Summary
Målet med detta protokoll är att isolera mikrofartyg från flera regioner i det centralanervsystemet hos lissencephalic och gyrencephalic-ryggradsdjur.
Abstract
Isolering av mikrokärl från centralanervsystemet (CNS) utförs vanligen genom att kombinera kortikal vävnad från flera djur, oftast gnagare. Detta tillvägagångssätt begränsar förhör av blod-hjärnbarriären (BBB) egenskaper till cortex och tillåter inte för individuell jämförelse. Detta projekt fokuserar på utveckling av en isoleringsmetod som möjliggör jämförelse av neurovaskulär enhet (NVU) från flera CNS regioner: cortex, cerebellum, Optic Lobe, hypotalamus, hypofys, hjärnstammen, och ryggmärgen. Dessutom, detta protokoll, ursprungligen utvecklades för murina prover, framgångsrikt anpassats för användning på CNS-vävnader från små och stora ryggradsdjur som vi också kan isolera mikrofartyg från hjärnhalvan vit materia. Denna metod, när den paras ihop med immunolabeling, möjliggör kvantifiering av proteinuttryck och statistisk jämförelse mellan individer, vävnadstyp, eller behandling. Vi bevisade denna tillämplighet genom att utvärdera förändringar i proteinuttryck under experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE), en murin modell av en neuroinflammatorisk sjukdom, multipel skleros. Dessutom kan mikrofartyg som isolerats med denna metod användas för nedströmsprogram som qPCR, RNA-SEQ och Western blot, bland annat. Även om detta inte är det första försöket att isolera CNS mikrofartyg utan användning av ultracentrifugering eller enzymatisk dissociation, det är unikt i sin adeptness för jämförelsen av enskilda individer och flera CNS regioner. Därför, det gör det möjligt för utredning av en rad skillnader som annars kan förbli oklara: CNS portioner (cortex, cerebellum, optisk LOB, hjärnstammen, hypotalamus, hypofys, och ryggmärgen), CNS vävnad typ (grå eller vit materia), individer, experimentella behandlingsgrupper och arter.
Introduction
Vår hjärna är den viktigaste orgeln i vår kropp. Av denna anledning, hålla hjärnan homeostas trots yttre faktorer som kan utlösa en avvikelse från normalitet är en prioritet. Enligt vissa forskare, cirka 400 – 500 miljoner år sedan1, ryggradsdjur utvecklat vad vi nu känner som blod-hjärnbarriären (BBB)2,3. Detta skyddande "staket" utövar det största inflytandet över centralanervsystemet (CNS) homeostas och funktioner genom att tätt reglera transporten av joner, molekyler, och celler mellan blod och CNS parenkymet. När BBB störs, hjärnan blir mottagliga för toxisk exponering, infektion, och inflammation. Därför är BBB dysfunktion förknippad med många, om inte alla, neurologiska och neurologiska utvecklingsstörningar4,5,6.
Den sofistikerade funktionen av BBB tillskrivs den unika CNS mikrovaskulatur formas av neurovaskulära enhet (NVU)2,3. Mycket specialiserade endotelceller, pericyter, och astrocytic slutet av fötterna är de cellulära komponenterna i NVU2,3. Den extracellulära matris som genereras av dessa celler är också viktigt att NVU och BBB fysiologi2,3. Även om viktiga cellulära och molekylära komponenter i NVU bevaras bland ryggradsdjur, rapporteras heterogenitet bland order och arter7,8. Men tekniska begränsningar hindrar vår förmåga att till fullo beakta dessa skillnader i neurobiologi, biomedicinsk eller translationell forskning.
På grund av detta utökade vi en CNS regionspecifika microvessel-isoleringsmetod för att göra den tillämplig på många arter från alla fem ryggradsdjur grupper: fisk, amfibier, reptiler, fåglar och däggdjur. Protokollet beskrivs för användning på små-lissencephalic och stora gyrencephalic-ryggradsdjur, inklusive arter med translationell relevans9. Dessutom, vi inkluderar andra regioner i CNS som inte undersökts tidigare i detta sammanhang, men relevant för neurofysiologi och med oerhörda kliniska konsekvenser: hypotalamus, hypofysen, och vit materia. Slutligen testade vi kapaciteten hos denna isoleringsmetod som ett pålitligt verktyg för att identifiera förändringar i proteinuttryck längs med NVU och/eller BBB9,10,11. Som ett proof-of-koncept, visade vi hur man bestämmer förändringar i VCAM-1 och JAM-B uttryck under EAE med isolerings metoden följt av immunofluorescens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden i denna studie är i enlighet med de riktlinjer som fastställts av University of California (UC), Davis institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC). Djuromsorg på UC Davis regleras av flera oberoende resurser och har ackrediterats fullt ut av föreningen för bedömning och ackreditering av laboratoriedjur omsorg International (AAALAC) sedan 1966. Svin CNS vävnader erhölls från UCD Institutionen för djur vetenskaper, kött vetenskap laboratorium. CNS-vävnader från Rhesus makaker erhölls från California National Primate Research Center patologi Department (NIH P51OD011107). Ingen anestesi, eutanasi eller nekropsy utfördes av laboratoriepersonal på svin och makaker. Därför finns det inga särskilda rekommendationer om dessa frågor.
Anmärkning: denna metod har validerats för flera arter, men det medföljande protokollet motsvarar mer direkt till mus och svin vävnader. Detaljer som hänför sig till optikloden gäller inte vid användning av däggdjurs preparat. Alla biologiskt farliga material måste hanteras i en lämplig anläggning för biosäkerhetsnivå (BSL). Alla akut giftiga material måste hanteras under ett draghuv. Allt biologiskt farligt medicinskt avfall och akut giftigt avfall måste kasseras på rätt sätt.
1. förberedelser
- Förbered lösningarna (tabell 1) minst en dag i förväg.
Obs: det är mycket svårt att lösa 70 kDa molekylvikt (MW) dextran. Det är mer effektivt att låta lösningen rör över natten täckt med antingen paraffin film eller folie. Protokollet kräver att man använder två olika MV-2-lösningar beroende på vilket preparat som undersöks. Den 18% dextran separerar effektivt myelin från mikrokärl pelleten när du utför protokollet på små lissencephalic prover. Det utvecklar dock ett utstryk av myelin inom gränssnittet av CNS-vävnader från stora gyrencephalic prover, liksom hypotalamus och hypofysen från små exemplar. Detta utstryk förhindras genom att använda 20% dextran. - Förbered väl-slides genom att fylla 50 μL per brunn av Poly-D-lysin och låt torka i 2 h vid rumstemperatur (RT), företrädesvis i en biologisk säkerhetsskåp-klass 2 (BSC-2). Övertorka inte. Skölj två gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och förvara den i kylskåpet tills den är klar att användas.
2. dissektion av CNS-vävnad från små
Obs: artikeln visar tillämpningen av protokollet på en C57BL6/J, 10 vecka gammal, ~ 25 g, manlig mus.
- Bered 2 15 mL koniska rör och ett 1,7 mL microcentrifugrör med 5 mL respektive 1 mL MV-1 lösning per prov. Håll rören på is.
- Anesthetization
- Anesthetize möss genom intraperitoneal injektion av en ketamin, xylazin, och Acepromazin bedövningsmedel cocktail på 100/10/3 mg per kg kroppsvikt och spraya med 70% etanol. Bekräfta anestesi genom att bedöma frånvaron av palpebrala och pedal reflexer genom att röra ett öga och nypa en fot, respektive.
- Anesthetize duvor genom inandning av 5% isofluran med hjälp av en induktion anestesi låda.
- Anesthetize fisk och grodor i 1% Tricaine i antingen en fisk som innehar vattentank eller groddjur ringer lösning (tabell över material), respektive.
- Anesthetize ödlor genom kylning vid 4 ° c före eutanasi.
- Halshugga djuret med kirurgiska saxar, skala bort huden med tång för att exponera skallen, och skär med LaGrange sax genom foramen magnum (figur 1A).
- Dissekera hjärnan med en spatel och överför till ett 15 mL koniskt rör med MV-1 lösning. Håll röret på is.
- Hämta hypofysen från skallen ' s Sella turcica med tång och överföring till en 1,7 ml microcentrifug rör med MV-1 lösning. Håll röret på is.
- Ta bort huden och muskler att exponera ryggraden. Klipp ut armar och ben, bröstkorg och inre organ (figur 1B).
- Dissekera ryggmärgen med en av de två metoder som beskrivs nedan. Överför sedan till ett 5 mL koniskt rör med MV-1-lösning. Håll röret på is.
- Utför laminektomi genom att skära i en rostralt till caudal riktning med LaGrange sax, med början genom livmoderhalsen kotfrakturer foramen, tills de når ländryggen sladden.
- Utför spolning i en caudal till rostralt riktning i hela länd kotpelaren foramen med en 18 G nål och 10 ml spruta laddad med MV-1 lösning (figur 1C, D).
Anmärkning: denna metod fungerar endast med mycket små prover, mestadels gnagare (< 100 g).
- Använd en dissekera omfattning, skär dural SAC från ryggmärgen med våren sax och ta bort de återstående hjärnhinnorna med en dubbel-pronged plocka (figur 2).
- Överföra hjärnan till en petriskål och, med hjälp av en dissekera omfattning, ta bort hjärnhinnorna med en dubbel-pronged plocka (figur 2a – C).
- Punktskatter lukt lökar och thalamus med pinken, Iris sax, och våren sax. Med hjälp av dubbel-pronged plocka, ta bort plexus koroidea från alla hjärn ventriklarna. Se till att ta bort alla plexus koroidea.
Obs: plexus koroidea och lukt lökar är en massiv källa till kontaminering. I motsats till BBB, dessa kapillärer är mycket Fenestrated och resultaten av de efterföljande experimenten kommer att äventyras om de inte avlägsnas. - Med hjälp av tång, separera de olika CNS-regioner: cortex, cerebellum, hjärnstammen, optisk lob (inte på däggdjur prover), och hypothalamus.
3. dissektion av CNS-vävnad från ett stort Gyrencephalic-ryggradsdjur
Anmärkning: detta protokoll använder svin CNS-vävnader som erhållits från ett slakteriet. Därför, ingen anestesi, eutanasi, eller obduktion beskrivs eller visas här.
- Transport svin CNS vävnader i en 0,946 L (32 oz) histologisk behållare laddad med MV-1 lösning inuti en is bröstet/hink.
- Använd en dissekera omfattning, ta bort hjärnhinnorna med en dubbel-pronged plocka, pinps, Iris sax, och vårsax från varje CNS vävnad. Se till att ta bort alla bitar av koroidea plexus från hjärnans ventriklar.
4. homogenisering av CNS-vävnad
Obs: det är mer effektivt när två utredare engagera sig i homogenisering processen: en dissekera hjärnhinnorna under stereoskop och andra homogenisera den malda vävnader. På detta sätt, vävnaderna snabbt tillbaka till isen hink och hålls kallt.
- Placera varje CNS region på en petriskål med ~ 1 mL av MV-1 lösning. Med hjälp av ett enkantsblad, skräll vävnaden för att få 1 – 2 mm bitar.
- För ett litet ryggradsdjur, Använd en 100 mm x 20 mm petriskål.
- För ett stort ryggradsdjur, Använd en 150 mm x 15 mm petriskål.
- Homogenisering av ett litet ryggradsdjur (tabell 2 och tabell 3)
- Överför cortex, cerebellum, hjärnstammen, optisk LOB, och ryggmärgen till ~ 1 mL av MV-1 lösning i en individuell 10 mL Potter-Elvehjem glas vävnad Grinder med en PTFE mortelstöt med en överföringspipett. Tillsätt 5 mL MV-1 lösning och homogenisera varje vävnad (~ 10 slag). Överför till enskilda 15 mL koniska rör. Håll rören på is.
Anmärkning: för en liten ryggradsdjur, 5 eller 4, med eller utan optisk LOB, 10 mL Potter-Elvehjem slipmaskiner och 15 mL koniska rör behövs. - Överför hypotalamus och hypofysen med tång till ~ 100 μL av MV-1 lösning i en individuell 1,7 mL tub och noggrant homogenisera med ett glas micropestle. Skölj varje micropestle med ~ 1 mL MV-1 lösning. Håll röret på is.
Anmärkning: för en liten ryggradsdjur, 2 glas micropestles och 1,7 mL rör behövs.
- Överför cortex, cerebellum, hjärnstammen, optisk LOB, och ryggmärgen till ~ 1 mL av MV-1 lösning i en individuell 10 mL Potter-Elvehjem glas vävnad Grinder med en PTFE mortelstöt med en överföringspipett. Tillsätt 5 mL MV-1 lösning och homogenisera varje vävnad (~ 10 slag). Överför till enskilda 15 mL koniska rör. Håll rören på is.
- Homogenisering av ett stort ryggradsdjur (tabell 4 och tabell 5)
- Överför den malda vävnaden med hjälp av en överföringspipett till en 55 mL Potter-Elvehjem glas vävnad Grinder med PTFE mortelstöt och fäster på overhead omrörare. Tillsätt hälften av den rekommenderade volymen av MV-1 lösning, enligt den specifika CNS-delen som homogeniseras (tabell 5).
- Slå på overhead omrörare vid mycket låg hastighet (~ 150 rpm) och försiktigt flytta glaset röret upp och ner i ca 30 s.
- Stäng av overhead omrörare, tillsätt mer MV-1 lösning, och upprepa steg 4.3.2 tills en homogen slurry.
- Överför till ett 50 mL koniskt rör. Håll röret på is.
- Tvätta kvarnen med avjoniserat vatten mellan varje CNS vävnad homogenisering.
Anmärkning: för en stor ryggradsdjur 5 eller 4, med eller utan vit substans, respektive, 50 mL koniska rör behövs. Likaså, två (2) 15 ml koniska rör behövs för hypotalamus och hypofysen.
5. rening av mikrofartyg
- Centrifugera vävnads homogena till följd av steg 4.2.1, 4.2.2 eller 4.3.4 vid 2 000 x g i 10 min vid 4 ° c. Ett stort vitt gränssnitt av myelin kommer att bildas på toppen av de rödaktiga mikrofartygens pellets. Kassera supernatanterna.
- Litet ryggradsdjur (tabell 2 och tabell 3)
- Omsuspendera cortex, cerebellum, hjärnstammen, optisk LOB och ryggmärgs pellets i 5 ml iskall MV-2 lösning med en 5 ml serologiska pipett (~ 10 spolar). Tillsätt 5 mL iskall MV-2-lösning till varje suspension och blanda försiktigt genom att vrida rören.
- Omsuspendera hypotalamus och hypofysen pellets med 1 ml av MV-2 lösning.
- Stort ryggradsdjur (tabell 4 och tabell 5)
- Tillsätt 20 ml iskall MV-2-lösning till cortex, cerebellum, hjärnstammen och ryggmärgen mikrokärl pellets. Omsuspendera pellets genom att blanda på ett rör revolver shaker, omrörning vid 40 RPM för ~ 5 min. balansera de koniska rören ' volymer av cortex, cerebellum, hjärnstammen, och ryggmärgen suspensioner genom att lägga till mer MV-2 lösning.
- Omsuspendera hypotalamus och hypofysen mikrokärl pellets i 5 ml av MV-2 lösning med en 5 ml serologiska pipett (~ 10 spolar). Tillsätt 5 mL iskall MV-2-lösning till fjädringen och blanda försiktigt genom att vrida röret.
- Litet ryggradsdjur (tabell 2 och tabell 3)
- Centrifugera vid 4 400 x g i 15 min vid 4 ° c.
- Lossa försiktigt det tjocka och täta myelin-skiktet på vätske gränssnittet från varje rörets väggar genom att sakta rotera rören och låta supernatanten passera längs väggarna.
- Kassera myelin och flytande gränssnittet och blot insidan av varje tub med en spatel lindad med en låg-ludd papper torka. För små ryggradsdjur, avlägsna myelin skikt från varje hypotalamus och hypofysen röret genom att försiktigt med en överföringspipett.
- Torka ut överflödig vätska med en vriden låg-ludd papper torka. Omsuspendera varje pellet med 1 mL MV-3-lösning med låg bindnings spets. Håll rören på is.
6. Elueringoch filtrering av mikrofartyg
- Häll iskall MV-3-lösning i enskilda bägare för varje CNS-region. Förvaras vid 4 ° c.
- För små ryggradsdjur, Använd 10 mL MV-3 lösning per 50 mL bägare. Totalt 6 – 7 bägare är nödvändigt beroende på om optisk LOB ingår eller inte.
- För stora ryggradsdjur, Använd 30 mL MV-3 lösning per 100 mL bägare. Totalt 6 – 7 bägare är nödvändigt beroende på om vit materia ingår.
- Placera en cellsil ovanpå ett 50 mL koniskt rör. Använd en per CNS-region. Använd en 100 μm sil för cortex, hjärnstammen, optisk LOB, ryggmärgen, och hypofysen. Använd en 70 μm cell sil för lillhjärnan och hypotalamus.
- Blöt varje SIL med 1 mL iskall MV-3 lösning.
- Tillsätt mer MV-3-lösning till de upphängningar som förberetts i steg 5,5 med en serologisk pipett vid blandning för att undvika aggregat. Ladda försiktigt mikrokärlen ovanpå SIL. Skölj med iskall MV-3 lösning.
- För små ryggradsdjur (tabell 2 och tabell 3), tillsätt 10 – 15 ml MV-3-lösning med en serologisk pipett och skölj med 5 ml MV-3-lösning.
- För stora ryggradsdjur, tillsätt 20 mL MV-3-lösning med en serologisk pipett och skölj med 10 mL MV-3-lösning.
- Montera filtrerings enheten genom att placera ett 20 μm nylonnät filter på en modifierad filterhållare (figur 2D), en per CNS-region.
- För små ryggradsdjur (tabell 2 och tabell 3), Använd 25 mm modifierade filterhållare för cortex, cerebellum, hjärnstammen, optisk LOB och ryggmärg. Använd 13 mm modifierade filterhållare för hypotalamus och hypofysen.
- För stora ryggradsdjur (tabell 4 och tabell 5), Använd 47 mm modifierade filterhållare för cortex, cerebellum, hjärnstammen och ryggmärgen. Använd 25 mm för hypotalamus och hypofysen.
- Placera filtret ovanpå ett 50 mL koniskt rör och vått filter med 5 mL iskall MV-3-lösning, vilket gör att bufferten häller ner filterhållaren till det koniska röret.
- Överför de eluerade mikrokärlen (från steg 6,4) ovanpå det 20 μm nylonnet-filtret och skölj mikrokärlen med 5 – 10 mL iskall MV-3-lösning.
- Återställ filtret med hjälp av rena tång och sänk ned det i bägaren som innehåller den iskalla MV-3-lösningen som bereds i steg 6,1.
- Lossa mikrokärlen från filtret genom att skaka det försiktigt i ca 30 s. För små ryggradsdjur, häll bägaren i ett 15 mL koniskt rör. För stora ryggradsdjur, häll bägaren innehållet i ett 50 mL koniskt rör.
- Centrifugera vid 2 000 x g i 5 min vid 4 ° c och Omsuspendera pelleten i 1 ml iskall MV-3-lösning med en lågbindande pipettspets.
- För små ryggradsdjur, överför suspensionen (från steg 6,10) till ett 1,7 mL microcentrifugerör och centrifugera vid 20 000 x g i 5 minuter vid 4 ° c.
Obs: denna dragning utförs på en bänkskiva centrifug med maximal hastighet (~ 20 000 x g) för att säkerställa en robust avkastning. - För stora ryggradsdjur, överför suspensionen från steg 6,10 till ett 5,0 mL microcentrifugerör, tillsätt 4 mL MV-3-lösning och centrifugera vid 2 000 x g i 5 minuter vid 4 ° c.
- För små ryggradsdjur, överför suspensionen (från steg 6,10) till ett 1,7 mL microcentrifugerör och centrifugera vid 20 000 x g i 5 minuter vid 4 ° c.
7. immunofärgning
Anmärkning: hematoxylin och eosin (H & E) färgning utfördes på reptil, Amfi, och fisk exemplar som ett proof-of-konceptet av protokollet genomförbarhet. Därför finns det ingen rekommendation för immunolabeling för dessa preparat.
- Avlägsna supernatanten från microcentrifugerören.
- Omsuspendera pelleten i 1x steril PBS med en lågbindande pipettspets (tabell över material). Håll mikrokärlen från att bilda aggregat genom att Pipettera flera gånger. För små ryggradsdjur (tabell 3), använd ~ 100 μl – 2000 μl enligt pelletstorleken. För stora ryggradsdjur (tabell 5), använd ~ 1 000 μl – 4000 μl enligt pelletstorleken.
- Med hjälp av en låg-bindande pipettspetsen, överföra mikrokärlen till väl diabilder, är noga med att lägga till dem i mitten av varje brunn, undvika sidoväggarna.
- Ställ brunnen diabilder, avslöjade, inuti en BSC-2, och låt torka i 20 till 30 min vid RT.
Anmärkning: en relativt hög volym 1x PBS används för att undvika aggregerad bildning. På grund av detta, är det nödvändigt att låta bilderna torka före fixering för att se till att mikrokärlen hålls av Poly-D-lysin beläggning. - Ta bort resterande 1x PBS genom att Pipettera ut med en överföringspipett, tillsätt 200 μL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) och inkubera i 30 minuter vid RT.
- Pipettera över fixativ lösning och tvätta 3x med 200 μL 1x PBS i 5 minuter vid RT.
Obs: H & E färgning på fisk, amfianiska och reptil CNS mikrokärl utfördes på denna punkt. - Tillsätt 200 μL blockerande buffert i brunnen och inkubera i 60 min vid 37 ° c.
- Ta bort blockeringsbufferten med en överföringspipett och tillsätt 200 μL av den primära antikropps cocktail i antikropps spädningsmedel (tabell över material). Inkubera vid 4 ° c över natten.
- Pipettera över den primära antikropps cocktail och tvätta 3x med 200 μL 1x PBS i 5 minuter vid RT.
- Ladda den sekundära antikropps cocktail (tabell över material) utspädd i 1x PBS och inkubera i 2 timmar vid RT, skyddas från ljus.
- Pipettera över den sekundära antikropps cocktail och tvätta 3x med 200 μL 1x PBS i 5 minuter vid RT, skyddat från ljus. Efter den sista tvätten ta bort brunnen Slide ' s ram och torka av överflödig 1x PBS med en låg ludd papper torka.
- Lägg till en täckslip, flytande AntiFade Mountant medium, och 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) för nukleär färgning. Låt torka över natten på RT skyddas från ljus.
- När torr, håll skyddat från ljus på en bildruta vid 4 ° c tills redo för konfokalmikroskopi och datainsamling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikrofartyg isolerade från murin CNS visade alla inneboende cellulära komponenter i neurovaskulär enhet2,3. Använda antingen trombocyt endotelcelladhesion molekyl-1 (PECAM, även känd som CD31) eller isolectin IB4 (ett glykoprotein som binder endotelcellglykocalyx) för endotelceller, trombocythärledd tillväxtfaktor-β (PDGFRβ) eller neuron-Glial antigen 2 (NG2) för pericyter och aquaporin-4 (AQP4) för astrocytiska änd fötter (figur 3a, B) visar att dessa inneboende komponenter finns i isolerade mikrofartyg. CNS-regioner synlig inkluderar kortikala mikrofartyg (figur3B), lillhjärnan (figur 3C),hypofys(figur 3D), hypotalamus (figur 3E), hjärnstammen (figur 3F), och ryggmärgen (figur 3G). Alla visade uttryck för dessa kanoniska markörer.
Likaså visade mikrokärlen uttryck för adherens Junction protein ve-cadherin (figur 4A, C), snäva Knut punkts proteiner Claudin-5 och Auktor occludens-1 (CLDN5 och zo-1, figur 4a, D), tricellulära Knut punkts protein angulin-1 (figur 4a, E) och apicobasal markörer C-X-c motiv Chemokine ligand 12 och gamma-glutamyltransferas 1 (CXCL12 och GGT1, figur 4a, F). Dessa fynd är relevanta eftersom dessa proteiner är indikatorer på pivotala BBB-specifika egenskaper9,12,13,14. En begränsad förekomst av astrocyter, oligodendrocyter, och nervceller som uttrycker gliaceller hjärn surt protein (gfap, figur 4B, C, G), oligodendrocyte specifikt protein (OSP, figur 4b, g), och neurofilament-medium (NFM, figur 4b, H), respektive, visar att isolerade mikrofartyg hade försumbara spår av oönskade icke-neurovaskulära enhets celler. Dessutom saknade majoriteten av mikrokärlen uttrycket av α-glatta muskeln aktin (αsma, figur 5B, C). Detta är relevant eftersom αsma är en markör för glatta muskelceller i samband med arterioler och venoler (figur 5a), vilket indikerar att detta isolerings protokoll selektivt riktar små kaliber mikrofartyg15.
Mikrofartyg som erhållits från andra små lissencefaliska ryggradsdjur har vissa morfologiska egenskaper, som ses i fisk (groda och ödla inte visas) och aviär mikrofartyg. Detta tyder på att denna metod är användbar för att ytterligare karakterisera skillnader i NVU mellan arter (figur 6). Dessutom visade aviär CNS-mikrofartyg (figur 6H – N) korreaktivitet med många av de antikroppar som utvecklats för människa och mus. Detta uppmuntrar till ytterligare utredning av fågelprover för biologiska och biomedicinska BBB-studier. Vi observerade liknande resultat när vi isolerade mikrofartyg från svin och makaker, två gyrencephalic arter (figur 7). Endast NVU kanoniska markörer i svin mikrofartyg visas. Förutom de tidigare nämnda CNS-regionerna kunde vi isolera mikrofartyg från periventrikulär vit substans (figur 7B). Detta är relevant eftersom vit materia är inblandad i neuroinflammatoriska tillstånd (t. ex. multipel skleros16,17,18).
Vi ville ta reda på om denna metod skulle kunna användas som ett tillförlitligt verktyg för att fastställa förändringar i proteinuttryck. Att veta att VCAM-1 och Jam-B har varit inblandade i den neuroinflammatoriska processen vid ryggmärgen under EAE, vi bestämde oss för att kvantifiera uttrycket av dessa proteiner vid topp och kroniska stadier av EAE och Sham-Control möss (10 veckor gamla C57BL/6j möss)9,10,11. För att göra detta, mätte vi den godtyckliga enheten intensitet (AUI) längs mikrofartygens diameter. Sedan, med ett tröskelvärde på ≤ 20 AUI för DAPI, beräknade vi området under kurvan (AUC) för VE-cadherin, VCAM-1 och JAM-B för 50 mikrofartyg per CNS-regionen (figur 8a, B). Slutligen utförde vi tvåvägsanova följt av Sidaks post-hoc-test för att fastställa statistisk signifikans för förändringar i proteinuttryck.
Som väntat observerade vi en ökning av VCAM-1 och JAM-B längs ryggmärgs mikrofartyg under toppen av EAE (figur 8D, E). Vi observerade dock förändringar i andra CNS-regioner som inte tidigare rapporterats för EAE. VCAM-1 ökade signifikant i hypofysen mikrokärl och minskade i hypotalamus och hjärnstammen mikrokärl. Det fanns förändringar under kronisk EAE i alla CNS-vävnader (figur 8D). JAM-B ökade signifikant i hypotalamus och hypofysen mikrokärl under kronisk EAE (figur 8E). Intressant, observerade vi förändringar i ve-cadherin längs mikrofartyg isolerade från hypotalamus och hjärnstammen under toppen av EAE, lillhjärnan under kronisk EAE (figur 8C), och en minskning av hypofysen mikrokärl bredd under topp och kronisk EAE. Sammantaget tyder dessa data på att denna metod för isolering av mikrofartyg är ett användbart verktyg för att karakterisera förändringar i regionala protein uttrycksmönster under hälsa och sjukdom.
Figur 1: effektiv ryggmärg dissektion utan laminektomi. Dissektion av ryggmärgen från små ryggradsdjur (upp till 100 g) utförs snabbare och mer effektivt genom att spola sladden i en caudal till rostralt riktning i hela kotfrakturer foramen. Använda dissekera sax huvudet avlägsnas genom Atlas leden och ryggraden skärs ut av höft (a). Alla återstående organ avlägsnas, lämnar endast ryggraden (B). Ryggmärgen i länd kotpelaren foramen visas som en mycket liten vit cirkel (< 1 mm diameter) jämfört med bredden på den cervikala sladden (B, gula pilar). Att hålla en smal öppning vid länd kotpelaren foramen underlättar en tryckgradient från ländryggen till cervikal ryggrad vid spolning med en 18 G nål och 10 CC spruta laddad med 1x PBS (C och D). När spolas, ryggmärgen (D, gul pil) är nästan helt devoided av dural SAC, och endast Pia behöver tas bort under dissekera omfattning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: dubbelpronerad Pick dissekeringsverktyg och modifierad filterhållare. Detta 11 cm långa dissekeringsverktyg (a) har två mycket skarpa, nästan horisontellt motsatta punkter, 2 mm spets-till-spets (B). Genom att tillämpa mjukt tryck nedåt och vrida något i medurs mode (C), de punkter bädda in sig horisontellt i hjärnhinnorna så att de kan lyftas uppåt. Detta är särskilt användbart när du tar bort hjärnhinnorna från lillhjärnan, eftersom det ger tillgång till djupet av cerebelli Folia. Det är också mycket användbart när du tar bort hjärnhinnorna från kortikal vävnad, särskilt gyrencephalic. I det här fallet är Pia mycket inbäddad med hög kaliber kärl som kommer att äventyra renhet microsevessel isolering. Likaså, det underlättar avlägsnande av plexus koroidea, som är den troliga källan till kontaminering. Filter hållare på 47 mm, 25 mm och 13 mm i diameter var laserskurna för att ta bort inlopps kontakten (D) från det övre facket (E), men behåll sikten (G). Denna ändring tillät monteringen av en filterenhet (I,J) genom att placera det 20 μm nylonfilternet över sikten och nedre delen (G,H), och säkra nätet på plats vid skruvning av den övre delen (E). Endast 25 mm filterhållaren visas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Mikrofartyg isolerade från flera CNS-regioner uttryckte kanoniska neurovaskulära enhets markörer. A) användning av immunolabeling och konfokalmikroskopi, inneboende cellulära komponenter i NVU används för att identifiera vuxna (8 – 14 veckors C57BL/6j) MURIN CNS mikrofartyg. Som kan ses på sammanfoga bilden för kortikala mikrofartyg (B), ovanför de enskilda konfokala bilder för endotelceller cell markör CD31 (vit), pericytbiologi markör PDGFRβ (röd), och astrocytic slut-fötter markör AQP4 (grön) alla dessa cellulära komponenter behålls. Observera att den intima relationen mellan endotelceller och pericyter gör dem verkar Magenta på den sammanslagna bilden, medan astrocytic slutet fötter verkar ha en Gloria omger dem (B). Samma uttrycksmönster observeras för lillhjärnan (C), hypofys (D), hypotalamus (E), hjärnstammen (F), och ryggmärgen (G, DAPI, nukleär fläck = blå; skalstapel = 10 μm). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Mikrofartyg uttryckte proteiner associerade med BBB-specifika egenskaper. Endotelceller inom neurovaskulär enhet (NVU) beskrivs också av de proteiner som är förknippade med deras inneboende barriäregenskaper (a). Som framgår av figuren, endotelceller har korsningar gjorda av VE-cadherin, CLDN5, ZO-1 (a, gul), och angulin-1 (a, Teal). De uppvisar också apicobasal polaritet till flera proteiner inklusive GGT-1 och CXCL12 (a, grön och röd). Nervceller, oligodendrocyter, och astrocytceller organ kan ingå i de isolerade mikrofartyg, även om de inte är inneboende i NVU (B). Dessa kan identifieras genom uttrycket av NFM (röd), OSP (cyan), och GFAP (Lime Green), respektive (B). I enlighet med dessa, våra isolerade mikrofartyg uttryckte anhängare protein VE-cadherin (C, röd), snäva knutpunkter proteiner CLDN5 och zo-1 (D, röd och grön, respektive, merge = gul), TRICELLULÄRA korsning protein LSR (E, grön), och APICOBASAL markörer CXCL12 och GGT1 (F, röd och grön, respektive). De uppvisade också begränsade mängder GFAP (a, grön, g, vit), OSP (G, grön), och NFM (H, röd), vilket tyder på försumbar retention av icke-neurovaskulära enhets celler (DAPI, nukleär fläck = blå; skala bar = 10 μm). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: de flesta isolerade mikrofartyg uttrycker inte αSMA. Den neurovaskulära enheten uppvisar en sofistikerad övergång från arteriole-capillary-venule (a). αSMA anular Expression identifierar tydligt arteriole, och som det blir kapillär, αSMA (b, rött) uttryck minskar, utsätta väggmålning markören NG2 (b, grön). Vi mätte diametern på αSMA + och αSMA-fartyg (vita konsoler, n = 20), att skilja dem som arterioler eller kapillärer (DAPI, nukleär fläck = blå, skala bar = 10 μm). Oparade t-test analys av diametern på αSMA + och αSMA-fartyg visade en hög statistisk signifikans (C, αsma + = röd, αsma-röd/grön, * * * * p < 0,0001). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: lyckad isolering av CNS-mikrofartyg från andra lissencephalic-arter. CNS skördades från en vild Fångad groda (8,2 cm), ödla (12,7 cm), tank-Raised regnbåge (2 år gammal, 35,6 cm), och Aviary-upphöjd duva (9 månader gammal, ~ 300 g). Mikrokärlen från grodan, fisk och ödla färgas av H & E (endast mikrofartyg från öring visas, skala bar = 20 μm). Duva mikrofartyg immunolabeled. Vi kunde identifiera mikrofartyg i alla regioner som märkt på Fish and Pigeon CNS konturer: Cortex (A och H), Optic lob (B och I), lillhjärnan (C och J),hypofys (D och L), hypotalamus (E och K), hjärnstammen (F och M), och ryggmärgen (G och N). Dessutom kunde vi identifiera endotelceller med isolectin IB4 (vit), astrocytic slut-fötter med AQP4 (grön), och angränsande nervceller med NFM (röd) från Pigeon isolerade mikrofartyg (DAPI, nukleär fläck = blå, skala bar = 10 μm). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: isolering av CNS-mikrofartyg från gyrencephalic-arter. Hjärnan och ryggmärgen dissekeras från en Farm-Raised gris (~ 6 månader gamla, ~ 120 kg) för mikrokärl isolering och immunolabeling. Vi kunde identifiera mikrofartyg positivt märkta för IB4 (vit), PDGFRβ (röd), och AQP4 (grön) på alla regioner i porcin CNS: Cortex (a), periventrikulär vit substans (B), lillhjärnan (C), hypofys (D), hypotalamus (E), hjärnstammen (F), och ryggmärgen (G, DAPI, nukleär fläck = blå, skala bar = 10 μm). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: exempel på andra appliceringen av mikrofartygs isolering i CNS. Uttryck av JAB-B och VCAM-1 kvantifierades för murina EAE mikrofartyg. Godtyckliga enheter av intensitet (AUI) mättes för cortex, cerebellum, hypotalamus, hypofys, hjärnstammen, och ryggmärgen av möss vid topp och kroniska stadier av EAE, med bluff som kontroll (n = 4). För varje CNS-region utvärderades tolv mikrofartyg per mus för bestämning av AUI per fluorokrom och mikrofartygets diameter (a). Vita konsoler visar exempel på det konfokalmikroskopi Mikroskop programvara mätverktyg som används för att bestämma AUI för VCAM-1 (vit), ve-cadherin (grön), Jam-B (röd), och DAPI (blå, skala bar = 10 μm). Därefter var den resulterande AUI plottas mot diametern i mikrometer (B) för att beräkna arean under KURVAN (AUC) för varje immunolabeled protein som en uppskattning av proteinuttryck. Medelvärdet för AUC per grupp analyserades sedan av tvåvägsanova, följt av Sidaks post hoc-test, för sammanlagt 48 mikrofartyg per CNS-region. Med undantag för hypofysen mikrofartyg, observerade vi inga större skillnader mellan mikrokärl diameter i samband med sjukdomsstatus (c, infoga), men en signifikant minskning av ve-cadherin uttryck från hypotalamus och hjärnstammen i EAE möss (c). Liknande statistisk analys visade en signifikant ökning för VCAM-1 (D) och Jam-B (E) vid ryggmärgen, i överensstämmelse med neuroinflammatorisk status under toppen av EAE. Intressant, vi observerade också förändringar för VCAM-1 på hypotalamus, hypofysen, och hjärnstammen. Dessa resultat är under utredning (svarta staplar och prickar = Sham, röda staplar och prickar = Peak EAE, lax barer och prickar = kroniska EAE, * p < 0,05, @p < 0,01, #p < 0,001, och & p < 0,0001). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| MV-1 | 10 mM HEPER |
| i 1x Hank ' s balanserade saltlösning (HBSS) med kalcium och magnesium | |
| MV-2 | 18% 70 kDa molekylvikt (MW) dextran |
| i 10 mM HEPES/HBSS (MV-1) | |
| MV-2 | 20% 70 kDa MW dextran |
| i 10 mM HEPES/HBSS (MV-1) | |
| MV-3 | 1% bovint serumalbumin (BSA) |
| i 10 mM HEPES/HBSS (MV-1) | |
| Fixativ | 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) |
| i 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) pH 7,4 | |
| Tvättbuffert | 1x PBS pH 7,4 |
| Permeabilization & blockerande buffert | 10% BSA |
| 0,25% nonioniskt ytaktivt ämne | |
| i 1x PBS pH 7,4 | |
| Antikropps spädningsmedel | 5% BSA |
| 0,25% nonioniskt ytaktivt ämne | |
| i 1x PBS pH 7,4 |
Tabell 1: lösningar som används i protokollet.
| Steg (ar) | Åtgärder |
| 4,1 och 4.1.1 | Finhacka i MV-1 lösning med ett enda eggblad |
| 4,2 till 4.2.2 | Homogenisera i MV-1 lösning med hjälp av en Potter-elvj PTFE eller mikrorör stöt |
| 5,1 | Snurra på 2 000 x g, 4 ° c, 10 min |
| 5.1.1 till 5.1.1.2 | Omsuspendera pelleten i MV-2-lösning |
| 5,2 | Snurra på 4 400 x g, 4 ° c, 15 min |
| 5,3 till 5,5 | Omsuspendera pelleten med 1 mL MV-3-lösning |
| 6,2 till 6.4.1 | Eluera över ett 50 mL koniskt rör genom en cellsil och skölj med MV-3 lösning |
| 6,5, 6.5.1, 6,6 och 6,7 | Filter med ett 20 μm nylonnät på den modifierade filterhållaren |
| 6,8 | Fyll på nylonnätet i 50 mL-bägaren med 10 mL MV-3-lösning och skaka i 30-talet |
| 6,9 till 6,10 | Dekanera i ett 15 mL koniskt rör och snurra på 2 000 x g, 4 ° c, 5 min |
| 6,10 | Omsuspendera i 1 mL MV-3-lösning |
| 6.10.1 | Överför till en 1,7 ml mikrorör och snurra på 20 000 x g, 4 ° c, 5 min |
| 7,1 till 7,3 | Omsuspendera i 1x PBS och ladda in i brunnen glidbanor |
Tabell 2: layout för små ryggradsdjur mikrofartyg isolering. Det här diagrammet är en förkortad version av protokollet när du använder ett lissencephalic-prov.
| Steg (ar) | Lösning | Åtgärder | CTX | Cbl | Välja | Bst | Sc | Hyp | Grop |
| 4,1 | MV-1 | Finhacka på skålen | 100 mm x 20 mm petriskål, 1 mL | n/a | |||||
| 4.2.1 och 4.2.2 | MV-1 | Homogenisera | 5 mL, 10 mL keramiker-Elvehjem med mortelstöt | 1 mL, micropestle | |||||
| 5.1.1.1 och 5.1.1.2 | MV-2 | Omsuspendera cellerna under | 5 mL + 5 mL, 18% dextran | 1 mL, 20% dextran | |||||
| 5,5 och 6.4.1 | MV-3 | Omsuspendera cellerna under | 1 mL + 10-15 mL | 1 mL | |||||
| 6,2 och 6.4.1 | MV-3 | SIL storlek | 100 μm | 70 μm | 100 μm | 70 μm | 100 μm | ||
| Skölj | 5 mL | ||||||||
| 6,5, 6.5.1 och 6,7 | MV-3 | Filter storlek, skölj | 25 mm filter, 10 mL | 13 mm, 5 mL | |||||
| 6,8 | MV-3 | Skaka på bägaren | 10 mL | ||||||
| 6,10 | MV-3 | Omsuspendera cellerna under | 1 mL | ||||||
| 7,2 | 1x PBS | Omsuspendera cellerna under | 1,5 till 2,0 mL | 0,5 till 1,0 mL | 0,1 till 0,2 mL | ||||
| 7,3 | 1x PBS | Last per brunn | 200 μL | 100 μL | 25 till 50 μL | ||||
| CTX = cortex, CBL = cerebellum, BST = hjärnstammen, OPT = optisk lob (förekommer inte hos däggdjur), HYP = hypotalamus, GROP = hypofys, SC = ryggmärgen. Rekommenderade volymer är för hela vävnad från djur som varierar i storlek från 20 g (ung mus) till 800 g (Adult råtta). | |||||||||
Tabell 3: Rekommenderad volym/storlek. Den här dispositionen har den rekommenderade volymen av lösningar för användning av ett litet ryggradsdjur som sträcker sig från ~ 20 – ~ 800 g, eller mer specifikt, ~ 25 g-musen som visas på videon. Den slutliga justeringen av de nödvändiga volymerna skall bestämmas av forskaren i enlighet med den särskilda mängd våt vävnad som erhålls efter dissektion. Övning och felsökning rekommenderas starkt. CTX = cortex, CBL = cerebellum, BST = hjärnstammen, OPT = optisk lob (förekommer inte hos däggdjur), HYP = hypotalamus, GROP = hypofys, SC = ryggmärgen.
| Steg (ar) | Åtgärder |
| 4,1 och 4.1.2 | Mince i MV-1 med ett enda eggblad |
| 4,3 till 4.3.4 | Homogenisera i MV-1 lösning med en keramiker-Elvehjem Grinder med en PTFE mortelstöt |
| 5,1 | Snurra på 2 000 x g, 4 ° c, 10 min |
| 5.1.2 till 5.1.2.2 | Omsuspendera pelleten i MV-2-lösning |
| 5,2 | Snurra på 4 400 x g, 4 ° c, 15 min |
| 5,3 till 5,5 | Omsuspendera pelleten med 1 mL MV-3-lösning |
| 6,2 till 6,4 och 6.4.2 | Eluera över ett 50 mL koniskt rör genom en cellsil och skölj med MV-3 lösning |
| 6,5, 6.5.2, 6,6 och 6,7 | Filter med ett 20 μm nylonnät på den modifierade filterhållaren |
| 6,8 | Fyll på nylonnätet i en 50 mL-bägare med 30 mL MV-3-lösning och skaka i 30-talet |
| 6,9 och 6,10 | Dekanera i ett 50 mL koniskt rör och snurra på 2 000 x g, 4 ° c, 5 min |
| 6,10 | Omsuspendera i 1 mL MV-3-lösning |
| 6.10.2 | Överför till en 5 ml mikrorör och snurra på 2 000 x g, 4 ° c, 5 min |
| 7,1 till 7,3 | Omsuspendera i 1x PBS och ladda in i brunnen glidbanor |
Tabell 4: layout för stora ryggradsdjur mikrofartyg isolering. Detta diagram är en förkortad version av protokollet när du använder ett gyrencephalic prov.
| Steg (ar) | Länken | Åtgärder | CTX | Cbl | Wm | Bst | Sc | Hyp | Grop |
| 4,1 | MV-1 | Finhacka på skålen | 3 − 5 mL | 1 mL | |||||
| 4,3 till 4.3.4 | MV-1 | Homogenisera | 20 − 30 mL, 55 mL keramiker-Elvehjem med stöt & overheadomrörare | 5 mL, 10 mL keramiker-Elvehjem med mortelstöt | |||||
| 5.1.2 till 5.1.2.2 | MV-2 | Omsuspendera cellerna under | > 20 mL, 20% dextran | 5 mL + 5 mL, 20% dextran | |||||
| 5,5, 6,4 och 6.4.2 | MV-3 | Omsuspendera cellerna under | 1 mL + 20 mL | 1 mL + 10 mL | |||||
| 6,2 och 6.4.2 | MV-3 | SIL storlek | 100 μm | 70 μm | 100 μm | 70 μm | 100 μm | ||
| Skölj | 10 mL | ||||||||
| 6,5, 6.5.2 och 6,7 | MV-3 | Filter storlek, skölj | 47 mm filter, 10 mL | 25 mm, 10 mL | |||||
| 6,8 | MV-3 | Skaka på bägaren | 30 mL | ||||||
| 6,10 och 6.10.2 | MV-3 | Omsuspendera cellerna under | 1 mL + 4 mL | ||||||
| 7,2 | 1x PBS | Omsuspendera cellerna under | 2,0 till 4,0 mL | 1,0 till 2,0 mL | |||||
| 7,3 | 1x PBS | Last per brunn | 200 μL | 100 μL | |||||
| CTX = cortex, CBL = cerebellum, WM = vit materia, BST = hjärnstammen, HYP = hypothalamus, GROP = hypofys, SC = ryggmärgen. Rekommenderade volymer är för prover på ~ 45 cm3 för CTX, CBL, BST och SC hela HYP och grop. | |||||||||
Tabell 5: Rekommenderad volym/storlek. Detta skisserar har den rekommenderade volymen av lösningar för att använda ett stort ryggradsdjur prov. Mer specifikt gäller det för CNS-vävnadbiopsier av ~ 45 cm3 för cortex, cerebellum, vit substans, hjärnstammen, ryggmärgen, och hela hypotalamus och hypofysen, som visas på videon. Den slutliga justeringen av de nödvändiga volymerna skall bestämmas av forskaren i enlighet med den särskilda mängd våt vävnad som erhålls efter dissektion. Övning och felsökning rekommenderas starkt. CTX = cortex, CBL = cerebellum, WM = vit materia, BST = hjärnstammen, HYP = hypothalamus, GROP = hypofys, SC = ryggmärgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BBB innehåller de unika egenskaperna hos hjärnans mikrovaskulatur endotelceller i kombination med en sofistikerad arkitektur av tight-, anhängare-, "Peg-socket"-korsningar, och vidhäftning plack kritisk för CNS homeostas2,3,19. Endotelceller egenskaper induceras och upprätthålls av pericyter och den omgivande astroglia slutet fot processer2,3,19. BBB mikrovasculature visar polaritet (dvs, det asymmetriska uttrycksmönstret av proteiner lokaliserade på luminala eller abluminal endotelceller ytor)20. Även om detta kan kortfattat definiera BBB, i verkligheten är det fortfarande en av de mest gåtfulla föreställningar inom neurovetenskap. Till exempel, regionala, kön, och ålder skillnader inom NVU kan förklara CNS regionala sårbarheter för trauma, toxicitet, infektion, och inflammation, som kan ha stora kliniska konsekvenser3,5,6. Ett annat hinder i förståelsen av BBB är de skillnader som observerats bland flera taxa7,8. En av de största hindren för att förstå och utreda BBB är just svårigheten i samband med isoleringen av NVU som omfattar BBB, samtidigt som de behåller sin barriär-specifika egenskaper14.
I ett försök att påskynda vår förståelse av BBB, CNS-regionala skillnader, samt art skillnader, vi anpassade tidigare publicerade metoder. Vi har framgångsrikt anpassat dessa, särskilt Boulay et al.21, för att få mikrofartyg från enstaka kortikala, cerebellär, hypotalamus, hypofys, hjärnstammen, och ryggrads vävnader på en myriad av lissencephalic små ryggradsdjur: fisk, amfibier, reptiler, fåglar och däggdjur(figur 3, figur 4, figur 5 En fördel med denna metod är att dess anpassningar baseras på den totala storleken av CNS-vävnad: forskaren väljer mängden lösning, storlek på vävnadslipmaskin, koniskt rör, filterhållare, etc. enligt våt vävnad, oavsett art, kön, och ålder. I vår erfarenhet med immunolabeling, en ~ 20 g preparatet ger tillräckligt med mikrokärl för en 8 väl bild per cortex, cerebellum, optisk LOB, hjärnstammen, och ryggmärgen och en halv 8 väl bild per hypotalamus och hypofys. Emellertid, avkastningen av kortikal och optisk LOB är mycket högre i jämförelse med cerebellum, hjärnstammen, och ryggmärgen.
Som visad, utförde vi nödvändiga anpassningar för isolering och immunolabeling av CNS mikrokärl av gris och makak, större gyrencephalic däggdjur som är mer relevanta för translationell forskning (figur 7). I synnerhet kunde vi inkludera periventrikulär vit materia på dessa arter bara. Eftersom CNS i dessa djur är större, vi samlat tillräckligt med vit substans för att tillåta oss att separera en mikrokärl pellet från myelin skiktet under den andra centrifugering (steg 5,3, MV-2 med 20% dextran). Vi spekulerar i att en kritisk massa behövs för att kunna uppnå denna separation och vi aktivt söker hur man får ett liknande resultat med murin CNS vävnad.
Även utelämnas för enkelhetens skull, vi utförde immunolabeling bortom NVU Canonical markörer på aviär, svin, och makak mikrofartyg. Framför allt har alla arter gemensamma cellulära och molekylära markörer som tidigare identifierats på murinprover som relevanta för BBB-funktionen (junctional proteiner VE-cadherin, CLDN5, ZO-1, LSR och apicobasal markörer CXCL12 och GGT1) eller i närheten av NVU (NFM, OSP och GFAP). Återigen, dessa fynd uppmuntrar användningen av denna metod på andra arter för att ytterligare identifiera NVU ortologi och divergens mellan arter. Det öppnar också möjligheten för ytterligare utredning av NVU-stammar, kön och åldersskillnader inom samma art och möjligheten att använda andra organismer för BBB biomedicinsk forskning. Vi visar också tecken på en lyckad användning av denna microvessel-isoleringsmetod för att kvantifiera förändringar i protein uttrycks nivåer under neuroinflammation (figur 8). Även om vi utfört detta experiment som ett proof-of-koncept, den metod som används här är för närvarande i stor utsträckning utnyttjas i vårt laboratorium. Vi gynnar detta tillvägagångssätt jämfört med andra kvantitativa metoder (t. ex. Western blot) eftersom vi vill fokusera inte bara på uttrycksnivån utan relativt protein överflöd, omlokalisering av CXCL12 och andra apicobasal proteiner, koppling av av proteiner, etc., inom det komplicerade utseendet av CNS mikrokärl9,13,22. Likaså är vi för närvarande felsökning vår metod för andra tillämpningar, såsom ytterligare isolering av NVU cellulära komponenter (endotelceller och pericyter), RNA-SEQ, och proteomik23,24,25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Dr Cruz-Orengo stöddes av University of California, Davis, skolan för veterinärmedicin starta upp medel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS | ThermoFisher | BP39920 | Used for blocking and antibody diluent. |
| 20% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | Used as fixative (4% PFA) |
| 70,000 MW Dextran | Millipore Sigma | 9004-54-0 | Used for MV-2 solution |
| Adson Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11006-12 | Used for removal of muscle and skin |
| Adson Forceps, student quality | FST | 91106-12 | Same as above but cheaper |
| Bovine serum albumin (BSA) | Millipore Sigma | A7906-100G | Used for MV-3 solution, blocking and antibody diluent |
| Corning 100 μm Cell strainer | Millipore Sigma | CLS431752-50EA | |
| Corning 70 μm Cell strainer | Millipore Sigma | CLS431751-50EA | |
| Corning Deskwork low-binding tips | Millipore Sigma | CLS4151 | Same as below but cheaper. |
| Cultrex Poly-D-Lysine | R&D | 3439-100-01 | Used for slide coating |
| Donkey anti-Goat IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21432 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Mouse IgG-ALEXA 488 | Thermo | A21202 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 488 | Thermo | A21206 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 647 | Thermo | A31573 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rat IgG-DyLight 650 | Thermo | SA5-10029 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Double-Pronged Tissue Pick | FST | 18067-11 | Used for removal of meninges and choroid plexus |
| Dumont #3c Forceps | FST | 11231-20 | Used for more delicate and/or small CNS tissue handling (like pituitary) |
| Dumont #7 Forceps | FST | 11274-20 | Used for CNS tisssue dissection and handling |
| Dumont #7 Forceps, student | FST | 91197-00 | Same as above but cheaper |
| ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Tips | Eppendorf | 22493008 | Better quality than the tips above (more expensive). |
| Extra Fine Graefe Forceps, serrated | FST | 11151-10 | Used for bone removal |
| Fine Scissors, sharp | FST | 14060-09 | Used for removal of pig and macaque dural sac |
| Glass Pestle 1.5 mL Microcentrifuge Tube Tissue Grinder Homogenizer, Pack of 10 | Chang Bioscience Inc. (eBay) | GP1.5_10 | Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Goat anti-CXCL12, biotinylated | PeproTech | 500-P87BGBT | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution: 1:20. |
| Goat anti-JAM-B | R&D | AF1074 | Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 488 | Thermo | A11001 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21424 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-PDGFRβ | R&D | AF1042 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Goat anti-Rabbit IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21249 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Rabbit IgG-DyLight 488 | Thermo | 35552 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Rat IgG-DyLight 650 | Thermo | SA5-10021 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Graefe Forceps, curved tip, 1X2 teeth | FST | 11054-10 | Use for nylon filter net holding and shaking |
| HBSS, 1X buffer with calcium and magnesium | Corning | 21-022-CM | Used for MV-1 solution |
| HEPES, 1M liquid buffer | Corning | 25-060-CI | Used for MV-1 solution |
| Isolectin GS-IB4-Biotin-XX | ThermoFisher Scientific (Thermo) | I21414 | Glycoprotein isolated from legume Griffonia simplicifolia that binds D-galactosyl residues of endothelial cell glycocalysx. Used for avian and porcine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| LaGrange Scissors, serrated | FST | 14173-12 | Used for skull dissection and laminectomy (except pig and macaque) |
| Millicell EZ slide 8-well unit | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| Mouse anti-CLDN5 | Thermo | 35-2500 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-GGT1 | Abcam | ab55138 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-Human CD31 | R&D | BBA7 | Used as primary antibody on primate CNS microvessels. Recommended concentration: 16.5 μg/mL. |
| Mouse anti-NFM | Thermo | RMO-270 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-αSMA | Thermo | MA5-11547 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Nylon Filter Net, roll | Millipore Sigma | NY6000010 | Laser-cut to 13 mm diameter filter net discs. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Nylon Filter Nets, 25 mm | Millipore Sigma | NY2002500 | Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Nylon Filter Nets, 47 mm | Millipore Sigma | NY2004700 | Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | ThermoFisher | P36935 | Used to coverslip slides. |
| Rabbit anti-AQP4 | Millipore Sigma | A5971 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rabbit anti-LSR | Millipore Sigma | SAB2107967 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rabbit anti-NG2 | Millipore Sigma | AB5320 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rabbit anti-OSP | Abcam | ab53041 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 1 μg/mL. |
| Rabbit anti-VE-Cadherin | Abcam | ab33168 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rabbit anti-ZO-1 | Thermo | 61-7300 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rat anti-CD31 | Becton Dickinson | BD 550274 | Used as primary antibody for murine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rat anti-GFAP | Thermo | 13-0300 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rat anti-VCAM-1 | Becton Dickinson | BD 553329 | Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Sterile Ringer's Solution, Frog | Aldon Corporation | IS5066 | Used for amfibian anesthesia |
| Streptavidin-ALEXA 555 | Thermo | S32355 | Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500. |
| Streptavidin-ALEXA 647 | Thermo | S32357 | Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500. |
| Surgical Scissors, sharp | FST | 14002-12 | Used for removal of muscle and skin |
| Surgical Scissors, sharp-blunt | FST | 14001-16 | Used for decapitation (except pig and macaque) |
| Swinnex Filter Holder, 13 mm | Millipore Sigma | SX0001300 | Modified by laser-cut. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Swinnex Filter Holder, 25 mm | Millipore Sigma | SX0002500 | Modified by laser-cut. Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Swinnex Filter Holder, 47 mm | Millipore Sigma | SX0004700 | Modified by laser-cut. Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
| Triton X-100 | ThermoFisher | 50-165-7277 | Used for blocking and antibody diluent. |
| Wheaton 120 Vac Overhead Stirrer | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 62400-904 (DWK #903475) | Used for macaque and pig CNS tissues with 55 mL tissue grinder, except hypothalamus and pituitary. |
| Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 10 mL | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 14231-384 (DWK #357979) | Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 55 mL | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 14231-372 (DWK #357994) | Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
References
- Bundgaard, M., Abbott, N. J. All vertebrates started out with a glial blood-brain barrier 4-500 million years ago. Glia. 56, 699-708 (2008).
- Daneman, R., Prat, A.
- Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M.
- Kealy, J., Greene, C., Campbell, M.
- Sweeney, M. D., Kisler, K., Montagne, A., Toga, A. W., Zlokovic, B. V. The role of brain vasculature in neurodegenerative disorders. Nature Neuroscience. 21, 1318-1331 (2018).
- Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back. Physiological Reviews. 99, 21-78 (2019).
- Wilhelm, I., Nyul-Toth, A., Suciu, M., Hermenean, A., Krizbai, I. A.
- O'Brown, N. M., Pfau, S. J., Gu, C. Bridging barriers: a comparative look at the blood-brain barrier across organisms. Genes & Development. 32, 466-478 (2018).
- Cruz-Orengo, L., et al. CXCR7 influences leukocyte entry into the CNS parenchyma by controlling abluminal CXCL12 abundance during autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 208, 327-339 (2011).
- Serres, S., et al. VCAM-1-targeted magnetic resonance imaging reveals subclinical disease in a mouse model of multiple sclerosis. FASEB Journal. 25, 4415-4422 (2011).
- Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
- Sohet, F., et al. LSR/angulin-1 is a tricellular tight junction protein involved in blood-brain barrier formation. Journal of Cell Biology. 208, 703-711 (2015).
- Cruz-Orengo, L., et al. Enhanced sphingosine-1-phosphate receptor 2 expression underlies female CNS autoimmunity susceptibility. Journal of Clinical Investigation. 124, 2571-2584 (2014).
- Dayton, J. R., Franke, M. C., Yuan, Y., Cruz-Orengo, L. Straightforward method for singularized and region-specific CNS microvessels isolation. Journal of Neuroscience Methods. 318, 17-33 (2019).
- Smyth, L. C. D., et al. Markers for human brain pericytes and smooth muscle cells. Journal of Chemical Neuroanatomy. 92, 48-60 (2018).
- Granberg, T., et al. In vivo characterization of cortical and white matter neuroaxonal pathology in early multiple sclerosis. Brain. 140, 2912-2926 (2017).
- Datta, G., et al. Neuroinflammation and its relationship to changes in brain volume and white matter lesions in multiple sclerosis. Brain. 140, 2927-2938 (2017).
- Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging Techniques to Assess Inflammation in Multiple Sclerosis. Neuroscience. 403, 4-16 (2019).
- Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).
- Cornford, E., Hyman, S. Localization of brain endothelial luminal and abluminal transporters with immunogold electron microscopy. NeuroRx. 2, 27-43 (2005).
- Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M.
- Paul, D., Cowan, A. E., Ge, S., Pachter, J. S. Novel 3D analysis of Claudin-5 reveals significant endothelial heterogeneity among CNS microvessels. Microvascular Research. , (2012).
- Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. Journal of Neuroscience Methods. 207, 80-85 (2012).
- Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
- Bourassa, P., Tremblay, C., Schneider, J. A., Bennett, D. A., Calon, F. Beta-amyloid pathology in human brain microvessel extracts from the parietal cortex: relation with cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 137, 801-823 (2019).
- Porte, B., et al. Proteomic and transcriptomic study of brain microvessels in neonatal and adult mice. PLoS One. 12, e0171048 (2017).
