Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Cancer Research

Karakterisering av effekter av Migrastatic hemmere på 3D tumor spheroid Invasion av høy oppløsning Konfokalmikroskopi mikroskopi

doi: 10.3791/60273 Published: September 16, 2019

Summary

Effekten av migrastatic hemmere på glioma kreftcelle migrasjon i tredimensjonale (3D) invasjon analyser ved hjelp av en Histone deacetylase (HDCA) inhibitor er preget av høyoppløselig konfokalmikroskopi mikroskopi.

Abstract

Drug oppdagelse og utvikling i kreftforskning er i økende grad basert på narkotika skjermer i et 3D-format. Romanen hemmere rettet mot trekk og invasiv potensialet for kreftceller, og følgelig metastatisk spredning av sykdom, blir oppdaget og betraktes som komplementære behandlinger i svært invasiv kreftformer som gliomas. Dermed er det nødvendig å generere data som muliggjør detaljert analyse av celler i et 3D-miljø etter tilsetning av et medikament. Metodikken beskrevet her, kombinerer spheroid invasjon analyser med høyoppløselig bilde fangst og dataanalyse av konfokalmikroskopi laserskanning mikroskopi (CLSM), aktivert detaljert karakterisering av virkningene av den potensielle anti-trekk-hemmer MI-192 på glioma celler. Spheroids ble generert fra cellelinjer for invasjon analyser i lav tilhenger 96-brønn plater og deretter forberedt for CLSM analyse. Den beskrevne arbeidsflyten ble foretrukket fremfor andre brukte spheroid teknikker på grunn av både enkel og reproduserbarhet. Dette, kombinert med forbedret bildeoppløsning oppnådd ved konfokalmikroskopi mikroskopi sammenlignet med konvensjonelle bredt felt tilnærminger, tillot identifisering og analyse av distinkte morfologiske endringer i trekk celler i et 3D-miljø etter behandling med migrastatic stoffet MI-192.

Introduction

Tredimensjonale spheroid teknologier for prekliniske narkotika oppdagelse og utvikling av potensielle kreft stoffer blir i økende grad favorisert over konvensjonelle narkotika skjermer; Dermed er det mer utvikling av migrastatic-migrasjon og invasjon forebygge-narkotika. Begrunnelsen bak denne utviklingen i kreft behandling er klar: 3D spheroid analyser representerer en mer realistisk tilnærming for screening potensielle anti-kreft narkotika som de etterligner 3D svulst arkitektur mer trofast enn celle monolag kulturer, recapitulate legemiddel-tumor interaksjoner (Kinetics) mer nøyaktig, og tillate karakterisering av narkotika aktivitet i en svulst-relaterte innstillingen. I tillegg, fremveksten av resistens mot chemotoxic narkotika i mange krefttyper og høy dødelighet blant kreftpasienter på grunn av metastasering forsterket av evnen til kreftceller til å migrere til fjerne tumor nettsteder støtter inkludering av kjemoterapeutiske agenter målretting av trekk potensialet av kreftceller som adjuvant behandling i fremtidig klinisk kreft forsøk1. Dette er spesielt tilfelle i svært invasiv kreft, for eksempel høyverdig glioblastomas (GBM). GBM ledelse omfatter kirurgi, strålebehandling og kjemoterapi. Men selv med Kombinasjonsbehandling, de fleste pasientene tilbakefall innen 1 år etter første diagnose med en median overlevelse av 11-15 måneder2,3. Store fremskritt innen 3D-teknologi har blitt gjort de siste årene: roterende systemer, microfabricated strukturer og 3D-stillaser, og andre individuelle analyser blir kontinuerlig forbedret for å tillate rutinemessig testing på en stor skala4, 5,6,7. Resultatene fra disse analysene må imidlertid analyseres på en meningsfull måte fordi data tolkning ofte hindres av forsøk på å analysere 3D-genererte data med 2D-bildeanalyse systemer.

Til tross for å foretrekke i form av bildet oppkjøpet hastighet og redusert Foto-toksisitet, de fleste Wide-feltet systemer fortsatt begrenset av oppløsning8. Således, bortsett fra data lese-outs knyttet til narkotika effekt, detaljerte effekter av narkotika handling på 3D cellulære strukturer av migrere celler er uunngåelig tapt hvis avbildet ved hjelp av et bredt felt system. Omvendt, konfokalmikroskopi laserskanning mikroskopi (CLSM) fange høy kvalitet, optisk delt profilen det kan rekonstruert og gjengitt inne 3D stolpe-oppkjøpet benytter computer programvare. Således, CLSM er lett anvendelig å tenkelig innviklet 3D Cellular strukturer, derved muliggjør avhør av effektene av anti-migrastatic hemmere opp på 3D strukturer og inne-dybden analyser av cellen Migration mekanismer. Dette vil utvilsomt veilede fremtidige migrastatic narkotika utvikling. Her beskrives en kombinert arbeidsflyt av spheroid generasjon, legemiddelbehandling, fargeprotokoll og karakterisering av konfokalmikroskopi mikroskopi med høy oppløsning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. generering av Cell Spheroids

Dag 1

  1. Klargjør standard kultur medium slik det kreves av cellelinjen under etterforskning.
  2. Utføre alle vev kultur-tilknyttede trinn i en vev kultur hette ved hjelp av sterile håndtering teknikker.
  3. Trypsinize og telle kreftceller. Bruk 20 mL celle oppheng per plate. Hold celle suspensjoner i tydelig merket sterile Universalrør.
  4. Legg til et forhåndsbestemt antall celler i hver brønn. Både det første antallet celler og den ultimate spheroid størrelsen som kreves, avhenger av sprednings hastigheten til cellelinjen som undersøkes.
    Merk: For etablerte glioma cellelinjer som U251 og KNS429,10, 5 x 103 celler/ml vil produsere en mikroskopisk synlig spheroid (200 eller 800 μm) etter 4 dager med inkubasjons.
  5. Resuspend cellene i universelle rør ved milde inversjon å unngå celle klumper. Pipetter 200 μL av celle fjæringen i hver brønn på en 96-brønn plate. Hvis alle brønnene ikke er nødvendig, er det tilrådelig å legge til 200 μL av 1x PBS til hver tomme brønn for å unngå fordamping.
  6. Ruge cellene i en inkubator som normalt ved 37 ° c.
    Merk: Cellelinjer som glioma kreftcelle linjer vil danne spheroids innen 24 h. Tillat 3D Cellular arkitektur å danne ved incubating spheroid for 72 h.

Dag 2

  1. Sjekk celler med lyse felt mikroskopi etter 24 h. avhengig av cellelinjen, kan celler ha dannet en spheroid synlig i bunnen av brønnen.
    Merk: Etablerte glioma kreftcelle linjer lett form spheroids innen 24 h. pasient-avledet glioma kreftcelle linjer kan ta opptil 1-2 uker.

2. kollagen Invasion analysen

Dag 3

  1. Plasser kollagen, 5x kultur medium, 1 M NaOH og 1 20 mL rør på is.
  2. Forsiktig og langsomt legge 10,4 mL kaldt kollagen i en kjølt kultur tube. Unngå bobler. Denne mengden av kollagen er nok for 1 96-brønn plate. Oppskalering er mulig, men det anbefales at 1 20 mL rør per plate er forberedt på en gang.
  3. Legg forsiktig 1,52 mL av kaldt sterilt 5x kultur medium. Unngå bobler.
  4. Like før bruk, forsiktig tilsett 72 μL av kaldt steril 1 M NaOH. Hold løsningen på isen.
  5. Bland forsiktig ved pipettering. Unngå bobler. Effektiv miksing fører til en fargeendring (fra rød til oransje-rød (pH 7,4) i mediet. La blandingen på isen til bruk.
  6. Avgjørende trinn: Fjern 190 μL av supernatanten fra 96-brønn platen som er tilberedt på dag 1. Vær svært forsiktig med å forstyrre spheroids som dannes i bunnen av brønnen. Bruk pipette i vinkel mot siden, ikke sentrum, av brønnen.
  7. Legg forsiktig 100 μL av kollagen blandingen til hver brønn. For å hindre eventuelle spheroid forstyrrelser, pipette blandingen ned på siden av brønnen. Unngå bobler. Hold gjenværende kollagen miks i 20 mL rør ved romtemperatur for å vurdere polymerisering.
  8. Ruge plate i inkubator i minst 10 min for å tillate kollagen å polymeres. Som en retningslinje, hvis leftover kollagen har satt, blir semisolid og svamp-lignende, er spheroids klar til å bli behandlet med inhibitor.
  9. Tilsett narkotika eller hemmere på 2x konsentrasjon til kultur medium. Tilsett mediet forsiktig i hver brønn (100 μL per brønn). Igjen, pipette mediet ned på siden av brønnen for å unngå spheroid forstyrrelse.
  10. Observer og bilde hver spheroid av lyse felt mikroskopi til tider T = 0 h, 24 h, 48 h, og 72 h å vurdere narkotika aktivitet. Deretter returnerer platen til inkubator.
    Merk: Avhengig av invasiv oppførsel av cellelinjen, migrasjon bort fra den opprinnelige spheroid kjernen kan observeres fra 24 h og utover.

3. utarbeidelse av kollagen embedded Spheroids og trekk celler for Konfokalmikroskopi mikroskopi

  1. Plasser platen i en vev kultur hette og fjern forsiktig supernatanten (200 μL). Igjen, ta vare ikke å forstyrre spheroid og unngå å berøre kollagen, da dette kan forstyrre kollagen pluggen.
  2. Skift ut supernatanten med 100 μL av 1x PBS. Gjenta denne vasken trinn 3x.
  3. Fjern den siste vasken og Erstatt med 4% formaldehyd i 1x PBS (100 μL per brønn).
    Forsiktig: Formaldehyd er et potensielt kreftfremkallende stoff. Håndteres med forsiktighet i henhold til retningslinjene for helse og sikkerhet.
  4. Plasser 96-brønn platen på en laboratoriebenk, dekk med folie, og la stå i 24 timer ved romtemperatur.
  5. Forsiktig fjerne formaldehyd og erstatte med 1x PBS. Gjenta denne 1x PBS vask 3x.
  6. Forbered 0,1% Triton X-100 i 1x PBS. Fjern 1x PBS vask og Erstatt med 100 μL av Triton X-100-løsningen. Ruge i 30 minutter ved romtemperatur. I mellomtiden, forberede blokkering løsning med 1x PBS og 0,05% skummet melkepulver og bland godt.
  7. Fjern Triton X-100 og vask 3x med 1x PBS. Tilsett 100 μL av blokkerings løsning for hver brønn og ruge i 15 min.
  8. Fortynne nødvendig primære antistoff i blokkering buffer ved forhåndsbestemt konsentrasjon. Her, bruk anti-mus IgG acetylert tubulin antistoff (1:100).
  9. Sentrifuger den primære antistoff-blokkerende buffer mix i 5 min ved 15 682 x g. Fjern forsiktig blokkerings løsningen og tilsett supernatanten (25 − 50 μL) i hver brønn. Ruge i mørket ved romtemperatur i 1 time.
  10. Fjern antistoff oppløsningen og vask 3x med 1x PBS (100 μL per brønn).
  11. Fortynne sekundær antistoff i blokkerings bufferen ved anbefalt eller forhåndsbestemt konsentrasjon i tillegg til eventuelle ekstra fluorescerende flekker. Her bruker 1:500 anti-mus fluoroforen-488 bøyd antistoff, phalloidin-594 (1:500) for utgangen farging, og DNA flekken (DAPI).
  12. Igjen, sentrifuger den sekundære antistoff løsning for 5 min ved 13 000 rpm.
  13. Fjern blokkerings løsningen fra hver brønn og tilsett 25 − 50 μL av den sekundære antistoff/phalloidin/DAPI-miksen. Ruge i mørket for 1,5 h ved romtemperatur.
  14. Fjern sekundær antistoff-Dye-oppløsning og vask 3x med 1x PBS (100 μL per brønn).
  15. Løft forsiktig individuelle kollagen plugger ved sug med en plast pipette (200 μL) på midten av en høy kvalitet vanlig glass Slide.
  16. Legg en dråpe av en egnet mountant til kollagen pluggen, slik at pluggen er helt dekket. Unngå bobler.
  17. Påfør dekkglass av optimal tykkelse for mikroskop målet som skal brukes for bildebehandling og tillate å sette over natten. Oppbevar lysbildene i romtemperatur i mørket.

4. fluorescens mikroskopi

  1. Fang opp fluorescerende bilder med et egnet konfokalmikroskopi mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tredimensjonal spheroid teknologi er fremme forståelsen av narkotika-tumor interaksjoner fordi det er mer representativt for kreft-spesifikke miljø. Generering av spheroids kan oppnås på flere måter; lav tilslutning 96-brønn platene ble brukt i denne protokollen. Etter testing flere produkter fra ulike produsenter, platene som brukes her ble valgt fordi de konsekvent utført best i forhold til vellykket spheroid produksjon og ensartethet. Utskifting trinn, der veksten medium er erstattet med kollagen matrise, er et kritisk punkt i protokollen; stor forsiktighet må tas for å fjerne det meste av mediet uten å forstyrre spheroid selv. Automatisert tenkelig for karakterisering av narkotika-indusert effekter av bred-feltet mikroskopi kan anses å fjerne eventuelle handler bias, men for tiden kommersielt tilgjengelige instrumenter fortsatt betydelig dyrere enn Imaging tilnærminger skissert her.

Bredt felt epifluorescence mikroskopi tillater undersøkelse av effekten av narkotika aktivitet på celle migrasjon og invasjon. Imidlertid er oppløsningen oppnådd fra bred-feltet mikroskopi ikke er god nok til å tillate detaljert tolkning av resultatene med hensyn til narkotika effekt på celle morfologi (figur 1). Her beskrives utarbeidelsen av glioma spheroids og migrering av celler gjennom lett reproduserbar farge protokoller, etterfulgt av avbildning ved hjelp av et konfokalmikroskopi mikroskop. Fra Wide-feltet mikroskopi bildeanalyse, var det tydelig at ulike morfologiske endringer hadde skjedd i glioma cellene etter behandling med MI-192 inhibitor, men klart definerte detaljer manglet. Konfokalmikroskopi mikroskopi bekreftet de første funnene, og disse høyere oppløselige bilder tillot vurdering av effekten av MI-192 ytterligere. Vesentlige forskjeller mellom ubehandlet (kontroll) spheroids, migrere celler (figur 2), og behandlet spheroids og celler (Figur 3) ble tydelig. Mens den voksne glioma cellelinje U251 syntes å migrere i "pigger", utstråler bort fra den opprinnelige spheroid kjernen med enkeltceller frakobling, den pediatric cellelinjen KNS42 vedtatt en ark-lignende migrasjon mønster med få distinkte celle pigger. Tidligere, ulike migrasjon mønstre mellom ulike cellelinjer (her den voksne glioma cellelinje U251 og pediatric cellelinje KNS42) ble observert, potensielt reflekterer celletypen de oppsto fra og stedet av tumor isolasjon. En økning av acetylert tubulin med økende hemmer konsentrasjon (fra 0,1 − 10 μM) ble også avdekket, ikke bare i migrerer celler, men også i de spheroid cellene. Dette var ikke tydelig i den innledende bredt felt mikroskopi ervervet bilder. Videre Imaging vil også tillate kvantitativ analyse av protein uttrykk nivåer som en cellulær respons på behandling med migrastatic hemmere.

I denne studien ble det demonstrert at cellene endret morfologisk som svar på behandling; celle avrunding ble klart med økende hemmer konsentrasjoner og celle død ved den høyeste hemmer konsentrasjon (10 μM), med kjernefysisk fragmentering tydelig i U251 celler og kollapset mikrotubuli og kjernefysisk fragmentering i KNS42. Disse funnene er i tråd med tidligere observasjoner at den anti-vandrende aktiviteten til mi-192 på glioma cellelinjer er konsentrasjon avhengig13,14. Den generelle arbeidsflyten for protokollen er avbildet i Figur 4.

Figure 1
Figur 1: spheroid celle invasjon i kollagen avbildet av bred-feltet mikroskopi. Representative bilder av cellelinjene U251 og KNS42 vises etter behandling med inhibitor MI-192 ved den anti-vandrende konsentrasjonen av 1 μM og ved 24 h intervaller. Det vises også en kontroll spheroid uten behandling. Potensielle anti-eller Pro-trekk-effekter oppdages som uthevet (piler). Dette er spesielt merkbart i KNS42 med tilsynelatende ingen migrasjon i enten kontroll eller behandlet spheroids. Alle bilder ble tatt på 4X. Scale bar = 1 000 μm. Skaler linje i forstørrede bilder for SF188 = 200 μm, KNS42 = 1 000 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: effekten av migrastatic INHIBITOR mi-192 på glioma cellelinje U251 avslørt av konfokalmikroskopi mikroskopi. Faste og fargede glioma spheroids og trekk celler viser distinkte trekk fenotyper. Trekk celler nær de opprinnelige spheroid kantene vises. U251 celle spheroids er preget av pigger som stråler bort fra den opprinnelige spheroid med økende celle avrunding i celler som er åpenbare med økende inhibitor konsentrasjon (pilen indikerer celle pigg). Skala bar = 10 μm. etiketter: rød = utgangen, grønn = acetylert tubulin, blå = DAPI. For hvert bilde, en enkelt representant optiske delen ble tatt med alle innstillinger med både pre-og post-image fangst opprettholdes for komparative formål. Alle bilder ble senere behandlet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: effekten av migrastatic INHIBITOR mi-192 på glioma cellelinje KNS42 avslørt av konfokalmikroskopi mikroskopi. KNS42 migrasjon er karakterisert ved sheetlike utstikkende med enkelt celle pigger (pilen indikerer celle ark). Ved den laveste hemmer konsentrasjonen synes denne fenotype å være uttalt, men går tapt med økende hemmer konsentrasjon (skala bar = 10 μm); Etiketter: rød = utgangen, grønn = acetylert tubulin, blå = DAPI. For hvert bilde en enkelt representant optiske delen ble tatt, med alle innstillinger med både pre-og post-image fangst opprettholdes for komparative formål. Alle bilder ble senere behandlet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Sammendrag av arbeidsflyt. Innlemmet i denne arbeidsflyten er generering av spheroids, innebygging i kollagen, narkotikabehandling, festing, farging, og Imaging av konfokalmikroskopi mikroskopi. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En ny måte å skape kreftcelle spheroids for identifisering av migrastatic narkotika aktivitet ved hjelp av høyoppløselig konfokalmikroskopi mikroskopi er beskrevet. Bruken av lave tilhenger plater over andre teknikker, slik som hengende dråper15, har muliggjort et middel til å generere reproduserbar og ensartet spheroids for bruk i kollagen migrasjon og invasjon analyser. Den kritiske punkter i denne protokollen er fjerning av vekstmedium fra 96-brønn plate før celle spheroid innebygging i en kollagen matrise og forsiktig håndtering av kollagen pluggene inneholder spheroids etterpå. Nye teknologier som digital materialer16 er nå tilgjengelig, og selv om dyrere, kan gi et alternativ til manuell fjerning av medier og væsker. Den viktigste begrensningen av den beskrevne protokollen er at det er tidkrevende når enkelt spheroids er avbildet og deretter analyseres manuelt av lyse felt mikroskopi for å vurdere hemmer narkotika aktivitet. I tillegg er reagensene som kreves for alle trinnene i prosessen dyrt, og spesialisert utstyr, nemlig et konfokalmikroskopi mikroskop med høy oppløsning, er også nødvendig. Optimale celle tall som kreves for seeding og tiden det tar å få en celle spheroid av den nødvendige størrelsen må også være forhåndsbestemt før oppstart av kollagen invasjonen analysen.

Utviklingen av narkotika målretting av kreftceller, stor skala narkotika screening, og karakterisering av narkotika aktivitet for narkotika modifikasjon og forbedring i økende grad avhengig av 3D-celleanalyser og teknologi. Denne protokollen kan optimaliseres og tilpasses for bruk med andre eksperimentelle analyser og en rekke andre celletyper av betydning i andre sykdoms systemer. Hittil har tolkningen av data generert mikroskopisk blitt hemmet av anvendelsen av bred-feltet mikroskopi, med bilder ervervet tilbyr begrenset oppløsning og plaget med iboende bilde uskarphet som følge av lys opprinnelse utenfor fokalplanet. Det bred-åker mikroskopi profilen vist her over var ervervet manuelt benytter en EVOS tenkelig system, en forarbeide det var tid-forbruker og kunne muligheter introdusere hånd bias. Nye teknologier, inkludert automatiserte arbeidsstasjoner og analyse plattformer17,18, er nå tilgjengelige, men forblir kostbare og er derfor fortsatt utilgjengelige for mange forskningslaboratorier. I tillegg kan ytterligere programvareutviklingen hjelpe i analysen av høyoppløselig 3D gjengitte bilder for å nøyaktig kvantifisere fenotypiske endringer som de som er nevnt her, og derfor effekten av hemmere på celle migrasjon. Videre anvendelsen av super-oppløsning fluorescerende Imaging teknikker som i økende grad blir standard i mange forskningslaboratorier vil gi ytterligere innsikt i den vandrende atferd og morfologi av celler dyrket i 3D spheroid strukturer og behandles med hemmer narkotika.

Det ble fastslått at det er mulig å fikse og beis spheroids, etter behandling med en migrastatic inhibitor, når den er innebygd i kollagen. Denne metoden var enkel å utføre, med alle trinn fullført i 96-brønn plater, etterfulgt av montering av kollagen pluggene som inneholder spheroids på coverslips for bildebehandling. I vurderingen av effekten av hemmer aktivitet på kreftcelle morfologi ble konfokalmikroskopi mikroskopi brukt til å belyse narkotika aktivitet. De første funnene på den anti-vandrende effekten av hemmer MI-192 fra bilder med lav oppløsning ble bekreftet av konfokalmikroskopi mikroskopi med høy oppløsning. Denne spesielle inhibitor mål Histone deacetylase 3 (HDAC3). Hdac er enzymer involvert i epigenetic regulering av genuttrykk og har nylig vært av økende interesse som potensielle mål i kreft narkotika utvikling. Tidligere erfaringer med MI-192 har vist at ved lave konsentrasjoner regulerer den acetylering av tubulin, noe som fører til hyperacetylation og stabilisering av mikrotubuli. Stabilisert mikrotubuli er mindre dynamisk, med en potensiell effekt på trekk celler. Det ble konstatert at effekten observert var tilstede i både representative pediatric og voksen glioma cellelinjer. En konsentrasjonsavhengig økning i tubulin acetylering status for begge glioma cellelinjer ble avdekket, et funn som har implikasjoner for forhåndsvalg av pasientene når de vurderer komplementær behandling med migrastatic legemidler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke professor Chris Jones for å bidra med KNS42 cellelinjen. Zeiss LSM880 konfokalmikroskopi mikroskop med AiryScan som brukes i dette arbeidet er en del av Huddersfield Innovation and Inkubasjons Project (HIIP) finansiert gjennom Leeds City region Enterprise Partnership (LEP) vekst avtale. Kreditt for mikroskop bildet Figur 3: Carl Zeiss mikroskopi GmbH, microscopy@zeiss.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagen I, rat tail, 100 mg Corning 354236 for glioma invasion assay; this is offered by many distributors/manufacturers and will need to be determined for both the type of assay intended and cell lines used. For glioma cancer cell lines Collagen rat tail type 1 (e.g. Corning) is the preferred choice. Collagen should be stored at 4 °C, in the dark, until required. It is not advisable to mix collagen from different batches as this may affect the consistency of the polymerized collagen.   
Coverslips various various for microscopy imaging
DMEM powder Sigma D5648 needed at 5x concentration for collagen solution for glioma invasion assay;  this may be purchased in powdered form, made up in double distilled water and, depending upon final composition of the growth medium, completed with any additives required. The complete 5x solution should be filtered through a syringe filter system (0.22 μm) before use.
Foetal calf serum Sigma F7524-500ML needed for cell culture of glioma cell lines
Glass slides various various for microscopy imaging
High glucose DMEM Gibco 41965062 needed for cell culture of glioma cell lines
Inhibitor Tocris various various - according to experimental design; inhibitors can be purchased from manufacturers such as Selleckchem and Tocris. These manufacturers offer detailed description of inhibitor characteristics, links to associated references and suggestion of working concentrations. As with all inhibitors, they may be potentially toxic and should be handled according to health and safety guidelines. Inhibitors are prepared as stock solutions as recommended by the manufacturer. As an example we used the migrastatic inhibitor MI-192 to demonstrate the use of such inhibitors. We have tested a range of migrastatic inhibitors in this way with comparable results.
Mountant various various for microscopic imaging
NaOH (1 M) various  various NaOH can be either purchased at the required molarity or prepared from solid form. The prepared solution should be filter sterilized using a syringe filter system. One M NaOH is corrosive and care should be taken during solution preparation.
Paraformaldehyde  various various for fixing spheroids and cells; make up at 4%, caution health hazard, ensure that health and safety regulations are adhered to for collagen solution for invasion assay
Pastettes (graduated pipette, 3 mL) various various for invasion assay, solution removal
PBS, sterile for tissue culture Sigma D1408-500ML   needed for cell culture of glioma cell lines and washes for staining
Pen/strep (antibiotics) Sigma P4333 needed for cell culture of glioma cell lines
Primary antibody, secondary antibody, DAPI, Phalloidin various various there are many manufacturers for these reagents, for secondary labelled antibodies we recommend Alexa Fluor (Molecular Probes). Here we used for primary antibodies mouse anti-acetylated tubulin antibody (1/100, Abcam). For secondary antibodies we used 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 conjugated antibody, Molecular Probes. For nuclear stain we used DAPI (many manufacturers) and the actin stain Phalloidin (many manufacturers) both used at recommended dilution of 1/500.
Sodium bicarbonate Sigma S5761 needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5x concentration
Sodium pyruvate Sigma P5280 needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5x concentration
Trypsin Sigma T4049 for trypsinisation
Ultra low attachment plates Sigma/Nunc CLS7007-24EA for glioma invasion assay; a low adherent plate is required, with 96-well plates preferred to allow for large-scale screening of compounds under investigation. There are several low adherence plates commercially available; it is advisable to test a variety of plates for optimum spheroid generation. In our experience Costar Ultra Low Cluster with lid, round bottom, works best for the generation of spheroids from glioma cancer cells in terms of 100% spheroid formation and reproducibility. These plates were also successfully used for the generation of glioma spheroids from patient-derived material, bladder and ovarian cancer cells in our laboratory. In addition, stem or progenitor neurospheres can be used in these plates to facilitate the generation of standardized neurosphere-spheroids
Stripettes (serological pipettes, sterile, 5 mL and 10 mL) various e.g. Costar CLS4488-50; CLS4487-50 for tissue culture and collagen preparation
Various multichannel (50 - 250 μL) and single channel pipettes (10 μL, 50 μL, 200 μL 1 mL) various various for cell and spheroid handling
Widefield microscopy various  various for observation of spheroid generation and spheroid imaging; here wide-field fluorescence images were captured using an EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific)
Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective Zeiss quote from manufacturer Confocal images were captured using a Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline and HeNe 594nm lasers were used to excite Phalloidin 594, Alexa Fluor 488, and DAPI respectively. For each image a single representative optical section were captured, with all settings, both pre- and post-image capture, maintained for comparative purposes. All images were subsequently processed using the associated Zen imaging software and Adobe Photoshop.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gandalovičová, A., et al. Migrastatics-anti-metastatic and anti-invasion drugs: promises and challenges. Trends in Cancer. 3, (6), 391-406 (2017).
  2. Delgado-López, P. D., Corrales-García, E. M. Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities. Clinical and Translational Oncology. 18, 1062 (2016).
  3. Foreman, P. M., et al. Oncolytic virotherapy for the treatment of malignant glioma. Neurotherapeutics. 14, 333 (2017).
  4. Rodrigues, T., et al. Emerging tumor spheroids technologies for 3D in vitro cancer modelling. Pharmacology and Therapeutics Technologies. 184, 201-211 (2018).
  5. Sirenko, O., et al. High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures. Assay and Drug Development Technologies. 13, (7), Mary Ann Liebert, Inc. (2015).
  6. Wu, Q., et al. Bionic 3D spheroids biosensor chips for high-throughput and dynamic drug screening. Biomedical Microdevices. 20, 82 (2018).
  7. Mosaad, E., Chambers, K. F., Futrega, K., Clements, J. A., Doran, M. R. The microwell-mesh: a high-throughput 3D prostate cancer spheroid and drug-testing platform. Scientific Reports. 8, 253 (2018).
  8. Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-a comparison of confocal microscopy techniques. Journal of Biomolecular Techniques. 26, (2), 54-65 (2015).
  9. Pontén, J. Neoplastic human glia cells in culture. Human Tumor Cells in Vitro. Springer US. Boston. 175-206 (1975).
  10. Takeshita, I., et al. Characteristics of an established human glioma cell line, KNS-42. Neurologica Medico Chirurgica. 27, (7), 581-587 (1987).
  11. Bance, B., Seetharaman, S., Leduc, C., Boëda, B., Etienne-Manneville, S. Microtubule acetylation but not detyrosination promotes focal adhesion dynamics and cell migration. Journal of Cell Science. 132, (2019).
  12. Bacon, T., et al. Histone deacetylase 3 indirectly modulates tubulin acetylation. Biochemical Journal. 472, 367-377 (2015).
  13. Jackman, L., et al. Tackling infiltration in paediatric glioma using histone deacetylase inhibitors, a promising approach. Neuro-Oncology. 20, i19-i19 (2018).
  14. Bhandal, K., et al. Targeting glioma migration with the histone deacetylase inhibitor MI192. Neuro-Oncology. 19, i12-i12 (2017).
  15. Del Duca, D., Werbowetski-Ogilvie, T. E., Del Maestro, R. Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion. Journal of Neuro-oncology. 67, (3), 295-303 (2004).
  16. Bender, B. F., Aijian, A. P., Garrell, R. L. Digital microfluidics for spheroid-based invasion assays. Lab on a Chip. 16, (8), 1505-1513 (2016).
  17. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
  18. Härmä, V., et al. Quantification of dynamic morphological drug responses in 3D organotypic cell cultures by automated image analysis. PLOS ONE. 9, (5), e96426 (2014).
Karakterisering av effekter av Migrastatic hemmere på 3D tumor spheroid Invasion av høy oppløsning Konfokalmikroskopi mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Harmer, J., Struve, N., Brüning-Richardson, A. Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (151), e60273, doi:10.3791/60273 (2019).More

Harmer, J., Struve, N., Brüning-Richardson, A. Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (151), e60273, doi:10.3791/60273 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter