貧血を含む様々なSCD合併症につながる。ノルモキシック条件でも、RbC変形性はSCD患者において損なわれる。低酸素濃度では変形性がさらに低下する。ノルモクシアでの変形性を決定する主要なプレーヤーは、緻密な細胞、不可逆的に病んだ細胞(ISC)、および脱水細胞であり、そのすべてが表面対体積比1、2、3の減少を有する。
エクタキトメトリーは、RBC変形性を測定する確立された方法であり、遺伝性血栓性麻酔薬、特にメムブラノ症4の診断に広く用いられている。また、ヘモロジー5、6、7、8、9を研究するために使用することができます。浸透図勾配エクタキトメトリーは、浸透モスラリティの連続的な変化の間にRBC変形性が測定され、10年10、11年以上にわたってSCDを研究するために使用されてきた。胎児ヘモグロビン(HbF)のパーセンテージは、HbFおよびその混合ハイブリッド四量体(△2βSγ)がデオキシHbSポリマー相12に入ることができないため、HbS重合の最も強い阻害剤の1つである。最近の研究は、SCD患者におけるHbFレベルの増加が、より良い表面対体積比につながり、それによって水和状態を改善し、したがって非トランスフューズされた患者11における変形性を示唆している。
RBC変形性は、SCD合併症のバイオマーカーとして過去に研究されてきたが、相反する結果を有する。断面的かつ安定した状態で行われた研究において、RBC変形性の高いレベルを有する個体は、骨壊死の発生率が高く、より多くの疼痛危機13、14、15を有することが判明した。これらの知見とは対照的に、急性VOC中の定常状態値と比較すると、RBC変形性は同一個体内の縦方向の研究において減少した16.この不一致は、異なる条件下(すなわち、定常状態対VOCの間)でRBC変形性を研究した結果である可能性がある。鎌状赤血球の割合はVOCの開始時に高く、危機が進むにつれて細胞は急速に破壊され、VOC中に得られた定常状態の断面発生データと縦方向のデータの違いを説明する可能性があります。しかしながら、内皮表面へのRBC部分集団の付着などの他の要因も、VOCの発生において重要であり得る。SCDでは、脱酸素中の変形性を測定することがより臨床的に関連しており、血管閉塞は典型的には低酸素後毛細血管静脈で起こり、低酸素性微小毛細管ネットワーク17では起こらない。さらに、ISCの存在は、ノルモクシアでの変形性を測定するエクタキトメーターの能力を変更する可能性があります。回折パターンの歪みは ISC によって引き起こされ、フロー1、2、3の間の非線形が原因です。
VOCの病態生理学を研究するための代替アプローチには、人工表面18へのRBC付着の測定、単一セル電気インピーダンスマイクロフローサイトメトリー19、定量を組み合わせたマイクロ流体ベースモデルが含まれる。単一細胞リヒロジー20との細胞病欠および非病欠の測定、およびレーザー誘導重合21。有望ですが、これらの技術はコストがかかり、労働集約的であり、広範なオペレータトレーニングを必要とします。また、形態に基づくアッセイには、酸素勾配の関数として、変形性などの細胞挙動を研究する能力が欠けている。
本研究では、エクタキトメータで行われる迅速かつ再現性の高い機能アッセイについて述べている。脱酸素時(1,300s)および迅速な再酸素化(280s)の間にEIとして表されるRBC変形性の異なる質的側面を測定する次世代エクタキトメトリー測定です。これらの時間間隔は、HbSポリマー形成を可能にし、それによって形態学的変化の発生および回復を可能にする。脱酸素は、エクタキトメーターのボブとカップの間の隙間で血液サンプル中の酸素張力をゆっくりと低下させる窒素ガスを導入することによって起こる。RBC変形性は、カップの壁に存在する小さなO2スポットによって酸素張力を20sごとに測定しながら連続的に測定されます。試験中、約80pO2測定がその時点で測定されたEIに結合されます。酸素圧力は脱酸素中に20mmHg以下に低下し、再酸素化は周囲の空気の受動的拡散によって促進される。エクタキトメータおよび酸素勾配エクタキ測定モジュールの実験的セットアップを図1および図2に記載する。エクタキトメトリーの原理は、レーザー光からの光のRBC誘発散乱に基づいています。この結果、せん断応力を同時に適用すると楕円回パターンが発生します(図1)。
ここでは、酸素勾配エクタキトメトリー、酸素濃度の範囲下でSCD患者からの赤血球の病欠挙挙行動を研究するために使用できる方法を説明する(図4および図5)。再現性のある結果を得るためには、結果に影響を与える要因を特定することが重要です。例えば、温度はRBC変形性に大きな影響を与えますが、主に粘性溶液(PVP)の厚さに及ぼす影響によるものです。機械を37°Cに徹底的に加熱するには、1日の開始時に試験測定を行うことをお勧めします。これにより、結果の再現性が向上します。粘性溶液の浸透性は狭い範囲(PVPの場合は282~286 mOsm/kg)内にある必要があります。PVPのpHと粘度も厳しく調整する必要があります。pHと温度の違いは、曲線に劇的に影響を与えることができます22.さらに、カップ、ボブ、チューブ内の残りの水は、RBCのリシスを引き起こす可能性があり、それによって、カップ内に存在する無傷のRBCが少なく測定されるため、誤ったデータをもたらす。
酸素勾配エクタキトメトリーを実行するための設定は、特定の調査の質問に対処するために調整することができます。推奨される設定を表 1に示します。脱酸素の延長は、ほとんどの患者のために低いEI分をもたらさなかったことを示す観察に基づいて1,300sの脱酸素時間が選択された。対照的に、脱酸素時間の短縮は、酸素勾配エクタキトメトリーの判別力を妨げるであろう。再酸素化時間は、再酸素化時にHbSポリマーを急速に解決し、脱酸素前に測定された値に対するEIの併用回復のために280sに設定した。せん断応力は30Paに設定され、これは浸透勾配エクタキトメトリーに似ています。このパラメータを下げると、判別力が妨げられる可能性があります。脱酸素制御は、脱酸素速度のセットがすべての患者サンプルに適用される場合に使用することができる。我々の好ましい設定では、脱酸素の速度は独特なヘモグロビン解離曲線による患者特異的であるため、このオプションはオフになった。したがって、脱酸素制御をオンに切り替えると、アッセイからこの特性が排除されます。しかし、酸素勾配エクタキトメトリーのこの特徴はまだ調査中である。
いくつかのよく知られた因子は、酸素勾配エクタキトメトリーパラメータ、すなわちpH、温度、および浸透圧に影響を与えます。エクタキトメトリー、特にPoSは、2,3-ジホスホグリセリン酸(2,3-DPG)22の影響を受ける。また、%HbFとEIminとの間には明確な相関関係があり、PoSの程度は低い(図5A–D)。EImaxはノルモキシアの鎌状赤血球に関連しており、VOCの直後にノルモクシア(EImax)でRBC変形性が高いという観察を説明できる。後者は、最も鎌状の細胞の破壊によって引き起こされ、したがってVOC16の間に変形性の低いRBC.図 5Fに示すように、より高い %高密度 RBC (ヘモグロビン濃度を持つ RBC として定義されている >1.11 mg/mL) は、より低い EImaxと強く相関します。これは、緻密な細胞がノルモクシアにおけるRBC変形性において重要な因子であることを示し、以前に報告された結果1と同様である。
サンプルの標準化は、再現性の高い結果を得るために、および異なる遺伝子型と治療を区別するために非常に重要です。RBC の数が回折パターンの強度に影響を与えるため、RBC カウントの補正は重要です。ボブとカップの間のギャップに低いRBC番号が存在する場合、曲線は上方および左にシフトします。さらに、曲線は変動し、パラメータ、特にPoSの正確な計算を妨げる。
この手法の制限は、EI 値が異なる部分母集団を含むすべてのセルの平均を表すことです。SCD患者におけるRBC集団の不均一性とエクタキ測定への影響が集中的に研究されている。その結果、回折パターンのサイズがRBCカウント23、24に対して補正されるのではなく、固定値に調整されるという標準化が生じた。この標準化方法を酸素勾配エクタキ測定測定にも適用すべきかどうかは、現在検討中である。
低酸素条件下でRBC変形性を測定するいくつかの技術は、エクタキトメータ25、26、27の外で行われた脱酸素ステップに基づいて開発された。これらの条件下では、HbS形質を有する患者と生理学的pH25下での健全なコントロールとの間で細胞行動の違いは認められなかった。しかし、酸素勾配エクタキトメトリーは、HbS形質を有する個体においては、低いが明らかなPoSを明らかに示している(図4A)。現在までに、日常的な臨床現場では、個々の患者のRBCがインビトロで鎌状赤血球に対する傾向を測定する唯一の代替方法には、形態ベースの病病アッセイが含まれます:RBCは、HbS重合を促進する条件下でインキュベートされます。低酸素張力または低pH。固定剤はインキュベーション後に添加され、鎌状細胞の割合は光顕微鏡を用いて手動またはデジタルでカウントされます。多くの前期薬理学的試験は、SCD 28、29、30、31の臨床有効性を予測することができる二次的な結果変数を生成するために鎌状赤面アッセイを使用する、32.しかし、時間がかかり、ばらつきが高く感度が低く、技術は自動化されず、したがって、労働集約的である。また、鎌による形態学的変化は、RBC変形性などの生理学的パラメータとうまく相関しない場合があり、それは2次元静的アッセイ2である。
酸素勾配エクタキトメトリーは、迅速かつ再現可能なシリングの機能的アッセイを提供します。これは、内皮表面を考慮しないインビトロ試験です。しかし、それは鎌状赤血球研究のための有望な技術を作る鎌状赤血球の行動およびRBC特性の機能的側面を提供する。この技術の将来の応用には、SCD患者における治療効果のモニタリング、新しい治療戦略のバイオマーカーとしての役割、病欠行動の研究、SCDにおける幹細胞移植後のキメラリズムのモニタリングなどが含まれる。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、ユーロスターズの助成金estar18105とRRメカトロニクスが提供する無制限の助成金によって部分的にサポートされました。著者たちは、シスト・ヘンドリックスとヤン・デ・ゾエテンの技術サポートに感謝しています。
ADVIA 120 Hematology Analyzer | Siemens | 067-A004-14 | Instrument |
Cell-Dyn Sapphire Hematology Analyzer | Abbott | 8H00-01 | Instrument |
Lorrca | RR Mechatronics | LORC109230 or LORC109110 | Instrument |
Lorrca Software version V5.08 | RR Mechatronics | – | Software |
Nitrogen gas 4.8 or 5.0 | Local | – | |
O2-spot | RR Mechatronics | PO2S020153 | O2 measurement |
Oxygenscan module (pO2scan) | RR Mechatronics | PO2S109000 | Add-on |
Oxy-ISO | RR Mechatronics | QRR 030905 | Viscous solution |
X-Clean | RR Mechatronics | QRR 010946 | Cleaning solution Lorrca |