Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

عزل يمكن الاعتماد عليه من الاوعيه المجهرية للجهاز العصبي المركزي عبر خمس مجموعات فقاري

Published: January 12, 2020 doi: 10.3791/60291
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1
1Department of Anatomy, Physiology and Cell Biology, University of California Davis, 2University of Veterinary Medicine Hannover Foundation
* These authors contributed equally

Summary

والهدف من هذا البروتوكول هو عزل الاوعيه المجهرية من مناطق متعددة من الجهاز العصبي المركزي لفقاريات السسينسيفريك والفقريات.

Abstract

يتم اجراء عزل الاوعيه الدقيقة من الجهاز العصبي المركزي (CNS) عاده عن طريق الجمع بين الانسجه القشرية من العديد من الكائنات ، وغالبا ما تكون القوارض. هذا النهج يحد من التحقيق في خصائص حاجز الدم في الدماغ (BBB) إلى القشرة ولا يسمح للمقارنة الفردية. يركز هذا المشروع علي تطوير طريقه العزلة التي تسمح للمقارنة بين وحده الاوعيه الدموية (NVU) من المناطق العصبية المتعددة: القشرة ، المخيخ ، الفص البصري ، المهاد ، الغدة النخامية ، جذع الدماغ ، والحبل الشوكي. وعلاوة علي ذلك ، تم تكييف هذا البروتوكول ، الذي وضع أصلا لعينات murine ، بنجاح للاستخدام علي الانسجه العصبية من الأنواع الصغيرة والكبيرة فقاري التي نحن أيضا قادره علي عزل الاوعيه الدقيقة من المادة البيضاء في نصف الكره الدماغ. هذا الأسلوب ، عندما يقترن مع المناعي ، يسمح لكميه من التعبير البروتين والمقارنة الاحصائيه بين الافراد ، ونوع الانسجه ، أو العلاج. وقد أثبتنا هذا التطبيق من خلال تقييم التغيرات في تعبير البروتين خلال التهاب الدماغ المناعي الذاتي التجريبي (EAE) ، وهو نموذج murine للمرض التهابي العصبي ، والتصلب المتعدد. بالاضافه إلى ذلك ، يمكن استخدام الاوعيه المجهرية المعزولة بواسطة هذه الطريقة للتطبيقات المصب مثل qPCR ، الحمض الريبي المتسلسل ، ولطخه الغربية ، من بين أمور أخرى. علي الرغم من ان هذه ليست المحاولة الاولي لعزل الاوعيه الدقيقة CNS دون استخدام الانحلال القصبي أو التفكك الانزيمي ، فهي فريدة من نوعها في الدقة للمقارنة بين افراد واحد والمناطق العصبية المتعددة. لذلك ، فانه يسمح للتحقيق في مجموعه من الاختلافات التي قد تظل غامضه والا: أجزاء CNS (القشرة ، المخيخ ، الفص البصري ، جذع الدماغ ، المهاد ، الغدة النخامية ، والحبل الشوكي) ، ونوع الانسجه العصبية (المادة الرمادية أو البيضاء) ، والافراد ، مجموعات العلاج التجريبية ، والأنواع.

Introduction

دماغنا هو الجهاز الأكثر اهميه في جسمنا. لهذا السبب, الحفاظ علي التوازن الدماغ علي الرغم من العوامل الخارجية التي قد تؤدي إلى انحراف عن الحياة الطبيعية هو اولويه. وفقا لبعض العلماء ، حوالي 400-500 مليون سنه مضت1، فقاري الحيوانية وضعت ما نعرفه الآن باسم حاجز الدم في الدماغ (BBB)2،3. هذا "السياج" الواقية تمارس أكبر قدر من التاثير علي النظام العصبي المركزي (CNS) التوازن والوظائف من خلال تنظيم باحكام نقل الأيونات والجزيئات والخلايا بين الدم والخلية العصبية. عندما تتعطل BBB ، يصبح الدماغ عرضه للتعرض السام ، والعدوى ، والتهاب. ولذلك ، يرتبط الخلل الوظيفي BBB مع العديد ، ان لم يكن كل ، اضطرابات العصبية والنمو العصبي4،5،6.

وتعزي الوظيفة المتطورة لل BBB إلى الاوعيه المجهرية العصبية الفريدة التي تتوافق مع وحده الاوعيه العصبية (nvu)2،3. الخلايا البطانية عاليه التخصص ، بيريسيلات ، والقدمين النهاية استروسيتيك هي المكونات الخلوية لل nvu2،3. مصفوفة خارج الخلية المتولدة من هذه الخلايا هي أيضا ضرورية لل nvu و BBB فسيولوجيا2,3. علي الرغم من ان المكونات الخلوية والجزيئية الاساسيه لل nvu يتم الحفاظ عليها بين الفقاريات ، يتم الإبلاغ عن عدم التجانس بين الأوامر والأنواع7،8. ومع ذلك ، القيود التقنية تعيق قدرتنا علي النظر بشكل كامل في هذه الاختلافات في البيولوجيا العصبية ، الطب الحيوي ، أو البحوث الانتقالية.

وبسبب ذلك ، قمنا بتوسيع طريقه العزل المجهري الخاصة بمنطقه السفينة العصبية الخاصة لجعلها قابله للتطبيق علي العديد من الأنواع من مجموعات الفقاري الخمسة: الأسماك والبرمائيات والزواحف والطيور والثدييات. يوصف البروتوكول لاستخدامه علي الفقاريات الصغيرة والفقريات الكبيرة ، بما في ذلك الأنواع ذات الصلة الانتقالية9. بالاضافه إلى ذلك ، ونحن تشمل مناطق أخرى من الCNS لم يتم التحقيق فيها من قبل في هذا السياق ، ولكن ذات الصلة لفسيولوجيا الأعصاب ومع الآثار السريرية الهائلة: المهاد ، الغدة النخامية ، والمادة البيضاء. وأخيرا ، اختبرنا قدره هذه الطريقة العزلة كاداه موثوق بها لتحديد التغيرات في تعبير البروتين علي طول nvu و/أو BBB9،10،11. كدليل علي المفهوم ، أظهرنا كيفيه تحديد التغييرات في VCAM-1 والتعبير جام-B خلال EAE باستخدام طريقه العزل تليها المناعي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

جميع إجراءات هذه الدراسة وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها جامعه كاليفورنيا (UC) ، ديفيس المؤسسية الرعاية الحيوانية واستخدام اللجنة (IACUC). يتم تنظيم الرعاية الحيوانية في جامعه كاليفورنيا ديفيس من قبل العديد من الموارد المستقلة ، وقد تم اعتمادها بالبالكامل من قبل جمعيه لتقييم واعتماد المختبر الدولي لرعاية الحيوانية (AAALAC) منذ 1966. تم الحصول علي انسجه الخلايا العصبية الخاصة بالخنازير من قسم العلوم الحيوانية في جامعه UCD ، مختبر علوم اللحوم. تم الحصول علي الانسجه العصبية المركزية من macaques ريسوس من كاليفورنيا الرئيسية الرئيسية للبحوث قسم علم الامراض (المعاهد الوطنية للصحة P51OD011107). لم يتم اجراء التخدير أو القتل الرحيم أو الانحلال الجسدي من قبل موظفي المختبر علي الخنازير و macaques. ولذلك ، لا توجد توصيات محدده بشان هذه المسائل.

ملاحظه: تم التحقق من صحة هذا الأسلوب لأنواع متعددة ، ولكن يتوافق مع البروتوكول المتوفر أكثر مباشره إلى الماوس والانسجه الخنازير. لا تنطبق التفاصيل المتعلقة بالفص البصري عند استخدام عينات الثدييات. ويجب معالجه جميع المواد البيولوجية الخطرة في مرفق مناسب لمستوي السلامة البيولوجية (BSL). يجب التعامل مع جميع المواد السامة حاد تحت غطاء الدخان. ويجب التخلص من جميع النفايات الطبية الخطرة بيولوجيا والنفايات السمية الحاده بشكل صحيح.

1-الاعداد

  1. اعداد الحلول (الجدول 1) قبل يوم واحد علي الأقل.
    ملاحظه: من الصعب جدا حل 70 الوزن الجزيئي (MW) ديكسان. فمن أكثر كفاءه للسماح للحل يحرك بين عشيه وضحيها مغطاه اما فيلم البارافين أو إحباط. يتطلب البروتوكول استخدام اثنين من الحلول المختلفة MV-2 اعتمادا علي العينة قيد التحقيق. و 18 ٪ ديديكسان يفصل بكفاءة الميالين من بيليه الاوعيه الدقيقة عند تنفيذ البروتوكول علي العينات الصغيرة ليسينسيفريك. ومع ذلك ، فانه يطور مسحه من الميالين داخل واجهه الانسجه العصبية من العينات الكبيرة الجيروسكوب ، فضلا عن المهاد والغدة النخامية من العينات الصغيرة. يتم منع هذه المسحة باستخدام 20 ٪ ديكدكان.
  2. اعداد الشرائح جيدا عن طريق تحميل 50 μL لكل بئر من بولي-D-يسين واسمحوا الجافة ل 2 ح في درجه حرارة الغرفة (RT) ، ويفضل في السلامة البيولوجية مجلس الوزراء-الدرجة 2 (BSC-2). لا تفرط في الجفاف. يشطف مرتين بالمحلول الملحي المخزن بالفوسفات ويحفظ في البراد حتى يصبح جاهزا للاستعمال.

2. تشريح الانسجه العصبية من العينات الصغيرة فقاري ليسينسيفريك

ملاحظه: توضح هذه المقالة تطبيق البروتوكول علي C57BL6/J ، 10 الأسبوع القديم ، ~ 25 ز ، الذكور الماوس.

  1. اعداد 2 15 mL أنابيب مخروطيه و 1.7 mL أنبوب ميكروالطرد المركزي مع 5 مل و 1 مل ، علي التوالي ، من الحل MV-1 لكل عينه. إبقاء الأنابيب علي الجليد.
  2. تخدير
    1. تخدير الفئران بواسطة حقن داخل الصفاق من الكيتامين ، اكسيليازين ، وكوكتيل التخدير اسيبرومازين في 100/10/3 ملغ لكل كيلوغرام من وزن الجسم ورذاذ مع 70 ٪ الايثانول. تاكيد التخدير من خلال تقييم غياب المنعكسات ودواسات الأصابع عن طريق لمس العين ومعسر القدم ، علي التوالي.
    2. تخدير الحمام عن طريق استنشاق 5 ٪ ايزوفلواني باستخدام مربع التخدير التعريفي.
    3. تخدير الأسماك والضفادع في 1 ٪ Tricaine اما في الأسماك عقد خزان المياه أو البرمائية الحل الرنين (جدول المواد) ، علي التوالي.
    4. تخدير السحالي بالتبريد عند 4 درجه مئوية قبل القتل الرحيم.
  3. قطع الراس الحيوانية مع مقص الجراحية ، قشر بعيدا الجلد مع ملقط لفضح الجمجمة ، وقص مع مقص لاجنج من خلال ماغنوم فورامين (الشكل 1ا).
  4. تشريح الدماغ خارجا مع ملعقة ونقل إلى أنبوب مخروطي 15 مل مع الحل MV-1. ابقي الأنبوب علي الثلج
  5. استرداد الغدة النخامية من الجمجمة سيلا سرج مع ملقط ونقل إلى أنبوب الطرد المركزي 1.7 mL الصغرى مع الحل MV-1. ابقي الأنبوب علي الثلج
  6. أزاله الجلد والعضلات للكشف عن العمود الفقري. قطع الأطراف والقفص الصدري والأعضاء الداخلية (الشكل 1ب).
  7. تشريح الحبل الشوكي بأحدي الطريقتين الموصوفتين أدناه. ثم ، نقل إلى أنبوب مخروطي 5 مل مع الحل MV-1. ابقي الأنبوب علي الثلج
    1. اجراء استئصال الصفيحة الفقرية عن طريق قطع في منقاري إلى اتجاه الذيليه مع مقص لاجنج ، بدءا من خلال النخاع الشوكي العنقية، حتى تصل إلى الحبل القطني.
    2. اجراء بيغ في الذيليه إلى اتجاه منقاري في جميع انحاء القطنية الفقرية مع ابره 18 ز و 10 مل حقنه محمله بالحل MV-1 (الشكل 1ج ، د).
      ملاحظه: هذا الأسلوب يعمل فقط مع عينات صغيره جدا ، ومعظمهم من القوارض (< 100 غرام).
  8. باستخدام نطاق تشريح ، قطع الكيس الوضعي من الحبل الشوكي مع مقص الربيع وأزاله السحايا المتبقية مع اختيار مزدوجة الشق (الشكل 2).
  9. نقل الدماغ إلى طبق بيتري ، وباستخدام نطاق تشريح ، وأزاله السحايا مع اختيار مزدوجة الشق (الشكل 2ا – ج).
  10. المكوس المصابيح حاسة الشم والمهاد مع ملقط ، مقص القزحية ، ومقص الربيع. باستخدام اختيار مزدوجة الشق ، وأزاله الضفيرة المشيميه من جميع البطينين في الدماغ. تاكد من أزاله جميع الضفيرة المشيميه.
    ملاحظه: الضفيرة المشيميه والمصابيح حاسة الشم هي مصدر هائل من التلوث. وعلي النقيض من BBB, هذه الشعيرات الدموية هي منوفذه للغاية ونتائج التجارب اللاحقة سيتم المساس إذا لم يتم ازالتها.
  11. باستخدام ملقط ، فصل المناطق المستقلة العصبية: القشرة ، المخيخ ، جذع الدماغ ، الفص البصري (وليس علي عينات الثدييات) ، والمهاد.

3. تشريح الانسجه العصبية من عينه كبيره من فقاري الجيروسكوبات

ملاحظه: يستخدم هذا البروتوكول انسجه الاشعه العصبية التي تم الحصول عليها من مسلخ. ولذلك ، لا يتم وصف أو إظهار التخدير ، القتل الرحيم ، أو العنكبوت.

  1. نقل الانسجه العصبية العامة في حاويه الانسجه 0.946 L (32 oz) محمله بمحلول MV-1 داخل الصدر الجليد/دلو.
  2. باستخدام نطاق تشريح ، وأزاله السحايا مع اختيار مزدوجة الشق ، ملقط ، مقص القزحية ، ومقص الربيع من كل الانسجه العصبية. تاكد من أزاله اي قطع من الضفيرة المشيميه من البطينات الدماغ.

4. العصبي الانسجه التجانس

ملاحظه: هو أكثر كفاءه عندما اثنين من المحققين الانخراط في عمليه التجانس: واحد تشريح السحايا تحت المنظار الفراغي وغيرها من المجانسة الانسجه المفرومة. بهذه الطريقة ، يتم إرجاع الانسجه بسرعة إلى دلو الثلج وتبقي بارده.

  1. وضع كل منطقه CNS علي طبق بتري مع ~ 1 مل من الحل MV-1. باستخدام شفره أحاديه الحافة ، فرم النسيج للحصول علي قطعه 1 – 2 مم.
    1. للحصول علي عينه فقاري صغيره ، استخدم 100 مم × 20 مم طبق بيتري.
    2. للحصول علي عينه فقاري كبيره ، استخدم 150 مم × 15 مم طبق بيتري.
  2. تجانس عينه فقاري صغيره (الجدول 2 والجدول 3)
    1. نقل القشرة ، المخيخ ، جذع الدماغ ، الفص البصري ، والحبل الشوكي إلى ~ 1 مل من الحل MV-1 في الفرد 10 مل بوتر-Elvehjem طاحونة الانسجه الزجاجية مع مدقه PTFE باستخدام ماصه النقل. أضافه 5 مل من الحل MV-1 وتجانس كل الانسجه (~ 10 السكتات الدماغية). نقل إلى الفردية 15 مل أنابيب مخروطيه. إبقاء الأنابيب علي الجليد.
      ملاحظه: بالنسبة لفقاري الصغيرة ، 5 أو 4 ، مع أو بدون الفص البصري ، علي التوالي ، وهناك حاجه إلى 10 مل المطاحن بوتر-Elvehjem و 15 مل أنابيب مخروطيه.
    2. نقل في المهاد والغدة النخامية مع ملقط ل ~ 100 μL من الحل MV-1 في أنبوب الفردية 1.7 mL والمجانسة بعناية مع ميكروبيستلي الزجاج. شطف كل ميكروبيستلي مع ~ 1 مل من الحل MV-1. ابقي الأنبوب علي الثلج
      ملاحظه: بالنسبة لفقاري الصغيرة ، هناك حاجه إلى 2 الزجاج microمدقه وأنابيب 1.7 mL.
  3. تجانس عينه فقاري كبيره (الجدول 4 والجدول 5)
    1. باستخدام ماصه نقل ، نقل الانسجه المفرومة إلى طاحونة الانسجه الزجاجية بوتر-Elvehjem 55 مل مع مدقه PTFE ونعلق علي الركاب العلوية. يضاف نصف الحجم الموصي به لمحلول MV-1 ، وفقا للجزء الخاص بالوحدة العصبية الخاصة الذي يجري تجانسه (الجدول 5).
    2. بدوره علي الركاب العلوية في سرعه منخفضه جدا (~ 150 دوره في الدقيقة) ونقل بعناية أنبوب الزجاج صعودا وهبوطا لحوالي 30 ق.
    3. إيقاف الحمولة الزائدة ، أضافه المزيد من الحل MV-1 ، وكرر الخطوة 4.3.2 حتى الحصول علي الطين متجانسة.
    4. نقل إلى أنبوب مخروطي 50 mL. ابقي الأنبوب علي الثلج
    5. اغسل الطاحونة بالماء منزوع الأيونات بين تجانس الانسجه العصبية.
      ملاحظه: بالنسبة لفقاري كبيره 5 أو 4 ، مع أو بدون ماده بيضاء ، علي التوالي ، وهناك حاجه إلى أنابيب مخروطيه 50 mL. المثل ، هناك حاجه إلى اثنين (2) 15 مل أنابيب مخروطيه لمهاد والغدة النخامية.

5. تنقيه الاوعيه المجهرية

  1. الخالطون الانسجه الطاردة المركزية الناتجة عن الخطوة 4-2-1 ، 4.2.2 ، أو 4.3.4 في 2,000 x g لمده 10 دقيقه في 4 درجه مئوية. ستتشكل واجهه بيضاء كبيره من الميالين علي قمة كريات الاوعيه المجهرية المحمرة. تخلص من النمل الخارق.
    1. عينه فقاري صغيره (الجدول 2 والجدول 3)
      1. أعاده تعليق القشرة, المخيخ, جذع الدماغ, الفص البصري, والكريات الحبل الشوكي في 5 مل من محلول الجليد الباردة MV-2 مع ماصه 5 مل المصلية (~ 10 الهبات). أضافه 5 مل من الجليد الباردة MV-2 حل لكل تعليق ومزيج بعناية عن طريق التقليب الأنابيب.
      2. أعاده التعليق الكريات في المهاد والغدة النخامية مع 1 مل من الحل MV-2.
    2. عينه فقاري كبيره (الجدول 4 والجدول 5)
      1. أضافه 20 مل من الجليد الباردة MV-2 الحل إلى القشرة ، المخيخ ، جذع الدماغ ، والكريات الحبل الشوكي الاوعيه الدقيقة. أعاده التعليق الكريات عن طريق خلط علي أنبوب المسدس شاكر ، مع التحريك في 40 لفه في الدقيقة ل ~ 5 دقيقه. موازنة احجام الأنابيب المخروطية من القشرة ، المخيخ ، جذع الدماغ ، وتعليقات الحبل الشوكي عن طريق أضافه المزيد من محلول MV-2.
      2. أعاده تعليق الكريات في المهاد والغدة النخامية المجهرية في 5 مل من الحل MV-2 مع ماصه المصلية 5 مل (~ 10 الهبات). أضافه 5 مل من الجليد الباردة MV-2 حل لتعليق وخلط بعناية عن طريق التقليب الأنبوب.
  2. جهاز الطرد المركزي في 4,400 x g لمده 15 دقيقه في 4 °c.
  3. افصل طبقه المايلين السميكة والكثيفة بعناية علي الواجهة السائلة من جدران كل أنبوب بتدوير الأنابيب ببطء والسماح لل ماده طافي بالمرور علي طول الجدران.
  4. تجاهل الميالين وواجهه السائل ولطخه الجدار الداخلي لكل أنبوب مع ملعقة ملفوفه مع مسح ورقه منخفضه الوبر. بالنسبة للعينات فقاري الصغيرة ، قم بازاله طبقه الميلين من كل المهاد وأنبوب الغدة النخامية عن طريق الشفط بعناية مع ماصه النقل.
  5. امسحي السائل الزائد بمسحه ورقيه منخفضه الوبر. أعاده تعليق كل بيليه مع 1 مل من الحل MV-3 باستخدام نصائح ملزمه منخفضه. إبقاء الأنابيب علي الجليد.

6. المرجل المجهري والترشيح

  1. صب الجليد الباردة MV-3 الحل في الأكواب الفردية لكل منطقه CNS. يحفظ في 4 درجه مئوية.
    1. لفقاري الصغيرة العينات ، استخدم 10 مل من الحل MV-3 لكل كوب 50 mL. ومن الضروري ما مجموعه 6 – 7 أكواب اعتمادا علي ما إذا كان الفص البصري مشمولا ام لا.
    2. لفقاري العينات الكبيرة ، استخدم 30 مل من محلول MV-3 لكل كوب 100 مل. ما مجموعه 6 – 7 أكواب ضرورية اعتمادا علي ما إذا كانت المادة البيضاء مشمولة ام لا.
  2. وضع مصفاه الخلية علي راس أنبوب مخروطي 50 mL. استخدم واحده لكل منطقه CNS. استخدام مصفاه 100 μm لقشره, جذع الدماغ, الفص البصري, الحبل الشوكي, والغدة النخامية. استخدام مصفاه الخلية 70 μm لمخيخ والمهاد.
  3. الرطب كل مصفاه مع 1 مل من الجليد الباردة MV-3 الحل.
  4. أضافه المزيد من الحل MV-3 للتعليقات التي أعدت في الخطوة 5.5 مع ماصه المصلية في حين خلط لتجنب المجاميع. بعناية تحميل الاوعيه الدقيقة علي راس المصفاة. شطف مع الجليد الباردة MV-3 الحل.
    1. بالنسبة للعينات فقاري الصغيرة (الجدول 2 والجدول 3) ، أضف 10 – 15 مل من محلول mv-3 مع ماصه مصليه واشطف مع 5 مل من محلول mv-3.
    2. بالنسبة للعينات فقاري الكبيرة ، أضف 20 مل من محلول MV-3 مع ماصه مصليه واشطف مع 10 مل من محلول MV-3.
  5. تجميع وحده الترشيح عن طريق وضع فلتر صافي 20 μm النايلون علي حامل مرشح تعديل (الشكل 2د) ، واحد لكل منطقه الجهاز العصبي الخاص.
    1. بالنسبة للعينات الفقارية الصغيرة (الجدول 2 والجدول 3) ، استخدم حامل الفلتر المعدل 25 مم للقشرة والمخيخ وجذع الدماغ والفص البصري والحبل الشوكي. استخدام 13 ملم مرشحين تعديل لفي المهاد والغدة النخامية.
    2. بالنسبة للعينات الفقارية الكبيرة (الجدول 4 والجدول 5) ، استخدم أصحاب مرشحات 47 mm المعدلة للقشرة ، المخيخ ، جذع الدماغ ، والحبل الشوكي. استخدام 25 ملم لمهاد والغدة النخامية.
  6. تصفيه مكان علي راس أنبوب مخروطي 50 mL وفلتر الرطب مع 5 مل من الجليد الباردة MV-3 الحل مما يجعل العازلة بالتاكيد يصب أسفل حامل مرشح إلى أنبوب مخروطي.
  7. نقل الاوعيه الدقيقة التي لا يمكن التملص منها (من الخطوة 6.4) علي اعلي فلتر صافي النايلون 20 μm وشطف الاوعيه الدقيقة مع 5-10 مل من محلول الثلج البارد MV-3.
  8. استعاده فلتر باستخدام ملقط نظيفه وتزج به في الكاس التي تحتوي علي الجليد الباردة MV-3 الحل أعدت في الخطوة 6.1.
  9. افصل الاوعيه الدقيقة من الفلتر عن طريق هزها برفق لحوالي 30 ثانيه. لفقاري الصغيرة العينات ، صب المحتوي الكاس في أنبوب مخروطي 15 مل. لفقاري الكبيرة العينات ، صب المحتوي الكاس في أنبوب مخروطي 50 mL.
  10. جهاز الطرد المركزي في 2,000 x g لمده 5 دقائق عند 4 °c وأعاده تعليق بيليه في 1 مل من محلول الجليد الباردة MV-3 باستخدام غيض ماصه منخفضه التصاق.
    1. لفقاري الصغيرة العينات ، نقل تعليق (من الخطوة 6.10) إلى 1.7 mL أنبوب الطرد المركزي والطرد المركزي في 20,000 x g لمده 5 دقائق في 4 ° c.
      ملاحظه: يتم تنفيذ هذه الدورة علي أجهزه الطرد المركزي بالأعلى بسرعة قصوى (~ 20,000 × g) لضمان العائد القوي.
    2. لفقاري العينات الكبيرة ، نقل التعليق من الخطوة 6.10 إلى 5.0 mL أنبوب الطرد المركزي ، أضافه 4 مل من الحل MV-3 ، وأجهزه الطرد المركزي في 2,000 x g لمده 5 دقائق في 4 ° c.

7-التحصين المناعي

ملاحظه: تم اجراء تلطيخ الهييوكسيلين و ايوسين (H & E) علي الزواحف ، البرمائيات ، وعينات الأسماك كدليل علي مفهوم جدوى البروتوكول. ولذلك ، لا توجد توصيه للمناعة لهذه العينات.

  1. أزاله ماده طافي من أنابيب الطرد المركزي الصغير.
  2. أعاده تعليق بيليه في 1x العقيمة تلفزيوني باستخدام غيض ماصه منخفضه ملزمه (جدول المواد). الحفاظ علي الاوعيه المجهرية من تشكيل المجاميع عن طريق الأنابيب عده مرات. لفقاري الصغيرة العينات (الجدول 3) ، استخدم ~ 100 μl-2000 μl وفقا لحجم بيليه. لفقاري الكبيرة العينات (الجدول 5) ، استخدم ~ 1,000 μl-4000 μl وفقا لحجم بيليه.
  3. باستخدام طرف ماصه منخفضه التصاق ، قم بنقل الاوعيه الدقيقة إلى شرائح جيدا ، وتوخي الحذر لأضافها إلى وسط كل بئر ، وتجنب الجوانب الجانبية.
  4. تعيين الشرائح جيدا ، وكشفت ، داخل BSC-2 ، واسمحوا الجافة لمده 20 إلى 30 دقيقه في RT.
    ملاحظه: يتم استخدام حجم كبير نسبيا من 1x تلفزيوني لتجنب تشكيل التجميعية. وبسبب هذا ، فمن الضروري السماح للشرائح الجافة قبل التثبيت للتاكد من ان يتم عقد الاوعيه الدقيقة بواسطة طلاء بولي دي يسين.
  5. أزاله المتبقية 1x تلفزيوني عن طريق السحب خارج مع ماصه نقل ، أضافه 200 μL من 4 ٪ بارافورمالدهيد (PFA) واحتضان لمده 30 دقيقه في RT.
  6. ماصه للحل المثبت وغسل 3x مع 200 μL من 1x تلفزيوني لمده 5 دقائق في RT.
    ملاحظه: H & E تلطيخ علي الأسماك ، البرمائيات ، والزواحف المجهرية CNS تم تنفيذها في هذه المرحلة.
  7. أضافه 200 μL من حظر المخزن المؤقت إلى الشريحة جيدا واحتضان لمده 60 دقيقه في 37 درجه مئوية.
  8. أزاله العازلة حظر مع ماصه نقل وأضافه 200 μl من كوكتيل الأجسام المضادة الاساسيه في مخفف الأجسام المضادة (جدول المواد). احتضان في 4 °C بين عشيه وضحيها.
  9. ماصه من كوكتيل الأجسام المضادة الاساسيه وغسل 3x مع 200 μL من 1x تلفزيوني لمده 5 دقائق في RT.
  10. تحميل كوكتيل الأجسام المضادة الثانوية (جدول المواد) المخفف في 1X تلفزيوني واحتضان لمده 2 ح في RT ، محمية من الضوء.
  11. ماصه من كوكتيل الأجسام المضادة الثانوية وغسل 3x مع 200 μL من 1x تلفزيوني لمده 5 دقائق في RT ، محمية من الضوء. بعد غسل الماضي فصل الإطار جيدا الشريحة ولطخه الجافة اي الزائدة 1x تلفزيوني مع مسح ورقه منخفضه الوبر.
  12. أضافه كوفيرسليب ، السائل اللورن المتوسطة ، و 4 ′ ، 6-diamidino-2-فينيلانديول (dapi) لتلطيخ النووية. اسمحوا الجافة بين عشيه وضحيها في RT المحمية من الضوء.
  13. مره واحده الجافة ، والحفاظ علي حماية من الضوء علي مربع الشريحة في 4 درجه مئوية حتى تصبح جاهزه للمجهر البؤري والحصول علي البيانات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وأظهرت الاوعيه المجهرية المعزولة من murine CNS جميع المكونات الخلوية الجوهرية للوحدة العصبية2,3. باستخدام اما الصفائح الدموية الغشائية التصاق جزيء-1 (PECAM ، المعروف أيضا باسم CD31) أو ايسولكتين IB4 (بروتين سكري الذي يربط غليكوكاليكس الخلية البطانية) للخلايا البطانية ، عامل النمو المستمدة من الصفائح الدموية-β (PDGFRβ) أو الخلايا العصبية-غليال مستضد 2 (NG2) ل perسيلات و اكوابورين-4 (AQP4) للحصول علي نهاية القدم الفلكية (الشكل 3ا ، ب) يوضح ان هذه المكونات الجوهرية موجودة في الاوعيه الدقيقة المعزولة. وتشمل مناطق النفثالينات المرئية الاوعيه المجهرية القشرية (الشكل 3ب) ، والمخيخ (الشكل 3ج) ، والغدة النخامية(الشكل 3د) ، والمهاد (الشكل 3ه) ، وجذع الدماغ (الشكل 3و) ، والحبل الشوكي (الشكل 3ز). وأظهرت جميع التعبير عن هذه العلامات الكنسية.

المثل ، أظهرت الاوعيه الدقيقة التعبير عن تمسك البروتين تقاطع VE-الملتصقون (الشكل 4ا ، ج) ، البروتينات تقاطع ضيقه العرج-5 و zonula أوككلودينس (CLDN5 و ZO-1 ، الشكل 4ا ، د) ، بروتين تقاطع ثلاثي الخلايا انجولين-1 (الشكل 4ا ، ه) وعلامات أبيكوباسال النقش c-X-c عزر chemokine يجند 12 وغاما-غلوتاميلترانستاز 1 (CXCL12 و GGT1 ، الشكل 4ا ، و). هذه النتائج ذات الصلة لان هذه البروتينات هي مؤشرات للخصائص المحورية الخاصة BBB-9,12,13,14. وجود محدود من الأسطرلاب ، oligodendrocytes ، والخلايا العصبية التي تعبر عن البروتين الحمضي الليفي الليليليه (GFAP ، الشكل 4ب ، ج ، ز) ، oligodendrocytes البروتين محدده (OSP ، الشكل 4ب ، ز) ، والعصبية المتوسطة (Nfm ، الشكل 4b ، H) ، علي التوالي ، يدل علي ان الاوعيه وعلاوة علي ذلك ، كانت غالبيه الاوعيه الدقيقة خاليه من التعبير عن الاكتين العضلات α السلس (αsma ، الشكل 5ب ، ج). هذا هو ذات الصلة لان αSMA هو علامة لخلايا العضلات الملساء المرتبطة بالشرايين والحويصلات (الشكل 5ا) ، مشيراإلى ان هذا البروتوكول العزل يستهدف انتقائية صغيره عيار15.

وتشترك الاوعيه المجهرية التي يتم الحصول عليها من الفقاريات الصغيرة الأخرى في بعض الخواص المورفولوجية ، كما يتبين من الأسماك (الضفدع والسحلية غير الظاهرة) والاوعيه المجهرية للطيور. وهذا يوحي بان هذه الطريقة مفيده لمزيد من توصيف الاختلافات في النهج الجديد بين الأنواع (الشكل 6). وعلاوة علي ذلك ، أظهرت الاوعيه المجهرية العصبية الطيور (الشكل 6H-N) التفاعل مع العديد من الأجسام المضادة التي وضعت للإنسان والفار. وهذا يشجع علي مواصله التحقيق في عينات الطيور للدراسات البيولوجية والطبية الحيوية. لاحظنا نتائج مماثله عندما قمنا بعزل الاوعيه الدقيقة من الخنازير و macaques ، اثنين من الأنواع الجيروسكوب (الشكل 7). يتم عرض فقط علامات NVU المتعارف عليها في الاوعيه المجهرية الخنازير. بالاضافه إلى مناطق CNS المذكورة أعلاه ، تمكنا من عزل الاوعيه الدقيقة من المادة البيضاء البطينية (الشكل 7ب). هذا أمر مهم لان المادة البيضاء متورطة في ظروف التهابات العصبية (علي سبيل المثال ، التصلب المتعدد16،17،18).

أردنا معرفه ما إذا كان يمكن استخدام هذه الطريقة كاداه موثوقه لتحديد التغيرات في تعبير البروتين. مع العلم ان vcam-1 والمربي-B وقد تورطت في عمليه التهاب العصبي في الحبل الشوكي خلال eae ، قررنا ان كميه التعبير عن هذه البروتينات في المراحل الذروة والمزمنة من eae والفئران السيطرة الشام (10 أسبوع C57BL/6j الفئران)9،10،11. وللقيام بذلك ، قمنا بقياس وحده الكثافة العشوائية (AUI) علي طول قطر الاوعيه المجهرية. ثم ، وذلك باستخدام عتبه ≤ 20 AUI ل DAPI ، ونحن حساب المنطقة تحت المنحني (اوك) لل VE-cملتصقين ، VCAM-1 ، و جام-B ل 50 الاوعيه الدقيقة لكل منطقه CNS (الشكل 8ا ، ب). وأخيرا ، قمنا باجراء ANOVA ثنائي الاتجاه متبوعا باختبار Sidak المخصص لتحديد الاهميه الاحصائيه للتغيرات في تعبير البروتين.

وكما كان متوقعا ، لاحظنا زيادة في VCAM-1 والمربي-B علي طول الاوعيه الدقيقة الحبل الشوكي خلال ذروه EAE (الشكل 8د ، ه). ومع ذلك ، لاحظنا التغييرات في مناطق CNS الأخرى التي لم يتم الإبلاغ عنها سابقا ل EAE. VCAM-1 زيادة كبيره في الاوعيه الدقيقة النخامية وانخفضت في المهاد والاوعيه الدقيقة الجذعية الدماغية. وكانت هناك تغيرات اثناء المرض المزمن في جميع الانسجه العصبية (الشكل 8د). زادت جام-ب بشكل كبير في الاوعيه الدموية والغدة النخامية المجهرية خلال EAE المزمن (الشكل 8ه). ومن المثير للاهتمام, لاحظنا التغييرات في VE-الملتصقون علي طول الاوعيه الدقيقة المعزولة من المهاد وجذع الدماغ خلال ذروه eae, المخيخ خلال eae المزمن (الشكل 8ج), وانخفاض في عرض الغدة النخامية المجهرية خلال الذروة والمزمن eae. وعموما ، تشير هذه البيانات إلى ان هذه الطريقة لعزل الاوعيه الدقيقة هي أداه مفيده لتوصيف التغيرات في الأنماط الاقليميه للتعبير عن البروتين اثناء الصحة والمرض.

Figure 1
الشكل 1: تشريح النخاع الشوكي بكفاءة دون استئصال الصفيحة. يتم اجراء تشريح الحبل الشوكي من العينات فقاري الصغيرة (تصل إلى 100 غرام) أسرع وأكثر كفاءه عن طريق تنظيف الحبل في الذيليه إلى اتجاه منقاري في جميع انحاء العمود الفقري. باستخدام مقص تشريح يتم أزاله الراس بواسطة مفصل الأطلس ويتم قطع العمود الفقري من قبل الورك (A). تتم أزاله جميع الأعضاء الأذان ، وترك فقط العمود الفقري (ب). يظهر الحبل الشوكي داخل العمود الفقري القطني كدائره بيضاء صغيره جدا (قطرها < 1 مم) مقارنه بعرض الحبل العنقي (B، الأسهم الصفراء). الحفاظ علي فتحه ضيقه في القطنية الفقرية العمود الفقري يسهل التدرج الضغط من أسفل الظهر إلى عنق الرحم عند بيغ مع ابره 18 ز و 10 حقنه cc محمله 1X تلفزيوني (C و D). مره واحده مسح, الحبل الشوكي (D, السهم الأصفر) يكاد يكون تماما ديفويديد من الكيس الوضعي, وفقط بيا يحتاج إلى ازالتها تحت نطاق تشريح. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: مزدوجة الشق اختيار أداه تشريح وتعديل حامل مرشح. تحتوي هذه الاداه التي تبلغطولها11 سم (A) علي نقطتين حادتين جدا ، ومتعارضتين أفقيا تقريبا ، وطرفين (B) بحجم 2 مم. من خلال تطبيق الضغط الهبوطي لطيف والتواء قليلا في اتجاه عقارب التوقيت (C) ، والنقاط تضمين أنفسهم أفقيا في السحايا بحيث يمكن رفعها إلى اعلي. وهذا مفيد بشكل خاص عند أزاله السحايا من المخيخ ، لأنه يسمح بالوصول إلى عمق المخيخ. كما انها مفيده جدا عند أزاله السحايا من الانسجه القشرية ، وخاصه الجيروسكوبات. في هذه الحالة ، يتم تضمين بيا للغاية مع الاوعيه الدموية ذات العيار العالي التي من شانها ان تضر نقاء العزلة ميكروسيفاسيل. المثل ، فانه يسهل أزاله الضفيرة المشيميه ، وهو المصدر الأرجح للتلوث. وكان أصحاب مرشح من 47 مم ، 25 ملم ، و 13 ملم قطرها قطع الليزر لأزاله مدخل موصل (D) من المقصورة العليا (E) ، ولكن الحفاظ علي المكون غربال (G). سمح هذا التعديل لتجميع وحده الفلتر (I,J) عن طريق وضع صافي فلتر النايلون 20 μm علي غربال والجزء السفلي (ز,ح), تامين الشبكة في مكان عند الشد الجزء العلوي (ه). يتم عرض حامل الفلتر بحجم 25 مم فقط. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الاوعيه المجهرية المعزولة من مناطق CNS متعددة عبرت عن علامات وحده الاوعيه العصبية الكنسية. (ا) باستخدام المجهر المناعي والمجهري البؤري ، تستخدم المكونات الخلوية الجوهرية لل nvu للتعرف علي البالغين (8-14 أسبوعا من العمر C57BL/6j) الاوعيه الدقيقة للجهاز العصبي المركزي. كما راينا في صوره دمج الاوعيه المجهرية القشرية (ب) ، فوق الصور الفردية المحورية لعلامة الخلية البطانية CD31 (ابيض) ، علامة perسيلات pdgfrβ (الأحمر) ، و والنجميه نهاية القدمين علامة AQP4 (الأخضر) يتم الاحتفاظ بجميع هذه المكونات الخلوية. لاحظ ان العلاقة الحميمة بين الخلايا البطانية والعجان تجعلها تظهر أرجوانيه علي الصورة المدمجة ، في حين ان القدمين النهائيتين الفلكيتين تظهر هاله محيطه بهما (B). لوحظ نفس نمط التعبير عن المخيخ (ج) ، الغدة النخامية (D) ، المهاد (E) ، جذع الدماغ (F) ، والحبل الشوكي (G، dapi ، وصمه عار النووية = الأزرق ؛ شريط مقياس = 10 μm). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: الاوعيه الدقيقة عبرت عن البروتينات المرتبطة بخصائص BBB الخاصة. كما توصف الخلايا البطانية داخل وحده الاوعيه الدموية (NVU) من قبل البروتينات المرتبطة بها خصائص الحاجز المتاصل (A). كما راينا في الشكل ، والخلايا البطانية لديها تقاطعات مصنوعة من VE-cملتصقون ، CLDN5 ، زو-1 (a، الأصفر) ، و angulin-1 (a، الأخضر المزرق). كما انها تظهر القطبية أبيكوباسال للبروتينات متعددة بما في ذلك GGT-1 و CXCL12 (A، الأخضر والأحمر). قد يتم تضمين الخلايا العصبية ، oligodendrocytes ، والأجسام الخلوية الفلكية في الاوعيه المجهرية المعزولة ، علي الرغم من انها ليست متاصله في NVU (B). هذه هي التي يمكن التعرف عليها عن طريق التعبير عن NFM (الأحمر) ، OSP (السماوي) ، و GFAP (الجير الأخضر) ، علي التوالي (ب). وتمشيا مع هذه ، وأعرب لدينا الاوعيه الدقيقة معزولة تمسك البروتين VE-الملتصقون (C، الأحمر) ، والبروتينات تقاطع ضيق CLDN5 و ZO-1 (D، الأحمر والأخضر ، علي التوالي ، ودمج = الأصفر) ،والخليةالبروتين تقاطع lsr (E، الأخضر) ، وعلامات أبيكوباسال CXCL12 و كما انهاأظهرتكميات محدوده من Gfap (A ، الأخضر ، ز، ابيض) ، OSP (ز، الأخضر) ، و nfm (H، الأحمر) ، مما يوحي الاحتفاظ لا تذكر من خلايا وحده الاوعيه الدموية غير العصبية (dapi ، وصمه عار النووية = الأزرق ؛ شريط مقياس = 10 μm). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: معظم الاوعيه المجهرية المعزولة لا تعبر عن αSMA. وتظهر وحده الاوعيه العصبية انتقالا متطورا من الشرايين-الشعرية-venule (a). αSMA التعبير الحلقي يحدد بوضوح الشرايين ، وكما يصبح الشعرية ، αSMA (ب، الأحمر) التعبير يقلل ، تعريض علامة جداريه NG2 (b، الأخضر). نقيس قطر αSMA + و αSMA-السفن (الأقواس البيضاء ، ن = 20) ، لتمييزها كما الشرايين أو الشعيرات الدموية (DAPI ، وصمه عار النووية = الأزرق ، شريط مقياس = 10 μm). اظهر تحليل t-اختبار القطر من αSMA + و αSMA-السفن دلاله احصائيه عاليه (C، αsma + = الأحمر ، αsma-احمر/اخضر ، * * * * p < 0.0001). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: العزل الناجح للاوعيه المجهرية للنفثالينات الدقيقة من الأنواع الأخرى من الكائنات الدقيقة. تم حصاد المركز العصبي العام من ضفدع البرية اشتعلت (8.2 سم) ، سحلية (12.7 سم) ، سمك السلمون المرقط التي أثيرت في خزان (2 سنه ، 35.6 سم) ، والقفص الطائر التي أثيرت (9 أشهر من العمر ، ~ 300 g). تم تلطيخ الاوعيه الدقيقة من الضفدع والأسماك والسحلية بواسطة H & E (يتم عرض الاوعيه المجهرية فقط من سمك السلمون المرقط ، شريط المقياس = 20 μm). وكانت الاوعيه الدقيقة حمامه المناعية. تمكنا من تحديد الاوعيهالدقيقة في جميع المناطق كما هو مسمي علي الأسماك والخطوط العريضة للحمام CNS: القشرة (A و H) ، الفص البصري (B و I) ، المخيخ (C و J) ، الغدة النخامية (D و L) ، والمهاد ( E و K ) ،جذع الدماغ بالاضافه إلى ذلك ، تمكنا من تحديد الخلايا البطانية مع ايسولكتين IB4 (الأبيض) ، والقدمين النهاية والنجميه مع AQP4 (الأخضر) ، والخلايا العصبية المجاورة مع nfm (احمر) من الاوعيه الدقيقة المعزولة حمامه (dapi ، وصمه عار النووية = الأزرق ، شريط مقياس = 10 μm). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: عزل الاوعيه المجهرية الخاصة بالنفثالينات عن الأنواع التي تحمل الجيروسكوبات. تم تشريح الدماغ والحبل الشوكي من خنزير المزرعة التي أثيرت (~ 6 أشهر من العمر ، ~ 120 كلغ) للعزل الاوعيه الدقيقة والمناعية. كنا قادرين علي تحديد الاوعيه الدقيقة المسمية إيجابيا ل IB4 (ابيض) ، PDGFRβ (الأحمر) ، و AQP4 (الأخضر) علي جميع مناطق الخنازير النفثالينات: القشرة (A) ، المادة البيضاء البطينية (B) ، المخيخ (C) ، الغدة النخامية (D) ، المهاد (E) ، جذع الدماغ (F) ، والحبل الشوكي (G، dapi ، وصمه عار النووية يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: مثال علي التطبيق الآخر لعزل الاوعيه الدقيقة للجهاز العصبي الجزئي. وتم تحديد كميه التعبير عن الضربتين الاولي والثانية بالنسبة للسفن الصغيرة التي من طراز EAE. وحدات الكثافة التعسفية (AUI) تم قياسها لقشره ، المخيخ ، تحت المهاد ، الغدة النخامية ، جذع الدماغ ، والحبل الشوكي من الفئران في المراحل الذروة والمزمنة من EAE ، مع الشام كعنصر تحكم (ن = 4). النسبة لكل منطقه من المناطق التابعة للجهاز العصبي الجزئي ، تم تقييم اثنتي عشره سفينة مجهريه لكل فاره لتحديد AUI لكل الفلوروكروم وقطر الوعاء المجهري (ا). الأقواس البيضاء تظهر أمثله من المجهر المركزي أداه قياس البرمجيات المستخدمة لتحديد AUI ل VCAM-1 (الأبيض) ، VE-cملتصقون (الأخضر) ، جام-B (الأحمر) ، و DAPI (الأزرق ، شريط مقياس = 10 μm). ثم ، تم رسم AUI الناتجة ضد القطر في ميكرون (ب) لحساب المنطقة تحت المنحني (اوك) لكل بروتين مناعي كتقدير للتعبير عن البروتين. ثم حللت الجماعة المتوسطة لكل مجموعه بواسطة ANOVA ثنائيه الاتجاه ، تليها اختبار Sidak المخصص لما مجموعه 48 من الاوعيه الدقيقة لكل منطقه من مناطق الجهاز العصبي الجزئي. باستثناء الاوعيه المجهرية النخامية ، لاحظنا عدم وجود اختلافات كبيره بين قطر الاوعيه الدقيقة المرتبطة بحاله المرض (C، ادراج) ، ولكن انخفاضا كبيرا من التعبير VE-cملتصقون من المهاد وجذع الدماغ في الفئران eae (C). واظهر تحليل إحصائي مماثل زيادة كبيره في VCAM-1 (D) والمربي-B (E) في الحبل الشوكي ، بما يتسق مع حاله التهاب العصبي خلال ذروه eae. ومن المثير للاهتمام, لاحظنا أيضا التغييرات ل VCAM-1 في تحت المهاد, الغدة النخامية, وجذع الدماغ. هذه النتائج هي قيد التحقيق (القضبان السوداء والنقاط = الشام ، القضبان الحمراء والنقاط = الذروة EAE ، القضبان السلمون والنقاط = EAE المزمن ، * p < 0.05 ، @p < 0.01 ، #p < 0.001 ، و & p < 0.0001). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

MV-1 10 مم HEPES
في 1x محلول الملح هانك المتوازن (HBSS) مع الكالسيوم والمغنيسيوم
MV-2 18% 70 الوزن الجزيئي (MW) ديكسكان
في 10 ملم HEPES/HBSS (MV-1)
MV-2 20% 70 كده ميغاواط
في 10 ملم HEPES/HBSS (MV-1)
MV-3 1 ٪ الزلال المصل البقري (بوسنيا)
في 10 ملم HEPES/HBSS (MV-1)
مثبت 4% بارافورمالدهيد (PFA)
في 1x الفوسفات-مخزنه المالحة (تلفزيوني) pH 7.4
غسل العازلة 1x 7.4 الأس الهيدروجيني
ال& العازلة لمنع التسرب 10 في المائة
0.25 ٪ غير أيوني السطحي
في 1x تلفزيوني الأس الهيدروجيني 7.4
الأجسام المضادة مخفف 5 في المائة
0.25 ٪ غير أيوني السطحي
في 1x تلفزيوني الأس الهيدروجيني 7.4

الجدول 1: الحلول المستخدمة في البروتوكول.

الخطوات العمل
4.1 و 4-1-1 الفرم في محلول MV-1 مع شفره أحاديه الحافة
4.2 إلى 4.2.2 التجانس في الحل MV-1 باستخدام بوتر-ELVJ PTFE أو مدقه الأنبوب المجهري
5.1 تدور في 2,000 x g، 4 درجه مئوية ، 10 دقيقه
5.1.1 إلى 5.1.1.2 أعاده تعليق بيليه في محلول MV-2
5.2 تدور في 4,400 x g، 4 درجه مئوية ، 15 دقيقه
5.3 إلى 5.5 أعاده التعليق بيليه مع 1 مل من الحل MV-3
6.2 ل6.4.1 Elute علي أنبوب مخروطي 50 mL من خلال مصفاه الخلية وشطف مع الحل MV-3
6.5 ، 6.5.1 ، 6.6 ، 6.7 فلتر بشبكه نايلون 20 μm علي حامل الفلتر المعدل
6.8 تحميل صافي النايلون في الكاس 50 مل مع 10 مل من الحل MV-3 ويهز لمده 30 ثانيه
6.9 إلى 6.10 Decant في أنبوب مخروطي 15 مل وتدور في 2,000 x g، 4 درجه مئوية ، 5 دقيقه
6.10 أعاده التعليق في 1 مل من محلول MV-3
6.10.1 نقل إلى ميكروتيوب 1.7 mL وتدور في 20,000 x g, 4 °c, 5 min
7.1 إلى 7.3 أعاده التعليق في 1x تلفزيوني والتحميل في الشرائح جيدا

الجدول 2: تخطيط لفقاري الصغيرة الاوعيه الدقيقة العزلة. هذا الرسم البياني هو نسخه مختصره من البروتوكول عند استخدام عينه من النظام.

الخطوات حل العمل CTX المخابرات تختار Eet Sc HYP حفره
4.1 MV-1 اللحم المفروم علي الطبق 100 مم × 20 مم طبق بيتري ، 1 مل n/a
4-2-1 و 4.2.2 MV-1 تجانس 5 مل ، 10 مل بوتر-الفيهجم مع مدقه 1 مل ، ميكروبيستلي
5.1.1.1 5.1.1.2 MV-2 أعاده التعليق 5 مل + 5 مل, 18% ديديكسان 1 مل ، 20 ٪ ديكسديكان
5.5 وال6.4.1 MV-3 أعاده التعليق 1 مل + 10-15 مل 1 مل
6.2 وال6.4.1 MV-3 حجم مصفاه 100 ميكرومتر 70 ميكرومتر 100 ميكرومتر 70 ميكرومتر 100 ميكرومتر
شطف 5 مل
6.5 ، 6.5.1 و 6.7 MV-3 حجم الفلتر ، شطف 25 ملم فلتر ، 10 مل 13 ملم ، 5 مل
6.8 MV-3 هزه علي الكاس 10 مل
6.10 MV-3 أعاده التعليق 1 مل
7.2 1x تلفزيوني أعاده التعليق 1.5 إلى 2.0 مل 0.5 إلى 1.0 مل 0.1 إلى 0.2 مل
7.3 1x تلفزيوني الحمولة لكل بئر 200 μL 100 μL 25 إلى 50 μL
CTX = القشرة ، كاليفورنيا = المخيخ ، BST = جذع الدماغ ، الأرض المحتلة = الفص البصري (غير موجود في الثدييات) ، HYP = المهاد ، حفره = الغدة النخامية ، SC = الحبل الشوكي. وحدات التخزين الموصي بها هي للانسجه الكاملة من الكائنات تتراوح في الحجم من 20 غرام (الماوس الشباب) إلى 800 غرام (الفئران الكبار).

الجدول 3: حجم/حجم الموصي بها. هذا المخطط يحتوي علي حجم الموصي بها من الحلول لاستخدام عينه صغيره فقاري تتراوح بين ~ 20-~ 800 ز ، أو أكثر تحديدا ، ~ 25 ز الماوس هو مبين علي الفيديو. يجب تحديد التعديل النهائي للمجلدات اللازمة من قبل الباحث وفقا لكميه محدده من الانسجه الرطبة التي تم الحصول عليها بعد تشريح. ينصح بشده الممارسة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها. CTX = القشرة ، كاليفورنيا = المخيخ ، BST = جذع الدماغ ، الأرض المحتلة = الفص البصري (غير موجود في الثدييات) ، HYP = المهاد ، حفره = الغدة النخامية ، SC = الحبل الشوكي.

الخطوات العمل
4.1 و 4-1-2 اللحم المفروم في MV-1 مع شفره أحاديه الحافة
4.3 ل4.3.4 التجانس في الحل MV-1 باستخدام طاحونة بوتر-Elvehjem مع مدقه PTFE
5.1 تدور في 2,000 x g، 4 درجه مئوية ، 10 دقيقه
5-1-2 إلى 5.1.2.2 أعاده تعليق بيليه في محلول MV-2
5.2 تدور في 4,400 x g، 4 درجه مئوية ، 15 دقيقه
5.3 إلى 5.5 أعاده التعليق بيليه مع 1 مل من الحل MV-3
6.2 إلى 6.4 و 6.4.2 Elute علي أنبوب مخروطي 50 mL من خلال مصفاه الخلية وشطف مع الحل MV-3
6.5 ، 6.5.2 ، 6.6 و 6.7 فلتر بشبكه نايلون 20 μm علي حامل الفلتر المعدل
6.8 تحميل صافي النايلون في كوب 50 مل مع 30 مل من الحل MV-3 ، ويهز لمده 30 ثانيه
ال6.9 ال6.10 Decant في أنبوب مخروطي 50 mL وتدور في 2,000 x g، 4 درجه مئوية ، 5 دقيقه
6.10 أعاده التعليق في 1 مل من محلول MV-3
6.10.2 نقل إلى ميكروتيوب 5 مل وتدور في 2,000 x g, 4 °c, 5 min
7.1 إلى 7.3 أعاده التعليق في 1x تلفزيوني والتحميل في الشرائح جيدا

الجدول 4: تخطيط لفقاري الكبيرة الاوعيه المجهرية العزلة. هذا الرسم البياني هو نسخه مختصره من البروتوكول عند استخدام عينه الجيروسكوب.

الخطوات سوتيون العمل CTX المخابرات Wm Eet Sc HYP حفره
4.1 MV-1 اللحم المفروم علي الطبق 3 − 5 مل 1 مل
4.3 ل4.3.4 MV-1 تجانس 20 − 30 مل ، 55 مل بوتر-الفيهجم مع المدقه & العلوية الركاب 5 مل ، 10 مل بوتر-الفيهجم مع مدقه
5-1-2 إلى 5.1.2.2 MV-2 أعاده التعليق > 20 مل, 20% ديدكان 5 مل + 5 مل, 20% ديديكسان
5.5 ، 6.4 و 6.4.2 MV-3 أعاده التعليق 1 مل + 20 مل 1 مل + 10 مل
6.2 وال6.4.2 MV-3 حجم مصفاه 100 ميكرومتر 70 ميكرومتر 100 ميكرومتر 70 ميكرومتر 100 ميكرومتر
شطف 10 مل
6.5 ، 6.5.2 و 6.7 MV-3 حجم الفلتر ، شطف 47 ملم فلتر ، 10 مل 25 ملم ، 10 مل
6.8 MV-3 هزه علي الكاس 30 مل
6.10 وال6.10.2 MV-3 أعاده التعليق 1 مل + 4 مل
7.2 1x تلفزيوني أعاده التعليق 2.0 إلى 4.0 مل 1.0 إلى 2.0 مل
7.3 1x تلفزيوني الحمولة لكل بئر 200 μL 100 μL
CTX = القشرة ، كاليفورنيا = المخيخ ، WM = المادة البيضاء ، BST = جذع الدماغ ، HYP = المهاد ، حفره = الغدة النخامية ، SC = الحبل الشوكي. وحدات التخزين الموصي بها هي لعينات من ~ 45 سم3 ل ctx ، والمخابرات العامة ، التوقيت الصيفي و SC كامل HYP و PIT.

الجدول 5: حجم/حجم الموصي بها. يحتوي هذا المخطط التفصيلي علي حجم الحلول الموصي بها لاستخدام نموذج فقاري كبير. وبشكل أكثر تحديدا ، فانه ينطبق علي الخزعات الانسجه CNS من ~ 45 سم3 للقشرة ، المخيخ ، المادة البيضاء ، جذع الدماغ ، الحبل الشوكي ، والمهاد كله والغدة النخامية ، كما هو مبين في الفيديو. يجب تحديد التعديل النهائي للمجلدات اللازمة من قبل الباحث وفقا لكميه محدده من الانسجه الرطبة التي تم الحصول عليها بعد تشريح. ينصح بشده الممارسة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها. CTX = القشرة ، كاليفورنيا = المخيخ ، WM = المادة البيضاء ، BST = جذع الدماغ ، HYP = المهاد ، حفره = الغدة النخامية ، SC = الحبل الشوكي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يتضمن BBB الخصائص الفريدة للخلايا الغشائية الوعائية المجهرية التي يقترن بها بنيه متطورة من ضيق-، ملتصقين-، "ربط المقبس"-تقاطعات ، والتصاق لويحات الحرجة ل CNS التوازن2،3،19. يتم الحث علي خصائص الخلايا البطانية والحفاظ عليها من قبل pericytes والعمليات المحيطة بالأرجل الفلكية المجاورة2،3،19. يعرض الاوعيه الدقيقة BBB القطبية (اي نمط التعبير غير متناظرة من البروتينات المترجمة علي السطوح الخلايا البطانية أو abluminal)20. في حين ان هذا قد يحدد بإيجاز BBB, في الواقع انها لا تزال واحده من المفاهيم الأكثر غموضا في علوم الأعصاب. علي سبيل المثال ، قد تفسر الاختلافات الاقليميه والجنسية والعمرية داخل nvu نقاط الضعف الاقليميه CNS للصدمات والسمية والعدوى والتهاب ، والتي يمكن ان يكون لها عواقب سريريه رئيسيه3،5،6. عقبه أخرى في فهم BBB هو الاختلافات التي لوحظت بين عده تاكا7,8. واحده من العقبات الرئيسية لفهم والتحقيق في BBB هو بالبالضبط الصعوبة المتعلقة بعزل NVU التي تشمل BBB ، في حين لا يزال الحفاظ علي خصائصه الخاصة الحاجز14.

في محاولة لتسريع فهمنا لل BBB ، الاختلافات الاقليميه CNS ، فضلا عن الاختلافات الأنواع ، ونحن تكييف أساليب نشرت سابقا. وقد نجحنا في تكييف هذه الاوعيه ، ولا سيما بولاي وآخرون21، للحصول علي السفن المجهرية من واحد القشرية ، المخيخ ، الطائي ، الغدة النخامية ، جذع الدماغ ، والانسجه الشوكية علي عدد لا يحصي من الفقاريات الصغيرة lissenكيفالونيا: الأسماك والبرمائيات والزواحفوالطيور و ميزه واحده من هذه الطريقة هي ان التعديلات التي تقوم علي أساس الحجم الكلي للانسجه العصبية: الباحث يختار كميه من الحل ، وحجم طاحونة الانسجه ، أنبوب مخروطي الشكل ، حاملي مرشح ، الخ وفقا للنسيج الرطب ، بغض الجنس عن الأنواع والنوع والعمر. في تجربتنا مع المناعة, a ~ 20 ز عينه تعطي ما يكفي من الاوعيه الدقيقة لشريحة 8 جيدا في القشرة, المخيخ, الفص البصري, جذع الدماغ, والحبل الشوكي ونصف الشريحة جيدا 8 في المهاد والغدة النخامية. ومع ذلك ، فان الغلة من الفص القشري والبصري هو اعلي بكثير بالمقارنة مع المخيخ ، جذع الدماغ ، والحبل الشوكي.

كما هو مبين ، قمنا باجراء التعديلات اللازمة للعزل والمناعة من الاوعيه المجهرية العصبية من الخنازير والماكاك ، والثدييات الكبيرة التي هي أكثر ملاءمة للبحوث الانتقالية (الشكل 7). ولا سيما ، تمكنا من تضمين المادة البيضاء البطين علي هذه الأنواع فقط. منذ الCNS في هذه الكائنات هو أكبر ، جمعنا ما يكفي من المواد البيضاء للسماح لنا لفصل بيليه الاوعيه الدقيقة من طبقه الميلين خلال الطرد الثانية (الخطوة 5.3 ، MV-2 مع 20 ٪ ديكستين). ونحن التكهن بان هناك حاجه إلى كتله حرجه لتكون قادره علي نحقق هذا الانفصال ، ونحن نسعى بنشاط كيفيه الحصول علي نتيجة مماثله مع الانسجه العصبية الCNS murine.

علي الرغم من حذفها من أجل البساطة ، فعلنا المناعية وراء علامات الكنسي NVU علي الطيور ، الخنازير ، والاوعيه المكاك. ومن الجدير بالذكر ان جميع الأنواع المشتركة علامات الخلوية والجزيئية التي تم تحديدها سابقا علي عينات murine ذات الصلة لوظيفة BBB (البروتينات المرتبطة VE-cملتصقون ، CLDN5 ، زو-1 ، و LSR وعلامات أبيكوباسال CXCL12 و GGT1) أو في القرب من NVU ومره أخرى ، تشجع هذه النتائج استخدام هذه الطريقة علي الأنواع الأخرى لزيادة تحديد التقويم والتباعد بين الأنواع. كما انه يفتح الفرصة لمزيد من التحقيق في سلاله NVU ، والجنس ، والاختلافات العمرية داخل نفس النوع وجدوى استخدام كائنات أخرى للبحوث الطبية الحيوية BBB. كما اننا نظهر دليلا علي الاستخدام الناجح لهذه الطريقة المعزولة للاوعيه المجهرية لتغيير كميات البروتين في مستويات التعبير البروتيني اثناء التهاب العصبي (الشكل 8). وعلي الرغم من اننا أجرينا هذه التجربة كدليل علي المفهوم ، فان النهج المستخدم هنا يجري استغلاله علي نطاق واسع في مختبرنا. نحن نفضل هذا النهج علي الطرق الكمية الأخرى (علي سبيل المثال ، لطخه الغربية) لأننا نريد ان نركز ليس فقط علي مستوي التعبير ولكن وفره البروتين النسبي ، ونقل CXCL12 وغيرها من البروتينات الأبيكوباساله ، والربط بين البروتينات المرتبطة ، وما إلى ذلك ، داخل المظهر المعقدللاوعيه المجهرية المثل ، ونحن حاليا استكشاف الأخطاء وإصلاحها طريقتنا للتطبيقات الأخرى ، مثل مزيد من العزلة من المكونات الخلوية nvu (الخلايا البطانية و pericytes) ، الحمض الريبي النيبالي-seq ، وبروبروتيميكس23،24،25،26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgments

تم دعم الدكتور كروز اورينجو من قبل جامعه كاليفورنيا ، ديفيس ، كليه الطب البيطري بدء الأموال.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X PBS ThermoFisher BP39920 Used for blocking and antibody diluent.
20% PFA Electron Microscopy Sciences 15713-S Used as fixative (4% PFA)
70,000 MW Dextran Millipore Sigma 9004-54-0 Used for MV-2 solution
Adson Forceps Fine Science Tools (FST) 11006-12 Used for removal of muscle and skin
Adson Forceps, student quality FST 91106-12 Same as above but cheaper
Bovine serum albumin (BSA) Millipore Sigma A7906-100G Used for MV-3 solution, blocking and antibody diluent
Corning 100 μm Cell strainer Millipore Sigma CLS431752-50EA
Corning 70 μm Cell strainer Millipore Sigma CLS431751-50EA
Corning Deskwork low-binding tips Millipore Sigma CLS4151 Same as below but cheaper.
Cultrex Poly-D-Lysine R&D 3439-100-01 Used for slide coating
Donkey anti-Goat IgG-ALEXA 555 Thermo A21432 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Donkey anti-Mouse IgG-ALEXA 488 Thermo A21202 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 488 Thermo A21206 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 647 Thermo A31573 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Donkey anti-Rat IgG-DyLight 650 Thermo SA5-10029 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Double-Pronged Tissue Pick FST 18067-11 Used for removal of meninges and choroid plexus
Dumont #3c Forceps FST 11231-20 Used for more delicate and/or small CNS tissue handling (like pituitary)
Dumont #7 Forceps FST 11274-20 Used for CNS tisssue dissection and handling
Dumont #7 Forceps, student FST 91197-00 Same as above but cheaper
ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Tips Eppendorf 22493008 Better quality than the tips above (more expensive).
Extra Fine Graefe Forceps, serrated FST 11151-10 Used for bone removal
Fine Scissors, sharp FST 14060-09 Used for removal of pig and macaque dural sac
Glass Pestle 1.5 mL Microcentrifuge Tube Tissue Grinder Homogenizer, Pack of 10 Chang Bioscience Inc. (eBay) GP1.5_10 Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.
Goat anti-CXCL12, biotinylated PeproTech 500-P87BGBT Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution: 1:20.
Goat anti-JAM-B R&D AF1074 Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 488 Thermo A11001 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 555 Thermo A21424 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Goat anti-PDGFRβ R&D AF1042 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Goat anti-Rabbit IgG-ALEXA 555 Thermo A21249 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Goat anti-Rabbit IgG-DyLight 488 Thermo 35552 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Goat anti-Rat IgG-DyLight 650 Thermo SA5-10021 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Graefe Forceps, curved tip, 1X2 teeth FST 11054-10 Use for nylon filter net holding and shaking
HBSS, 1X buffer with calcium and magnesium Corning 21-022-CM Used for MV-1 solution
HEPES, 1M liquid buffer Corning 25-060-CI Used for MV-1 solution
Isolectin GS-IB4-Biotin-XX ThermoFisher Scientific (Thermo) I21414 Glycoprotein isolated from legume Griffonia simplicifolia that binds D-galactosyl residues of endothelial cell glycocalysx. Used for avian and porcine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL.
LaGrange Scissors, serrated FST 14173-12 Used for skull dissection and laminectomy (except pig and macaque)
Millicell EZ slide 8-well unit Millipore Sigma PEZGS0816
Mouse anti-CLDN5 Thermo 35-2500 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Mouse anti-GGT1 Abcam ab55138 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Mouse anti-Human CD31 R&D BBA7 Used as primary antibody on primate CNS microvessels. Recommended concentration: 16.5 μg/mL.
Mouse anti-NFM Thermo RMO-270 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Mouse anti-αSMA Thermo MA5-11547 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.
Nylon Filter Net, roll Millipore Sigma NY6000010 Laser-cut to 13 mm diameter filter net discs. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.
Nylon Filter Nets, 25 mm Millipore Sigma NY2002500 Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.
Nylon Filter Nets, 47 mm Millipore Sigma NY2004700 Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.
ProLong Gold antifade reagent with DAPI ThermoFisher P36935 Used to coverslip slides.
Rabbit anti-AQP4 Millipore Sigma A5971 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.
Rabbit anti-LSR Millipore Sigma SAB2107967 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Rabbit anti-NG2 Millipore Sigma AB5320 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.
Rabbit anti-OSP Abcam ab53041 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 1 μg/mL.
Rabbit anti-VE-Cadherin Abcam ab33168 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Rabbit anti-ZO-1 Thermo 61-7300 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Rat anti-CD31 Becton Dickinson BD 550274 Used as primary antibody for murine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Rat anti-GFAP Thermo 13-0300 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.
Rat anti-VCAM-1 Becton Dickinson BD 553329 Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Sterile Ringer's Solution, Frog Aldon Corporation IS5066 Used for amfibian anesthesia
Streptavidin-ALEXA 555 Thermo S32355 Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500.
Streptavidin-ALEXA 647 Thermo S32357 Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500.
Surgical Scissors, sharp FST 14002-12 Used for removal of muscle and skin
Surgical Scissors, sharp-blunt FST 14001-16 Used for decapitation (except pig and macaque)
Swinnex Filter Holder, 13 mm Millipore Sigma SX0001300 Modified by laser-cut. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.
Swinnex Filter Holder, 25 mm Millipore Sigma SX0002500 Modified by laser-cut. Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.
Swinnex Filter Holder, 47 mm Millipore Sigma SX0004700 Modified by laser-cut. Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.
Triton X-100 ThermoFisher 50-165-7277 Used for blocking and antibody diluent.
Wheaton 120 Vac Overhead Stirrer VWR (Supplier DWK Life Sciences) 62400-904 (DWK #903475) Used for macaque and pig CNS tissues with 55 mL tissue grinder, except hypothalamus and pituitary.
Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 10 mL VWR (Supplier DWK Life Sciences) 14231-384 (DWK #357979) Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.
Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 55 mL VWR (Supplier DWK Life Sciences) 14231-372 (DWK #357994) Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bundgaard, M., Abbott, N. J. All vertebrates started out with a glial blood-brain barrier 4-500 million years ago. Glia. 56, 699-708 (2008).
  2. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a020412 (2015).
  3. Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).
  4. Kealy, J., Greene, C., Campbell, M. Blood-brain barrier regulation in psychiatric disorders. Neuroscience Letters. , (2018).
  5. Sweeney, M. D., Kisler, K., Montagne, A., Toga, A. W., Zlokovic, B. V. The role of brain vasculature in neurodegenerative disorders. Nature Neuroscience. 21, 1318-1331 (2018).
  6. Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back. Physiological Reviews. 99, 21-78 (2019).
  7. Wilhelm, I., Nyul-Toth, A., Suciu, M., Hermenean, A., Krizbai, I. A. Heterogeneity of the blood-brain barrier. Tissue Barriers. 4, e1143544 (2016).
  8. O'Brown, N. M., Pfau, S. J., Gu, C. Bridging barriers: a comparative look at the blood-brain barrier across organisms. Genes & Development. 32, 466-478 (2018).
  9. Cruz-Orengo, L., et al. CXCR7 influences leukocyte entry into the CNS parenchyma by controlling abluminal CXCL12 abundance during autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 208, 327-339 (2011).
  10. Serres, S., et al. VCAM-1-targeted magnetic resonance imaging reveals subclinical disease in a mouse model of multiple sclerosis. FASEB Journal. 25, 4415-4422 (2011).
  11. Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
  12. Sohet, F., et al. LSR/angulin-1 is a tricellular tight junction protein involved in blood-brain barrier formation. Journal of Cell Biology. 208, 703-711 (2015).
  13. Cruz-Orengo, L., et al. Enhanced sphingosine-1-phosphate receptor 2 expression underlies female CNS autoimmunity susceptibility. Journal of Clinical Investigation. 124, 2571-2584 (2014).
  14. Dayton, J. R., Franke, M. C., Yuan, Y., Cruz-Orengo, L. Straightforward method for singularized and region-specific CNS microvessels isolation. Journal of Neuroscience Methods. 318, 17-33 (2019).
  15. Smyth, L. C. D., et al. Markers for human brain pericytes and smooth muscle cells. Journal of Chemical Neuroanatomy. 92, 48-60 (2018).
  16. Granberg, T., et al. In vivo characterization of cortical and white matter neuroaxonal pathology in early multiple sclerosis. Brain. 140, 2912-2926 (2017).
  17. Datta, G., et al. Neuroinflammation and its relationship to changes in brain volume and white matter lesions in multiple sclerosis. Brain. 140, 2927-2938 (2017).
  18. Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging Techniques to Assess Inflammation in Multiple Sclerosis. Neuroscience. 403, 4-16 (2019).
  19. Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).
  20. Cornford, E., Hyman, S. Localization of brain endothelial luminal and abluminal transporters with immunogold electron microscopy. NeuroRx. 2, 27-43 (2005).
  21. Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M. Purification of Mouse Brain Vessels. Journal of Visualized Experiments. , 53208 (2015).
  22. Paul, D., Cowan, A. E., Ge, S., Pachter, J. S. Novel 3D analysis of Claudin-5 reveals significant endothelial heterogeneity among CNS microvessels. Microvascular Research. , (2012).
  23. Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. Journal of Neuroscience Methods. 207, 80-85 (2012).
  24. Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
  25. Bourassa, P., Tremblay, C., Schneider, J. A., Bennett, D. A., Calon, F. Beta-amyloid pathology in human brain microvessel extracts from the parietal cortex: relation with cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 137, 801-823 (2019).
  26. Porte, B., et al. Proteomic and transcriptomic study of brain microvessels in neonatal and adult mice. PLoS One. 12, e0171048 (2017).

Tags

علوم الأعصاب ، الإصدار 155 ، حاجز الدم في الدماغ ، الجهاز العصبي المركزي ، وحده الاوعيه العصبية ، الفاره ، البلازما ، التهاب العصبي
عزل يمكن الاعتماد عليه من الاوعيه المجهرية للجهاز العصبي المركزي عبر خمس مجموعات فقاري
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yuan, Y., Dayton, J. R., Freese, M.… More

Yuan, Y., Dayton, J. R., Freese, M. L., Dorflinger, B. G., Cruz-Orengo, L. Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups. J. Vis. Exp. (155), e60291, doi:10.3791/60291 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter