여기에서, 우리는 통제된 탈산소 및 재산소화의 밑에 겸상적혈구 질병을 가진 환자에게서 견본에 있는 적혈구 변형성을 측정하는 산소 구배 ektacytometry, 신속하고 재현가능한 방법을 제시합니다. 이 기술은 적혈구 낫을 연구하고 겸상적혈구 치료 효능을 모니터링하는 방법을 제공합니다.
겸상적혈구 (SCD)에서, 베타 글로빈을 코딩하는 유전자에 있는 단 하나 점 돌연변이는 이상한 헤모글로빈 S (HbS)의 생산을 일으키는 원인이 됩니다. 탈산소되면 HbS는 중합하여 헤모글로빈의 단단한 막대를 형성하여 적혈구 (RBC)의 병든 결과로 이어질 수 있습니다. 이 병든 RBC는 크게 변형성을 감소시켜 혈관 폐색을 일으켜 통증, 뇌졸중 및 장기 손상을 포함한 수많은 SCD 관련 임상 합병증을 유발합니다. RBC 변형은 또한 RBC 탈수에 의해 감소, 낫에 더 가능성이 조밀 한 적혈구의 결과. 현재까지, 질병 중증도를 예측하거나 신규한 비태아 헤모글로빈 유도 요법에 대한 치료 효과를 직접 모니터링할 수 있는 널리 이용 가능하고, 신속하고, 재현 가능한 실험실 분석실험은 존재하지 않는다. 본 연구에서, 우리는 SCD 환자에서 아픈 행동의 정량을 허용하는 pO2의 함수로 RBC 변형성을 측정하는 프로토콜을 기술한다. 산소 구배 ektacytometry는pO2의함수로서 신장 지수 (EI)로 표현된 RBC 변형성을 측정합니다. RBC는 탈산소 및 재산소화의 한 라운드 동안 30 Pa의 고정 전단 응력에 노출된다. 6개의 판독 매개변수가 생성됩니다. 이들 중, 최대 EI(EImax)가5% 감소를 나타내는 pO2로 정의된 병살지점(PoS)은 탈산소(EImin)동안 최소 EI가 가장 유익하며, 이는 개별 환자의 pO2를 반영하는 것입니다. 병이 시작되고 환자의 적혈구의 최소한의 변형성. PoS는 산소에 대한 개별 환자의 헤모글로빈 친화도와 관련이 있는 반면, EImin은 태아 헤모글로빈 수준과 강한 상관관계를 나타낸다. 우리는 산소 구배 ektacytometry가 임상 및 전임상 시험에서 항 병살제에 대한 바이오 마커로, SCD환자의 치료를 모니터링하는 유망한 기술이며, RBC의 아픈 행동을 연구하는 중요한 도구라고 결론지었습니다. SCD와 겸상적혈구 특성을 가진 개인.
SCD에서, 단 하나 점 돌연변이는 탈산소시 중합할 수 있는 HbS의 생산을 초래합니다. HbS 중합은 RBC의 병든 을 일으키고 RBC 변형성을 감소시킵니다. 내피에 RBC 병살과 RBC 준수의 조합은 혈관 폐색 위기 (VOC), 뇌졸중, 장기 손상 및 만성 용혈성 빈혈을 포함한 다양한 SCD 합병증으로 이어집니다. 노르목 성 조건에서도, RBC 변형성은 SCD 환자에서 손상됩니다. 변형성은 낮은 산소 농도에서 더 감소된다. 노르목에서 변형성을 결정하는 주요 플레이어는 조밀 한 세포, 비가역적으로 병든 세포 (ISC) 및 탈수 된 세포이며, 모두 표면 대 부피 비율1,2,3이감소합니다.
Ektacytometry는 유전 용혈성 빈혈, 특히 membranopathies4의진단에 널리 사용되는 RBC 변형성을 측정하는 확립 된 방법입니다. 그것은 또한출혈학을공부하는 데 사용할 수 있습니다5,6,7,8,9. RBC 변형성이 삼투압의 지속적인 변화 동안 측정되는 삼투성 구배 ektacytometry는, 10 년 이상 을 위해 SCD를 연구하기 위하여 이용되었습니다10,11. 태아 헤모글로빈(HbF)의 백분율은 HbF 또는 이의 혼합 하이브리드 테트라머(2βSγ)가 deoxyHbS 중합상12상에진입할 수 없기 때문에 HbS 중합의 가장 강력한 억제제 중 하나이다. 최근 연구는 SCD 환자에서 HbF 수준을 증가시키면 표면 대 부피 비가 더 좋아지며, 따라서 수화 상태를 개선하고 따라서 비트랜스퓨우 환자에서 변형성을 향상시키는 것으로 나타났습니다11.
RBC 변형성은 SCD 합병증을 위한 바이오마커로 과거에 연구되었지만, 상충하는 결과를 가지고 있다. 단면및 정상 상태에서 수행된 연구에서, RBC 변형성의 상부를 가진 개인은 골괴사 및 더 많은 통증 위기의 더 높은 발생률을 가지고 있는 것으로 나타났다13,14,15. 이러한 사실 인정과는 대조적으로, 급성 VOC 동안의 정상 상태 값과 비교할 때, RBC 변형성은 동일한개인(16)내에서 종방향 연구에서 감소하였다. 이러한 불일치는 상이한 조건하에서 RBC 변형성을 연구한 결과일 수 있다(즉, VOC 대 정상 상태). 병에 걸린 세포의 백분율은 VOC의 시작에 높고 세포는 위기가 진행됨에 따라 급속하게 파괴되며, 이는 VOC 동안 얻은 정상 상태 단면 발생 률 데이터와 종방향 데이터의 차이를 설명할 수 있습니다. 그러나, 내피 표면에 RBC 하위 집단의 준수와 같은 다른 요인은, 또한 VOC의 발생에 중요 할 수있다. SCD에서, 탈산소 동안 변형성을 측정하는 것이 임상적으로 더 관련성이 높으며, 왜냐하면 혈관-폐색은 전형적으로 저산소 후 모세관 에서 발생하고 저산소 미세 모세관네트워크(17)에서일어나지 않기 때문이다. 추가적으로, ISC의 존재는 normoxia에 기형성을 측정하는 ektacytometer의 기능을 바꿀 수 있습니다. 회절 패턴의 왜곡은 흐름1,2,3동안 비정렬로 인해 발생하는 ISC에 의해 발생합니다.
VOC의 병리생리학을 연구하는 대체 접근법은 인공 표면18,단세포 전기 임피던스 미세 유량 세포측정19,정량적 결합미세유체 기반 모델에 대한 RBC 준수의 측정을 포함한다. 단세포투과(20)와레이저 유도중합(21)을가진 세포 병들기 및 병든 의 측정. 유망하지만 이러한 기술은 비용이 많이 들고 노동 집약적이며 광범위한 작업자 교육이 필요합니다. 또한, 형태기반의 세포학적 인 세포 행동을 연구할 수 있는 능력이 부족한, 기형과 같은, 산소 구배의 기능으로.
본 연구에서는, 우리는 ektacytometer로 수행된 신속하고 재현 가능한 기능성 분석방법을 기술한다. 이것은 탈산소(1,300초) 및 신속한 재산소(280초) 동안 EI로 표현된 RBC 변형성의 상이한 질적 측면을 측정하는 차세대 ektacytometry 측정이다. 이러한 시간 간격은 HbS 중합체 형성을 허용하고, 이에 의하여 형태학적 변화 및 회수의 발생을 허용한다. 탈산소는 질소 가스를 도입하여 발생하며, 이는 ektacytometer의 밥과 컵 사이의 간격에서 혈액 샘플의 산소 긴장을 서서히 감소시다. RBC 변형성은 지속적으로 측정되고 산소 장력은 컵의 벽에 존재하는작은 O 2-spot을 통해 20s마다 측정됩니다. 시험 기간 동안 약 80pO2 측정은 그 순간에 측정된 EI에 결합됩니다. 산소 압력은 탈산소 동안 20 mmHg 이하로 떨어지고, 재산소화는 주변 공기의 수동 확산에 의해 촉진된다. ektacytometer 및 산소 구배 ektacytometry 모듈의 실험 설정은 도 1 및 도 2에설명되어 있습니다. ektacytometry의 원리는 레이저 광선에서 빛의 RBC 유도된 산란에 근거를 둔다. 이렇게 하면 전단 응력이 동시에 가해지면 타원형 회절 패턴이 생성됩니다(그림1).
여기서 우리는 산소 구배 ektacytometry, 산소 농도의 범위에서 SCD 환자에서 적혈구의 병든 행동을 연구하는 데 사용할 수있는 방법을 설명합니다(그림 4 및 그림 5). 재현 가능한 결과를 얻으려면 결과에 영향을 미치는 요인을 식별하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 온도는 주로 점성 용액(PVP)의 두께에 미치는 영향으로 인해 RBC 변형성에 큰 영향을 미칩니다. 기계를 37°C로 철저히 가열하려면 하루 가 시작될 때 테스트 측정을 수행하는 것이 좋습니다. 이렇게 하면 결과의 재현성이 향상됩니다. 점성 용액의 삼투압은 좁은 범위 (PVP의 경우 282-286 mOsm / kg) 내에 있어야하는데, 삼투압은 수화 상태에 영향을 미치고 RBC 변형성에 영향을 미치기 때문입니다. PVP의 pH 및 점도또한 엄격하게 통제되어야 합니다. pH와 온도의 차이는 곡선에 극적으로 영향을 미칠 수 있습니다22. 또한 컵, 밥 및 튜브에 남아있는 물은 RBC의 용해를 유발하여 컵에 존재하는 손상되지 않은 RBC가 적기 때문에 잘못된 데이터를 초래할 수 있습니다.
산소 구배 ektacytometry를 수행하는 설정은 특정 조사 질문을 해결하기 위해 조정할 수 있습니다. 기본 설정은 표 1에나열되어 있습니다. 1,300s의 탈산소 시간은 대부분의 환자에 대한 낮은 EI분 귀착되지 않았다는 것을 보여주는 관찰에 근거하여 선택되었습니다. 대조적으로, 탈산소 시간을 단축하면 산소 그라데이션 ektacytometry의 차별적 힘을 방해할 것이다. 재산소 화 시 HbS 폴리머를 빠르게 분해하고, 탈산소 전에 측정된 값으로 EI의 수반되는 복원으로 인해 재산소 시간이 280s로 설정되었습니다. 전단 응력은 삼투성 그라데이션 ektacytometry와 유사한 30 Pa로 설정되었다. 이 매개 변수를 낮추면 차별적 힘을 방해할 수 있습니다. 탈산소 제어는 모든 환자 샘플에 탈산소 속도 집합이 적용되는 경우 사용할 수 있습니다. 우리의 바람직한 설정에서, 탈산소의 비율은 독특한 헤모글로빈 해리 곡선 때문에 환자 특정이기 때문에 이 선택권은 꺼졌습니다. 따라서, 탈산소 제어를 전환하면 분석에서 이러한 특성이 제거됩니다. 그러나, 산소 그라데이션 ektacytometry의이 기능은 아직 조사 중입니다.
몇몇 잘 알려진 요인은 산소 구배 ektacytometry 매개 변수, 즉 pH, 온도 및 삼투에 영향을 미칩니다. Ektacytometry, 특히 PoS는 2,3-디포스포글리세레이트(2,3-DPG)22의영향을 받습니다. 또한, %HbF와 EI분사이에 명확한 상관 관계가 있으며, 이하 의 PoS(그림 5A–D). EImax는 노르목증의 겸상 적혈구와 관련이 있으며, 이는 VOC 직후, 노르목디아(EImax)에서의RBC 변형성이 더 높다는 관측을 설명할 수 있습니다. 후자는 가장 아픈 세포의 파괴에 의해 발생, 따라서 VOC 동안 덜 변형 RBC16. 그림 5F에서볼 수 있듯이, 더 높은 % 조밀 한 RBC (헤모글로빈 농도가 있는 RBC로 정의 >1.11 mg/mL)는 낮은 EImax와강하게 상관관계가 있습니다. 이는 조밀한 세포가 노르목에서 RBC 변형성에 중요한 요소임을 나타내며, 이전에 보고된 결과1과유사합니다.
시료의 표준화는 재현 가능한 결과를 얻고 다른 유전자형과 치료법을 구별하는 데 매우 중요합니다. RBC 수가 회절 패턴의 강도에 영향을 미치기 때문에 RBC 개수에 대한 수정이 중요합니다. 낮은 RBC 숫자가 밥과 컵 사이의 간격에 있는 경우 곡선은 위쪽과 왼쪽으로 이동합니다. 또한 곡선이 변동하여 매개 변수, 특히 PoS의 정확한 계산을 방해합니다.
이 기술의 한계는 EI 값이 다른 하위 집단을 포함한 모든 셀의 평균을 나타낸다는 것입니다. SCD 환자에 있는 RBC 인구의 이질성 및 ektacytometry 측정에 그것의 영향은 집중적으로 공부되었습니다. 이는 RBC 카운트23,24에대해 보정된 대신 에 대한 회절 패턴의 크기가 고정값으로 조정되는 것을 여기서 표준화하는 결과를 초래했다. 이러한 표준화 방식이 산소 구배 에택티튜드 측정에도 적용되어야 하는지 여부는 현재 연구 중입니다.
저산소 조건하에서 RBC 변형성을 측정하는 몇 가지 기술은 ektacytometer25,26,27외부에서 일어난 탈산소 단계에 기초하여 개발되었다. 이러한 조건하에서, 세포 행동의 차이는 생리적 pH25하에서HbS 형질을 가진 환자 와 건강한 대조군 사이에서 관찰되지 않았다. 산소 구배 ektacytometry, 그러나, 명확하게 HbS 특성을 가진 개인에서 낮지만 명백한 PoS를 보여줍니다(그림 4A). 현재까지, 일상적인 임상 사례에서, 개별 환자의 RBC가 체외에서 낫을 하는 경향을 측정하는 유일한 대체 방법은 형태학 기반의 병든 분석법을 포함합니다: RBC는 HbS 중합을 촉진하는 조건하에서 배양됩니다. 낮은 산소 장력 또는 낮은 pH. 인큐베이션 후 고정제가 추가되고 병든 세포의 비율은 가벼운 현미경 검사법을 사용하여 수동으로 또는 디지털로 계산됩니다. 많은 전임상 및 초기 상 약리학 시험은 SCD28,29,30,31에서 임상 적 효능을 예측할 수 있도록 이차 결과 변수를 생성하기 위해 병들기분석기를사용합니다. ,32. 그러나, 시간이 많이 걸리고, 가변성이 높고, 민감도가 낮고, 기술이 자동화되지 않아 노동집약적이다. 더욱이, 병들기로 인한 형태학적 변화는 2차원 정적분석법2이기때문에 RBC 변형성과 같은 생리학적 파라미터와 잘 상관되지 않을 수 있다.
산소 그라데이션 ektacytometry는 신속하고 재현 가능한 병의 기능적인 분석기를 제공합니다. 이것은 내피 표면을 고려하지 않는 시험관 내 시험입니다. 그러나, 그것은 겸상적한 행동 및 RBC 특성의 기능적인 양상을 제공합니까, 겸상적혈구 연구 결과를 위한 유망한 기술 만들기. 기술의 미래 응용은 SCD 환자에 있는 처리 효험을 감시하고, 새로운 처리 전략에 대한 biomarker로 봉사하고, 겸상적인 행동을 공부하고, SCD에 있는 줄기 세포 이식 후에 키메라증을 감시하는 것을 포함합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 유로 스타 그랜트 estar18105및 RR 메카트로닉스가 제공하는 무제한 교부금에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 저자는 시스토 헨드릭스와 얀 드 조에텐의 기술 지원에 감사드립니다.
ADVIA 120 Hematology Analyzer | Siemens | 067-A004-14 | Instrument |
Cell-Dyn Sapphire Hematology Analyzer | Abbott | 8H00-01 | Instrument |
Lorrca | RR Mechatronics | LORC109230 or LORC109110 | Instrument |
Lorrca Software version V5.08 | RR Mechatronics | – | Software |
Nitrogen gas 4.8 or 5.0 | Local | – | |
O2-spot | RR Mechatronics | PO2S020153 | O2 measurement |
Oxygenscan module (pO2scan) | RR Mechatronics | PO2S109000 | Add-on |
Oxy-ISO | RR Mechatronics | QRR 030905 | Viscous solution |
X-Clean | RR Mechatronics | QRR 010946 | Cleaning solution Lorrca |