Здесь мы представляем оксигенный градиент эктацитометрии, быстрый и воспроизводимый метод измерения деформации красных кровяных телец в образцах у пациентов с серповидно-клеточной болезнью под контролируемой дезоксигенацией и реоксигенциацией. Этот метод обеспечивает способ изучения красных кровяных клеток серпового и для мониторинга эффективности лечения серповидно-клеточных заболеваний.
При серповидно-клеточной болезни (SCD) одноточечная мутация в кодировании генов для бета-глобина вызывает выработку аномального гемоглобина S (HbS). При дезоксигенировании, HbS может полимеризировать, образуя жесткие стержни гемоглобина, в результате чего серп красных кровяных телец (РБК). Эти серповые РБК значительно снизили уродственность, вызывая вазо-окклюзию, что приводит к многочисленным клиническим осложнениям, связанным с SCD, включая боль, инсульт и повреждение органов. Деформация РБК также снижается за счет обезвоживания РБК, что приводит к плотным эритроцитам, которые с большей вероятностью серповые. На сегодняшний день не существует ни одного широко доступного, быстрого и воспроизводимого лабораторного анализа, способного предсказывать тяжесть заболевания или непосредственно контролировать последствия лечения новых, нефетальных гемоглобинов, вызывающих терапию. В этом исследовании мы описываем протокол для измерения деформации РБК как функции PO2, что позволяет количественно ймеповидного поведения у пациентов SCD. Градиент кислорода эктацитометрия измеряет рбк деформацию, выраженную в виде индекса удлинения (EI), как функция pO2. РБК подвергаются фиксированному стрессу сдвига 30 Pa во время одного раунда дезоксигенации и реоксигенации. Производится шесть параметров считываемого. Из них точка серпового (PoS), определяется как PO2, при котором максимальный EI (EImax) показывает снижение на 5%, а минимальный EI во время дезоксигенации (EIмин)являются наиболее информативными, отражающими PO2 отдельного пациента, при котором серпотые начинается и минимальная деформация красных кровяных телец пациента, соответственно. PoS связано с гемоглобина сродство отдельных пациентов к кислороду, в то время как EIмин показывает сильную корреляцию с уровнями гемоглобина плода. Мы заключаем, что градиент кислорода эктачитометрия является перспективным методом для мониторинга лечения пациентов с SCD, как биомаркер для противобольных агентов в клинических и доклинических испытаниях, и важным инструментом для изучения серповидного поведения РБК от лиц с SCD и серповидно-клеточной черты.
В SCD, одна точка мутации приводит к производству HbS, которые могут полимеризации при дезоксигенации. Полимеризация HbS вызывает серп РБК и снижает деформацию РБК. Сочетание серпа РБК и приверженности РБК эндотелии приводит к различным осложнениям SCD, включая вазо-окклюзионные кризисы (ЛОС), инсульт, повреждение органов и хроническую гемолитическую анемию. Даже при нормокиси, деформация РБК скомпрометирована у пациентов с SCD. Унижаемость еще больше снижается при низких концентрациях кислорода. Ключевыми игроками, определяющими деформацию в normoxia являются плотные клетки, необратимо серотистые клетки (ISC), и обезвоженные клетки, все из которых имеют снижение поверхностного к объему соотношение1,2,3.
Эктачитометрия является устоявшимся методом измерения деформации РБК, широко используемым для диагностики наследственных гимолитических анемий, в частности мембранопатий4. Он также может быть использован для изучения геморхеологии5,6,7,8,9. Осмотический градиент эктацитометрии, в котором РБК деформации измеряется во время непрерывного изменения осмолальности, был использован для изучения SCD на протяжении более десяти лет10,11. Процент гемоглобина плода (HbF) является одним из сильнейших ингибиторов полимеризации HbS, потому что ни HbF, ни его смешанный гибридный тетрамер (No2’S) не могут войти в полимерную фазу deoxyHbS12. Недавние исследования показывают, что повышение уровня HbF у пациентов СКЗ приводит к лучшему соотношению поверхности к объему, тем самым улучшая состояние гидратации и, таким образом, умышленность у нетрансграниченных пациентов11.
Деформация РБК изучалась в прошлом как биомаркер для осложнений SCD, но с противоречивыми результатами. В исследованиях, проведенных поперечным и в стабильном состоянии, лиц с более высоким уровнем деформации РБК было установлено, что более высокая частота остеонекроза и более боли кризисов13,14,15. В отличие от этих выводов, по сравнению с устойчивыми значениями состояния во время острого ЛОС, деформация РБК была снижена в продольных исследованиях в рамках тех же лиц16. Это несоответствие может быть результатом изучения деформации РБК в различных условиях (т.е. при стабильном состоянии против ЛОС). Процент серсовых клеток высок в начале ЛОС, и клетки быстро разрушаются по мере развития кризиса, что может объяснить разницу между устойчивыми данными о поперечном сечении состояния и продольными данными, полученными во время ЛОС. Однако другие факторы, такие как присоединение субпопуляций РБК к эндотелиальной поверхности, также могут иметь важное значение для возникновения ЛОС. В SCD, это более клинически актуальной для измерения деформации во время дезоксигенации, потому что вазо-окклюзия обычно происходит в гипоксических postcapillary венулей, а не в менее гипоксической микрокапиллярной сети17. Кроме того, наличие МСЦ может изменить способность эктацитометра измерять деформацию при нормоксии. Искажение дифракционного шаблона вызвано МСК, что является результатом невыравнивания во время потока1,2,3.
Альтернативные подходы к изучению патофизиологии ЛОС включают измерения прилипания РБК к искусственной поверхности18, одноклеточной электрической импеданс микропотокции19, микрофлюидные модели, сочетающие количественные измерения серпа клетки и unsickling с одноклеточной реологией20,и лазер-индуцированной полимеризации21. Хотя эти методы являются перспективными, трудоемкими и требуют обширной подготовки операторов. Кроме того, анализы, основанные на морфологии, не обладают способностью изучать клеточное поведение, например, деформацию, как функцию градиента кислорода.
В этом исследовании мы описываем быстрый и воспроизводимый функциональный ассс, выполненный с помощью эктакитометра. Это следующее поколение эктацитометрии измерения, которое измеряет различные качественные аспекты деформации РБК, выраженные как EI во время дезоксигенации (1300 с) и быстрой реоксигенации (280 с). Эти временные интервалы позволяют hbS полимерного образования, и, таким образом, возникновение морфологических изменений, а затем восстановления. Дезоксигенация происходит путем введения азотного газа, который медленно снижает кислородное напряжение в образце крови в зазоре между бобом и чашкой эктакитометра. Деформация РБК постоянно измеряется, в то время как кислородноенапряжение измеряется каждые 20 с с помощью небольшого O 2-пятна, присутствуют в стене чашки. Во время теста, около 80 pO2 измерений связаны с EI измеряется в этот момент. При дезоксигенации давление кислорода падает ниже 20 мм рт. мг, а реоксигенации способствует пассивная диффузия окружающего воздуха. Экспериментальная установка эктацитометра и кислородного градиента эктацитометрии описана на рисунке 1 и рисунке 2. Принцип эктацитометрии основан на индуцированном РБК рассеянии света от лазерного луча. Это приводит к эллиптической дифракции картины, когда сдвига стресс применяется в то же время (Рисунок 1).
Здесь мы описываем кислородный градиент эктачитометрии, метод, который может быть использован для изучения серповидного поведения красных кровяных телец от пациентов SCD в диапазоне концентраций кислорода(Рисунок 4 и Рисунок 5). Для того, чтобы получить воспроизводимые результаты, важно определить факторы, которые влияют на результаты. Например, температура оказывает большое влияние на деформацию РБК, в основном из-за ее влияния на толщину вязкой раствора (PVP). Мы рекомендуем проводить тестовые измерения в начале дня, чтобы тщательно нагреть машину до 37 градусов по Цельсию. Это позволит повысить воспроизводимость результатов. Осмолялярность вязкого раствора должна находиться в узком диапазоне (282-286 мОзм/кг для PVP), так как осмоляритность влияет на состояние гидратации, что, в свою очередь, влияет на деформацию РБК. рН и вязкость PVP также должны быть жестко регламентированы. Различия в рН и температуре могут сильно влиять на кривые22. Кроме того, оставшаяся вода в чашке, боб, и трубки, может вызвать лиза РБК, что приводит к неверным данным, потому что меньше нетронутыми РБК, присутствующих в чашке будет измеряться.
Настройки для выполнения кислородного градиента эктачитометрии могут быть скорректированы для решения конкретных исследуемых вопросов. Предпочтительные настройки перечислены в таблице 1. Время дезоксигенации 1300 с было выбрано на основе наблюдений, показывающих, что расширение дезоксигенации не привело к снижениюEI мин для большинства пациентов. В отличие от этого, сокращение времени дезоксигенации будет препятствовать дискриминационной мощности кислородного градиента эктацитометрии. Время реоксигенации было установлено до 280 с из-за быстроразрешающих полимеров HbS во время реоксигенации, и сопутствующей восстановления EI к значениям, измеренным до дезоксигенации. Сдвига стресс был установлен на 30 Па, который аналогично осмотического градиента эктазитометрии. Снижение этого параметра может затруднить дискриминационную мощность. Контроль дезоксигенации может быть использован, если набор скорости дезоксигенации применяется к каждому образцу пациента. В наших предпочтительных настройках, эта опция была выключена, потому что скорость дезоксигенации пациента специфична из-за уникальной кривой диссоциации гемоглобина. Таким образом, включение контроля дезоксигенации исключило бы эту характеристику из асссе. Тем не менее, эта особенность кислородного градиента эктачитометрии все еще расследуется.
Несколько известных факторов влияют на параметры градиента кислорода ektacytometry, а именно рН, температуру и осмолярность. Эктачитометрия, особенно PoS, находится под влиянием 2,3-дифоспоглицерат (2,3-DPG)22. Кроме того, существует четкая корреляция между %HbF и EIмин, и в меньшей степени PoS(рисунок 5–D). EImax связан с серповидно-клеток на normoxia, что может объяснить наблюдение, что вскоре после ЛОС, РБК деформации на normoxia (EIмакс), выше. Последнее вызвано разрушением самых серповых клеток, а значит, и менее деформируемых РБК во время VOC16. Как показано на рисунке 5F, более высокий %плотный РБК (определяется как РБК с концентрацией гемоглобина Это указывает на то, что плотные клетки являются важным фактором деформации РБК в normoxia, аналогичные ранее сообщалось результаты1.
Стандартизация образцов очень важна для получения воспроизводимых результатов и для разграничения между различными генотипами и методами лечения. Корректировка подсчета ГОЛОСОВ РБК важна, так как количество РБК влияет на интенсивность дифракционного шаблона. Если в зазоре между бобом и чашкой присутствуют более низкие цифры РБК, кривая сместится вверх и влево. Кроме того, кривая будет колебаться, препятствуя точному расчету параметров, особенно PoS.
Ограничение этого метода заключается в том, что значение EI представляет собой среднее значение всех клеток, включая различные субпопуляции. Интенсивно изучалась гетерогенность популяций РБК у пациентов СКД и ее влияние на измерение эктацитометрии. Это привело к стандартизации, при которой размер дифракционного шаблона корректируется на фиксированное значение вместо исправленного для подсчета РБК23,24. В настоящее время изучается вопрос о том, следует ли применять этот способ стандартизации к измерениям оксигенного градиента эктацитометрии.
Несколько методов измерения деформации РБК в гипоксических условиях были разработаны на основе шага дезоксигенации, который проходил за пределами эктацитометра25,26,27. В этих условиях, различия в клеточном поведении не наблюдались между пациентами с hbS черты и здоровый контроль при физиологических рН25. Кислородградиент эктачитометрии, однако, ясно показывает низкий, но очевидный PoS у людей с hbS черты(Рисунок 4A). На сегодняшний день, в обычной клинической практике, только альтернативные методы для измерения склонности отдельных РБК пациента к серпу в пробирке включают морфологии основе серпового анализа: РБК инкубируются в условиях, способствующих полимеризации HbS, таких как низкое кислородное напряжение или низкий рН. Фиксатор добавляется после инкубации, и процент серповых клеток подсчитывается вручную или цифрово с помощью световой микроскопии. Многие доклинические и ранние фармакологические испытания фазы используют анализ серпового для создания вторичной переменной исхода, чтобы быть в состоянии предсказать клиническую эффективность в SCD28,29,30,31 ,32. Однако это отнимает много времени, вариативность высока, а чувствительность низкая, техника не автоматизирована и, следовательно, трудоемкая. Кроме того, морфологические изменения из-за серпа могут не коррелировать хорошо с физиологическими параметрами, такими как деформация РБК, потому что это 2-мерный статический самописец2.
Кислородный градиент эктацитометрии обеспечивает функциональный анализ серпового, который является быстрым и воспроизводимым. Это тест in vitro, который не учитывает эндотелиальную поверхность. Тем не менее, он обеспечивает функциональные аспекты серповидного поведения и характеристики РБК, что делает его перспективным методом для исследования серповидно-клеточных клеток. Будущие применения метода включают мониторинг эффективности лечения у пациентов SCD, выступающей в качестве биомаркера для новых стратегий лечения, изучение серповидного поведения, и мониторинг химеризма после трансплантации стволовых клеток в SCD.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была частично поддержана грантом Eurostars estar18105 и неограниченным грантом, предоставленным RR Mechatronics. Авторы благодарят Систо Хендрикса и Яна де Зоэтена за техническую поддержку.
ADVIA 120 Hematology Analyzer | Siemens | 067-A004-14 | Instrument |
Cell-Dyn Sapphire Hematology Analyzer | Abbott | 8H00-01 | Instrument |
Lorrca | RR Mechatronics | LORC109230 or LORC109110 | Instrument |
Lorrca Software version V5.08 | RR Mechatronics | – | Software |
Nitrogen gas 4.8 or 5.0 | Local | – | |
O2-spot | RR Mechatronics | PO2S020153 | O2 measurement |
Oxygenscan module (pO2scan) | RR Mechatronics | PO2S109000 | Add-on |
Oxy-ISO | RR Mechatronics | QRR 030905 | Viscous solution |
X-Clean | RR Mechatronics | QRR 010946 | Cleaning solution Lorrca |