Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Cancer Research

Migrastatik İnhibitörlerin 3Boyutlu Tümör Spheroid İnvazyonu Üzerine Etkilerinin Yüksek Çözünürlüklü Konfokal Mikroskopi Ile Karakterizasyonu

doi: 10.3791/60273 Published: September 16, 2019

Summary

Histon deasetilez (HDAC) inhibitörü kullanılarak yapılan üç boyutlu (3D) invazyon tahlillerinde migrastatik inhibitörlerin glioma kanser hücresi göçü üzerindeki etkileri yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi ile karakterizedir.

Abstract

Kanser araştırmalarında ilaç keşfi ve gelişimi giderek 3D formatında ilaç ekranları üzerinde kuruluyor. Kanser hücrelerinin göçmen ve invaziv potansiyelini ve dolayısıyla hastalığın metastatik yayılımını hedefleyen yeni inhibitörler, gliomas gibi yüksek invaziv kanserlerde keşfedilmekte ve tamamlayıcı tedaviler olarak kabul edilmektedir. Bu nedenle, bir ilacın eklenmesinden sonra 3Boyutlu bir ortamda hücrelerin ayrıntılı analizlerini sağlayan veri üretmek gereklidir. Burada açıklanan metodoloji, yüksek çözünürlüklü görüntü yakalama ve konfokal lazer tarama mikroskopisi (CLSM) ile veri analizi ile küresel invazyon tahlilleri birleştirerek, potansiyel anti-göçmen inhibitörü etkilerinin ayrıntılı karakterizasyonu sağladı Mi-192 glioma hücrelerinde. Sferoidler düşük yapışık 96-iyi plakalar invazyon tahlilleri için hücre hatlarından üretildi ve daha sonra CLSM analizi için hazırlandı. Açıklanan iş akışı, hem kolaylık hem de tekrarlanabilirlik nedeniyle yaygın olarak kullanılan küresel üretim tekniklerine göre tercih edilebildi. Konfokal mikroskopi ile elde edilen gelişmiş görüntü çözünürlüğü ile birlikte konvansiyonel geniş alan yaklaşımları, göçmen hücrelerdeki farklı morfolojik değişikliklerin tanımlanmasına ve analiz inanılmaktadır. migrastatik ilaç MI-192 ile tedavi.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Preklinik ilaç keşfi ve potansiyel kanser ilaçlarının geliştirilmesi için üç boyutlu küresel teknolojiler giderek geleneksel ilaç ekranları üzerinde tercih edilmektedir; böylece, migrastatik daha fazla gelişme var - göç ve işgali önleme - uyuşturucu. Kanser tedavisindeki bu gelişmelerin ardındaki mantık açıktır: 3D küresel tahliller, 3D tümör mimarisini hücre monokatmanlı kültürlere göre daha sadık bir şekilde taklit ettikleri için potansiyel anti-kanser ilaçlarının taranması için daha gerçekçi bir yaklaşım dır. ilaç-tümör etkileşimlerini (kinetik) daha doğru bir şekilde özetler ve tümörle ilgili bir ortamda ilaç aktivitesinin karakterizasyonuna izin verir. Buna ek olarak, birçok kanser türünde kemotoksik ilaçlara karşı direncin artması ve kanser hücrelerinin uzak tümör bölgelerine göç etme yeteneği ile güçlü metastaz nedeniyle kanser hastaları arasında yüksek ölüm oranları kemoterapötik ajanların dahil edilmesini destekler gelecekteki klinik kanser çalışmalarında adjuvan tedavi olarak kanser hücrelerinin göç potansiyelini hedefleme1. Bu durum özellikle yüksek dereceli glioblastomlar (GBM) gibi yüksek invaziv kanserlerde geçerlidir. GBM yönetimi cerrahi, radyoterapi ve kemoterapi içerir. Ancak, kombinasyon tedavisi ile bile, çoğu hasta 11-15 ay ortanca sağkalım ile ilk tanı 1 yıl içinde nüks2,3. 3D teknolojisi alanında büyük gelişmeler son birkaç yıl içinde yapılmıştır: rotatif sistemler, mikrofabrikasif yapılar ve 3D iskeleler, ve diğer bireysel tahliller sürekli büyük ölçekli rutin test sağlamak için geliştirilmektedir4, 5,6,7. Ancak, veri yorumlama genellikle 2B görüntü analiz sistemleri ile 3D oluşturulan verileri analiz girişimleri tarafından engellenir, çünkü bu tahlillerden elde edilen sonuçlar anlamlı bir şekilde analiz edilmelidir.

Görüntü edinme hızı ve azaltılmış foto-toksisite açısından tercih edilmesine rağmen, en geniş alan sistemleri çözünürlük8ile sınırlı kalır. Bu nedenle, uyuşturucu etkinliğiyle ilgili veri okumalarının yanı sıra, geniş alan sistemi kullanılarak görüntülendiği takdirde, uyuşturucu eyleminin göç eden hücrelerin 3B hücresel yapıları üzerindeki ayrıntılı etkileri kaçınılmaz olarak kaybolmaktadır. Buna karşılık, confocal lazer tarama mikroskobu (CLSM) bilgisayar yazılımı kullanılarak 3D satın alma sonrası yeniden inşa edilebilir ve işlenebilir yüksek kaliteli, optik kesitli görüntüler yakalar. Böylece CLSM, kompleks 3D hücresel yapıların görüntülenmesi için kolayca uygulanabilir ve böylece anti-migrastatik inhibitörlerin 3Boyutlu yapılar üzerindeki etkilerinin sorgulanmasını ve hücre geçiş mekanizmalarının derinlemesine analizlerinin incelenmesini sağlar. Bu şüphesiz gelecekteki migrastatik ilaç gelişimine rehberlik edecektir. Burada, küresel nesil kombine bir iş akışı, ilaç tedavisi, boyama protokolü, ve yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi ile karakterizasyon açıklanmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Hücre Spheroids Üretimi

1. Gün

  1. Araştırma altındaki hücre hattının gerektirdiği standart kültür ortamını hazırlayın.
  2. Steril işleme tekniklerini kullanarak doku kültürü ile ilişkili tüm adımları bir doku kültürü başlık yürütmek.
  3. Kanser hücrelerini deneyin ve sayın. Plaka başına 20 mL hücre süspansiyonu kullanın. Hücre süspansiyonlarını açıkça etiketli steril evrensel tüplerde tutun.
  4. Her kuyuya önceden belirlenmiş sayıda hücre ekleyin. Hem ilk hücre sayısı hem de gerekli olan nihai küresel boyut araştırılan hücre hattının çoğalma hızına bağlıdır.
    NOT: U251 ve KNS429,10,5 x 103 hücre/mL gibi glioma hücre hatları için 4 günlük kuluçkadan sonra mikroskobik olarak görünür bir sferoid (200 veya 800 m) üretecektir.
  5. Hücre kümelenmeönlemek için nazik inversiyon ile evrensel tüplerhücreleri resuspend. Pipet 96 kuyulu bir plakanın her kuyuya hücre süspansiyonunun 200°L.'si. Tüm kuyular gerekli değilse, buharlaşmayı önlemek için her boş kuyuya 200 μL 1x PBS eklemeniz tavsiye edilir.
  6. Hücreleri 37 °C'de normal bir kuvözde kuluçkaya yatırın.
    NOT: Glioma kanser hücre hatları gibi hücre hatları içinde spheroidler oluşturacak 24 saat. 3D hücresel mimari 72 saat için spheroid kuluçka tarafından oluşturmak için izin verir.

2. Gün

  1. Hücreleri 24 saat sonra parlak alan mikroskobu ile kontrol edin.
    NOT: Kurulan glioma kanser hücre hatları kolayca 24 saat içinde spheroids formu. Hasta kaynaklı glioma kanser hücre hatları kadar sürebilir 1-2 hafta.

2. Kollajen İstilası Tsası

3. Gün

  1. Buz üzerinde kollajen, 5x kültür orta, 1 M NaOH ve bir 20 mL tüp yerleştirin.
  2. Dikkatle ve yavaş yavaş soğutulmuş bir kültür tüpü içine soğuk kollajen 10.4 mL ekleyin. Kabarcıklar kaçının. Kollajen bu miktar bir 96-well plaka için yeterlidir. Yükseltme mümkündür, ancak her bir seferde plaka başına 20 mL tüp hazırlanması önerilir.
  3. Hafifçe soğuk steril 5x kültür orta 1,52 mL ekleyin. Kabarcıklar kaçının.
  4. Kullanımdan hemen önce, 72 μL soğuk steril 1 M NaOH ekleyin. Çözeltiyi buzda tut.
  5. Pipetleme yaparak hafifçe karıştırın. Kabarcıklar kaçının. Verimli karıştırma, ortamda bir renk değişimine (kırmızıdan turuncu-kırmızıya (pH 7.4) yol açar. Kullanıma kadar buz üzerinde karışımı bırakın.
  6. Önemli adım: 1. günde hazırlanan 96 kuyulu plakadan 190 μL supernatant'ı çıkarın. Kuyunun dibinde oluşan küreselleri rahatsız etmemek için çok dikkatli olun. Pipeti kuyunun ortasına değil, yan tarafına doğru bir açıyla kullanın.
  7. Kollajen karışımından 100 μL'yi her kuyuya hafifçe ekleyin. Herhangi bir küresel bozulmayı önlemek için, pipet kuyunun yan aşağı karışımı. Kabarcıklar kaçının. Polimerizasyonu değerlendirmek için kalan kollajen karışımını oda sıcaklığında 20 mL tüpte saklayın.
  8. Kollajen polimerize sağlamak için en az 10 dakika kuluçka plakası. Bir kılavuz olarak, kalan kollajen ayarlanmış ise, yarı katı ve sünger gibi olma, küresel ler inhibitör ile tedavi edilmesi için hazırız.
  9. Kültür ortamına 2x konsantrasyonunda ilaç veya inhibitörlerekleyin. Ortayı her kuyuya hafifçe ekleyin (kuyubaşına 100°L). Yine, pipet spheroid bozukluğu önlemek için kuyunun yan aşağı orta.
  10. İlaç aktivitesini değerlendirmek için her küresel spheroidi t = 0 h, 24 h, 48 h ve 72 h zamanlarında parlak alan mikroskobu ile gözlemleyin ve görüntüleyin. Sonra tabağı kuvöze geri ver.
    NOT: Hücre hattının invaziv davranışına bağlı olarak, orijinal küresel çekirdekten uzak göç 24 saat itibaren görülebilir.

3. Kollajen Gömülü Spheroidlerin ve Göçmen Hücrelerinin Konfokal Mikroskopi İçin Hazırlanması

  1. Plakayı bir doku kültürü başlığına yerleştirin ve süpernatantı (200 μL) yavaşça çıkarın. Yine, bu kollajen fişi ile müdahale edebilir gibi, küresel rahatsız ve kollajen dokunmaktan kaçınmak dikkat edin.
  2. Supernatant'ı 1x PBS'nin 100 μL'si ile değiştirin. Bu yıkama adım 3x tekrarlayın.
  3. Son yıkamayı çıkarın ve 1x PBS'de (kuyu başına 100°L) %4 formaldehit ile değiştirin.
    DİkKAT: Formaldehit potansiyel bir karsinojendir. Sağlık ve güvenlik yönergelerine uygun olarak özenle işleyebilir.
  4. 96 kuyulu plakayı bir laboratuvar bankına yerleştirin, folyo ile kaplayın ve oda sıcaklığında 24 saat bekletin.
  5. Formaldehiti dikkatlice çıkarın ve 1x PBS ile değiştirin. Bu 1x PBS yıkama 3x tekrarlayın.
  6. 1x PBS%0.1 Triton X-100 hazırlayın. 1x PBS yıkamayı çıkarın ve Triton X-100 çözeltisinin 100 μL'si ile değiştirin. Oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka. Bu arada, 1x PBS ve% 0.05 yağsız süt tozu ile engelleme çözeltisi hazırlamak ve iyice karıştırın.
  7. Triton X-100'ü çıkarın ve 1x PBS ile 3x yıkayın. Her kuyuya 100 μL engelleme çözeltisi ekleyin ve 15 dakika kuluçkaya yatırın.
  8. Önceden belirlenmiş konsantrasyonda tampon engelleme gerekli birincil antikor seyreltmek. Burada, anti-fare IgG asetiltli tubulin antikor (1:100) kullanın.
  9. Santrifüj birincil antikor engelleme tampon karışımı için 5 dk 15,682 x g. Engelleme çözeltisini dikkatlice çıkarın ve her kuyuya süpernatant (25−50°L) ekleyin. 1 saat oda sıcaklığında karanlıkta kuluçka.
  10. Antikor solüsyonunu çıkarın ve 3x 1x PBS (kuyu başına 100°L) ile yıkayın.
  11. Herhangi bir ek floresan lekelere ek olarak, önerilen veya önceden belirlenmiş konsantrasyonda bloke edici tampon ikincil antikor seyreltin. Burada, actin boyama için 1:500 anti-fare florofor-488 konjuge antikor, phalloidin-594 (1:500) ve DNA lekesi (DAPI) kullanın.
  12. Yine, 13.000 rpm 5 dakika için ikincil antikor çözeltisi santrifüj.
  13. Her kuyudan blokaj çözeltisini çıkarın ve ikincil antikor/phalloidin/DAPI karışımından 25−50 μL ekleyin. Oda sıcaklığında 1,5 saat karanlıkta kuluçka.
  14. İkincil antikor boya çözeltisi çıkarın ve 1x PBS (kuyu başına 100 μL) ile 3x yıkayın.
  15. Yüksek kaliteli düz cam kaydırak merkezine plastik pipet (200 μL) ile emme ile bireysel kollajen fişleri dikkatlice kaldırın.
  16. Kollajen fişe uygun bir montaj antünün bir damlasını ekleyin, fişin tamamen kapalı olmasını sağlar. Kabarcıklar kaçının.
  17. Görüntüleme için kullanılacak ve bir gecede ayarlanabilmesine izin verecek olan mikroskop hedefi için en uygun kalınlıkta kapak kaymasını uygulayın. Slaytları karanlıkta oda sıcaklığında saklayın.

4. Floresan Mikroskopisi

  1. Uygun bir konfokal mikroskop kullanarak floresan görüntüleri yakalayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Üç boyutlu küresel teknoloji kansere özgü ortamın daha fazla temsilcisi olduğu için ilaç-tümör etkileşimleri anlayışı nı ilerletmektedir. Küresel lerin üretimi çeşitli şekillerde elde edilebilir; bu protokolde düşük yapışma 96-kuyu plakaları kullanılmıştır. Farklı üreticilerin çeşitli ürünleri test ettikten sonra, burada kullanılan plakalar sürekli başarılı küresel üretim ve tekdüzelik açısından en iyi performans çünkü seçildi. Büyüme ortamının kollajen matrisle değiştirildiği değiştirme adımı protokolün kritik bir noktasıdır; spheroid kendisi rahatsız etmeden orta çoğu kaldırmak için büyük özen alınmalıdır. Geniş alan mikroskobu ile ilaç kaynaklı etkilerin karakterizasyonu için otomatik görüntüleme herhangi bir işleyici önyargı kaldırmak için kabul edilebilir, ancak şu anda ticari olarak kullanılabilir araçlar görüntüleme yaklaşımları çok daha pahalı kalır burada özetlenmiştir.

Geniş alan epifloresan mikroskopisi, ilaç aktivitesinin hücre göçü ve invazyonu üzerindeki etkisinin incelenmesine olanak sağlar. Ancak, geniş alan mikroskobundan elde edilen çözünürlük, hücre morfolojisi üzerindeki ilaç etkisine ilişkin sonuçların ayrıntılı olarak yorumlanmasına olanak sağlayacak kadar iyi değildir(Şekil 1). Burada glioma spheroidlerinin ve göç eden hücrelerin kolayca tekrarlanabilir boyama protokolleri ile hazırlanması, ardından konfokal mikroskop kullanılarak görüntüleme nin izlenmesi anlatılmaktadır. Geniş alan mikroskopi görüntü analizinden, MI-192 inhibitörü ile tedavi den sonra glioma hücrelerinde farklı morfolojik değişiklikler meydana geldiği, ancak açıkça tanımlanmış ayrıntıların eksik olduğu anlaşılmıştır. Konfokal mikroskopi ilk bulguları doğruladı ve bu yüksek çözünürlüklü görüntüler MI-192'nin etkisinin daha da değerlendirilmesini sağladı. Tedavi edilmeyen (kontrol) küreseloidler, göç eden hücreler(Şekil 2)ile tedavi edilen küresel oidler ve hücreler(Şekil 3)arasında anlamlı farklar ortaya çıktı. Yetişkin glioma hücre hattı U251 'sivri' göç gibi görünürken, tek hücre ayrılması ile orijinal küresel çekirdek uzak yayılan, pediatrik hücre hattı KNS42 birkaç farklı hücre sivri ile bir levha gibi göç desen kabul etti. Daha önce, farklı hücre hatları arasında farklı göç desenleri (burada yetişkin glioma hücre hattı U251 ve pediatrik hücre hattı KNS42) gözlendi, potansiyel olarak ortaya çıkan hücre tipi ve tümör izolasyon yeri yansıtan. En önemlisi, inhibitör konsantrasyonu artan asetiltli tubulin bir artış da ortaya çıkarıldı (dan 0.1−10 μM) ayrıca, sadece göç eden hücrelerde, ama aynı zamanda küresel ilişkili hücrelerde. Bu ilk geniş alan mikroskopi salınan görüntülerde belirgin değildi. Daha fazla görüntüleme de migrastatik inhibitörleri ile tedaviye hücresel bir yanıt olarak protein ekspresyonu düzeylerinin kantitatif analizi sağlayacaktır.

Bu çalışmada, tedaviye yanıt olarak hücrelerin morfolojik olarak değiştiği gösterilmiştir; hücre yuvarlama, en yüksek inhibitör konsantrasyonda (10 μM) artan inhibitör konsantrasyonları ve hücre ölümü ile belirgin hale geldi, U251 hücrelerinde nükleer parçalanma ve KNS42'de çökmüş mikrotübüller ve nükleer parçalanma ile belirginleşti. Bu bulgular, MI-192'nin glioma hücre hatlarındaki göçmen karşıtı aktivitesinin konsantrasyona bağlı olduğu önceki gözlemlere uygun olarak13,14. Protokolün genel iş akışı Şekil 4'tegösterilmiştir.

Figure 1
Şekil 1: Geniş alan mikroskobu ile görüntülenmiş kollajeniçine küresel hücre invazyonu. U251 ve KNS42 hücre hatlarının temsili görüntüleri, 1 μM'lik anti-göçmen konsantrasyonunda ve 24 saat aralıklarla inhibitör MI-192 ile tedaviden sonra gösterilmiştir. Tedavisi olmayan bir kontrol spheroidi de gösterilmiştir. Potansiyel anti-veya pro-migratory etkileri vurgulanmış olarak algılanır (oklar). Bu özellikle KNS42'de kontrol veya tedavi edilen küresel lerde göç olmadığı görülür. Tüm görüntüler 4x'te çekildi. Ölçek çubuğu = 1.000 μm. SF188 = 200 μm, KNS42 = 1.000 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Migrastatik inhibitörü MI-192'nin fokal mikroskopi ile ortaya çıkan glioma hücre hattı U251 üzerine etkisi. Sabit ve lekeli glioma küreseloidler ve göçmen hücreler farklı göçmen fenotipleri gösterirler. Orijinal küresel kenarlara yakın göçmen hücreler gösterilir. U251 hücre spheroidleri, orijinal küresel oidden uzağa yayılan ani artışlarla karakterizedir ve inhibitör konsantrasyonu artan hücrelerde hücre yuvarlama artmaktadır (ok hücre dikenini gösterir). Ölçek çubuğu = 10 μm. Etiketler: kırmızı = aktin, yeşil = asetiltli tubulin, mavi = DAPI. Her görüntü için, karşılaştırmalı amaçlar için hem öncesi hem de sonrası görüntü yakalama bakımı ile tüm ayarları ile tek bir temsili optik bölüm yakalandı. Tüm görüntüler daha sonra işlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Migrastatik inhibitörü MI-192'nin konfokal mikroskopi ile ortaya çıkan glioma hücre hattı KNS42 üzerindeki etkisi. KNS42 geçişi, tek hücreli sivri uçlu yaprak benzeri çıkıntılarla karakterize edilir (ok hücre sayfasını gösterir). En düşük inhibitör konsantrasyonda bu fenotip belirgin görünür ancak artan inhibitör konsantrasyonu ile kaybolur (ölçek çubuğu = 10 μm); etiketler: kırmızı = aktin, yeşil = asetiltli tubulin, mavi = DAPI. Her görüntü için tek bir temsili optik bölüm yakalandı ve karşılaştırmalı amaçlar için hem öncesi hem de sonrası görüntü yakalama ile tüm ayarlar tutuldu. Tüm görüntüler daha sonra işlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: İş akışının özeti. Bu iş akışında yer alan küresel lerin üretimi, kollajen gömme, ilaç tedavisi, sabitleme, boyama ve konfokal mikroskopi ile görüntüleme. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi kullanarak migrastatik ilaç aktivitesinin belirlenmesi için kanser hücresi küresel oluşturmak için yeni bir yol açıklanmıştır. Diğer teknikler üzerinde düşük yapışkan plakaların kullanımı, bu tür damla asılı15, kollajen göç ve istila tahlilleri kullanılmak üzere tekrarlanabilir ve tek tip sferoidler üreten bir araç kolaylaştırmıştır. Bu protokoldeki kritik noktalar, kollajen matrisine hücre küresel katıştırma işleminden önce 96 kuyulu plakadan büyüme ortamının çıkarılması ve bundan sonra küresel fişlerin içeren kollajen fişlerin dikkatli bir şekilde kullanılmasıdır. Dijital mikroakışkan16 gibi yeni teknolojiler artık mevcuttur ve daha pahalı olmasına rağmen, medya ve sıvıların manuel olarak kaldırılmasına alternatif olabilir. Açıklanan protokolün ana sınırlaması, tek küresel lerin görüntülenmesi ve daha sonra inhibitör ilaç aktivitesini değerlendirmek için parlak alan mikroskobu ile elle analiz edilmesi zaman alıcı olmasıdır. Buna ek olarak, sürecin tüm adımları için gerekli reaktifler pahalı, ve özel ekipman, yani yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskop, ayrıca gereklidir. Tohumlama için gerekli olan optimum hücre sayıları ve gerekli boyutta bir hücre sferoidi elde etmek için geçen süre de kollajen invazyonu tizinin başlamasından önce önceden belirlenmelidir.

Kanser hücrelerini hedef alan ilaçların geliştirilmesi, büyük ölçekli ilaç taraması ve ilaç modifikasyonu ve iyileştirilmesi için ilaç aktivitesinin karakterizasyonu giderek daha fazla 3D hücre tahlilleri ve teknolojisine dayanmaktadır. Bu protokol optimize edilebilir ve diğer deneysel tahliller ve diğer hastalık sistemlerinde önemi çok sayıda diğer hücre türleri ile kullanılmak üzere adapte edilebilir. Bugüne kadar, mikroskobik olarak oluşturulan verilerin yorumlanması geniş alan mikroskobu uygulaması ile engellenmiş, elde edilen görüntüler sınırlı çözünürlük sunan ve ışık dışında kaynaklanan doğal görüntü bulanıklığı ile boğulmuş odak düzlemi. Burada gösterilen geniş alan mikroskopi görüntüleri, zaman alan ve işleyici önyargısı getirebilecek bir süreç olan EVOS görüntüleme sistemi kullanılarak el ile elde edilebilmektedir. Yeni teknolojiler, otomatik iş istasyonları ve analiz platformları da dahil olmak üzere17,18, şimdi mevcuttur ama pahalı kalır ve bu nedenle hala birçok araştırma laboratuvarları için kullanılamaz. Buna ek olarak, daha fazla yazılım geliştirmeleri, burada belirtildiği gibi fenotipik değişiklikleri ve dolayısıyla hücre göçü üzerindeki inhibitörlerin etkinliğini doğru bir şekilde ölçmek için yüksek çözünürlüklü 3D işlenmiş görüntülerin analizine yardımcı olabilir. Ayrıca, birçok araştırma laboratuvarında giderek standart hale gelen süper çözünürlüklü floresan görüntüleme tekniklerinin uygulanması, 3Boyutlu spheroid'de yetişen hücrelerin göçmen davranışları ve morfolojisi hakkında daha fazla bilgi sağlayacaktır. inhibitör ilaçlarla tedavi edilir.

Bu düzeltmek ve leke küresel oidler mümkün olduğu tespit edildi, bir migrastatik inhibitör ile tedavi sonrasında, kollajen gömülü zaman. Bu yöntemin gerçeklemesi kolaydı, 96 kuyulu plakalar halinde tamamlanan tüm adımlar, ardından küresel fişleri içeren kollajen fişlerin görüntüleme için kapaklara monte edilmesi yle. İnhibitör aktivitesinin kanser hücresi morfolojisi üzerindeki etkisini değerlendirirken ilaç aktivitesini açıklamak için konfokal mikroskopi kullanılmıştır. Düşük çözünürlüklü görüntülerden inhibitör MI-192 anti-göçmen etkisi ilk bulgular yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi ile doğrulandı. Bu özel inhibitör histone deasetilaz 3 (HDAC3) hedefler. HDAC'lar gen ekspresyonunun epigenetik düzenlenmesinde rol oynayan enzimlerdir ve son zamanlarda kanser ilacı gelişiminde potansiyel hedefler olarak artan ilgi olmuştur. MI-192 ile önceki deneyimler göstermiştir ki, düşük konsantrasyonlarda, bu tubulin asetilasyon düzenler, hiperasetilasyon ve mikrotübüllerin stabilizasyonu yol. Stabilize mikrotübüller daha az dinamiktir ve hücrelerin göç faaliyetleri üzerinde potansiyel bir etkiye sahiptir. Gözlenen etkinin hem temsili pediatrik hem de erişkin glioma hücre hatlarında mevcut olduğu saptadı. Her iki glioma hücre hattının tubulin asetilasyon durumunda konsantrasyona bağlı bir artış ortaya çıkarılmış, migrastatik ilaçlarla tamamlayıcı tedavi düşünüldüğünde hastaların ön seçimi üzerinde etkileri olan bir bulgu ortaya çıkarılmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmezler.

Acknowledgments

Profesör Chris Jones'a KNS42 hücre hattına katkıda bulunanlara teşekkür ederiz. Bu çalışmada kullanılan AiryScan ile Zeiss LSM880 konfokal mikroskobu Huddersfield Yenilik ve Kuluçka Projesi (HIIP) Leeds City Region Enterprise Partnership (LEP) Büyüme Anlaşması ile finanse bir parçasıdır. Mikroskop görüntüsü için Kredi Şekil 3: Carl Zeiss Mikscopy GmbH, microscopy@zeiss.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagen I, rat tail, 100 mg Corning 354236 for glioma invasion assay; this is offered by many distributors/manufacturers and will need to be determined for both the type of assay intended and cell lines used. For glioma cancer cell lines Collagen rat tail type 1 (e.g. Corning) is the preferred choice. Collagen should be stored at 4 °C, in the dark, until required. It is not advisable to mix collagen from different batches as this may affect the consistency of the polymerized collagen.   
Coverslips various various for microscopy imaging
DMEM powder Sigma D5648 needed at 5x concentration for collagen solution for glioma invasion assay;  this may be purchased in powdered form, made up in double distilled water and, depending upon final composition of the growth medium, completed with any additives required. The complete 5x solution should be filtered through a syringe filter system (0.22 μm) before use.
Foetal calf serum Sigma F7524-500ML needed for cell culture of glioma cell lines
Glass slides various various for microscopy imaging
High glucose DMEM Gibco 41965062 needed for cell culture of glioma cell lines
Inhibitor Tocris various various - according to experimental design; inhibitors can be purchased from manufacturers such as Selleckchem and Tocris. These manufacturers offer detailed description of inhibitor characteristics, links to associated references and suggestion of working concentrations. As with all inhibitors, they may be potentially toxic and should be handled according to health and safety guidelines. Inhibitors are prepared as stock solutions as recommended by the manufacturer. As an example we used the migrastatic inhibitor MI-192 to demonstrate the use of such inhibitors. We have tested a range of migrastatic inhibitors in this way with comparable results.
Mountant various various for microscopic imaging
NaOH (1 M) various  various NaOH can be either purchased at the required molarity or prepared from solid form. The prepared solution should be filter sterilized using a syringe filter system. One M NaOH is corrosive and care should be taken during solution preparation.
Paraformaldehyde  various various for fixing spheroids and cells; make up at 4%, caution health hazard, ensure that health and safety regulations are adhered to for collagen solution for invasion assay
Pastettes (graduated pipette, 3 mL) various various for invasion assay, solution removal
PBS, sterile for tissue culture Sigma D1408-500ML   needed for cell culture of glioma cell lines and washes for staining
Pen/strep (antibiotics) Sigma P4333 needed for cell culture of glioma cell lines
Primary antibody, secondary antibody, DAPI, Phalloidin various various there are many manufacturers for these reagents, for secondary labelled antibodies we recommend Alexa Fluor (Molecular Probes). Here we used for primary antibodies mouse anti-acetylated tubulin antibody (1/100, Abcam). For secondary antibodies we used 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 conjugated antibody, Molecular Probes. For nuclear stain we used DAPI (many manufacturers) and the actin stain Phalloidin (many manufacturers) both used at recommended dilution of 1/500.
Sodium bicarbonate Sigma S5761 needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5x concentration
Sodium pyruvate Sigma P5280 needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5x concentration
Trypsin Sigma T4049 for trypsinisation
Ultra low attachment plates Sigma/Nunc CLS7007-24EA for glioma invasion assay; a low adherent plate is required, with 96-well plates preferred to allow for large-scale screening of compounds under investigation. There are several low adherence plates commercially available; it is advisable to test a variety of plates for optimum spheroid generation. In our experience Costar Ultra Low Cluster with lid, round bottom, works best for the generation of spheroids from glioma cancer cells in terms of 100% spheroid formation and reproducibility. These plates were also successfully used for the generation of glioma spheroids from patient-derived material, bladder and ovarian cancer cells in our laboratory. In addition, stem or progenitor neurospheres can be used in these plates to facilitate the generation of standardized neurosphere-spheroids
Stripettes (serological pipettes, sterile, 5 mL and 10 mL) various e.g. Costar CLS4488-50; CLS4487-50 for tissue culture and collagen preparation
Various multichannel (50 - 250 μL) and single channel pipettes (10 μL, 50 μL, 200 μL 1 mL) various various for cell and spheroid handling
Widefield microscopy various  various for observation of spheroid generation and spheroid imaging; here wide-field fluorescence images were captured using an EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific)
Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective Zeiss quote from manufacturer Confocal images were captured using a Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline and HeNe 594nm lasers were used to excite Phalloidin 594, Alexa Fluor 488, and DAPI respectively. For each image a single representative optical section were captured, with all settings, both pre- and post-image capture, maintained for comparative purposes. All images were subsequently processed using the associated Zen imaging software and Adobe Photoshop.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gandalovičová, A., et al. Migrastatics-anti-metastatic and anti-invasion drugs: promises and challenges. Trends in Cancer. 3, (6), 391-406 (2017).
  2. Delgado-López, P. D., Corrales-García, E. M. Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities. Clinical and Translational Oncology. 18, 1062 (2016).
  3. Foreman, P. M., et al. Oncolytic virotherapy for the treatment of malignant glioma. Neurotherapeutics. 14, 333 (2017).
  4. Rodrigues, T., et al. Emerging tumor spheroids technologies for 3D in vitro cancer modelling. Pharmacology and Therapeutics Technologies. 184, 201-211 (2018).
  5. Sirenko, O., et al. High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures. Assay and Drug Development Technologies. 13, (7), Mary Ann Liebert, Inc. (2015).
  6. Wu, Q., et al. Bionic 3D spheroids biosensor chips for high-throughput and dynamic drug screening. Biomedical Microdevices. 20, 82 (2018).
  7. Mosaad, E., Chambers, K. F., Futrega, K., Clements, J. A., Doran, M. R. The microwell-mesh: a high-throughput 3D prostate cancer spheroid and drug-testing platform. Scientific Reports. 8, 253 (2018).
  8. Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-a comparison of confocal microscopy techniques. Journal of Biomolecular Techniques. 26, (2), 54-65 (2015).
  9. Pontén, J. Neoplastic human glia cells in culture. Human Tumor Cells in Vitro. Springer US. Boston. 175-206 (1975).
  10. Takeshita, I., et al. Characteristics of an established human glioma cell line, KNS-42. Neurologica Medico Chirurgica. 27, (7), 581-587 (1987).
  11. Bance, B., Seetharaman, S., Leduc, C., Boëda, B., Etienne-Manneville, S. Microtubule acetylation but not detyrosination promotes focal adhesion dynamics and cell migration. Journal of Cell Science. 132, (2019).
  12. Bacon, T., et al. Histone deacetylase 3 indirectly modulates tubulin acetylation. Biochemical Journal. 472, 367-377 (2015).
  13. Jackman, L., et al. Tackling infiltration in paediatric glioma using histone deacetylase inhibitors, a promising approach. Neuro-Oncology. 20, i19-i19 (2018).
  14. Bhandal, K., et al. Targeting glioma migration with the histone deacetylase inhibitor MI192. Neuro-Oncology. 19, i12-i12 (2017).
  15. Del Duca, D., Werbowetski-Ogilvie, T. E., Del Maestro, R. Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion. Journal of Neuro-oncology. 67, (3), 295-303 (2004).
  16. Bender, B. F., Aijian, A. P., Garrell, R. L. Digital microfluidics for spheroid-based invasion assays. Lab on a Chip. 16, (8), 1505-1513 (2016).
  17. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
  18. Härmä, V., et al. Quantification of dynamic morphological drug responses in 3D organotypic cell cultures by automated image analysis. PLOS ONE. 9, (5), e96426 (2014).
Migrastatik İnhibitörlerin 3Boyutlu Tümör Spheroid İnvazyonu Üzerine Etkilerinin Yüksek Çözünürlüklü Konfokal Mikroskopi Ile Karakterizasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Harmer, J., Struve, N., Brüning-Richardson, A. Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (151), e60273, doi:10.3791/60273 (2019).More

Harmer, J., Struve, N., Brüning-Richardson, A. Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (151), e60273, doi:10.3791/60273 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter