Summary
Målet med denne protokol er at isolere mikrofartøjer fra flere regioner i centralnervesystemet af lissencephalic og gyrencephalic hvirveldyr.
Abstract
Isolering af mikrobeholdere fra centralnervesystemet (CNS) udføres almindeligvis ved at kombinere kortikale væv fra flere dyr, oftest gnavere. Denne fremgangsmåde begrænser forhør af blod-hjerne barrieren (BBB) egenskaber til cortex og tillader ikke individuel sammenligning. Dette projekt fokuserer på udvikling af en isolationsmetode, der gør det muligt at sammenligne den neurovaskulære enhed (NVU) fra flere CNS-regioner: cortex, cerebellum, optisk lap, hypothalamus, hypofyse, hjernestammen og rygmarven. Desuden blev denne protokol, der oprindeligt blev udviklet til murine prøver, med succes tilpasset til brug på CNS-væv fra små og store hvirveldyr, hvorfra vi også er i stand til at isolere mikrofartøjer fra hjernen halvkugle hvid stof. Denne metode, når parret med immunolabeling, giver mulighed for kvantitation af protein ekspression og statistisk sammenligning mellem individer, vævstype, eller behandling. Vi beviste denne anvendelighed ved at evaluere ændringer i protein ekspression under eksperimentel autoimmun hesteencephalitis (EAE), en murine model af en Neuro inflammatorisk sygdom, multipel sklerose. Desuden kan mikrofartøjer isoleret ved denne metode anvendes til downstream-applikationer som qPCR, RNA-SEQ, og Western blot, blandt andre. Selv om dette ikke er det første forsøg på at isolere CNS-mikrofartøjer uden brug af ultracentrifugering eller enzymatisk dissociation, er det unikt i sin adepthed for sammenligning af enkeltpersoner og flere CNS-regioner. Derfor, det giver mulighed for undersøgelse af en række forskelle, som ellers kan forblive uklar: CNS portioner (cortex, cerebellum, optiske lap, hjernestammen, hypothalamus, hypofyse, og rygmarv), CNS vævstype (grå eller hvide stof), individer, eksperimentelle behandlingsgrupper og arter.
Introduction
Vores hjerne er det vigtigste organ i vores krop. Af denne grund, at holde hjernen homøostase trods eksterne faktorer, der kan udløse en afvigelse fra normalitet er en prioritet. Ifølge nogle lærde, omkring 400-500 millioner år siden1, hvirveldyr udviklet, hvad vi nu kender som blod-hjerne barrieren (BBB)2,3. Denne beskyttende "hegn" udøver den største indflydelse på centralnervesystemet (CNS) homøostase og funktioner ved stramt regulere transport af ioner, molekyler, og celler mellem blod og CNS parenchyma. Når BBB er forstyrret, hjernen bliver modtagelig for giftig eksponering, infektion, og inflammation. Derfor, BBB dysfunktion er forbundet med mange, hvis ikke alle, neurologiske og neuroudviklingsmæssige lidelser4,5,6.
Den sofistikerede funktion af BBB tilskrives den unikke CNS mikrovaskulaturen konforme af neurovaskulære enhed (Nvu)2,3. Højt specialiserede endotelceller, pericytes og astrocytiske endefødder er de cellulære komponenter i Nvu2,3. Den ekstracellulære matrix genereret af disse celler er også afgørende for Nvu og BBB fysiologi2,3. Selvom de essentielle cellulære og molekylære bestanddele i Nvu bevares blandt hvirveldyr, rapporteres heterogenitet blandt ordrer og arter7,8. Men, tekniske begrænsninger hindrer vores evne til fuldt ud at overveje disse forskelle i neurobiologi, biomedicinsk, eller Translationel forskning.
På grund af dette, vi udvidet en CNS region-specifikke Micro Vessel-isolation metode til at gøre det gældende for mange arter fra alle fem hvirveldyr grupper: fisk, padder, krybdyr, fugle, og pattedyr. Protokollen er beskrevet til brug på små-lissencephalic-og store-gyrencephalic-hvirveldyr, herunder arter med translationel relevans9. Derudover omfatter vi andre regioner i CNS ikke undersøgt før i denne sammenhæng, men relevant for Neuro fysiologi og med enorme kliniske konsekvenser: hypothalamus, hypofyse, og hvide stof. Endelig testede vi kapaciteten af denne isolationsmetode som et pålideligt værktøj til at identificere ændringer i protein ekspression langs Nvu og/eller BBB9,10,11. Som en proof-of-koncept, viste vi, hvordan man kan bestemme ændringer i VCAM-1 og JAM-B udtryk under EAE ved hjælp af isolations metoden efterfulgt af immunofluorescence.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer i denne undersøgelse er i overensstemmelse med de retningslinjer, der er fastsat af University of California (UC), Davis institutionel dyrepleje og brug udvalg (IACUC). Animal Care på UC Davis er reguleret af flere uafhængige ressourcer og er blevet fuldt akkrediteret af foreningen for vurdering og akkreditering af laboratorium Animal Care International (AAALAC) siden 1966. Porcin CNS væv blev opnået fra UCD Department of Animal Sciences, kød Sciences laboratorium. CNS-væv fra rhesus macaques blev indhentet fra California national Primate Research Center patologi Department (NIH P51OD011107). Ingen anæstesi, eutanasi, eller nekropsy blev udført af laboratoriepersonale på svin og macaques. Der er derfor ingen særlige anbefalinger vedrørende disse spørgsmål.
Bemærk: denne metode blev valideret for flere arter, men den medfølgende protokol svarer mere direkte til mus og ornesæv. Detaljer vedrørende optik lap gælder ikke ved brug af pattedyrs prøver. Alle biofarlige materialer skal håndteres i et passende biosikkerhedsniveau (BSL)-anlæg. Alle akut giftige materialer skal håndteres under en røg hætte. Alt biologisk farligt medicinsk affald og akut giftigt affald skal bortskaffes korrekt.
1. forberedelse
- Forbered løsninger (tabel 1) mindst en dag frem.
Bemærk: det er meget svært at opløse 70 kDa molekylvægt (MW) dextran. Det er mere effektivt at lade opløsningen røre natten dækket med enten paraffin film eller folie. Protokollen kræver anvendelse af to forskellige MV-2-opløsninger afhængigt af den prøve, som er omfattet af undersøgelsen. Den 18% dextran adskiller effektivt myelin fra Micro Vessel pellet, når du udfører protokollen om små lissencephalic prøver. Men, det udvikler en smøre af myelin inden for grænsefladen af CNS-væv fra store gyrencephalic prøver, samt hypothalamus og hypofysen fra små prøver. Dette smøre forhindres ved at bruge 20% dextran. - Forbered godt slides ved at indlæse 50 μL pr. brønd af poly-D-Lysin og lad tørre i 2 timer ved stuetemperatur (RT), fortrinsvis i et biologisk sikkerhedskabinet-klasse 2 (BSC-2). Må ikke over tørre. Skyl to gange med fosfat-bufferet saltvand (PBS), og opbevar det i køleskab, indtil det er klar til brug.
2. CNS-vævs dissektion fra lille Lissencephalic-hvirveldyr
Bemærk: artiklen viser anvendelsen af protokollen på en C57BL6/J, 10 uger gammel, ~ 25 g, mandlig mus.
- Der fremstilles 2 15 mL koniske rør og et 1,7 mL mikrocentrifuge glas med henholdsvis 5 mL og 1 mL af MV-1 opløsning pr. prøve. Hold rørene på isen.
- Bedøvelse
- Anesthetize mus ved intraperitoneal injektion af en ketamin, xylazin, og Acepromazin bedøvelsesmiddel cocktail på 100/10/3 mg pr kg legemsvægt og spray med 70% ethanol. Bekræft anæstesi ved at vurdere fraværet af øjenspalten og pedal reflekser ved at røre et øje og klemme en fod, hhv.
- Bedøvelses duer ved indånding af 5% isofluran ved hjælp af en induktion anæstesi boks.
- Bedøve fisk og frøer i 1% Tricain i enten en fisk bedrift vandtank eller amfibie Ringer's løsning (tabel over materialer), hhv.
- Anæstetize firben ved afkøling ved 4 °C før eutanasi.
- Decapitate dyret med kirurgisk saks, skrælle huden med tang til at udsætte kraniet, og skæres med LaGrange saks gennem foramen magnum (figur 1A).
- Dissekere hjernen ud med en spatel og Overfør til en 15 mL konisk slange med MV-1 opløsning. Hold røret på isen.
- Hent hypofysen fra kraniets Sella turcica med tang og Overfør til et 1,7 ml mikrocentrifuge glas med mv-1 opløsning. Hold røret på isen.
- Fjern huden og musklen for at udsætte rygsøjlen. Skær lemmer, rib bur, og indre organer (figur 1B).
- Dissekere rygmarven ved en af de to metoder, der er beskrevet nedenfor. Derefter overføres til et 5 mL konisk rør med MV-1 opløsning. Hold røret på isen.
- Udfør laminektomi ved at skære i en rostral Columns til hale retning med LaGrange saks, der starter gennem den cervikale vertebrale foramen, indtil de når lænde snoren.
- Udfør skylning i en hale til rostral Columns retning i hele lændehvirvelsøjlen vertebrale foramen med en 18 G nål og 10 ml sprøjte lastet med mv-1 opløsning (figur 1C, D).
Bemærk: denne metode virker kun med meget små prøver, for det meste gnavere (< 100 g).
- Brug et dissekting område, skær dural SAC fra rygmarven med fjeder saks og fjerne de resterende meninges med en dobbelt-strenget pick (figur 2).
- Overføre hjernen til en Petri skål og, ved hjælp af en dissekting anvendelsesområde, fjerne meninges med en dobbelt-strenget pick (figur 2a – C).
- Punktafgiftspligtige pærer og thalamus med tang, iris saks og fjeder saks. Brug dobbelt-strenget pick, fjerne chorioideus plexus fra alle hjernens ventrikler. Sørg for at fjerne alle chorioideus plexus.
Bemærk: den chorioideus plexus og olfaktoriske pærer er en massiv kilde til kontaminering. I modsætning til BBB, disse kapillærer er meget fenestreret og resultaterne af de efterfølgende eksperimenter vil blive kompromitteret, hvis de ikke er fjernet. - Ved hjælp af pincet, adskille de særskilte CNS regioner: cortex, cerebellum, hjernestammen, optisk lap (ikke på pattedyr prøver), og hypothalamus.
3. CNS-vævs dissektion fra et stort Gyrencephalic-hvirveldyr-præparat
Bemærk: denne protokol anvender væv fra svin, som er fremstillet på et slagteri. Derfor er ingen anæstesi, eutanasi eller nekropsy beskrevet eller vist her.
- Transport af Porcin CNS-væv i en 0,946 L (32 oz) histologi beholder fyldt med MV-1 opløsning inde i en iskiste/spand.
- Ved hjælp af en dissekting omfang, fjerne meninges med en dobbelt-strenget pick, pincet, iris saks, og foråret saks fra hver CNS væv. Sørg for at fjerne alle stykker af chorioideus plexus fra hjernens ventrikler.
4. CNS-Vævshomogenisering
Bemærk: det er mere effektivt, når to efterforskere engagere sig i homogenisering proces: en dissekere meninges under Stereoskopet og den anden homogenisering af hakket væv. På denne måde bliver vævene hurtigt vendt tilbage til isspanden og holdt koldt.
- Placer hver CNS-region på en Petri skål med ~ 1 mL MV-1-opløsning. Brug en enkelt kant klinge, hakp vævet for at opnå 1 – 2 mm stykker.
- For en lille hvirveldyr prøve, brug en 100 mm x 20 mm Petri skål.
- For en stor hvirveldyr prøve, brug en 150 mm x 15 mm Petri skål.
- Homogenisering af en lille hvirveldyr prøve (tabel 2 og tabel 3)
- Overfør cortex, cerebellum, hjernestammen, optisk lap og rygmarven til ~ 1 mL MV-1-opløsning i en individuel 10 mL Potter-Elvehjem-glasfiber mølle med en PTFE-Pestle ved hjælp af en overførings pipette. Tilsæt 5 mL MV-1 opløsning og homogenisere hvert væv (~ 10 slagtilfælde). Overføres til individuelle 15 mL koniske rør. Hold rørene på isen.
Bemærk: for et lille hvirveldyr, 5 eller 4, med eller uden optisk lap, er 10 mL Potter-Elvehjem slibemaskiner og 15 mL koniske rør nødvendige. - Overfør hypothalamus og hypofyse med pincet til ~ 100 μL MV-1 opløsning i et individuelt 1,7 mL rør og homogeniser forsigtigt med et glas mikropestle. Skyl hver mikropestle med ~ 1 mL MV-1 opløsning. Hold røret på isen.
Bemærk: for et lille hvirveldyr er der behov for 2 glas mikropestler og 1,7 mL rør.
- Overfør cortex, cerebellum, hjernestammen, optisk lap og rygmarven til ~ 1 mL MV-1-opløsning i en individuel 10 mL Potter-Elvehjem-glasfiber mølle med en PTFE-Pestle ved hjælp af en overførings pipette. Tilsæt 5 mL MV-1 opløsning og homogenisere hvert væv (~ 10 slagtilfælde). Overføres til individuelle 15 mL koniske rør. Hold rørene på isen.
- Homogenisering af et stort hvirveldyr præparat (tabel 4 og tabel 5)
- Brug en overførings pipette til at overføre det hakkede væv til en 55 mL Potter-elve hjem-glasfiber sliber med PTFE-Pestle og Fastgør til overliggende omrører. Tilsæt halvdelen af den anbefalede volumen af MV-1-opløsning i henhold til den specifikke CNS-portion, der er homogeniseret (tabel 5).
- Tænd for den overliggende omrører ved meget lav hastighed (~ 150 rpm) og bevæg forsigtigt glasrøret op og ned i ca. 30 s.
- Sluk for omrører, tilsæt mere MV-1-opløsning, og Gentag trin 4.3.2, indtil du får en homogen gylle.
- Overføres til et 50 mL konisk rør. Hold røret på isen.
- Vask kværnen med deioniseret vand mellem hver CNS-vævshomogenisering.
Bemærk: for et stort hvirveldyr 5 eller 4, med eller uden hvidt stof, er der behov for 50 mL koniske rør. Ligeledes, to (2) 15 mL koniske rør er nødvendige for hypothalamus og hypofyse.
5. rensning af mikrofartøj
- Centrifuge vævet homogeniseres som følge af trin 4.2.1, 4.2.2 eller 4.3.4 ved 2.000 x g i 10 minutter ved 4 °c. En stor hvid grænseflade af myelin vil danne på toppen af de rødlige mikrofartøjer ' pellets. Kassér Supernatanterne.
- Lille hvirveldyr prøve (tabel 2 og tabel 3)
- Resuspension af cortex, cerebellum, hjernestammen, optiske lap og rygmarv pellets i 5 mL is-Cold MV-2 opløsning med en 5 mL serologisk pipette (~ 10 flushes). Tilsæt 5 mL iskold MV-2-opløsning til hver suspension, og bland forsigtigt ved at vende rørene.
- Resuspension hypothalamus og hypofyse pellets med 1 mL MV-2 opløsning.
- Store hvirveldyr prøve (tabel 4 og tabel 5)
- Tilsæt 20 mL iskold MV-2-opløsning til cortex, cerebellum, hjernestammen og rygmarven mikrofartøj pellets. Resuspendere pellets ved at blande på en tube revolver Shaker, omrøring ved 40 rpm for ~ 5 min. balance de koniske rør ' volumener af cortex, cerebellum, hjernestammen, og rygmarvs suspensioner ved at tilføje mere MV-2 opløsning.
- Resuspension hypothalamus og hypofyse mikrofartøj pellets i 5 mL MV-2 opløsning med en 5 mL serologisk pipette (~ 10 flushes). Tilsæt 5 mL iskold MV-2-opløsning til suspensionerne, og bland forsigtigt ved at vende røret.
- Lille hvirveldyr prøve (tabel 2 og tabel 3)
- Centrifugeres ved 4.400 x g i 15 minutter ved 4 °c.
- Fjern forsigtigt det tykke og tætte myelin-lag på den flydende grænseflade fra hvert rørs vægge ved langsomt at rotere rørene og lade supernatanten passere langs væggene.
- Kassér myelin-og Liquid-grænsefladen, og sæt den indvendige væg af hvert rør med en spatel, der er pakket med en tør papirserviet. For små hvirveldyr prøver, fjerne myelin lag fra hver hypothalamus og hypofyse røret ved at suse forsigtigt med en overførsel pipette.
- Tør overskydende væske ud med en snoet papirserviet med lav fnug. Resuspendér hver pille med 1 mL MV-3-opløsning ved hjælp af lavbindings spidser. Hold rørene på isen.
6. eluering og filtrering af mikrofartøj
- Hæld iskold MV-3 opløsning i de enkelte bægre for hver CNS-region. Opbevares ved 4 °C.
- Til små hvirveldyr skal du bruge 10 mL MV-3-opløsning pr. 50 mL bægerglas. I alt 6 – 7 bægre er nødvendig, afhængigt af om den optiske lap er inkluderet eller ej.
- Ved store hvirveldyr anvendes 30 mL MV-3-opløsning pr. 100 mL bægerglas. I alt 6 – 7 bægre er nødvendig afhængigt af, om der medfølger hvidt stof eller ej.
- Placer en cellefilter oven på et 50 mL konisk rør. Brug en pr. CNS-region. Brug en 100 μm si til cortex, brainstorm, optisk lap, rygmarv, og hypofyse. Brug en 70 μm cellefilter for cerebellum og hypothalamus.
- Våd hver si med 1 ml iskold mv-3 opløsning.
- Tilsæt mere MV-3-opløsning til de suspensioner, der er forberedt i trin 5,5 med en serologisk pipette under blanding for at undgå aggregater. Læg forsigtigt mikrobeholdere oven på sien. Skyl med Ice-Cold MV-3 opløsning.
- For små hvirveldyr prøver (tabel 2 og tabel 3) tilsættes 10 – 15 ml mv-3 opløsning med en serologisk pipette og SKYLLES med 5 ml mv-3 opløsning.
- For store hvirveldyr tilsættes 20 mL MV-3-opløsning med en serologisk pipette, og der skylles med 10 mL MV-3-opløsning.
- Filtrerings enheden monteres ved at anbringe et 20 μm nylon Netfilter på en modificeret filterholder (figur 2D), en pr. CNS-region.
- For små hvirveldyr prøver (tabel 2 og tabel 3), brug 25 mm modificerede filterholdere til cortex, cerebellum, hjernestammen, optiske lap, og rygmarven. Brug 13 mm modificeret filterholdere til hypothalamus og hypofyse.
- For store hvirveldyr (tabel 4 og tabel 5), brug 47 mm modificeret filterholdere til cortex, cerebellum, hjernestammen og rygmarven. Brug 25 mm for hypothalamus og hypofyse.
- Placer filteret oven på et 50 mL konisk rør og vådt filter med 5 mL is-kold MV-3-opløsning, og sørg for, at buffer hælder filterholderen ned til det koniske rør.
- De eluede mikrobeholdere overføres (fra trin 6,4) oven på det 20 μm nylon Netfilter og skylles med 5-10 mL iskold MV-3-opløsning.
- Genopret filteret ved hjælp af rene pincet, og sænk det i bægerglasset, som indeholder den iskold MV-3-opløsning, der er fremstillet i trin 6,1.
- Fjern mikrokarrene fra filteret ved at ryste det forsigtigt i ca. 30 s. For små hvirveldyr, hæld bæger indholdet i et 15 mL konisk rør. For store hvirveldyr, hæld bæger indholdet i et 50 mL konisk rør.
- Der centrifugeres ved 2.000 x g i 5 minutter ved 4 °c, og pellet opslæmmes i 1 ml is-kold mv-3-opløsning ved hjælp af en lavbindende pipettespids.
- For små hvirveldyr bør suspensionen (fra trin 6,10) overføres til et 1,7 mL mikrocentrifuge glas og centrifugeres ved 20.000 x g i 5 minutter ved 4 °c.
Bemærk: dette spin udføres på en stationære centrifuge ved maksimal hastighed (~ 20.000 x g) for at sikre et robust udbytte. - For store hvirveldyr, Overfør suspensionen fra trin 6,10 til et 5,0 mL mikrocentrifuge glas, tilsæt 4 mL MV-3 opløsning, og centrifugeres ved 2.000 x g i 5 min ved 4 °c.
- For små hvirveldyr bør suspensionen (fra trin 6,10) overføres til et 1,7 mL mikrocentrifuge glas og centrifugeres ved 20.000 x g i 5 minutter ved 4 °c.
7. immun farvning
Bemærk: Hematoxylin og eosin (H & E) farvning blev udført på krybdyr, amphibian, og fisk prøver som en proof-of-koncept af protokollen gennemførlighed. Derfor er der ingen anbefaling for immunolabeling for disse prøver.
- Fjern supernatanten fra mikrocentrifuge rørene.
- Resuspension af pellet i 1x sterile PBS ved hjælp af en lav-binding pipettespids (tabel over materialer). Opbevar mikroskibene i at danne aggregater ved pipettering flere gange. For små hvirveldyr prøver (tabel 3), brug ~ 100 μl-2000 μl i henhold til pellet størrelse. For store hvirveldyr (tabel 5) anvendes ~ 1.000 μl – 4000 μl i henhold til pellet størrelsen.
- Ved hjælp af en lav-binding pipettespids, overføre mikroskibene til godt glider, at være omhyggelig med at tilføje dem til midten af hver brønd, undgå sidevæggene.
- Sæt brøndene, afdækket, inde i en BSC-2, og lad tørre i 20 til 30 min på RT.
Bemærk: en relativ stor mængde 1x PBS bruges til at undgå aggregat dannelse. På grund af dette, er det nødvendigt at lade glider tørre før fiksering for at sikre, at mikroskibene bliver holdt af poly-D-lysin belægning. - Fjern resterende 1x PBS ved pipettering ud med en overførings pipette tilsættes 200 μL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) og Inkuber i 30 minutter ved RT.
- Afpipettér den fiktionative opløsning og vask 3x med 200 μL 1x PBS i 5 minutter ved RT.
Bemærk: H & E farvning på fisk, padder, og krybdyr CNS mikrofartøjer blev udført på dette punkt. - Tilsæt 200 μL blokerende buffer til brønden og Inkuber i 60 min ved 37 °C.
- Fjern blokerings bufferen med en overførings pipette, og tilsæt 200 μL af den primære antistof cocktail i antistof fortynder (tabel over materialer). Inkuber ved 4 °C natten over.
- Pipette ud den primære antistof cocktail og vask 3x med 200 μL 1x PBS i 5 min ved RT.
- Indlæs den sekundære antistof cocktail (tabel over materialer) fortyndet i 1x PBS og Inkuber i 2 timer ved rt, beskyttet mod lys.
- Pipette ud den sekundære antistof cocktail og vask 3x med 200 μL 1x PBS i 5 min ved RT, beskyttet mod lys. Efter den sidste vask løsnes brøndens ramme og tør enhver overskydende 1x PBS med en tør fnug papir.
- Tilsæt en dækseddel, flydende antifade mellem middel og 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) til nuklear farvning. Lad tørre natten over på RT beskyttet mod lys.
- Når den er tør, holdes den beskyttet mod lys på en slide boks ved 4 °C, indtil den er klar til Konfokal mikroskopi og dataopsamling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikrofartøjer isoleret fra murine CNS viste alle iboende cellulære komponenter i den neurovaskulære enhed2,3. Ved hjælp af enten trombocyttal endotel celle adhæsions molekyle-1 (pecam, også kendt som CD31) eller isolectin IB4 (et glykoprotein, der binder endotel celle glycocalyx) for endotelceller, trombocytafledt vækstfaktor-β (pdgfrβ) eller neuron-glial antigen 2 (NG2) for pericytes og aquaporin-4 (AQP4) for astrocytiske fødder (figur 3a, B) viser, at disse iboende komponenter er til stede i isolerede mikrobeholdere. CNS-regioner synlige omfatter de kortikale mikrobeholdere (figur 3B), cerebellum (figur 3C), hypofyse (figur 3D), hypothalamus (figur 3E), hjernestammen (figur 3F) og rygmarv (figur 3G). Alle viste udtryk for disse kanoniske markører.
På samme måde viste mikroskibene udtryk for klæber Junction protein VE-cadherin (figur 4A, C), tætte samlings proteiner claudin-5 og zonula OCCLUDENS-1 (CLDN5 og zo-1, figur 4a, D), Tricellulære Junction protein Angulin-1 (figur 4a, E) og apicobasal markører C-X-C Motif chemokine LIGAND 12 og gamma-Glutamyltransferase 1 (CXCL12 og GGT1, figur 4a, F). Disse fund er relevante, fordi disse proteiner er indikatorer for pivotale BBB-specifikke egenskaber9,12,13,14. En begrænset tilstedeværelse af astrocytter, oligodendrocytter, og neuroner, der udtrykker glialfibrillært syreholdigt protein (GFAP, figur 4b, C, g), oligodendrocyt specifikt protein (OSP, figur 4b, g) og Neuro filament-medium (NFM, figur 4b, H), viser henholdsvis, at isolerede mikrobeholdere havde ubetydelige spor af uønskede ikke-neurovaskulære enheds celler. Desuden var størstedelen af mikroskibene blottet for udtryk for α-Smooth muskel actin (αSMA, figur 5B, C). Dette er relevant, fordi αsma er en markør for glatte muskelceller forbundet med arterioler og venoler (figur 5a), hvilket indikerer, at denne isolations protokol selektivt er rettet mod små kaliber mikrofartøjer15.
Mikrofartøjer fremstillet af andre små lissencephalic-hvirveldyr har nogle morfologiske egenskaber, som ses i fisk (frø og firben ikke vist) og aviær mikrofartøjer. Dette tyder på, at denne metode er nyttig til yderligere karakterisering af forskelle i NVU mellem arterne (figur 6). Desuden viste aviær CNS-mikrofartøjer (figur 6H – N) krydsreaktivitet med mange af de antistoffer, som er udviklet til mennesker og mus. Dette tilskynder til yderligere undersøgelser af aviær prøver til biologiske og biomedicinske BBB-undersøgelser. Vi observerede lignende resultater, når vi isolerede mikrobeholdere fra svin og makaques, to gyrencephalic arter (figur 7). Der vises kun NVU-kanoniske markører i Porcin mikrofartøjer. Ud over de førnævnte CNS-regioner var vi i stand til at isolere mikrofartøjer fra periventrikulært hvidt stof (figur 7B). Dette er relevant, fordi hvide stof er impliceret i neuroinflammatoriske tilstande (f. eks multipel sklerose16,17,18).
Vi ønskede at finde ud af, om denne metode kan bruges som et pålideligt værktøj til at bestemme ændringer i protein ekspression. Vel vidende, at VCAM-1 og Jam-B har været impliceret i den neuroinflammatoriske proces på rygmarven under EAE, vi besluttede at kvantificere ekspression af disse proteiner på Peak og kroniske stadier af EAE og Sham-Control mus (10 uger gamle C57BL/6j mus)9,10,11. For at gøre dette målte vi den vilkårlige enhed af intensitet (AUI) langs mikrofartøjs diameteren. Ved hjælp af en tærskel på ≤ 20 AUI for DAPI beregnede vi arealet under kurven (AUC) for VE-cadherin, VCAM-1 og JAM-B for 50-mikrofartøjer pr. CNS-region (figur 8a, B). Endelig udførte vi to-vejs ANOVA efterfulgt af Sidaks post-hoc test for at bestemme den statistiske signifikans af ændringer i protein ekspression.
Som forventet observerede vi en stigning i VCAM-1 og JAM-B langs rygmarvs mikrofartøjer under toppen af EAE (figur 8D, E). Vi observerede dog ændringer i andre CNS-regioner, som ikke tidligere er indberettet for EAE. VCAM-1 signifikant øget i hypofyse mikrofartøjer og faldt i hypothalamus og hjernestammen mikrofartøjer. Der var ændringer under kronisk EAE i alle CNS-væv (figur 8D). JAM-B steg signifikant i hypothalamus og hypofyse mikrofartøjer under kronisk EAE (figur 8E). Interessant, vi observerede ændringer i ve-cadherin langs mikrofartøjer isoleret fra hypothalamus og hjernestammen under toppen af EAE, cerebellum under kronisk EAE (figur 8C), og et fald i hypofyse Micro Vessel bredde under peak og kronisk EAE. Samlet set tyder disse data på, at denne metode til mikrofartøjs isolation er et nyttigt redskab til at karakterisere ændringer i regionale protein udtryks mønstre under sundhed og sygdom.
Figur 1: effektiv rygmarv dissektion uden laminektomi. Dissektion af rygmarven fra små hvirveldyr prøver (op til 100 g) udføres hurtigere og mere effektivt ved at skylle ledningen i en hale til rostral Columns retning i hele vertebrale foramen. Ved hjælp af dissekere saks hovedet fjernes af Atlas leddet og rygsøjlen skæres ud af hofte (A). Alle remaing organer fjernes, forlader kun rygsøjlen (B). Rygmarven i lænde hvirvelbar vertebrale foramen fremstår som en meget lille hvid cirkel (< 1 mm diameter) sammenlignet med bredden af Cervixledningen (B, gule pile). Ved at holde en smal åbning ved lænde hvirvelbar vertebrale foramen lettes en trykgradient fra lænden til halshvirvelsøjlen, når der rødmen med en 18 G nål og 10 CC sprøjte lastet med 1x PBS (C og D). Når det er skyllet, er rygmarven (D, gul pil) næsten helt henlagt til dural SAC, og kun Pia skal fjernes under den dissekting rækkevidde. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: dobbelt-strenget pick dissekere værktøj og modificeret filterholder. Dette 11 cm lange dissekere-værktøj (A) har to meget skarpe, næsten horisontalt modsatrettede punkter, 2 mm spids-til-spids (B). Ved at anvende forsigtigt nedadgående tryk og dreje lidt i urets retning (C) indlejrer punkterne sig horisontalt i meningerne, så de kan løftes opad. Dette er især nyttigt, når du fjerner meninges fra cerebellum, fordi det giver adgang til dybden af cerebelli Folia. Det er også meget nyttigt, når du fjerner meninges fra kortikale væv, især gyrencephalic. I dette tilfælde er Pia meget indlejret med høj kaliber vaskulatur, der vil kompromittere renheden af microsevessel isolation. Ligeledes, det letter fjernelsen af chorioideus plexus, som er den mest sandsynlige kilde til kontaminering. Filter holdere på 47 mm, 25 mm og 13 mm diameter var laserskårne for at fjerne indløbs stikket (D) fra det øverste rum (E), men Behold sigte komponenten (G). Denne ændring tillod montering af en filterenhed (I,J) ved at placere 20 μm nylon filternet over sigte og bund del (G,H), hvilket sikrer, at nettet er på plads, når man skruer den øverste del (E). Kun 25 mm filterholderen vises. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Mikrofartøjer isoleret fra flere CNS-regioner udtrykte kanoniske neurovaskulære enheds markører. (A) ved hjælp af immunolabeling og konfokal mikroskopi anvendes de iboende cellulære komponenter i Nvu til at identificere voksne (8 – 14 uger gamle C57BL/6j) MURINE CNS-mikrobeholdere. Som det ses på fusionens billede for kortikale mikrobeholdere (B), over de individuelle konfokale billeder for endotel cellemarkør CD31 (hvid), pericyte markør PDGFRβ (rød), og astrocytiske ENDEFØDDER markør AQP4 (grøn) alle disse cellulære komponenter bevares. Bemærk, at det intime forhold mellem endotelceller og pericytes får dem til at fremstå magenta på det fusionerede billede, mens de astrocytiske endefødder synes at have en Halo omkring dem (B). Det samme udtryk mønster er observeret for cerebellum (C), hypofyse (D), hypothalamus (E), hjernestammen (F), og rygmarven (G, dapi, nuklear plet = blå; skala bar = 10 μm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Mikrofartøjer udtrykte proteiner forbundet med BBB-specifikke egenskaber. Endotelceller i neurovaskulære enheder (NVU) er også beskrevet af proteiner, der er forbundet med deres iboende barriereegenskaber (A). Som det ses i figuren, endotelceller har kryds lavet af VE-cadherin, CLDN5, ZO-1 (a, gul), og angulin-1 (a, Teal). De udviser også apicobasal polaritet til flere proteiner, herunder GGT-1 og CXCL12 (A, grøn og rød). Neuroner, oligodendrocytter, og astrocyt-celle organer kan indgå i de isolerede mikrobeholdere, selv om de ikke er iboende til NVU (B). Disse er identificerbare ved ekspression af henholdsvis NFM (rød), OSP (cyan) og GFAP (lime Green) (B). I overensstemmelse med disse, vores isolerede mikrofartøjer udtrykte klæber protein VE-cadherin (C, rød), stramme Junction proteiner CLDN5 og zo-1 (D, rød og grøn, henholdsvis fusionere = gul), TRICELLULÆRE Junction protein LSR (E, grøn), og APICOBASAL markører CXCL12 og GGT1 (F, rød og grøn, henholdsvis). De udviste også begrænsede mængder af GFAP (A, grøn, g, hvid), OSP (G, grøn) og NFM (H, rød), hvilket tyder på ubetydelig tilbageholdelse af ikke-neurovaskulære enheds celler (dapi, nuklear bejdset = blå; skala stang = 10 μm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: de fleste isolerede mikrobeholdere udtrykker ikke αSMA. Den neurovaskulære enhed udviser en sofistikeret overgang fra arteriole-kapillær-venule (a). αSMA anular udtryk klart identificerer arterien, og da det bliver kapillar, αSMA (B, rød) udtryk mindsker, udsætter vægmaleri markør NG2 (b, grøn). Vi målte diameteren af αSMA + og αSMA-fartøjer (hvide beslag, n = 20), for at skelne dem som arterioler eller kapillærer (DAPI, nuklear bejdsning = blå, skala bar = 10 μm). Uparret t-test analyse af diameteren af αSMA + og αSMA-fartøjer viste en høj Statistisk signifikans (C, αsma + = rød, αsma-rød/grøn, * * * * p < 0,0001). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: vellykket isolering af CNS-mikrofartøjer fra andre lissencephalic-arter. CNS blev høstet fra en vild fanget frø (8,2 cm), firben (12,7 cm), tank-hævede regnbueørred (2 år gammel, 35,6 cm), og volierende-hævet Due (9 måneder gamle, ~ 300 g). Mikroskibene fra frøen, fisken og firben blev plettet af H & E (kun mikrofartøjer fra ørred vises, Scale bar = 20 μm). Dueslag var immunolabeled. Vi var i stand til at identificere mikrofartøjer på alle regioner som mærket på fisk og Due CNS konturer: Cortex (A og H), optik lap (B og I), cerebellum (C og J), hypofyse (D og L), hypothalamus (E og K), hjernestammen (F og M), og rygmarven (G og N). Derudover var vi i stand til at identificere endotelceller med isolectin IB4 (hvid), astrocytiske endefødder med AQP4 (grøn) og tilstødende neuroner med NFM (rød) fra duens isolerede mikrofartøjer (DAPI, Nuclear Stain = blå, Scale bar = 10 μm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: isolering af CNS-mikrofartøjer fra gyrencephalic-arter. Hjernen og rygmarven blev dissekeret fra en gård-hævet gris (~ 6 måneder gamle, ~ 120 kg) for tumormikrokar isolation og immunolabeling. Vi var i stand til at identificere mikrofartøjer positivt mærket for IB4 (hvid), PDGFRβ (rød), og AQP4 (grøn) på alle regioner af Porcin CNS: Cortex (A), periventrikulært hvidt stof (B), cerebellum (C), hypofyse (D), hypothalamus (E), hjernestammen (F), og rygmarven (G, dapi, atomar plet = blå, skala bar = 10 μm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: eksempel på anden anvendelse af isolation af CNS-mikrofartøj. Udtryk for JAB-B og VCAM-1 blev kvantificeret for murine EAE-mikrofartøjer. Vilkårlige enheder af intensitet (AUI) blev målt for cortex, cerebellum, hypothalamus, hypofyse, hjernestammen og rygmarven af mus i Peak og kroniske stadier af EAE, med Sham som kontrol (n = 4). For hver CNS-region blev 12 mikrofartøjer evalueret pr. mus for at bestemme AUI pr. fluorchrom og mikrofartoejets diameter (A). Hvide beslag viser eksempler på det confokale mikroskop software måleværktøj, der bruges til at bestemme AUI for VCAM-1 (hvid), VE-cadherin (grøn), JAM-B (rød) og DAPI (blå, skaleringsbar = 10 μm). Derefter blev den resulterende AUI plottet mod diameteren i mikron (B) at beregne arealet under kurven (AUC) for hvert immunolabeled protein som et estimat af protein ekspression. Den gennemsnitlige AUC pr. gruppe blev derefter analyseret af to-vejs ANOVA, efterfulgt af Sidaks efterfølgende test, for i alt 48 mikrofartøjer pr. CNS-region. Bortset fra de hypofyse mikrobeholdere observerede vi ingen større forskelle mellem mikrofartøjs diameteren forbundet med sygdomsstatus (c, INSERT), men et signifikant fald i ve-cadherin-ekspression fra hypothalamus og brainstorm i EAE-mus (c). Tilsvarende statistisk analyse viste en signifikant stigning for VCAM-1 (D) og Jam-B (E) ved rygmarven, i overensstemmelse med neuroinflammatorisk status under toppen af EAE. Interessant, vi også observeret ændringer for VCAM-1 på hypothalamus, hypofyse, og hjernestammen. Disse resultater er under efterforskning (sorte bjælker og prikker = Sham, røde bjælker og prikker = peak EAE, laks stænger og prikker = kronisk EAE, * p < 0,05, @p < 0,01, #p < 0,001, og & p < 0.0001). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| MV-1 | 10 mM HEPES |
| i 1x Hank's afbalancerede saltopløsning (HBSS) med calcium og magnesium | |
| MV-2 | 18% 70 kDa molekylvægt (MW) dextran |
| i 10 mM HEPES/HBSS (MV-1) | |
| MV-2 | 20% 70 kDa MW dextran |
| i 10 mM HEPES/HBSS (MV-1) | |
| MV-3 | 1% bovint serumalbumin (BSA) |
| i 10 mM HEPES/HBSS (MV-1) | |
| Fiksativ | 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) |
| i 1x fosfat-bufferet saltvand (PBS) pH 7,4 | |
| Vask buffer | 1x PBS pH 7,4 |
| Permeabilisering & blokerende buffer | 10% BSA |
| 0,25% nonionisk overfladeaktivt stof | |
| i 1x PBS pH 7,4 | |
| Antistof-fortyndingsmiddel | 5% BSA |
| 0,25% nonionisk overfladeaktivt stof | |
| i 1x PBS pH 7,4 |
Tabel 1: løsninger, der anvendes i protokollen.
| Trin (r) | Handling |
| 4,1 og 4.1.1 | Hakning i MV-1 opløsning med en enkelt kant klinge |
| 4,2 til 4.2.2 | Homogeniser i MV-1 opløsning ved hjælp af en Potter-ELVJ PTFE eller Micro tube Pestle |
| 5,1 | Spin ved 2.000 x g, 4 °c, 10 min |
| 5.1.1 til 5.1.1.2 | Resuspension af pellet i MV-2 opløsning |
| 5,2 | Spin ved 4.400 x g, 4 °c, 15 min |
| 5,3 til 5,5 | Resuspension af pellet med 1 mL MV-3 opløsning |
| 6,2 til 6.4.1 | Elute over et 50 mL konisk rør gennem en celle si og skyl med MV-3 opløsning |
| 6,5, 6.5.1, 6,6 og 6,7 | Filter med et 20 μm nylon net på den modificerede filterholder |
| 6,8 | Sæt nylon nettet i 50 mL bægerglas med 10 mL MV-3 opløsning og ryst i 30 s |
| 6,9 til 6,10 | Decant i et 15 mL konisk rør og spin ved 2.000 x g, 4 °c, 5 min |
| 6,10 | Resuspension i 1 mL MV-3 opløsning |
| 6.10.1 | Overfør til et 1,7 mL mikrorør og spin ved 20.000 x g, 4 °c, 5 min |
| 7,1 til 7,3 | Resuspension i 1x PBS og indlæse i godt slides |
Tabel 2: layout for små hvirveldyr mikrofartøjer isolation. Dette diagram er en forkortet version af protokollen, når der anvendes en lissencephalic-prøve.
| Trin (r) | Løsning | Handling | CTX | Cbl | Vælge | Bst | Sc | HYP | Pit |
| 4,1 | MV-1 | Mince på fad | 100 mm x 20 mm Petri skål, 1 mL | Nielsen | |||||
| 4.2.1 og 4.2.2 | MV-1 | Homogenisere | 5 mL, 10 mL Potter-elve hjem med Pestle | 1 mL, mikropestle | |||||
| 5.1.1.1 og 5.1.1.2 | MV-2 | Insulinet opblandes | 5 mL + 5 mL, 18% dextran | 1 mL, 20% dextran | |||||
| 5,5 og 6.4.1 | MV-3 | Insulinet opblandes | 1 mL + 10-15 mL | 1 mL | |||||
| 6,2 og 6.4.1 | MV-3 | Strainer størrelse | 100 μm | 70 μm | 100 μm | 70 μm | 100 μm | ||
| Skyl | 5 mL | ||||||||
| 6,5, 6.5.1 og 6,7 | MV-3 | Filter størrelse, skyl | 25 mm filter, 10 mL | 13 mm, 5 mL | |||||
| 6,8 | MV-3 | Ryst på bægerglas | 10 mL | ||||||
| 6,10 | MV-3 | Insulinet opblandes | 1 mL | ||||||
| 7,2 | 1x PBS | Insulinet opblandes | 1,5 til 2,0 mL | 0,5 til 1,0 mL | 0,1 til 0,2 mL | ||||
| 7,3 | 1x PBS | Belastning pr. brønd | 200 μL | 100 μL | 25 til 50 μL | ||||
| CTX = cortex, CBL = cerebellum, BST = hjernestammen, OPT = optisk lap (ikke til stede i pattedyr), HYP = hypothalamus, PIT = hypofyse, SC = rygmarv. Anbefalede volumener er for hele vævet fra dyr, der spænder i størrelse fra 20 g (ung mus) til 800 g (voksen rotte). | |||||||||
Tabel 3: anbefalet lydstyrke/størrelse. Dette oplæg har den anbefalede volumen af løsninger til brug af en lille hvirveldyr objekt spænder fra ~ 20-~ 800 g, eller mere specifikt, ~ 25 g mus vises på videoen. Den endelige justering af de nødvendige volumener skal bestemmes af forskeren i henhold til den specifikke mængde vådt væv opnået efter dissektion. Øvelse og fejlfinding anbefales stærkt. CTX = cortex, CBL = cerebellum, BST = hjernestammen, OPT = optisk lap (ikke til stede i pattedyr), HYP = hypothalamus, PIT = hypofyse, SC = rygmarv.
| Trin (r) | Handling |
| 4,1 og 4.1.2 | Mince i MV-1 med en enkelt kant klinge |
| 4,3 til 4.3.4 | Homogeniser i MV-1 løsning ved hjælp af en Potter-elve hjem Grinder med en PTFE Pestle |
| 5,1 | Spin ved 2.000 x g, 4 °c, 10 min |
| 5.1.2 til 5.1.2.2 | Resuspension af pellet i MV-2 opløsning |
| 5,2 | Spin ved 4.400 x g, 4 °c, 15 min |
| 5,3 til 5,5 | Resuspension af pellet med 1 mL MV-3 opløsning |
| 6,2 til 6,4 og 6.4.2 | Elute over et 50 mL konisk rør gennem en celle si og skyl med MV-3 opløsning |
| 6,5, 6.5.2, 6,6 og 6,7 | Filter med et 20 μm nylon net på den modificerede filterholder |
| 6,8 | Indgiv nylon nettet i et 50 mL bægerglas med 30 mL MV-3-opløsning, og ryst i 30 s |
| 6,9 og 6,10 | Decant i et 50 mL konisk rør og spin ved 2.000 x g, 4 °c, 5 min |
| 6,10 | Resuspension i 1 mL MV-3 opløsning |
| 6.10.2 | Overfør til et 5 mL mikrorør og spin ved 2.000 x g, 4 °c, 5 min |
| 7,1 til 7,3 | Resuspension i 1x PBS og indlæse i godt slides |
Tabel 4: layout for store hvirveldyr mikrofartøjer isolation. Dette diagram er en forkortet version af protokollen, når du bruger en gyrencephalic prøve.
| Trin (r) | Solution | Handling | CTX | Cbl | Wm | Bst | Sc | HYP | Pit |
| 4,1 | MV-1 | Mince på fad | 3 − 5 mL | 1 mL | |||||
| 4,3 til 4.3.4 | MV-1 | Homogenisere | 20 − 30 mL, 55 mL Potter-elve hjem med Pestle & overhead omrører | 5 mL, 10 mL Potter-elve hjem med Pestle | |||||
| 5.1.2 til 5.1.2.2 | MV-2 | Insulinet opblandes | > 20 mL, 20% dextran | 5 mL + 5 mL, 20% dextran | |||||
| 5,5, 6,4 og 6.4.2 | MV-3 | Insulinet opblandes | 1 mL + 20 mL | 1 mL + 10 mL | |||||
| 6,2 og 6.4.2 | MV-3 | Strainer størrelse | 100 μm | 70 μm | 100 μm | 70 μm | 100 μm | ||
| Skyl | 10 mL | ||||||||
| 6,5, 6.5.2 og 6,7 | MV-3 | Filter størrelse, skyl | 47 mm filter, 10 mL | 25 mm, 10 mL | |||||
| 6,8 | MV-3 | Ryst på bægerglas | 30 mL | ||||||
| 6,10 og 6.10.2 | MV-3 | Insulinet opblandes | 1 mL + 4 mL | ||||||
| 7,2 | 1x PBS | Insulinet opblandes | 2,0 til 4,0 mL | 1,0 til 2,0 mL | |||||
| 7,3 | 1x PBS | Belastning pr. brønd | 200 μL | 100 μL | |||||
| CTX = cortex, CBL = cerebellum, WM = hvidt stof, BST = hjernestammen, HYP = hypothalamus, PIT = hypofyse, SC = rygmarv. Anbefalede volumener er for prøver af ~ 45 cm3 for ctx, CBL, BST og SC hele hyp og pit. | |||||||||
Tabel 5: anbefalet lydstyrke/størrelse. Dette oplæg har den anbefalede volumen af løsninger til brug af en stor hvirveldyr prøve. Mere specifikt, det gælder for CNS vævsbiopsier af ~ 45 cm3 for cortex, cerebellum, hvidt stof, hjernestammen, rygmarven, og hele hypothalamus og hypofyse, som vist på videoen. Den endelige justering af de nødvendige volumener skal bestemmes af forskeren i henhold til den specifikke mængde vådt væv opnået efter dissektion. Øvelse og fejlfinding anbefales stærkt. CTX = cortex, CBL = cerebellum, WM = hvidt stof, BST = hjernestammen, HYP = hypothalamus, PIT = hypofyse, SC = rygmarv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BBB omfatter de unikke egenskaber af hjernen mikrovaskulaturen endotelceller kombineret med en sofistikeret arkitektur af stramme, klæber-, "peg-socket"-vejkryds, og vedhæftning plaques kritisk for CNS homøostase2,3,19. Endotelcellernes egenskaber induceres og vedligeholdes af pericytes og de omgivende astroglia-endefods processer2,3,19. BBB mikrovaskulaturen viser polaritet (dvs. det asymmetriske udtryks mønster af proteiner lokaliseret på luminale eller abluminale endotelcellernes overflader)20. Mens dette kan kort definere BBB, i virkeligheden er det stadig en af de mest gådefulde forestillinger i neurovidenskab. For eksempel kan regionale, køn og aldersforskelle inden for Nvu forklare CNS regionale sårbarheder over for traumer, toksicitet, infektion og inflammation, som kan have store kliniske konsekvenser3,5,6. En anden hindring i forståelsen af BBB er forskellene observeret blandt flere taxa7,8. En af de store forhindringer for at forstå og undersøge BBB er netop vanskeligheden i forbindelse med isolering af NVU, der omfatter BBB, mens stadig holde sine barriere-specifikke egenskaber14.
I et forsøg på at fremskynde vores forståelse af BBB, CNS-regionale forskelle, samt artsforskelle, vi tilpasset tidligere offentliggjorte metoder. Vi har med held tilpasset disse, især Boulay et al.21, at opnå mikrobeholdere fra enkelt kortikale, cerebellare, hypothalamus, hypofyse, hjernestammen, og spinal væv på et utal af lissencephalic små hvirveldyr: fisk, padder, krybdyr, fugle, og pattedyr (figur 3, figur 4, figur 5, og figur 6). En fordel ved denne metode er, at dens tilpasninger er baseret på den samlede størrelse af CNS-væv: forskeren vælger mængden af opløsning, størrelsen af vævs kværn, konisk rør, filterholdere, etc. i henhold til det våde væv, uanset art, køn, og alder. I vores erfaring med immunolabeling, en ~ 20 g prøve giver nok mikrobeholdere til en 8 brønd slide per cortex, cerebellum, optisk lap, hjernestammen, og rygmarven og en halv 8 brønd slide per hypothalamus og hypofyse. Men, udbyttet af kortikale og optiske lap er meget højere i forhold til cerebellum, hjernestammen, og rygmarven.
Som vist, vi udførte de nødvendige tilpasninger til isolation og immunolabeling af CNS-mikrofartøjer af svin og makaque, større gyrencephalic pattedyr, der er mere relevante for Translationel forskning (figur 7). Især var vi i stand til at inkludere periventrikulær hvidt stof på disse arter kun. Da CNS i disse dyr er større, vi indsamlede nok hvidt stof til at tillade os at adskille en mikrofartøj pellet fra myelin lag under den anden centrifugering (trin 5,3, MV-2 med 20% dextran). Vi spekulerer på, at en kritisk masse er nødvendig for at kunne opnå denne adskillelse, og vi er aktivt søger hvordan man får et lignende resultat med murine CNS væv.
Selvom udeladt af hensyn til enkelhed, udførte vi immunolabeling ud over Nvu Canonical markører på aviær, svin, og makak mikrofartøjer. Især alle arter fælles cellulære og molekylære markører tidligere identificeret på murine prøver som relevant for BBB funktion (supplerende proteiner VE-cadherin, CLDN5, ZO-1, og LSR og apicobasal markører CXCL12 og GGT1) eller i nærheden af NVU (NFM, OSP, og GFAP). Igen, disse resultater tilskynde til anvendelse af denne metode på andre arter til yderligere at identificere NVU ortologi og divergens mellem arterne. Det åbner også mulighed for yderligere undersøgelse af NVU stamme, køn, og aldersforskelle inden for samme art og muligheden for at bruge andre organismer til BBB biomedicinsk forskning. Vi viser også tegn på en vellykket anvendelse af denne mikrofartøjs isolationsmetode til at kvantificere ændringer i protein ekspressions niveauerne under neuroinflammation (figur 8). Selv om vi udførte dette eksperiment som en proof-of-koncept, den tilgang, der anvendes her, er i øjeblikket udstrakt udnyttes i vores laboratorium. Vi favoriserer denne tilgang frem for andre kvantitative metoder (f. eks. Western blot), fordi vi ønsker at fokusere ikke kun på udtryks niveauet, men relativ protein tæthed, flytning af CXCL12 og andre apicobasal proteiner, sammenkædning af supplerende proteiner osv., inden for det komplicerede udseende af CNS-mikrofartøjer9,13,22. Ligeledes er vi i øjeblikket fejlfinding vores metode til andre applikationer, såsom yderligere isolering af Nvu cellulære komponenter (endotheliale celler og pericytes), RNA-SEQ, og proteomics23,24,25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dr. Cruz-Orengo blev støttet af University of California, Davis, School of Veterinary Medicine opstart midler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS | ThermoFisher | BP39920 | Used for blocking and antibody diluent. |
| 20% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | Used as fixative (4% PFA) |
| 70,000 MW Dextran | Millipore Sigma | 9004-54-0 | Used for MV-2 solution |
| Adson Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11006-12 | Used for removal of muscle and skin |
| Adson Forceps, student quality | FST | 91106-12 | Same as above but cheaper |
| Bovine serum albumin (BSA) | Millipore Sigma | A7906-100G | Used for MV-3 solution, blocking and antibody diluent |
| Corning 100 μm Cell strainer | Millipore Sigma | CLS431752-50EA | |
| Corning 70 μm Cell strainer | Millipore Sigma | CLS431751-50EA | |
| Corning Deskwork low-binding tips | Millipore Sigma | CLS4151 | Same as below but cheaper. |
| Cultrex Poly-D-Lysine | R&D | 3439-100-01 | Used for slide coating |
| Donkey anti-Goat IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21432 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Mouse IgG-ALEXA 488 | Thermo | A21202 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 488 | Thermo | A21206 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 647 | Thermo | A31573 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rat IgG-DyLight 650 | Thermo | SA5-10029 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Double-Pronged Tissue Pick | FST | 18067-11 | Used for removal of meninges and choroid plexus |
| Dumont #3c Forceps | FST | 11231-20 | Used for more delicate and/or small CNS tissue handling (like pituitary) |
| Dumont #7 Forceps | FST | 11274-20 | Used for CNS tisssue dissection and handling |
| Dumont #7 Forceps, student | FST | 91197-00 | Same as above but cheaper |
| ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Tips | Eppendorf | 22493008 | Better quality than the tips above (more expensive). |
| Extra Fine Graefe Forceps, serrated | FST | 11151-10 | Used for bone removal |
| Fine Scissors, sharp | FST | 14060-09 | Used for removal of pig and macaque dural sac |
| Glass Pestle 1.5 mL Microcentrifuge Tube Tissue Grinder Homogenizer, Pack of 10 | Chang Bioscience Inc. (eBay) | GP1.5_10 | Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Goat anti-CXCL12, biotinylated | PeproTech | 500-P87BGBT | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution: 1:20. |
| Goat anti-JAM-B | R&D | AF1074 | Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 488 | Thermo | A11001 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21424 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-PDGFRβ | R&D | AF1042 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Goat anti-Rabbit IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21249 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Rabbit IgG-DyLight 488 | Thermo | 35552 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Rat IgG-DyLight 650 | Thermo | SA5-10021 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Graefe Forceps, curved tip, 1X2 teeth | FST | 11054-10 | Use for nylon filter net holding and shaking |
| HBSS, 1X buffer with calcium and magnesium | Corning | 21-022-CM | Used for MV-1 solution |
| HEPES, 1M liquid buffer | Corning | 25-060-CI | Used for MV-1 solution |
| Isolectin GS-IB4-Biotin-XX | ThermoFisher Scientific (Thermo) | I21414 | Glycoprotein isolated from legume Griffonia simplicifolia that binds D-galactosyl residues of endothelial cell glycocalysx. Used for avian and porcine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| LaGrange Scissors, serrated | FST | 14173-12 | Used for skull dissection and laminectomy (except pig and macaque) |
| Millicell EZ slide 8-well unit | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| Mouse anti-CLDN5 | Thermo | 35-2500 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-GGT1 | Abcam | ab55138 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-Human CD31 | R&D | BBA7 | Used as primary antibody on primate CNS microvessels. Recommended concentration: 16.5 μg/mL. |
| Mouse anti-NFM | Thermo | RMO-270 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-αSMA | Thermo | MA5-11547 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Nylon Filter Net, roll | Millipore Sigma | NY6000010 | Laser-cut to 13 mm diameter filter net discs. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Nylon Filter Nets, 25 mm | Millipore Sigma | NY2002500 | Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Nylon Filter Nets, 47 mm | Millipore Sigma | NY2004700 | Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | ThermoFisher | P36935 | Used to coverslip slides. |
| Rabbit anti-AQP4 | Millipore Sigma | A5971 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rabbit anti-LSR | Millipore Sigma | SAB2107967 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rabbit anti-NG2 | Millipore Sigma | AB5320 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rabbit anti-OSP | Abcam | ab53041 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 1 μg/mL. |
| Rabbit anti-VE-Cadherin | Abcam | ab33168 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rabbit anti-ZO-1 | Thermo | 61-7300 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rat anti-CD31 | Becton Dickinson | BD 550274 | Used as primary antibody for murine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rat anti-GFAP | Thermo | 13-0300 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rat anti-VCAM-1 | Becton Dickinson | BD 553329 | Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Sterile Ringer's Solution, Frog | Aldon Corporation | IS5066 | Used for amfibian anesthesia |
| Streptavidin-ALEXA 555 | Thermo | S32355 | Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500. |
| Streptavidin-ALEXA 647 | Thermo | S32357 | Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500. |
| Surgical Scissors, sharp | FST | 14002-12 | Used for removal of muscle and skin |
| Surgical Scissors, sharp-blunt | FST | 14001-16 | Used for decapitation (except pig and macaque) |
| Swinnex Filter Holder, 13 mm | Millipore Sigma | SX0001300 | Modified by laser-cut. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Swinnex Filter Holder, 25 mm | Millipore Sigma | SX0002500 | Modified by laser-cut. Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Swinnex Filter Holder, 47 mm | Millipore Sigma | SX0004700 | Modified by laser-cut. Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
| Triton X-100 | ThermoFisher | 50-165-7277 | Used for blocking and antibody diluent. |
| Wheaton 120 Vac Overhead Stirrer | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 62400-904 (DWK #903475) | Used for macaque and pig CNS tissues with 55 mL tissue grinder, except hypothalamus and pituitary. |
| Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 10 mL | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 14231-384 (DWK #357979) | Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 55 mL | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 14231-372 (DWK #357994) | Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
References
- Bundgaard, M., Abbott, N. J. All vertebrates started out with a glial blood-brain barrier 4-500 million years ago. Glia. 56, 699-708 (2008).
- Daneman, R., Prat, A.
- Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M.
- Kealy, J., Greene, C., Campbell, M.
- Sweeney, M. D., Kisler, K., Montagne, A., Toga, A. W., Zlokovic, B. V. The role of brain vasculature in neurodegenerative disorders. Nature Neuroscience. 21, 1318-1331 (2018).
- Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back. Physiological Reviews. 99, 21-78 (2019).
- Wilhelm, I., Nyul-Toth, A., Suciu, M., Hermenean, A., Krizbai, I. A.
- O'Brown, N. M., Pfau, S. J., Gu, C. Bridging barriers: a comparative look at the blood-brain barrier across organisms. Genes & Development. 32, 466-478 (2018).
- Cruz-Orengo, L., et al. CXCR7 influences leukocyte entry into the CNS parenchyma by controlling abluminal CXCL12 abundance during autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 208, 327-339 (2011).
- Serres, S., et al. VCAM-1-targeted magnetic resonance imaging reveals subclinical disease in a mouse model of multiple sclerosis. FASEB Journal. 25, 4415-4422 (2011).
- Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
- Sohet, F., et al. LSR/angulin-1 is a tricellular tight junction protein involved in blood-brain barrier formation. Journal of Cell Biology. 208, 703-711 (2015).
- Cruz-Orengo, L., et al. Enhanced sphingosine-1-phosphate receptor 2 expression underlies female CNS autoimmunity susceptibility. Journal of Clinical Investigation. 124, 2571-2584 (2014).
- Dayton, J. R., Franke, M. C., Yuan, Y., Cruz-Orengo, L. Straightforward method for singularized and region-specific CNS microvessels isolation. Journal of Neuroscience Methods. 318, 17-33 (2019).
- Smyth, L. C. D., et al. Markers for human brain pericytes and smooth muscle cells. Journal of Chemical Neuroanatomy. 92, 48-60 (2018).
- Granberg, T., et al. In vivo characterization of cortical and white matter neuroaxonal pathology in early multiple sclerosis. Brain. 140, 2912-2926 (2017).
- Datta, G., et al. Neuroinflammation and its relationship to changes in brain volume and white matter lesions in multiple sclerosis. Brain. 140, 2927-2938 (2017).
- Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging Techniques to Assess Inflammation in Multiple Sclerosis. Neuroscience. 403, 4-16 (2019).
- Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).
- Cornford, E., Hyman, S. Localization of brain endothelial luminal and abluminal transporters with immunogold electron microscopy. NeuroRx. 2, 27-43 (2005).
- Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M.
- Paul, D., Cowan, A. E., Ge, S., Pachter, J. S. Novel 3D analysis of Claudin-5 reveals significant endothelial heterogeneity among CNS microvessels. Microvascular Research. , (2012).
- Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. Journal of Neuroscience Methods. 207, 80-85 (2012).
- Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
- Bourassa, P., Tremblay, C., Schneider, J. A., Bennett, D. A., Calon, F. Beta-amyloid pathology in human brain microvessel extracts from the parietal cortex: relation with cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 137, 801-823 (2019).
- Porte, B., et al. Proteomic and transcriptomic study of brain microvessels in neonatal and adult mice. PLoS One. 12, e0171048 (2017).
