Summary
该协议的目的是从脑血管和陀螺脊椎动物的中枢神经系统的多个区域分离微血管。
Abstract
从中枢神经系统 （CNS） 分离微血管通常通过结合多只动物（最常见的是啮齿动物）的皮质组织来执行。这种方法将血脑屏障（BBB）特性的询问限制在皮层，不允许进行个体比较。该项目的重点是开发一种隔离方法，允许比较来自多个中枢神经系统区域的神经血管单元（NVU）：皮层、小脑、视叶、下丘脑、脑干和脊髓。此外，最初为鼠类样本开发的这个方案被成功应用于中小脊椎动物的CNS组织，从中我们也能够从大脑半球白质中分离微血管。当与免疫标记配对时，该方法允许对蛋白质表达进行定量，并在个体、组织类型或治疗之间进行统计比较。通过评估实验性自身免疫性脑脊髓炎 （EAE） 期间蛋白质表达的变化，我们证明了这种适用性，这是神经炎疾病多发性硬化症的一种小鼠模型。此外，通过这种方法分离的微容器可用于下游应用，如qPCR、RNA-seq和西体斑点等。尽管这不是第一次尝试在不使用超离心或酶分离的情况下分离CNS微容器，但它在单一个体和多个CNS区域的比较方面的独特之处。因此，它允许调查一系列差异，否则可能仍然模糊： 中枢神经系统部分 （皮质， 小脑， 视叶， 脑干， 下丘脑， 脑垂体， 和脊髓）， CNS 组织类型 （灰色或白色物质）， 个人，实验性治疗组和物种。
Introduction
我们的大脑是我们身体中最重要的器官。因此，保持大脑平衡，尽管外部因素，可能会触发偏离正常是一个优先事项。据一些学者说，大约4亿至5亿年前，脊椎动物发展了我们现在所知的血脑屏障（BBB）2，3。这种保护性"篱笆"通过严格调节血液和中枢神经系统之间的离子、分子和细胞的传输，对中枢神经系统 （CNS） 平衡和功能产生最大的影响。当BBB被打乱时，大脑变得易受毒性暴露、感染和炎症的影响。因此，BBB功能障碍与许多，如果不是全部，神经和神经发育障碍4，5，6相关。
BBB的精密功能归因于神经血管单元（NVU）2，3所符合的独特CNS微血管。高度专业化的内皮细胞、围细胞和星形端脚是NVU2，3的细胞成分。这些细胞产生的细胞外基质对NVU和BBB生理学也至关重要。虽然NVU的基本细胞和分子成分在脊椎动物中保存，但各阶和物种7、8之间报告存在异质性。然而，技术限制阻碍了我们在神经生物学、生物医学或转化研究方面充分考虑这些差异的能力。
因此，我们扩展了CNS区域特定的微容器隔离方法，使其适用于来自所有五个脊椎动物群的众多物种：鱼类、两栖动物、爬行动物、鸟类和哺乳动物。该协议被描述为用于小脑脑和大陀螺脊椎动物，包括具有翻译相关性的物种9。此外，我们包括中枢神经系统的其他地区以前没有在此范围内调查，但与神经生理学相关，具有巨大的临床影响：下丘脑，脑垂体和白质。最后，我们测试了这种分离方法作为识别沿NVU和/或BBB9、10、11的蛋白质表达变化的可靠工具的能力。作为概念验证，我们展示了如何使用免疫荧光之后的隔离方法确定 EAE 期间 VCAM-1 和 JAM-B 表达的变化。
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Protocol
本研究的所有程序均符合加州大学（UC）、戴维斯机构动物护理和使用委员会（IACUC）制定的指导方针。加州大学戴维斯分校的动物护理由多个独立资源监管，自1966年以来一直获得国际实验室动物护理评估与认证协会（AAALAC）的认证。猪中枢神经系统组织从UCD动物科学系，肉类科学实验室获得。来自河河猴的CNS组织从加州国家灵长类研究中心病理学部（NIH P51OD0111107）获得。实验室工作人员对猪和猴没有进行麻醉、安乐死或尸检。因此，没有关于这些事项的具体建议。
注：此方法已验证为多个物种，但所提供的协议更直接地对应于小鼠和猪组织。使用哺乳动物标本时，与视叶有关的详细信息不适用。所有生物有害物质必须在适当的生物安全级别 （BSL） 设施中处理。所有剧毒物质必须在烟罩下处理。所有生物危害性医疗废物和剧毒废物必须妥善处理。
1. 准备
- 至少提前一天准备解决方案 （表 1）.
注：很难溶解70 kDa分子量（MW）dextran。更高效，让溶液搅拌过夜覆盖石蜡膜或箔。该协议要求根据所调查的样本使用两种不同的 MV-2 解决方案。在小脂脑标本上执行协议时，18% dextran 有效地将骨髓从微容器颗粒中分离出来。然而，它开发从大型陀螺仪标本，以及下丘脑和脑垂体从小标本的CNS组织界面内的骨髓涂片。这种涂抹是防止使用20%的dextran。 - 通过每井装载 50 μL 的多 D-流生物，并在室温 （RT） 下干燥 2 小时，最好在生物安全柜 2 级 （BSC-2） 中，从而准备良好的滑轨。不要过度干燥。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗两次，并保存在冰箱中，直到随时使用。
2. 从小脑血管标本的CNS组织解剖
注：本文演示了该协议在C57BL6/J，10周大，+25克，雄鼠标上的应用。
- 制备两个15 mL锥形管和一个1.7 mL微离心管，每个试样分别具有5 mL和1 mL的MV-1溶液。把管子放在冰上。
- 麻醉
- 在每公斤体重为100/10/3毫克的腹肌内注射氯胺酮、木兰辛和丙丙胺麻醉鸡尾酒，用70%乙醇喷洒，对小鼠进行麻醉。通过分别触摸眼睛和捏一只脚来评估没有眼和踏板反射，确认麻醉。
- 使用感应麻醉盒吸入5%的亚非卢兰来麻醉鸽子。
- 分别在鱼缸或两栖环林格溶液（材料表）中麻醉鱼和青蛙，在1%的三合一中麻醉。
- 在安乐死前，通过在4°C下冷却来麻醉蜥蜴。
- 用手术剪刀斩首动物，用钳子剥去皮肤以暴露头骨，用拉格朗日剪刀通过前臂剪刀切割（图1A）。
- 用铲子将大脑挖出来，用MV-1溶液转移到15 mL锥形管中。把管子放在冰上。
- 用钳子从头骨的sella turcica中取回垂体，并转移到带有MV-1溶液的1.7 mL微离心管中。把管子放在冰上。
- 去除皮肤和肌肉以暴露椎骨柱。切掉四肢、肋骨笼和内脏（图1B）。
- 通过下面描述的两种方法之一切除脊髓。然后，使用 MV-1 溶液转移到 5 mL 锥形管中。把管子放在冰上。
- 使用拉格朗日剪刀在玫瑰形刀上切割到牛骨方向，从颈椎前腹开始，直到到达腰线。完成拉皮内切切除术。
- 使用装有 MV-1 溶液的 18 G 针头和 10 mL 注射器在整个腰椎前身进行冲洗，以玫瑰色方向冲洗（图 1C，D）。
注：此方法仅适用于非常小的标本，主要是啮齿动物（<100 g）。
- 使用解剖范围，用弹簧剪刀从脊髓中切下硬囊，并用双管齐下的夹子去除剩余的脑膜（图2）。
- 将大脑转移到培养皿中，并使用解剖范围，用双管齐下的挑子去除脑筋（图2A+C）。
- 用钳子、虹膜剪刀和弹簧剪刀切除嗅觉球茎和丘拉。使用双管齐下的挑，从所有脑心室去除毛囊丛。确保去除所有的毛囊丛。
注：丘风丛和嗅觉球是一个巨大的污染源。与BBB相比，这些毛细血管受到高度的侵害，如果不去除这些毛细血管，后续实验的结果将受到损害。 - 使用钳子，分离不同的中枢神经系统区域：皮层、小脑、脑干、视叶（不在哺乳动物标本上）和下丘脑。
3. 从大陀螺仪标本的CNS组织解剖
注：本协议使用从屠宰场获得的猪中枢神经系统组织。因此，这里没有描述或显示麻醉、安乐死或尸检。
- 将猪中枢神经系统组织装在装有 MV-1 溶液的 0.946 L （32 oz） 组织容器中，装在冰箱/桶内。
- 使用解剖范围，从每个 CNS 组织中用双管齐下的夹子、钳子、虹膜剪刀和弹簧剪刀去除脑膜炎。确保从脑心室中取出任何丘风丛。
4. 中枢神经系统组织均质化
注：当两个调查员参与同质化过程时，效率更高：一个解剖立体镜下的脑膜炎，另一个对切碎的组织进行均质化。这样，组织被迅速返回到冰桶，并保持寒冷。
- 将每个 CNS 区域放在带有 ±1 mL MV-1 溶液的培养皿上。使用单刃刀片，切碎组织以获得 1⁄2 mm 的片件。
- 对于小型脊椎动物标本，使用 100 mm x 20 mm 培养皿。
- 对于大型脊椎动物标本，使用 150 mm x 15 mm 培养皿。
- 小型脊椎动物标本的同质化（表2和表3）
- 将皮层、小脑、脑干、视叶和脊髓转移到单个 10 mL Potter-Elvehjem 玻璃组织磨床中的 MV-1 溶液的 ±1 mL，并使用转移移液器使用 PTFE 纠缠器。加入5 mL的MV-1溶液，使每个组织均质化（+10冲程）。转移到单个 15 mL 锥形管。把管子放在冰上。
注：对于小型脊椎动物，5或4，有或不带视叶，分别需要10mL波特-埃尔维杰姆磨床和15mL锥形管。 - 将下丘脑和脑垂体用钳子转移到单个1.7 mL管中的MV-1溶液+100μL，并小心地与玻璃微虫均匀。用 ±1 mL 的 MV-1 溶液冲洗每个微虫。把管子放在冰上。
注：对于小型脊椎动物，需要2个玻璃微管和1.7 mL管。
- 将皮层、小脑、脑干、视叶和脊髓转移到单个 10 mL Potter-Elvehjem 玻璃组织磨床中的 MV-1 溶液的 ±1 mL，并使用转移移液器使用 PTFE 纠缠器。加入5 mL的MV-1溶液，使每个组织均质化（+10冲程）。转移到单个 15 mL 锥形管。把管子放在冰上。
- 大型脊椎动物标本的同质化（表4和表5）
- 使用转移移液器，将切碎的组织转移到 55 mL 波特-埃尔韦杰姆玻璃组织磨床，带有 PTFE 刺刀，并连接到头顶搅拌器上。根据具体中枢神经系统部分的同质化，添加一半的MV-1溶液推荐体积（表5）。
- 以极低速（±150 rpm）打开头顶搅拌器，并小心地上下移动玻璃管约 30 s。
- 关闭头顶搅拌器，添加更多 MV-1 溶液，并重复步骤 4.3.2，直到获得均匀浆料。
- 转移到 50 mL 锥形管中。把管子放在冰上。
- 在每个 CNS 组织均质化之间用去离子水清洗研磨机。
注：对于大型脊椎动物5或4，有或没有白质，分别需要50 mL锥形管。同样，下丘脑和垂体需要两 （2） 15 mL 锥形管。
5. 微容器净化
- 步骤 4.2.1、4.2.2 或 4.3.4 在 2，000 x g下产生的离心组织均质物在 4°C 下 10 分钟。在红微血管颗粒的顶部将形成一个大的白色界面。丢弃上生物。
- 小型脊椎动物标本（表2及表3）
- 在 5 mL 的冰冷的 MV-2 溶液中，使用 5 mL 血清移液器（±10 冲洗）重新悬浮皮层、小脑、脑干、视叶和脊髓颗粒。在每个悬架中加入5 mL的冰冷的MV-2溶液，并通过翻转管子仔细混合。
- 用1mL的MV-2溶液重新悬浮下丘脑和垂体颗粒。
- 大型脊椎动物标本（表4及表5）
- 在皮层、小脑、脑干和脊髓微血管颗粒中加入20 mL的冰冷的MV-2溶液。通过在管左轮手枪摇杆上混合来重新悬浮颗粒，在40rpm下搅拌±5分钟。 通过添加更多MV-2溶液，平衡圆皮层、小脑、脑干和脊髓悬浮液的锥形管体积。
- 用5mL血清移液器（±10冲洗）在5 mL的MV-2溶液中重新悬浮下丘脑和垂体微血管颗粒。在悬架中加入 5 mL 的冷冷 MV-2 溶液，并通过翻转管进行仔细混合。
- 小型脊椎动物标本（表2及表3）
- 在 4°C 下在 4，400 x g下离心 15 分钟。
- 通过缓慢旋转管，让上清液沿着墙壁穿过，小心地从每个管壁上分离液体界面上的厚而稠密的骨髓层。
- 丢弃骨髓和液体界面，用用低绒纸擦拭包裹的铲子擦拭每个管子的内壁。对于小型脊椎动物标本，通过用转移移液器小心吸吸，从每个下丘脑和垂体管中去除骨髓层。
- 用扭曲的低绒纸擦拭多余的液体。使用低结合尖端，用 1 mL 的 MV-3 溶液重新悬浮每个颗粒。把管子放在冰上。
6. 微容器洗脱和过滤
- 在每个 CNS 区域的单个烧杯中倒入冰冷的 MV-3 溶液。保持在4°C。
- 对于小型脊椎动物标本，每 50 mL 烧杯使用 10 mL 的 MV-3 溶液。根据是否包括视叶，总共需要 6~7 个烧杯。
- 对于大型脊椎动物标本，每 100 mL 烧杯使用 30 mL 的 MV-3 溶液。根据是否包括白质，总共需要 6~7 个烧杯。
- 将细胞滤网放在 50 mL 锥形管的顶部。每个 CNS 区域使用一个。使用100μm滤网治疗皮层、脑干、视叶、脊髓和脑垂体。对小脑和下丘脑使用70μm细胞过滤器。
- 用1 mL的冰冷的MV-3溶液润湿每个滤网。
- 在步骤 5.5 中用血清移液器在混合时为悬架添加更多 MV-3 解决方案，以避免聚集。小心地将微容器加载到滤网顶部。用冰冷的MV-3溶液冲洗。
- 对于小型脊椎动物标本（表2和表3），添加10~15 mL的MV-3溶液，用血清学移液器冲洗5mL的MV-3溶液。
- 对于大型脊椎动物标本，使用血清学移液器添加 20 mL 的 MV-3 溶液，然后用 10 mL 的 MV-3 溶液冲洗。
- 通过在经过修改的过滤器支架上放置一个20μm尼龙网过滤器（图2D），每个CNS区域一个，来组装过滤单元。
- 对于小型脊椎动物标本（表2和表3），使用25毫米改性过滤器支架用于皮层、小脑、脑干、视叶和脊髓。使用 13 mm 改性过滤器支架进行下丘脑和脑垂体。
- 对于大型脊椎动物标本（表4和表5），使用47毫米改性过滤器支架用于皮层、小脑、脑干和脊髓。使用25毫米的下丘脑和脑垂体。
- 将过滤器放在 50 mL 锥形管和湿式过滤器的顶部，并带有 5 mL 的冷冷 MV-3 溶液，确保缓冲液将缓冲液倒入锥形管中。
- 在 20 μm 尼龙网过滤器顶部转移洗净微容器（从步骤 6.4 起），用 5~10 mL 的冷冷 MV-3 溶液冲洗微容器。
- 使用干净的钳子回收过滤器，并将其浸入包含步骤 6.1 中制备的冰冷的 MV-3 溶液的烧杯中。
- 将微容器从过滤器上轻轻摇动约 30 s，将其从滤芯中分离。对于小型脊椎动物标本，将烧杯含量倒入 15 mL 锥形管中。对于大型脊椎动物标本，将烧杯含量倒入 50 mL 锥形管中。
- 在 2，000 x g下在 4°C 下离心 5 分钟，并使用低结合移液器尖端在 1 mL 的冷 MV-3 溶液中重新悬浮颗粒。
- 对于小型脊椎动物标本，将悬浮液（从步骤6.10）转移到1.7 mL微离心管中，并在20，000 x g下离心5分钟，在4°C下。
注：此旋转在台式离心机上以最大速度 （+20，000 x g）执行，以确保强劲屈服。 - 对于大型脊椎动物标本，将缓动液从步骤6.10转移到5.0 mL微离心管中，加入4 mL的MV-3溶液，并在2000 x g下在4°C下离心5分钟。
- 对于小型脊椎动物标本，将悬浮液（从步骤6.10）转移到1.7 mL微离心管中，并在20，000 x g下离心5分钟，在4°C下。
7. 免疫染色
注：在爬行动物、两栖动物和鱼类标本上进行了血氧林和eosin（H&E）染色，作为协议可行性的概念证明。因此，没有建议对这些标本进行免疫标记。
- 从微离心管中取出上清液。
- 使用低结合移液器尖端（材料表）将颗粒重新悬浮在 1x 无菌 PBS 中。通过多次移液，防止微容器形成骨料。对于小型脊椎动物标本（表3），根据颗粒大小使用+100 μL~2，000 μL。对于大型脊椎动物标本（表5），根据颗粒大小使用+1，000μL~4，000μL。
- 使用低结合移液器尖端，将微容器转移到井滑道，小心将它们添加到每个井的中心，避免侧壁。
- 将未覆盖的井幻灯片设置在 BSC-2 内，并在 RT 处干燥 20 到 30 分钟。
注： 相对较高的 1x PBS 体积用于避免聚合形成。因此，在固定之前，必须让滑片干燥，以确保微容器被多D-赖因涂层固定。 - 使用移液器移液去除残留的 1x PBS，加入 200 μL 的 4% 甲醛 （PFA），并在 RT 孵育 30 分钟。
- 移出固定溶液，用 200 μL 的 1x PBS 洗涤 3x，在 RT 下 5 分钟。
注：此时对鱼类、两栖动物和爬行动物CNS微容器进行H&E染色。 - 在油井滑梯中加入200 μL的阻塞缓冲液，并在37°C下孵育60分钟。
- 用转移移液器去除阻塞缓冲液，并在抗体稀释剂（材料表）中加入200μL的原抗体鸡尾酒。在4°C孵育过夜。
- 在RT上，用200μL的1xPBS洗净原抗体鸡尾酒，洗涤3x5分钟。
- 将二次抗体鸡尾酒（材料表）稀释在1xPBS中，在RT孵育2小时，防止光线照射。
- 移出二级抗体鸡尾酒，用200μL的1x PBS洗涤3x，在RT处5分钟，防止光线照射。上次清洗后，用低绒纸擦拭拆下井滑框架并擦拭任何多余的 1x PBS。
- 添加盖玻片、液体抗褪色安装介质和用于核染色的 4_6-二酰胺-2-苯林多尔 （DAPI）。在RT上过夜干燥，防止光线照射。
- 干燥后，在 4°C 下保护滑盒上的光线，直到准备好进行共聚焦显微镜和数据采集。
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Representative Results
从鼠中枢分离的微血管显示神经血管单元2，3的所有内在细胞成分。使用血小板内皮细胞粘附分子-1（PECAM，也称为CD31）或同化素IB4（一种结合内皮细胞的糖蛋白，用于内皮细胞， 血小板衍生的生长因子-β（PDGFR®）或神经元胶质抗原2（NG2）用于围细胞和水孢素-4（AQP4），用于星体端脚（图3A，B），表明这些内在成分存在于孤立的微血管中。可见的CNS区域包括皮质微血管（图3B）、小脑（图3C）、脑垂体（图3D）、下丘脑（图3E）、脑干（图3F）和脊髓（图3G）。所有显示这些规范标记的表达式。
同样，微血管显示粘结蛋白VE-cadherin（图4A，C），紧结蛋白claudin-5和zonula闭塞-1（CLDN5和ZO-1，图4A，D），三细胞结蛋白古林-1（图4A，E）和阿皮球标记C-X-C图案化学体配体12和伽马-谷氨基转移酶1（CXCL12和GGT1，图4A，F）。这些发现是相关的，因为这些蛋白质是关键的BBB特异性属性9，12，13，14。星形细胞、寡核苷酸和神经元表达胶质纤维酸性蛋白（GFAP，图4B，C，G），寡核苷酸特异性蛋白（OSP，图4B，G）和神经纤维介质（NFM，图4B，H），分别表明，分离微血管具有可忽略的不需要的非神经血管单元细胞的痕迹。此外，大多数微血管缺乏β-平滑肌动因的表达（βSMA，图5B，C）。这是相关的，因为βSMA是与动脉和静脉相关的平滑肌细胞的标记（图5A），表明这种隔离协议选择性地针对小口径微血管15。
从其他小脑脊椎动物中获得的微容器具有一些形态特征，如在鱼类（未显示的青蛙和蜥蜴）和鸟类微容器中可见。这表明，这种方法有助于进一步描述物种之间的NVU差异（图6）。此外，禽流感CNS微血管（图6H+N）显示与为人和小鼠研制的许多抗体的交叉反应。这鼓励进一步研究鸟类标本，用于生物和生物医学BBB研究。当我们从猪和猴身上分离出微血管时，我们观察到了类似的结果，它们包括两种环流动物（图7）。只显示了猪微血管中的NVU规范标记。除了上述的CNS区域外，我们还能够将微容器与近脑白质分离（图7B）。这是相关的，因为白质与神经炎条件（例如，多发性硬化症16，17，18）有关。
我们想找出这种方法是否可以作为确定蛋白质表达变化的可靠工具。知道VCAM-1和JAM-B在EAE期间与脊髓的神经炎过程有关，我们决定在EAE和假控制小鼠（10周老的C57BL/6J小鼠）的峰期和慢性阶段，将这些蛋白质的表达量化为9，10，11。为此，我们测量了微容器直径上的任意强度单位 （AUI）。然后，使用 DAPI 的阈值为 ±20 AUI，我们计算了每个 CNS 区域 50 微容器的 VE-cadherin、VCAM-1 和 JAM-B 曲线 （AUC） 下的面积（图 8A，B）。最后，我们进行了双向方差分析，然后进行Sidak的后特制测试，以确定蛋白质表达变化的统计意义。
如预期的那样，我们观察到在EAE高峰期间，脊髓微血管沿线的VCAM-1和JAM-B增加（图8D，E）。但是，我们观察到以前未为 EAE 报告的其他 CNS 区域的变化。VCAM-1在垂体微血管中显著增加，下丘脑和脑干微血管减少。在所有中枢神经系统组织中慢性EAE期间有变化 （图8D）。在慢性EAE期间，JAM-B在下丘脑和垂体微血管中显著增加（图8E）。有趣的是，我们观察到在EAE高峰期间从下丘脑和脑干分离的微血管中VE-卡塞林的变化，在慢性EAE期间（图8C）中小脑，以及峰和慢性EAE期间脑垂体微血管宽度的减少。总体而言，这一数据表明，这种微容器分离方法是一个有用的工具，用于描述健康和疾病期间区域蛋白质表达模式的变化。
图1：高效脊髓解剖，无层切除术。从小脊椎动物标本（高达100克）解剖脊髓更快，更高效地执行，通过冲洗脊髓在牛对罗斯特方向整个椎前。使用解剖剪刀，头部被阿特拉斯关节去除，脊柱被臀部切出（A）。所有保留的器官被移除，只留下脊柱 （B）.与颈椎的宽度（B，黄色箭头）相比，腰椎前科内的脊髓显示为一个非常小的白色圆圈（直径为<1 mm）。使用 18 G 针头和 10 cc 注射器冲洗时，在腰椎前部保持狭窄的开口有助于从腰部到颈椎的压力梯度，并配有 1x PBS（C和D） 的注射器。一旦冲洗，脊髓（D，黄色箭头）几乎完全没有硬骨囊，只有pia需要在解剖范围下去除。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：双管齐下拾取解剖工具和修改的过滤器支架。这个11厘米长的解剖工具 （A） 有两个非常锋利， 几乎水平对立点， 2 毫米尖端到尖端 （B）.通过施加温和的向下压力和顺时针稍微扭转（C），点嵌入水平到月下，以便他们可以向上抬起.这在从小脑中取出脑皮时特别有用，因为它允许进入小脑卵泡的深度。当从皮质组织（尤其是陀螺仪）中取出脑皮时，它也非常有用。在这种情况下，pia 高度嵌入高口径血管，这将损害微子容器隔离的纯度。同样，它有利于去除丘风丛，这是最有可能的污染来源。直径为 47 mm、25 mm 和 13 mm 的滤芯被激光切割，以从顶部隔间（E） 上拆下入口连接器（D），但保留筛分子 （G）。这种修改允许组装过滤器单元（I，J）， 将 20 μm 尼龙滤网放在筛子和底部（G，H） 上， 拧上部（E） 时将网固定到位。仅显示 25 mm 滤清器支架。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：从多个CNS区域分离的微血管表达规范神经血管单位标记。（A） 使用免疫标记和共聚焦显微镜，NVU 的内在细胞成分用于识别成人（8-14 周老 C57BL/6J）小鼠 CNS 微血管。如皮质微血管（B）的合并图像所示，内皮细胞标记CD31（白色）、内皮细胞标记PDGFR+（红色）和星形端脚标记AQP4（绿色）的单个共聚焦图像上方都保留这些细胞组分。请注意，内皮细胞和围细胞之间的亲密关系使它们出现在合并图片上的洋红色，而星形端脚似乎有一个光环围绕他们（B）。小脑（C）、脑垂体（D）、下丘脑（E）、脑干（F）和脊髓（G、DAPI、核污渍=蓝色;刻度柱=10μm）也观察到相同的表达模式。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：微血管表达与BBB特异性特性相关的蛋白质。神经血管单元 （NVU） 内的内皮细胞也由与其内在屏障特性（A） 相关的蛋白质来描述。如图所示，内皮细胞具有由VE-卡塞林、CLDN5、ZO-1（A、黄色）和古林-1（A，青色）组成的结。它们还表现出对多种蛋白质的极性，包括GGT-1和CXCL12（A，绿色和红色）。神经元、寡核苷酸和星形细胞细胞体可以包括在孤立的微血管中，尽管它们不是NVU（B）的固有物。这些分别可以通过 NFM（红色）、OSP（青色）和 GFAP（绿色）的表达（B） 来识别。与这些一致，我们孤立的微血管表达粘附蛋白VE-cadherin（C，红色），紧密结蛋白CLDN5和ZO-1（D，红色和绿色，分别合并+黄色），三细胞结蛋白LSR（E，绿色），和apicobasal标记CXCL12和GGT1（F，红色和绿色，分别）。他们还表现出有限数量的GFAP（A，绿色，G，白色），OSP（G，绿色）和NFM（H，红色），建议可以忽略不计的非神经血管单位细胞（DAPI，核染色= 蓝色;刻度条 = 10 μm）。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：大多数孤立的微血管不表达αSMA。神经血管单元表现出从动脉毛细血管 - 静脉 （A） 的复杂过渡.*SMA 表情清楚地识别动脉，当它成为毛细管时，αSMA（ B ，红色）表达减少，露出壁画标记 NG2 （ B ，绿色）。我们测量了βSMA®和βSMA-容器的直径（白色支架，n = 20），将它们区分为动脉或毛细血管（DAPI，核染色 = 蓝色，刻度杆 = 10 μm）。对βSMA®和βSMA-容器直径的未配对t测试分析显示出较高的统计显著性（C，[SMA]= 红色，αSMA- 红色/绿色，[p < 0.0001]）。请点击此处查看此图的较大版本。
图6：成功分离了CNS微血管与其他脑血管物种。CNS是从野生捕获的青蛙（8.2厘米），蜥蜴（12.7厘米），坦克饲养的虹鳟鱼（2岁，35.6厘米）和鸟饲养的鸽子（9个月大，约300克）收获的。青蛙、鱼和蜥蜴的微容器被H&E染色（只显示鳟鱼的微容器，刻度杆=20μm）。鸽子微血管被免疫标记。我们能够识别所有区域的微血管，如标记在鱼和鸽子的CNS轮廓：皮层（A和H），视叶（B和I），小脑（C和J），脑垂体（D和L），下丘脑（E和K），脑干（F和M），脊髓（G和N）。此外，我们还能够识别具有异子蛋白IB4（白色）、星形端脚与AQP4（绿色）的内皮细胞，以及从鸽子的隔离微血管（DAPI，核染色 =蓝色，刻度柱= 10 μm）的NFM（红色）的相邻神经元。请点击此处查看此图的较大版本。
图7：从环流器物种中分离CNS微容器。大脑和脊髓是从农场饲养的猪（约6个月大，约120公斤）解剖，用于微血管隔离和免疫标记。我们能够识别在猪中枢神经系统的所有区域上为IB4（白色）、PDGFR+（红色）和AQP4（绿色）贴上正标记的微血管：皮层（A）、表皮层白质（B）、小脑（C）、脑垂体（D）、脑干（F）和脊髓（G、DAPI、核染色请点击此处查看此图的较大版本。
图8：CNS微容器隔离的其他应用实例。JAB-B和VCAM-1的表达对鼠EAE微容器进行了量化。在EAE的高峰和慢性阶段，测量小鼠皮层、小脑、下丘脑、脑干、脑干和脊髓的任意强度单位（AUI），假作为对照（n = 4）。对于每个CNS区域，每只小鼠评估12个微容器，以确定每氟铬的AUI和微容器的直径（A）。白色括号显示了用于确定 VCAM-1（白色）、VE-卡塞林（绿色）、JAM-B（红色）和 DAPI（蓝色、刻度柱 = 10 μm）的共聚焦显微镜软件测量工具的示例。然后，根据微米（B） 的直径绘制生成的 AUI，以计算每个免疫标记蛋白（AUC）下的面积，作为蛋白质表达的估计值。然后，通过双向方差分析分析每组平均AUC，然后对每个CNS区域总共48个微容器进行后临时测试。除脑垂体微血管外，我们观察到微血管直径与疾病状态（C，插入）没有显著差异，但EAE小鼠的下丘脑和脑干的VE-球酸表达显著减少。类似的统计分析显示，脊髓的VCAM-1 （D） 和 JAM-B （E） 明显增加， 与 EAE 高峰期间的神经炎状态一致.有趣的是，我们还观察到VCAM-1在下丘脑、脑垂体和脑干的变化。这些结果正在调查中（黑条和点 = 假，红条和点 = 峰值 EAE，鲑鱼条和点 = 慢性 EAE， _p_lt;0.05， @p<0.01， #p<0.001， &p<0.001）。请点击此处查看此图的较大版本。
| MV-1 | 10 mM HEPES |
| 在1x汉克的平衡盐溶液（HBSS）与钙和镁 | |
| MV-2 | 18% 70 kDa 分子量 （MW） dextran |
| 在 10 mM HEPES/HBSS （MV-1） | |
| MV-2 | 20% 70 千瓦兆瓦 |
| 在 10 mM HEPES/HBSS （MV-1） | |
| MV-3 | 1% 牛血清白蛋白 （BSA） |
| 在 10 mM HEPES/HBSS （MV-1） | |
| 固定 | 4%甲醛（PFA） |
| 在1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）pH 7.4 | |
| 洗涤缓冲液 | 1x PBS pH 7.4 |
| 渗透和阻塞缓冲器 | 10% BSA |
| 0.25% 非离子表面活性剂 | |
| 在 1x PBS pH 7.4 | |
| 抗体稀释剂 | 5% BSA |
| 0.25% 非离子表面活性剂 | |
| 在 1x PBS pH 7.4 |
表 1：协议中使用的解决方案。
| 步骤 | 行动 |
| 4.1 和 4.1.1 | 带单边刀片的 MV-1 解决方案中的薄荷 |
| 4.2 到 4.2.2 | 使用波特-ELVJ PTFE 或微管害虫在 MV-1 解决方案中实现均质化 |
| 5.1 | 在 2，000 x g下旋转，4 °C，10 分钟 |
| 5.1.1 到 5.1.1.2 | 在 MV-2 溶液中重新悬浮颗粒 |
| 5.2 | 旋转速度为 4，400 x g，4°C，15 分钟 |
| 5.3 到 5.5 | 用 1 mL 的 MV-3 溶液重新悬浮颗粒 |
| 6.2 到 6.4.1 | 通过细胞过滤器在 50 mL 锥形管上洗净，用 MV-3 溶液冲洗 |
| 6.5、6.5.1、6.6 和 6.7 | 在改进的过滤器支架上使用 20 μm 尼龙网的过滤器 |
| 6.8 | 将尼龙网装入 50 mL 烧杯，使用 10 mL 的 MV-3 溶液，摇摇 30 s |
| 6.9 到 6.10 | 放入 15 mL 锥形管中，在 2，000 x g、4°C、5 分钟下旋转 |
| 6.10 | 在 1 mL 的 MV-3 溶液中重新悬浮 |
| 6.10.1 | 转移到 1.7 mL 微管，在 20，000 x g、4°C、5 分钟下旋转 |
| 7.1 到 7.3 | 在 1x PBS 中重新挂起并加载到井滑梯中 |
表2：小型脊椎动物微血管隔离的布局。此图表是使用利塞脑标本时协议的简略版本。
| 步骤 | 解决 方案 | 行动 | 环 磷 酰 胺 | CBL | 选择 | Bst | Sc | HYP | 坑 |
| 4.1 | MV-1 | 菜上的薄荷 | 100 毫米 x 20 毫米培养皿，1 毫米 | 不适用 | |||||
| 4.2.1 和 4.2.2 | MV-1 | 同质化 | 5 mL， 10 mL 波特-埃尔维杰姆带虫子 | 1 mL， 微虫 | |||||
| 5.1.1.1 和 5.1.1.2 | MV-2 | 重新挂起 | 5 mL = 5 mL，18% 德特恩 | 1 mL， 20% dextran | |||||
| 5.5 和 6.4.1 | MV-3 | 重新挂起 | 1 mL = 10-15 mL | 1 mL | |||||
| 6.2 和 6.4.1 | MV-3 | 过滤器尺寸 | 100 μm | 70 μm | 100 μm | 70 μm | 100 μm | ||
| 冲洗 | 5 mL | ||||||||
| 6.5、6.5.1 和 6.7 | MV-3 | 过滤器尺寸，冲洗 | 25 毫米过滤器，10 mL | 13 毫米，5 毫米 | |||||
| 6.8 | MV-3 | 在烧杯上摇动 | 10 mL | ||||||
| 6.10 | MV-3 | 重新挂起 | 1 mL | ||||||
| 7.2 | 1x PBS | 重新挂起 | 1.5 至 2.0 mL | 0.5 至 1.0 mL | 0.1 至 0.2 mL | ||||
| 7.3 | 1x PBS | 每口井的负载 | 200 μL | 100 μL | 25 至 50 μL | ||||
| CTX = 皮层，CBL = 小脑，BST = 脑干，OPT = 视叶（不存在哺乳动物），HYP = 下丘脑，PIT = 垂体，SC = 脊髓。推荐体积适用于从动物大小从20克（幼鼠）到800克（成年大鼠）的整个组织。 | |||||||||
表 3：建议的音量/大小。此轮廓具有用于使用小型脊椎动物标本的建议体积，范围从 ±20±800 g，或者更具体地说，视频中显示的 ±25 g 鼠标。所需体积的最终调整必须由研究人员根据解剖后获得的湿组织的具体数量来确定。强烈建议您进行练习和故障排除。CTX = 皮层，CBL = 小脑，BST = 脑干，OPT = 视叶（不存在哺乳动物），HYP = 下丘脑，PIT = 垂体，SC = 脊髓。
| 步骤 | 行动 |
| 4.1 和 4.1.2 | 带单边刀片的 MV-1 中的薄荷 |
| 4.3 到 4.3.4 | 使用带有 PTFE 刺虫的波特-埃尔维杰姆研磨机在 MV-1 解决方案中实现均质化 |
| 5.1 | 在 2，000 x g下旋转，4 °C，10 分钟 |
| 5.1.2 到 5.1.2.2 | 在 MV-2 溶液中重新悬浮颗粒 |
| 5.2 | 旋转速度为 4，400 x g，4°C，15 分钟 |
| 5.3 到 5.5 | 用 1 mL 的 MV-3 溶液重新悬浮颗粒 |
| 6.2 到 6.4 和 6.4.2 | 通过细胞过滤器在 50 mL 锥形管上洗净，用 MV-3 溶液冲洗 |
| 6.5、6.5.2、6.6 和 6.7 | 在改进的过滤器支架上使用 20 μm 尼龙网的过滤器 |
| 6.8 | 将尼龙网装入 50 mL 的烧杯中，使用 30 mL 的 MV-3 溶液，摇摇 30 s |
| 6.9 和 6.10 | 放入 50 mL 锥形管中，在 2，000 x g、4°C、5 分钟下旋转 |
| 6.10 | 在 1 mL 的 MV-3 溶液中重新悬浮 |
| 6.10.2 | 转移到 5 mL 微管，在 2，000 x g、4 °C、5 分钟下旋转 |
| 7.1 到 7.3 | 在 1x PBS 中重新挂起并加载到井滑梯中 |
表4：大型脊椎动物微血管隔离的布局。此图表是使用陀螺仪试样时协议的简略版本。
| 步骤 | 苏蒂翁 | 行动 | 环 磷 酰 胺 | CBL | Wm | Bst | Sc | HYP | 坑 |
| 4.1 | MV-1 | 菜上的薄荷 | 3⁄5 mL | 1 mL | |||||
| 4.3 到 4.3.4 | MV-1 | 同质化 | 20~30 mL，55 mL 波特-埃尔维杰姆带刺和头顶搅拌器 | 5 mL， 10 mL 波特-埃尔维杰姆带虫子 | |||||
| 5.1.2 到 5.1.2.2 | MV-2 | 重新挂起 | >20 mL，20% dextran | 5 mL = 5 mL，20% dextran | |||||
| 5.5、6.4 和 6.4.2 | MV-3 | 重新挂起 | 1 mL = 20 mL | 1 mL = 10 mL | |||||
| 6.2 和 6.4.2 | MV-3 | 过滤器尺寸 | 100 μm | 70 μm | 100 μm | 70 μm | 100 μm | ||
| 冲洗 | 10 mL | ||||||||
| 6.5、6.5.2 和 6.7 | MV-3 | 过滤器尺寸，冲洗 | 47 毫米过滤器，10 mL | 25 毫米，10 毫米 | |||||
| 6.8 | MV-3 | 在烧杯上摇动 | 30 mL | ||||||
| 6.10 和 6.10.2 | MV-3 | 重新挂起 | 1 mL = 4 mL | ||||||
| 7.2 | 1x PBS | 重新挂起 | 2.0 至 4.0 mL | 1.0 至 2.0 mL | |||||
| 7.3 | 1x PBS | 每口井的负载 | 200 μL | 100 μL | |||||
| CTX = 皮层，CBL = 小脑，WM = 白质，BST = 脑干，HYP = 下丘脑，PIT = 脑垂体，SC = 脊髓。推荐体积用于 CTX、CBL、BST 和 SC 整个 HYP 和 PIT 的 ±45 cm3样品。 | |||||||||
表 5：建议的音量/大小。此轮廓具有使用大型脊椎动物标本的推荐解决方案量。更具体地说，它适用于皮层、小脑、白质、脑干、脊髓以及整个下丘脑和垂体（如视频所示）的45cm3的CNS组织活检。所需体积的最终调整必须由研究人员根据解剖后获得的湿组织的具体数量来确定。强烈建议您进行练习和故障排除。CTX = 皮层，CBL = 小脑，WM = 白质，BST = 脑干，HYP = 下丘脑，PIT = 脑垂体，SC = 脊髓。
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Discussion
BBB包括脑微血管内皮细胞的独特特性，加上复杂的结构，紧，粘附，"粘接"结，和粘附斑块关键CNS平衡2，3，19。内皮细胞的特性是由围细胞和周围的星体末端脚过程2，3，19诱导和维护。BBB微血管显示极性（即，在发光或腹皮细胞表面局部的蛋白质的不对称表达模式）20。虽然这可能简要地定义了BBB，但实际上它仍然是神经科学中最神秘的概念之一。例如，NVU 内的区域、性别和年龄差异可以解释 CNS 区域对创伤、毒性、感染和炎症的脆弱性，这些脆弱性可产生重大临床后果3、5、6。理解BBB的另一个障碍是观察到的多个分类7，8之间的差异。理解和调查BBB的主要障碍之一恰恰是与包含BBB的NVU隔离相关的困难，同时仍然保持其特定障碍的属性14。
为了加速我们对BBB、CNS区域差异以及物种差异的理解，我们采用了以前发表的方法。我们成功地改造了这些，特别是Boulay等人21，从单皮质、小脑、下丘脑、脑垂体、脑干和脊柱组织获得微血管，这些脊椎动物包括鱼类、两栖动物、爬行动物、鸟类和哺乳动物（图3，图4，图5和图6）。这种方法的一个优点是，它的适应是基于中枢神经系统组织的整体大小：研究人员选择溶液的数量，组织磨床的大小，锥形管，过滤器持有人等根据湿组织，无论物种，性别和年龄。根据我们的免疫标记经验，一个±20 g的试样产生足够的微血管，每个皮层、小脑、视叶、脑干和脊髓可产生8口滑动，每个下丘脑和垂体可产生半8井滑动。然而，皮质和视叶的产生量比小脑、脑干和脊髓高得多。
如图所示，我们对猪和猴的中枢神经系统微血管进行了必要的调整和免疫标记，这些哺乳动物与转化研究更相关（图7）。值得注意的是，我们能够在这些物种上包括腹膜白质。由于这些动物中的中枢神经系统较大，我们收集了足够的白质，使我们能够在第二次离心过程中从骨髓层中分离微容器颗粒（步骤5.3，MV-2，20%dextran）。我们推测，需要一个临界质量，以便能够建立这种分离，我们正在积极寻求如何获得与鼠中枢神经系统组织类似的结果。
尽管为了简单起见，我们确实在鸟类、猪和猴微血管上进行了 NVU 规范标记以外的免疫标记。值得注意的是，所有物种共享细胞和分子标记，以前在鼠样本上识别为与BBB功能相关（结蛋白VE-cadherin、CLDN5、ZO-1、LSR和apicobasal标记CXCL12和GGT1）或靠近NVU（NFM、OSP和GFAP）。同样，这些发现鼓励将这种方法用于其他物种，以进一步识别NVU正交学和物种间的差异。它还为进一步调查同一物种内的NVU菌株、性别和年龄差异以及利用其他生物体进行BBB生物医学研究的可行性提供了机会。我们还展示了成功使用这种微血管分离方法在神经炎症期间定量表达水平变化的证据（图8）。尽管我们以概念验证的形式进行了此实验，但此处使用的方法目前在我们的实验室中得到了广泛的应用。我们赞成这种方法比其他定量方法（例如，西方印迹），因为我们不仅希望专注于表达水平，而且相对蛋白质丰度，CXCL12和其他apicobasal蛋白质的重新定位，结点蛋白的连结蛋白，等等，在CNS微血管9，13，22的复杂外观。同样，我们目前正在排除我们的方法为其他应用，如进一步分离NVU细胞组件（内皮细胞和围细胞），RNA-seq和蛋白质组学23，24，25，26。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
Cruz-Orengo博士得到了加州大学戴维斯分校兽医学院启动基金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS | ThermoFisher | BP39920 | Used for blocking and antibody diluent. |
| 20% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | Used as fixative (4% PFA) |
| 70,000 MW Dextran | Millipore Sigma | 9004-54-0 | Used for MV-2 solution |
| Adson Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11006-12 | Used for removal of muscle and skin |
| Adson Forceps, student quality | FST | 91106-12 | Same as above but cheaper |
| Bovine serum albumin (BSA) | Millipore Sigma | A7906-100G | Used for MV-3 solution, blocking and antibody diluent |
| Corning 100 μm Cell strainer | Millipore Sigma | CLS431752-50EA | |
| Corning 70 μm Cell strainer | Millipore Sigma | CLS431751-50EA | |
| Corning Deskwork low-binding tips | Millipore Sigma | CLS4151 | Same as below but cheaper. |
| Cultrex Poly-D-Lysine | R&D | 3439-100-01 | Used for slide coating |
| Donkey anti-Goat IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21432 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Mouse IgG-ALEXA 488 | Thermo | A21202 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 488 | Thermo | A21206 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 647 | Thermo | A31573 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rat IgG-DyLight 650 | Thermo | SA5-10029 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Double-Pronged Tissue Pick | FST | 18067-11 | Used for removal of meninges and choroid plexus |
| Dumont #3c Forceps | FST | 11231-20 | Used for more delicate and/or small CNS tissue handling (like pituitary) |
| Dumont #7 Forceps | FST | 11274-20 | Used for CNS tisssue dissection and handling |
| Dumont #7 Forceps, student | FST | 91197-00 | Same as above but cheaper |
| ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Tips | Eppendorf | 22493008 | Better quality than the tips above (more expensive). |
| Extra Fine Graefe Forceps, serrated | FST | 11151-10 | Used for bone removal |
| Fine Scissors, sharp | FST | 14060-09 | Used for removal of pig and macaque dural sac |
| Glass Pestle 1.5 mL Microcentrifuge Tube Tissue Grinder Homogenizer, Pack of 10 | Chang Bioscience Inc. (eBay) | GP1.5_10 | Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Goat anti-CXCL12, biotinylated | PeproTech | 500-P87BGBT | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution: 1:20. |
| Goat anti-JAM-B | R&D | AF1074 | Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 488 | Thermo | A11001 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21424 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-PDGFRβ | R&D | AF1042 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Goat anti-Rabbit IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21249 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Rabbit IgG-DyLight 488 | Thermo | 35552 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Rat IgG-DyLight 650 | Thermo | SA5-10021 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Graefe Forceps, curved tip, 1X2 teeth | FST | 11054-10 | Use for nylon filter net holding and shaking |
| HBSS, 1X buffer with calcium and magnesium | Corning | 21-022-CM | Used for MV-1 solution |
| HEPES, 1M liquid buffer | Corning | 25-060-CI | Used for MV-1 solution |
| Isolectin GS-IB4-Biotin-XX | ThermoFisher Scientific (Thermo) | I21414 | Glycoprotein isolated from legume Griffonia simplicifolia that binds D-galactosyl residues of endothelial cell glycocalysx. Used for avian and porcine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| LaGrange Scissors, serrated | FST | 14173-12 | Used for skull dissection and laminectomy (except pig and macaque) |
| Millicell EZ slide 8-well unit | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| Mouse anti-CLDN5 | Thermo | 35-2500 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-GGT1 | Abcam | ab55138 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-Human CD31 | R&D | BBA7 | Used as primary antibody on primate CNS microvessels. Recommended concentration: 16.5 μg/mL. |
| Mouse anti-NFM | Thermo | RMO-270 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-αSMA | Thermo | MA5-11547 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Nylon Filter Net, roll | Millipore Sigma | NY6000010 | Laser-cut to 13 mm diameter filter net discs. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Nylon Filter Nets, 25 mm | Millipore Sigma | NY2002500 | Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Nylon Filter Nets, 47 mm | Millipore Sigma | NY2004700 | Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | ThermoFisher | P36935 | Used to coverslip slides. |
| Rabbit anti-AQP4 | Millipore Sigma | A5971 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rabbit anti-LSR | Millipore Sigma | SAB2107967 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rabbit anti-NG2 | Millipore Sigma | AB5320 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rabbit anti-OSP | Abcam | ab53041 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 1 μg/mL. |
| Rabbit anti-VE-Cadherin | Abcam | ab33168 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rabbit anti-ZO-1 | Thermo | 61-7300 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rat anti-CD31 | Becton Dickinson | BD 550274 | Used as primary antibody for murine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rat anti-GFAP | Thermo | 13-0300 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rat anti-VCAM-1 | Becton Dickinson | BD 553329 | Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Sterile Ringer's Solution, Frog | Aldon Corporation | IS5066 | Used for amfibian anesthesia |
| Streptavidin-ALEXA 555 | Thermo | S32355 | Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500. |
| Streptavidin-ALEXA 647 | Thermo | S32357 | Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500. |
| Surgical Scissors, sharp | FST | 14002-12 | Used for removal of muscle and skin |
| Surgical Scissors, sharp-blunt | FST | 14001-16 | Used for decapitation (except pig and macaque) |
| Swinnex Filter Holder, 13 mm | Millipore Sigma | SX0001300 | Modified by laser-cut. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Swinnex Filter Holder, 25 mm | Millipore Sigma | SX0002500 | Modified by laser-cut. Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Swinnex Filter Holder, 47 mm | Millipore Sigma | SX0004700 | Modified by laser-cut. Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
| Triton X-100 | ThermoFisher | 50-165-7277 | Used for blocking and antibody diluent. |
| Wheaton 120 Vac Overhead Stirrer | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 62400-904 (DWK #903475) | Used for macaque and pig CNS tissues with 55 mL tissue grinder, except hypothalamus and pituitary. |
| Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 10 mL | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 14231-384 (DWK #357979) | Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 55 mL | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 14231-372 (DWK #357994) | Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
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