Aquí, presentamos ektacytometry de gradiente de oxígeno, un método rápido y reproducible para medir la deformabilidad de los glóbulos rojos en muestras de pacientes con enfermedad de células falciformes bajo desoxigenación controlada y reoxigenación. Esta técnica proporciona una manera de estudiar la enfermedad de los glóbulos rojos y controlar la eficacia del tratamiento de la enfermedad de células falciformes.
En la enfermedad de células falciformes (SCD), una mutación de un solo punto en la codificación genética de la betaglobina provoca la producción de hemoglobina S anormal (HbS). Cuando se desoxigena, HbS puede polimerizarse, formando varillas rígidas de hemoglobina, lo que resulta en la homiza de los glóbulos rojos (RBR). Estos glóbulos rojos enfermos han reducido significativamente la deformabilidad, causando vaso-oclusión, lo que conduce a numerosas complicaciones clínicas relacionadas con la SCD, incluyendo dolor, accidente cerebrovascular, y daño a los órganos. La deformabilidad del RBC también se reduce por la deshidratación del RBC, lo que resulta en glóbulos rojos densos que son más propensos a la hoz. Hasta la fecha, no existe un solo ensayo de laboratorio ampliamente disponible, rápido y reproducible capaz de predecir la gravedad de la enfermedad o monitorear directamente los efectos del tratamiento de nuevas terapias inductoras de hemoglobina no fetal. En este estudio, describimos un protocolo para medir la deformabilidad de RBC en función de pO2 que permite la cuantificación del comportamiento enfermizo en pacientes con SCD. La ektacytometría de gradiente de oxígeno mide la deformabilidad del RBC, expresada como el índice de alargamiento (EI), en función de pO2. Los glóbulos rojos están expuestos a una tensión de cizallamiento fija de 30 Pa durante una ronda de desoxigenación y reoxigenación. Se producen seis parámetros de lectura. De ellos, el punto de enfermedad (PoS), definido como la pO2 en la que el EI máximo (EImax)muestra una disminución del 5%, y el EI mínimo durante la desoxigenación (EImin) son los más informativos, reflejando lap/s p 2 de un paciente individual en la que comienza la enfermiza y la mínima deformabilidad de los glóbulos rojos de un paciente, respectivamente. PoS se asocia con la afinidad de hemoglobina de un paciente individual por el oxígeno, mientras que EImin muestra una fuerte correlación con los niveles de hemoglobina fetal. Concluimos que la ektacytometría de gradiente de oxígeno es una técnica prometedora para monitorear el tratamiento de pacientes con SCD, como biomarcador de agentes anti-enfermos en ensayos clínicos y preclínicos, y una herramienta importante para estudiar el comportamiento enfermizo de los glóbulos rojos individuos con SCD y rasgos celulares de hoz.
En la SCD, una mutación de un solo punto resulta en la producción de HbS, que puede polimerizarse tras la desoxigenación. La polimerización de HbS causa la enfermedad de los glóbulos rojos y reduce la deformabilidad del RBC. La combinación de la enfermedad de RBC y la adherencia del RBC al endotelio conduce a varias complicaciones de la SCD, incluyendo crisis vaso-oclusivas (COV), accidente cerebrovascular, daño a los órganos, y anemia hemolítica crónica. Incluso en condiciones normoxic, la deformabilidad del RBC se ve comprometida en pacientes con SCD. La deformabilidad se reduce aún más a bajas concentraciones de oxígeno. Los actores clave que determinan la deformabilidad en normoxia son las células densas, las células enfermas irreversiblemente (ISC) y las células deshidratadas, todas las cuales tienen una relación superficie-volumen disminuida1,2,3.
La ektacittometría es un método establecido para medir la deformidad del RBC, ampliamente utilizado para el diagnóstico de anemias hemolíticas hereditarias, particularmente membranopatías4. También se puede utilizar para estudiar hemorreología5,6,7,8,9. La ektacytometría de gradiente osmótico, en la que la deformabilidad del RBC se mide durante un cambio continuo en la osmolalidad, se ha utilizado para estudiar SCD durante más de una década10,11. El porcentaje de hemoglobina fetal (HbF) es uno de los inhibidores más fuertes de la polimerización de HbS, ya que ni el HbF ni su tetramero híbrido mixto (2o) pueden entrar en la fase de polímero desoxiHbS12. Estudios recientes sugieren que el aumento de los niveles de HbF en pacientes con SCD conduce a una mejor relación superficie-volumen, mejorando así el estado de hidratación y, por lo tanto, la deformabilidad en pacientes no transfundidos11.
La deformabilidad del RBC se ha estudiado en el pasado como un biomarcador para complicaciones de la SCD, pero con resultados contradictorios. En estudios realizados transversalmente y en estado estacionario, se encontró que los individuos con mayores niveles de deformabilidad del RBC tenían una mayor incidencia de osteonecrosis y más crisis de dolor13,14,15. En contraste con estos hallazgos, en comparación con los valores de estado estacionario durante un COV agudo, la deformabilidad de RBC se redujo en estudios longitudinales dentro de los mismos individuos16. Esta discrepancia puede ser el resultado del estudio de la deformabilidad del RBC en diferentes condiciones (es decir, durante el estado estacionario frente al COV). El porcentaje de células enfermas es alto al inicio de un COV y las células se destruyen rápidamente a medida que avanza la crisis, lo que puede explicar la diferencia entre los datos de incidencia transversal en estado estacionario y los datos longitudinales obtenidos durante el COV. Sin embargo, otros factores, como la adherencia de las subpoblaciones de RBC a la superficie endotelial, también pueden ser importantes en la aparición de COV. En sCD, es más clínicamente relevante medir la deformabilidad durante la desoxigenación, ya que la vaso-oclusión se produce típicamente en los venulos postcapilares hipóxicos y no en la red microcapilar menos hipóxica17. Además, la presencia de ISC puede alterar la capacidad de un ektacitómetro para medir la deformabilidad en normoxia. La distorsión del patrón de difracción es causada por ISC, que resulta de la no alineación durante el flujo1,2,3.
Los enfoques alternativos para estudiar la fisiopatología del COV incluyen mediciones de la adherencia del RBC a una superficie artificial18,citometría de microflujo de impedancia eléctrica de una sola célula19,modelos basados en microfluidos que combinan modelos cuantitativos mediciones de la enfermedad celular y desafiado con reología de una sola célula20,y polimerización inducida por láser21. Aunque prometedoras, estas técnicas son costosas, intensivas en mano de obra y requieren una amplia capacitación de los operadores. Además, los ensayos basados en morfología carecen de la capacidad de estudiar el comportamiento celular, como la deformabilidad, en función de un gradiente de oxígeno.
En este estudio, describimos un ensayo funcional rápido y reproducible realizado con un ektacitómetro. Se trata de una medición de ektacytometry de próxima generación que mide los diferentes aspectos cualitativos de la deformabilidad de RBC expresados como EI durante la desoxigenación (1.300 s) y la reoxigenación rápida (280 s). Estos intervalos de tiempo permiten la formación de polímeros HbS, y por lo tanto la aparición de cambios morfológicos y luego la recuperación. La desoxigenación se produce mediante la introducción de gas nitrógeno, que disminuye lentamente la tensión de oxígeno en la muestra de sangre en la brecha entre el bob y la copa del ektacitómetro. La deformabilidad del RBC se mide continuamente mientras que la tensión de oxígeno se mide cada 20 s por medio de un pequeño punto O2presente en la pared de la copa. Durante la prueba, aproximadamente 80 pO2 mediciones se acoplan a la EI medida en ese momento. La presión de oxígeno cae por debajo de 20 mmHg durante la desoxigenación, y la reoxigenación se facilita por la difusión pasiva del aire ambiente. La configuración experimental del módulo de ektacittómetro y ektacytometry de gradiente de oxígeno se describe en la Figura 1 y la Figura 2. El principio de la ektacytometry se basa en la dispersión de la luz inducida por El RBC de un rayo láser. Esto da como resultado un patrón de difracción elíptica cuando se aplica tensión de cizallamiento al mismo tiempo(Figura 1).
Aquí describimos la ektacytometría de gradiente de oxígeno, un método que se puede utilizar para estudiar el comportamiento enfermizo de los glóbulos rojos de los pacientes con SCD bajo una serie de concentraciones de oxígeno(Figura 4 y Figura 5). Para obtener resultados reproducibles, es importante identificar los factores que influyen en los resultados. Por ejemplo, la temperatura tiene un gran impacto en la deformabilidad de RBC, principalmente debido a sus efectos en el espesor de la solución viscosa (PVP). Recomendamos realizar una medición de prueba al inicio del día para calentar a fondo la máquina a 37 oC. Esto mejorará la reproducibilidad de los resultados. La osmolaridad de la solución viscosa debe estar dentro de un rango estrecho (282–286 mOsm/kg para PVP), porque la osmolaridad influye en el estado de hidratación, lo que a su vez afecta a la deformabilidad del RBC. El pH y la viscosidad de la PVP también deben estar estrictamente regulados. Las diferencias en el pH y la temperatura pueden influir en las curvas dramáticamente22. Además, el agua restante en la taza, bob y tubos, puede causar la lisis de los glóbulos rojos, lo que resulta en datos incorrectos, porque se medirán menos glóbulos rojos intactos presentes en la copa.
Los ajustes para realizar la ektacytometría de gradiente de oxígeno se pueden ajustar para abordar preguntas de investigación específicas. La configuración preferida se muestra en la Tabla 1. Se eligió un tiempo de desoxigenación de 1.300 s sobre la base de observaciones que muestran que la extensión de la desoxigenación no dio lugar a unmínimo de EI inferior para la mayoría de los pacientes. Por el contrario, el acortamiento del tiempo de desoxigenación obstaculizaría el poder discriminatorio de la ektacytometría del gradiente de oxígeno. El tiempo de reoxigenación se estableció en 280 s debido a la rápida resolución de polímeros HbS durante la reoxigenación, y la restauración concomitante de EI hacia los valores medidos antes de la desoxigenación. La tensión de cizallamiento se estableció en 30 Pa, lo que es análogo a la ektacytometría de gradiente osmótico. Bajar este parámetro podría obstaculizar el poder discriminatorio. El control de desoxigenación se puede utilizar si se aplica un conjunto de velocidad de desoxigenación a cada muestra de paciente. En nuestros ajustes preferidos, esta opción se apagó porque la tasa de desoxigenación es específica del paciente debido a la curva de disociación de hemoglobina única. Por lo tanto, encender el control de desoxigenación eliminaría esta característica del ensayo. Sin embargo, esta característica de la ektacytometría de gradiente de oxígeno todavía está bajo investigación.
Varios factores conocidos influyen en los parámetros de ektacytometry del gradiente de oxígeno, a saber, el pH, la temperatura y la osmolaridad. La ektacittometría, especialmente PoS, está influenciada por 2,3-difosfogliceo (2,3-DPG)22. Además, existe una clara correlación entre %HbF y elEI miny, en menor medida, PoS(Figura 5A–D). EImax se asocia con células falciformes en normoxia, lo que puede explicar la observación de que poco después de un COV, la deformabilidad de RBC en normoxia (EImax),es mayor. Este último es causado por la destrucción de las células más enfermas, y por lo tanto menos deformable sr. durante VOC16. Como se muestra en la Figura 5F, los Glóbulos Rojos más densos (definidos como RCC con una concentración de hemoglobina >1.11 mg/ml) se correlacionan fuertemente con unEI menor máx. Esto indica que las células densas son un factor importante en la deformabilidad del RBC en normoxia, similar a los resultados notificados anteriormente1.
La estandarización de muestras es muy importante para obtener resultados reproducibles y para distinguir entre diferentes genotipos y tratamientos. La corrección para el recuento de RBC es importante, ya que el número de Glóbulos rojos influye en la intensidad del patrón de difracción. Si los números de RBC más bajos están presentes en el espacio entre el bob y la copa, la curva se desplazará hacia arriba y hacia la izquierda. Además, la curva fluctuará, obstaculizando el cálculo preciso de los parámetros, especialmente el PoS.
Una limitación de esta técnica es que el valor EI representa un promedio de todas las celdas, incluidas las diferentes subpoblaciones. Se ha estudiado intensamente la heterogeneidad de las poblaciones de RBC en pacientes con SCD y su influencia en la medición de la ektacittometría. Esto dio lugar a la estandarización en la que el tamaño del patrón de difracción se ajusta a un valor fijo en lugar de corregido para el recuento de RBC23,24. Actualmente se está estudiando si esta forma de estandarización también debe aplicarse a las mediciones de ektacytometría de gradiente de oxígeno.
Se desarrollaron varias técnicas para medir la deformabilidad del RBC en condiciones hipoxiticas basadas en un paso de desoxigenación que tuvo lugar fuera del ektacitómetro25,26,27. En estas condiciones, no se observaron diferencias en el comportamiento celular entre pacientes con rasgos de HbS y controles saludables bajo pH fisiológico25. Sin embargo, la ektacytometría de gradiente de oxígeno muestra claramente un PoS bajo pero evidente en individuos con rasgos de HbS(Figura 4A). Hasta la fecha, en la práctica clínica de rutina, los únicos métodos alternativos para medir la tendencia de los glóbulos rojos de un paciente individual a hoz in vitro incluyen un ensayo de hoz basado en morfología: los glóbulos rojos se incuban en condiciones que promueven la polimerización de HbS, como la polimerización de HbS, como la polimerización de HbS, como la polimerización de HbS, como baja tensión de oxígeno o pH bajo. Se añade un fijador después de la incubación y el porcentaje de células enfermas se cuenta manualmente o digitalmente mediante microscopía de luz. Muchos ensayos farmacológicos preclínicos y de fase temprana utilizan el ensayo de hoz para generar una variable de resultado secundario para poder predecir la eficacia clínica en SCD28,29,30,31 ,32. Sin embargo, consume mucho tiempo, la variabilidad es alta y la sensibilidad es baja, la técnica no está automatizada y, por lo tanto, requiere mucha mano de obra. Además, los cambios morfológicos debidos a la hoz podrían no estar bien relacionados con parámetros fisiológicos, como la deformabilidad de RBC, ya que es un ensayo estático de 2 dimensiones2.
La ektacytometría de gradiente de oxígeno proporciona un ensayo funcional de enfermizo que es rápido y reproducible. Se trata de una prueba in vitro que no tiene en cuenta la superficie endotelial. Sin embargo, proporciona aspectos funcionales del comportamiento enfermizo y características del RBC, por lo que es una técnica prometedora para los estudios de células falciformes. Las aplicaciones futuras de la técnica incluyen el seguimiento de la eficacia del tratamiento en pacientes con SCD, sirviendo como biomarcador para nuevas estrategias de tratamiento, el estudio del comportamiento enfermizo y el seguimiento del chimerismo después del trasplante de células madre en la SCD.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado en parte por una beca Eurostars estar18105 y por una subvención sin restricciones otorgada por RR Mechatronics. Los autores agradecen a Sisto Hendriks y Jan de Zoeten por su apoyo técnico.
ADVIA 120 Hematology Analyzer | Siemens | 067-A004-14 | Instrument |
Cell-Dyn Sapphire Hematology Analyzer | Abbott | 8H00-01 | Instrument |
Lorrca | RR Mechatronics | LORC109230 or LORC109110 | Instrument |
Lorrca Software version V5.08 | RR Mechatronics | – | Software |
Nitrogen gas 4.8 or 5.0 | Local | – | |
O2-spot | RR Mechatronics | PO2S020153 | O2 measurement |
Oxygenscan module (pO2scan) | RR Mechatronics | PO2S109000 | Add-on |
Oxy-ISO | RR Mechatronics | QRR 030905 | Viscous solution |
X-Clean | RR Mechatronics | QRR 010946 | Cleaning solution Lorrca |