Här presenterar vi syregradient ektacytometri, en snabb och reproducerbar metod för att mäta röda blodkroppar deformabilitet i prover från patienter med sicklecellanemi under kontrollerad deoxygenering och reoxygenering. Denna teknik ger ett sätt att studera röda blodkroppar patologiska och att övervaka sicklecellanemi behandlingseffekt.
I sicklecellanemi (SCD), en enda punktmutation i genen kodning för beta-globin orsakar produktionen av onormala hemoglobin S (HbS). När deoxygenated, HbS kan polymerisera, bildar stela stavar av hemoglobin, vilket resulterar i sjukling av röda blodkroppar (RBCs). Dessa sickled RBCs har signifikant minskad deformabilitet, orsakar vaso-ocklusion, vilket leder till många SCD-relaterade kliniska komplikationer, inklusive smärta, stroke, och organskador. RBC deformability reduceras också genom RBC dehydrering, vilket resulterar i täta röda blodkroppar som är mer benägna att skära. Hittills finns det inte en enda allmänt tillgänglig, snabb, och reproducerbara laboratorieanalys kan förutsäga sjukdomens svårighetsgrad eller direkt övervakning av Behandlingseffekterna för nya, icke-fetala hemoglobin inducerande terapier. I denna studie, vi beskriver ett protokoll för att mäta RBC deformability som en funktion av pO2 som möjliggör kvantifiering av sjukling beteende hos SCD-patienter. Syregradienten ektacytometri mäter RBC-deformabilitet, uttryckt som förlängningen (EI), som en funktion av pO2. RBCs utsätts för en fast skjuvning stress av 30 pa under en omgång av deoxygenation och reoxygenation. Sex parametrar för avläsning produceras. Av dessa, den punkt av sjukling (PoS), definierad som pO2 vid vilken maximal EI (eiMax) visar en 5% minskning, och minimum EI under DEOXYGENATION (eimin) är de mest informativa, återspeglar en enskild patients pO2 där sjukling börjar och den minimala deformabiliteten hos patientens röda blodkroppar. PoS är associerat med en individuell patients hemoglobin affinitet för syre, medan EImin visar en stark korrelation med fetalt hemoglobin nivåer. Vi drar slutsatsen att syregradienten ektacytometry är en lovande teknik för att övervaka behandlingen av patienter med SCD, som en biomarkör för anti-sjukling agenter i kliniska och prekliniska prövningar, och ett viktigt verktyg för att studera patologiska beteende av RBCs från individer med SCD och sicklecelldrag.
I SCD, en enda punktmutation resultat i produktionen av HbS, som kan polymerisera på deoxygenation. HbS polymerisation orsakar sjukling av RBCs och minskar RBC deformabilitet. Kombinationen av RBC patologiska och RBC anslutning till endotelet leder till olika SCD komplikationer, inklusive vaso-ocklusiv kriser (VOC), stroke, organskador, och kronisk hemolytisk anemi. Även vid behandling villkor, RBC deformabilitet äventyras hos patienter med SCD. Deformabilitet minskas ytterligare vid låga syrekoncentrationer. Nyckelspelare som bestämmer deformabilitet vid normoxia är täta celler, oåterkalleligt sjukliga celler (ISC), och dehydrerade celler, som alla har en minskad yta till volymförhållandet1,2,3.
Ektacytometri är en etablerad metod för att mäta RBC deformability, ofta används för diagnos av ärftliga hemolytiska anemier, särskilt membranopatier4. Det kan också användas för att studera hemorheologi5,6,7,8,9. Osmotisk gradient ektacytometri, där RBC deformability mäts under en kontinuerlig förändring i osmolalitet, har använts för att studera SCD i över ett decennium10,11. Andelen fetalt hemoglobin (HbF) är en av de starkaste hämmare av HbS polymerisation eftersom varken HbF eller dess blandade hybrid tetramer (∝ 2βSγ) kan komma in i deoxyHbS polymer fas12. Nyligen genomförda studier tyder på att ökande HbF nivåer i SCD-patienter leder till en bättre yta-till-volym-förhållande, vilket förbättrar hydrering tillstånd och därmed deformability i icke transfixerade patienter11.
RBC deformability har studerats tidigare som en biomarkör för SCD komplikationer, men med motstridiga resultat. I studier som utfördes tvärsektionellt och vid steady state konstaterades att individer med högre RBC-deformerbarhet hade en högre incidens av osteonekros och mer smärt kriser13,14,15. I motsats till dessa fynd, jämfört med de steady state värden under en akut VOC, minskade RBC deformabilitet i longitudinella studier inom samma individer16. Denna avvikelse kan vara resultatet av studier av RBC-deformabilitet under olika förhållanden (dvs. under steady state kontra VOC). Andelen sjuknade celler är hög i början av en VOC och cellerna förstörs snabbt när krisen fortskrider, vilket kan förklara skillnaden mellan de tvärsnittsdata för steady state och longitudinella data som erhålls under VOC. Emellertid, andra faktorer, såsom följsamhet av RBC subpopulationer till endoteliala ytan, kan också vara viktigt i förekomsten av VOC. I SCD, det är mer kliniskt relevant att mäta deformabilitet under deoxygenation, eftersom vaso-ocklusion förekommer vanligtvis i hypoxisk postkapillära venoler och inte i mindre hypoxisk microcapillary nätverk17. Dessutom kan närvaron av ISCs förändra förmågan hos en ektacytometer att mäta deformabilitet vid normoxia. Förvrängning av diffraktions mönstret orsakas av iSCS, vilket resulterar från icke-anpassningen underflödet1,2,3.
Alternativa metoder för att studera patofysiologin av VOC inkluderar mätningar av RBC anslutning till en konstgjord yta18, Single cell elektrisk impedans microflow flödescytometrianalys19, microfluidic-baserade modeller som kombinerar kvantitativa mätningar av cellen sjuklig och unsickling med Single cell rheologi20, och laserinducerad polymerisation21. Även lovande, dessa tekniker är kostsamma, arbetsintensiva, och kräver omfattande förarutbildning. Dessutom, de analyser som är morfologi-baserade saknar förmågan att studera cellulära beteende, såsom deformabilitet, som en funktion av en syregradient.
I denna studie beskriver vi en snabb och reproducerbar funktionell analys utförd med en ektacytometer. Detta är en nästa generations ektakytometri mätning som mäter de olika kvalitativa aspekterna av RBC deformability uttryckt som EI under deoxygenation (1 300 s) och snabb reoxygenation (280 s). Dessa tidsintervall möjliggör HbS polymerbildning, och därmed uppkomsten av morfologiska förändringar och sedan återhämtning. Deoxygenation sker genom att införa kvävgas, som sakta minskar syre spänningen i blodprovet i gapet mellan Bob och kopp ektacytometer. RBC deformability mäts kontinuerligt medan syre spänningen mäts var 20: an med hjälp av en liten O2-fläck som finns i väggen på koppen. Under provningen är cirka 80 pO2 mätningar kopplade till EI mätt vid det tillfället. Syre trycket sjunker under 20 mmHg under avsyresättning, och reoxygenering underlättas av passiv diffusion av omgivningsluften. Den experimentella installationen av ektacytometer och syregradienten ektacytometry modul beskrivs i figur 1 och figur 2. Principen för ektacytometri är baserad på RBC-inducerad spridning av ljus från en laserstråle. Detta resulterar i ett elliptiskt diffraktionsmönster när skjuvspänningen appliceras samtidigt (figur 1).
Här beskriver vi syregradient ektacytometri, en metod som kan användas för att studera det sjukling beteendet hos röda blodkroppar från SCD-patienter under en rad syrekoncentrationer (figur 4 och figur 5). För att få reproducerbara resultat är det viktigt att identifiera de faktorer som påverkar resultatet. Till exempel har temperaturen en stor inverkan på RBC deformability, främst på grund av dess effekter på tjockleken av trögflytande lösning (PVP). Vi rekommenderar att du utför en test mätning i början av dagen för att grundligt värma upp maskinen till 37 ° c. Detta kommer att förbättra reproducerbarheten av resultaten. Den osmolaritet av trögflytande lösning bör vara inom ett smalt intervall (282-286 mOsm/kg för PVP), eftersom osmolaritet påverkar hydrering status, vilket i sin tur påverkar RBC deformabilitet. PH och viskositet PVP bör också vara hårt reglerad. Skillnader i pH och temperatur kan påverka kurvor dramatiskt22. Dessutom, resterande vatten i koppen, Bob, och rör, kan orsaka lys av RBCs, vilket resulterar i felaktiga data, eftersom färre intakta RBCs som finns i koppen kommer att mätas.
Inställningar för att utföra syregradient ektacytometri kan justeras för att lösa specifika prövnings frågor. Önskade inställningar listas i tabell 1. En deoxygenation tid på 1 300 s valdes baserat på observationer som visar att förlängningen av deoxygenation inte resultera i en lägre EImin för de flesta patienter. Däremot skulle en förkortning av deoxygenationstiden hämma den diskriminerande kraften hos syregradienten ektacytometri. Den reoxygenation tiden var satt till 280 s på grund av den snabbt lösa HbS polymerer under reoxygenation, och samtidig restaurering av EI mot värden som mäts före deoxygenering. Skjuvning stress var inställd på 30 Pa, vilket är analogt med den osmotiska lutningen ektacytometry. En sänkning av denna parameter kan hämma den diskriminerande kraften. Avsyresättning kan användas om en uppsättning avsyresättning tillämpas på varje patientprov. I våra föredragna inställningar, detta alternativ var avstängd eftersom graden av deoxygenation är patientspecifik på grund av den unika hemoglobin dissociation kurvan. Därför, slå på deoxygenation kontroll skulle eliminera denna egenskap från analysen. Emellertid, denna funktion av syregradient ektacytometri är fortfarande under utredning.
Flera välkända faktorer påverkar syregradienten ektacytometry parametrar, nämligen pH, temperatur, och osmolaritet. Ektacytometri, speciellt PoS, påverkas av 2, 3-diphosphoglycerate (2, 3-DPG)22. Det finns också ett tydligt samband mellan% HbF och EImin, och i mindre utsträckning POS (figur 5a–D). EIMax är associerad med sickleceller vid normoxia, som kan förklara observationen att kort efter en VOC, RBC deformability vid normoxia (eiMax), är högre. Den senare orsakas av förstörelsen av de mest sjuka cellerna, och därmed mindre deformerbara röda blodkroppar under VOC16. Som visas i figur 5F, högre% täta RBCs (definierad som RBCs med en hemoglobin koncentration ≫ 1,11 mg/ml) korrelerar starkt med en lägre EIMax. Detta indikerar att täta celler är en viktig faktor i RBC deformability vid normoxia, liknande tidigare rapporterade resultat1.
Standardisering av prover är mycket viktigt för att erhålla reproducerbara resultat och för att skilja mellan olika genotyper och behandlingar. Korrigera för RBC räkna är viktigt, eftersom antalet RBCs påverka intensiteten i diffraktions mönstret. Om det finns lägre RBC-nummer i gapet mellan Bob och Cup, kommer kurvan att skifta uppåt och till vänster. Dessutom kommer Kurvan fluktuera, hämmar korrekt beräkning av parametrarna, särskilt PoS.
En begränsning av denna teknik är att EI-värdet representerar ett genomsnitt av alla celler, inklusive olika subpopulationer. Heterogenitet av RBC populationer hos SCD-patienter och dess påverkan på ektacytometri mätning har studerats intensivt. Detta resulterade i standardisering vari storleken på diffraktion mönstret justeras till ett fast värde i stället för korrigeras för RBC greve23,24. Huruvida detta sätt för standardisering bör också tillämpas på syre lutning ektacytometry mätningar är för närvarande under studie.
Flera tekniker för att mäta deformabilitet av RBC under hypoxiska förhållanden utvecklades baserat på ett deoxygenationssteg som ägde rum utanför ektacytometern25,26,27. Under dessa förhållanden observerades inte skillnader i cellulära beteenden mellan patienter med HbS-egenskaper och friska kontroller under Fysiologiskt pH25. Syregradienten ektacytometri visar dock tydligt en låg men tydlig PoS hos individer med HbS drag (figur 4a). Hittills, i rutinmässig klinisk praxis, de enda alternativa metoder för att mäta tendensen hos en enskild patients RBCs att skära in vitro inkluderar en morfologi-baserade patologiska assay: RBCs inkuberas under förhållanden som främjar HBS polymerisation, såsom låg syre spänning eller lågt pH. En fixativ tillsätts efter inkubering och andelen sickled celler manuellt eller digitalt räknas med hjälp av ljusmikroskopi. Många prekliniska och tidig fas farmakologiska prövningar använder sjukling analysen för att generera en sekundär utfall variabel för att kunna förutsäga klinisk effekt i SCD28,29,30,31 ,32. Det är dock tidskrävande, variabiliteten är hög och känsligheten är låg, tekniken är inte automatiserad och därför arbetsintensiva. Dessutom kan morfologiska förändringar på grund av sjukling inte korrelera väl med fysiologiska parametrar, såsom RBC deformability, eftersom det är en 2-dimensionell statisk analys2.
Syregradienten ektacytometry ger en funktionell analys av sjukling som är snabb och reproducerbar. Detta är ett in vitro-test som inte beaktar endotelytan. Emellertid, det ger funktionella aspekter av sjukling beteende och RBC egenskaper, vilket gör det en lovande teknik för skäran cellstudier. Framtida tillämpningar av tekniken omfattar övervakning av behandlingseffekten hos SCD-patienter, som fungerar som en biomarkör för nya behandlingsstrategier, studerar sjukling beteende, och övervakning chimärism efter stamcellstransplantation i SCD.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes delvis av ett Eurostars Grant estar18105 och av ett fritt bidrag från RR Mechatronics. Författarna tackar Sisto Hendriks och Jan de Zoeten för deras tekniska stöd.
ADVIA 120 Hematology Analyzer | Siemens | 067-A004-14 | Instrument |
Cell-Dyn Sapphire Hematology Analyzer | Abbott | 8H00-01 | Instrument |
Lorrca | RR Mechatronics | LORC109230 or LORC109110 | Instrument |
Lorrca Software version V5.08 | RR Mechatronics | – | Software |
Nitrogen gas 4.8 or 5.0 | Local | – | |
O2-spot | RR Mechatronics | PO2S020153 | O2 measurement |
Oxygenscan module (pO2scan) | RR Mechatronics | PO2S109000 | Add-on |
Oxy-ISO | RR Mechatronics | QRR 030905 | Viscous solution |
X-Clean | RR Mechatronics | QRR 010946 | Cleaning solution Lorrca |