Summary
L'obiettivo di questo protocollo è quello di isolare i microvasi da più regioni del sistema nervoso centrale dei vertebrati lissencefalici e gyrencephalic.
Abstract
L'isolamento dei microvasi dal sistema nervoso centrale (CNS) è comunemente eseguito combinando tessuto corticale da più animali, il più delle volte roditori. Questo approccio limita l'interrogatorio delle proprietà della barriera emato-encefalica (BBB) alla corteccia e non consente il confronto individuale. Questo progetto si concentra sullo sviluppo di un metodo di isolamento che consente il confronto dell'unità neurovascolare (NVU) da più regioni del SNC: corteccia, cervelletto, lobo ottico, ipotalamo, ipofisi, tronco encefalico e midollo spinale. Inoltre, questo protocollo, originariamente sviluppato per i campioni di murini, è stato adattato con successo per l'uso su tessuti CNS da piccole e grandi specie di vertebrati da cui siamo anche in grado di isolare i microvasi dalla materia bianca dell'emisfero cerebrale. Questo metodo, se abbinato all'immunoetichettatura, consente la quantificazione dell'espressione proteica e il confronto statistico tra individui, tipo di tessuto o trattamento. Abbiamo dimostrato questa applicabilità valutando i cambiamenti nell'espressione delle proteine durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE), un modello murino di una malattia neuroinfiammatoria, la sclerosi multipla. Inoltre, i microvessels isolati con questo metodo potrebbero essere utilizzati per applicazioni a valle come qPCR, RNA-seq e macchia occidentale, tra gli altri. Anche se questo non è il primo tentativo di isolare le microvessels CNS senza l'uso di ultracentrifugazione o dissociazione enzimatica, è unico nella sua abilità per il confronto di singoli individui e più regioni del SNC. Pertanto, consente di scandire una serie di differenze che altrimenti potrebbero rimanere oscure: porzioni del SNC (corteccia, cervelletto, lobo ottico, tronco encefalico, ipotalamo, ipofisario e midollo spinale), tipo di tessuto CNS (materia grigia o bianca), individui, gruppi di trattamento sperimentale e specie.
Introduction
Il nostro cervello è l'organo più importante del nostro corpo. Per questo motivo, mantenere l'omeostasi del cervello nonostante fattori esterni che possono innescare una deviazione dalla normalità è una priorità. Secondo alcuni studiosi, circa 400-500 milioni di anni fa1, gli animali vertebrati hanno sviluppato quella che oggi conosciamo come la barriera emato-encefalica (BBB)2,3. Questa "recinto" protettiva esercita la maggiore influenza sull'omeostasi del sistema nervoso centrale (CNS) e sulle funzioni regolando strettamente il trasporto di ioni, molecole e cellule tra sangue e parenchyma del SNC. Quando il BBB viene interrotto, il cervello diventa suscettibile a esposizione tossica, infezione, e infiammazione. Pertanto, la disfunzione BBB è associata a molti, se non tutti, disturbi neurologici e neurosviluppo4 ,5,6.
La sofisticata funzione del BBB è attribuita all'unica microvascolatura CNS conformata dall'unità neurovascolare (NVU)2,3. Cellule endoteliali altamente specializzate, periciti e piedi finali astrociti cisonoci sono i componenti cellulari della NVU2,3. La matrice extracellulare generata da queste cellule è anche essenziale per la fisiologia NVU e BBB2,3. Anche se i componenti cellulari e molecolari essenziali della NVU sono conservati tra i vertebrati, l'eterogeneità è riportata tra gli ordini e le specie7,8. Tuttavia, limitazioni tecniche ostacolano la nostra capacità di considerare pienamente queste differenze nella ricerca neurobiologia, biomedica o traslazionale.
Per questo motivo, abbiamo ampliato un metodo di isolamento dei microvessel specifico della regione CNS per renderlo applicabile a numerose specie di tutti e cinque i gruppi di vertebrati: pesci, anfibi, rettili, uccelli e mammiferi. Il protocollo è descritto per l'uso su vertebrati small-lissencefalici e grandi girocefali, comprese specie con rilevanza traslazionale9. Inoltre, includiamo altre regioni del CNS non studiate prima in questo contesto, ma rilevanti per la neurofisiologia e con enormi implicazioni cliniche: l'ipotalamo, l'ipofisi e la materia bianca. Infine, abbiamo testato la capacità di questo metodo di isolamento come uno strumento affidabile per identificare i cambiamenti nell'espressione proteica lungo l'NVU e/o BBB9,10,11. Come proof-of-concept, abbiamo mostrato come determinare i cambiamenti nell'espressione VCAM-1 e JAM-B durante EAE utilizzando il metodo di isolamento seguito dall'immunofluorescenza.
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Protocol
Tutte le procedure del presente studio sono conformi alle linee guida stabilite dall'Università della California (UC), Davis Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). La cura degli animali all'UC Davis è regolata da diverse risorse indipendenti ed è stata pienamente accreditata dalla Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) dal 1966. I tessuti CNS porcino sono stati ottenuti dal Dipartimento UCD di Scienze Animali, Meat Sciences Laboratory. I tessuti del CNS dei macachi rhesus sono stati ottenuti dal California National Primate Research Center Pathology Department (NIH P51OD01107). Nessuna anestesia, eutanasia o necropsia è stata eseguita dal personale di laboratorio su maiali e macachi. Pertanto, non ci sono raccomandazioni particolari in merito a tali questioni.
NOTA: Questo metodo è stato convalidato per più specie, ma il protocollo fornito corrisponde più direttamente ai tessuti murini e porcini. I dettagli relativi al lobo ottico non si applicano quando si utilizzano campioni di mammiferi. Tutti i materiali biopericolosi devono essere trattati in un adeguato livello di biosicurezza (BSL). Tutti i materiali acutamente tossici devono essere maneggiati sotto un cofano di fumi. Tutti i rifiuti medici biopericolosi e i rifiuti acutamente tossici devono essere smaltiti correttamente.
1. Preparazione
- Preparare le soluzioni (Tabella 1) almeno un giorno prima.
NOTA: È molto difficile sciogliere 70 kDa peso molecolare (MW) dextran. È più efficiente lasciare che la soluzione si agita durante la notte coperta con pellicola paraffina o pellicola. Il protocollo richiede l'uso di due diverse soluzioni MV-2 a seconda del campione in esame. Il 18% dextran separa in modo efficiente la mielina dal pellet del microvaso quando si esegue il protocollo su piccoli esemplari lissencephalic. Tuttavia, sviluppa uno striscio di mielina all'interno dell'interfaccia dei tessuti CNS da grandi esemplari gyrencephalic, così come l'ipotalamo e l'iptuitario da piccoli esemplari. Questo striscio è impedito utilizzando 20% dextran. - Preparare i well-slides caricando 50 -L per pozzo di poli-D-lisina e lasciare asciugare per 2 h a temperatura ambiente (RT), preferibilmente in un armadio di sicurezza biologica-classe 2 (BSC-2). Non asciugare troppo. Sciacquare due volte con la salina con buffer fosfato (PBS) e conservarla in frigorifero fino a quando non è pronta per l'uso.
2. Dissezione dei tessuti CNS dal piccolo esemplare di vertebrato lissencefalico
NOTA: l'articolo illustra l'applicazione del protocollo su un C57BL6/J, 10 settimane di età, 25 g, mouse maschile.
- Preparare due tubi conici da 15 mL e un tubo di microcentrifuga da 1,7 mL con 5 mL e 1 mL, rispettivamente, di soluzione MV-1 per campione. Tenere i tubi sul ghiaccio.
- Anestesizzazione
- Anestetizza i topi mediante iniezione intraperitoneale di una chetamina, xilocina e acepromazina cocktail anestetico a 100/10/3 mg per kg di peso corporeo e spray con 70% di etanolo. Confermare l'anestesia valutando l'assenza di riflessi palpebrali e pedale toccando un occhio e pizzicando un piede, rispettivamente.
- Anestesizzai i piccioni per inalazione del 5% di isoflurane usando una scatola di anestesia ad induzione.
- Anestesizzare pesci e rane in 1% Tricaina in un acquario o soluzione anfibia Ringer (Tabella dei materiali), rispettivamente.
- Anestesizzale le lucertole raffreddandosi a 4 gradi centigradi prima dell'eutanasia.
- Decapitare l'animale con forbici chirurgiche, staccare la pelle con pinze per esporre il cranio e tagliare con le forbici LaGrange attraverso il forame magnum (Figura 1A).
- Dissezionare il cervello con una spatola e trasferirlo in un tubo conico da 15 mL con soluzione MV-1. Tieni il tubo sul ghiaccio.
- Recuperare l'ipofisi dalla sella turcica del cranio con pinze e trasferirlo in un tubo di microcentrifuga da 1,7 mL con soluzione MV-1. Tieni il tubo sul ghiaccio.
- Rimuovere la pelle e il muscolo per esporre la colonna vertebrale. Tagliare gli arti, la gabbia toracica e gli organi interni (Figura 1B).
- Dissezionare il midollo spinale con uno dei due metodi descritti di seguito. Quindi, trasferire in un tubo conico 5 mL con soluzione MV-1. Tieni il tubo sul ghiaccio.
- Eseguire laminectomia tagliando in direzione rostrale a caudale con forbici LaGrange, iniziando attraverso il forame vertebralecervicale , fino a raggiungere il cordone lombare.
- Eseguire il lavaggio in direzione caudale in rostrale in tutto il forame vertebrale lombare con un ago da 18 G e una siringa da 10 mL caricata con soluzione MV-1 (Figura 1C,D).
NOTA: questo metodo funziona solo con campioni molto piccoli, per lo più roditori (<100 g).
- Utilizzando un mirino di dissezione, tagliare il sacco durale dal midollo spinale con le forbici a molla e rimuovere le restanti meningi con un plettro a doppio campo (Figura 2).
- Trasferire il cervello in un piatto Petri e, utilizzando un mirino di dissezione, rimuovere le meningi con un plettro a doppia pletora (Figura 2A–C).
- Accise i bulbi olfattivi e il talamo con pinze, forbici da iride e forbici primaverili. Utilizzando il plettro a doppia puntura, rimuovere il plesso coroideo da tutti i ventricoli cerebrali. Assicurarsi di rimuovere tutto il plesso coroideo.
NOTA: Il plesso coroideo e i bulbi olfattivi sono una massiccia fonte di contaminazione. A differenza della BBB, questi capillari sono altamente fenestrated e i risultati degli esperimenti successivi saranno compromessi se non vengono rimossi. - Utilizzando pinze, separare le regioni SNC distinte: corteccia, cervelletto, tronco encefalico, lobo ottico (non su esemplari di mammiferi) e ipotalamo.
3. Dissezione dei tessuti CNS da un grande esemplare di vertebrato ginefalo
NOTA: Questo protocollo utilizza tessuti CNS porcina ottenuti da un mattatoio. Pertanto, nessuna anestesia, eutanasia o necroscopia è descritta o mostrata qui.
- Trasportare i tessuti CNS porcine in un contenitore di istologia da 0,946 L (32 oz) caricato con soluzione MV-1 all'interno di un forziere/secchio di ghiaccio.
- Utilizzando un mirino di dissezione, rimuovere le meningi con un piccone a doppia punta, pinze, forbici iride, e forbici a molla da ogni tessuto del SNC. Assicurarsi di rimuovere eventuali pezzi di plesso coroideo dai ventricoli cerebrali.
4. Omogeneizzazione dei tessuti del CNS
NOTA: È più efficiente quando due ricercatori si impegnano nel processo di omogeneizzazione: uno seziona le meningi sotto lo stereoscopio e l'altro omogeneizzando i tessuti macinati. In questo modo, i tessuti vengono rapidamente restituiti al secchio di ghiaccio e mantenuti freddi.
- Posizionare ogni regione CNS su una piastra Petri con 1 mL di soluzione MV-1. Utilizzando una lama a bordo singolo, macinare il tessuto per ottenere pezzi da 1–2 mm.
- Per un piccolo esemplare di vertebrato, utilizzare una piastra Petri da 100 mm x 20 mm.
- Per un grande esemplare di vertebrato, utilizzare una parabola Petri da 150 mm x 15 mm.
- Omogeneizzazione di un piccolo esemplare di vertebrato (Tabella 2 e Tabella 3)
- Trasferire la corteccia, il cervelletto, il tronco encefalico, il lobo ottico e il midollo spinale alla soluzione MV-1 da 1l mL in un'unica smerigliatrice di tessuto in vetro Potter-Elvehjem da 10 mL con un pestello PTFE utilizzando una pipetta di trasferimento. Aggiungere 5 mL di soluzione MV-1 e omogeneizzare ogni tessuto (10 colpi). Trasferire a singoli tubi conici da 15 mL. Tenere i tubi sul ghiaccio.
NOTA: Per un piccolo vertebrato, 5 o 4, rispettivamente con o senza lobo ottico, sono necessari smerigliatrici Potter-Elvehjem da 10 mL e tubi conici da 15 mL. - Trasferire l'ipotalamo e l'ipofisi con le pinze a 100 dollari di soluzione MV-1 in un tubo individuale da 1,7 mL e omogeneizzare con attenzione con un micropestle di vetro. Sciacquare ogni micropestle con una soluzione MV-1 da 1 mL di MV-1. Tieni il tubo sul ghiaccio.
NOTA: Per un piccolo vertebrato, sono necessari 2 micropestle di vetro e tubi da 1,7 mL.
- Trasferire la corteccia, il cervelletto, il tronco encefalico, il lobo ottico e il midollo spinale alla soluzione MV-1 da 1l mL in un'unica smerigliatrice di tessuto in vetro Potter-Elvehjem da 10 mL con un pestello PTFE utilizzando una pipetta di trasferimento. Aggiungere 5 mL di soluzione MV-1 e omogeneizzare ogni tessuto (10 colpi). Trasferire a singoli tubi conici da 15 mL. Tenere i tubi sul ghiaccio.
- Omogeneizzazione di un grande esemplare di vertebrato (Tabella 4 e Tabella 5)
- Utilizzando una pipetta di trasferimento, trasferire il tessuto macinato in un macinino in tessuto di vetro Potter-Elvehjem da 55 mL con un pestello PTFE e attaccarlo al mimossere in testa. Aggiungere metà del volume consigliato della soluzione MV-1, in base alla porzione CNS specifica che viene omogeneizzata (Tabella 5).
- Accendere lo staffatore in testa a velocità molto bassa (150 giri/min) e spostare con attenzione il tubo di vetro su e giù per circa 30 s.
- Spegnere il collegitore dall'alto, aggiungere altra soluzione MV-1 e ripetere il passaggio 4.3.2 fino ad ottenere un liquame omogeneo.
- Trasferire su un tubo conico da 50 mL. Tieni il tubo sul ghiaccio.
- Lavare la smerigliatrice con acqua deionizzata tra ogni omogeneizzazione del tessuto SNC.
NOTA: Per un vertebrato di grandi dimensioni 5 o 4, rispettivamente con o senza materia bianca, sono necessari 50 mL di tubi conici. Allo stesso modo, sono necessari due (2) 15 mL di tubi conici per l'ipotalamo e l'ipofisi.
5. Purificazione del recipiente
- Omogenei del tessuto di centrifuga derivanti dal passo 4.2.1, 4.2.2, o 4.3.4 a 2.000 g per 10 min a 4 gradi centigradi. Una grande interfaccia bianca di mielina si formerà sulla parte superiore dei pellet rossastri delle microvessels. Scartate i superalatari.
- Piccolo esemplare vertebrato (Tabella 2 e Tabella 3)
- Risospendere la corteccia, il cervelletto, il tronco encefalico, il lobo ottico e il pellet del midollo spinale in 5 mL di soluzione MV-2 ghiacciata con una pipetta sierologica da 5 mL (10 lavaggi). Aggiungere 5 mL di soluzione MV-2 ghiacciata ad ogni sospensione e mescolare attentamente capovolgendo i tubi.
- Risospendere l'ipotalamo e i pellet ipofisari con 1 mL di soluzione MV-2.
- Grande esemplare di vertebrato (Tabella 4 e Tabella 5)
- Aggiungere 20 mL di soluzione MV-2 ghiacciata alla corteccia, al cervelletto, al tronco encefalico e ai pellet dei recipienti del midollo spinale. Risospendere i pellet mescolando su uno shaker revolver a tubo, mescolando a 40 giri per 5 min. Bilanciare i volumi dei tubi conici della corteccia, cervelletto, tronco encefalico, e sospensioni del midollo spinale con l'aggiunta di più soluzione MV-2.
- Risospendere l'ipotalamo e i pellet a micronave pituitaria in 5 mL di soluzione MV-2 con una pipetta sierologica da 5 mL (vampate di calore) da 10 usd. Aggiungere 5 mL di soluzione MV-2 ghiacciata alle sospensioni e mescolare con attenzione capovolgendo il tubo.
- Piccolo esemplare vertebrato (Tabella 2 e Tabella 3)
- Centrifuga a 4.400 x g per 15 min a 4 gradi centigradi.
- Staccare con attenzione lo strato di mielina spesso e denso sull'interfaccia liquida dalle pareti di ogni tubo ruotando lentamente i tubi e permettendo al supernatante di passare lungo le pareti.
- Scartare la mielina e l'interfaccia liquida e macchiare la parete interna di ogni tubo con una spatola avvolta con una salvietta di carta bassa. Per piccoli campioni di vertebrati, rimuovere lo strato di mielina da ogni ipotalamo e tubo ipofisario aspirando con attenzione con una pipetta di trasferimento.
- Pulire il liquido in eccesso con una salvietta di carta contorta a bassa lanella. Risospendere ogni pellet con 1 mL di soluzione MV-3 utilizzando punte a basso legame. Tenere i tubi sul ghiaccio.
6. Eluzione e filtrazione dei recipienti
- Versare la soluzione MV-3 ghiacciata in singoli becher per ogni regione del SNC. Tenere a 4 gradi centigradi.
- Per piccoli campioni di vertebrati, utilizzare 10 mL di soluzione MV-3 per becher da 50 mL. Un totale di 6-7 becher è necessario a seconda se il lobo ottico è incluso o meno.
- Per grandi campioni di vertebrati, utilizzare 30 mL di soluzione MV-3 per becher da 100 mL. Un totale di 6-7 becher è necessario a seconda se la materia bianca è inclusa o meno.
- Posizionare un colino cellulare sopra un tubo conico da 50 mL. Usane uno per ogni area CNS. Utilizzare un colino da 100 m per la corteccia, il tronco encefalico, il lobo ottico, il midollo spinale e l'ipofisi. Utilizzare un colino a 70 celle m per il cervelletto e l'ipotalamo.
- Umidità di ogni colino con 1 mL di soluzione MV-3 ghiacciata.
- Aggiungere più soluzione MV-3 alle sospensioni preparate al punto 5.5 con una pipetta sierologica durante la miscelazione per evitare gli aggregati. Caricare con attenzione i microrecipient sopra il colino. Risciacquare con soluzione MV-3 ghiacciata.
- Per piccoli campioni di vertebrati (Tabella 2 e Tabella 3),aggiungere 10-15 mL di soluzione MV-3 con una pipetta sierologica e risciacquare con 5 mL di soluzione MV-3.
- Per grandi campioni di vertebrati, aggiungere 20 mL di soluzione MV-3 con una pipetta sierologica e risciacquare con 10 mL di soluzione MV-3.
- Assemblare l'unità di filtrazione posizionando un filtro di rete in nylon da 20 m su un supporto di filtro modificato (Figura 2D), uno per ogni regione DEL SNC.
- Per i piccoli campioni di vertebrati (Tabella 2 e Tabella 3), utilizzare i supporti filtranti modificati 25 mm per la corteccia, il cervelletto, il tronco cerebrale, il lobo ottico e il midollo spinale. Utilizzare portafiltri modificati da 13 mm per l'ipotalamo e l'ipofisi.
- Per i grandi campioni di vertebrati (Tabella 4 e Tabella 5), utilizzare supporti di filtro modificati 47 mm per la corteccia, il cervelletto, il tronco encefalico e il midollo spinale. Utilizzare 25 mm per l'ipotalamo e l'ipofisi.
- Posizionare il filtro sopra un tubo conico da 50 mL e un filtro bagnato con 5 mL di soluzione MV-3 ghiacciata assicurandosi che il buffer versa salga il supporto del filtro al tubo conico.
- Trasferire i microrecipient eluiti (dal punto 6.4) sopra il filtro a rete in nylon da 20 m e sciacquare i microrecipient con 5-10 mL di soluzione MV-3 ghiacciata.
- Recuperare il filtro con pinze pulite e immergerlo nel becher contenente la soluzione MV-3 ghiacciata preparata nel passaggio 6.1.
- Staccare i microrecipient dal filtro agitandolo delicatamente per circa 30 s. Per piccoli campioni di vertebrati, versare il contenuto del becher in un tubo conico da 15 mL. Per grandi campioni di vertebrati, versare il contenuto del becher in un tubo conico da 50 mL.
- Centrifuga a 2.000 x g per 5 minuti a 4 gradi centigradi e risospendere il pellet in 1 mL di soluzione MV-3 ghiacciata utilizzando una punta di pipetta a bassa legame.
- Per piccoli campioni di vertebrati, trasferire la sospensione (dal passo 6.10) in un tubo di microcentrifuga di 1,7 mL e centrifugare a 20.000 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
NOTA: Questo spin viene eseguito su una centrifuga da banco alla massima velocità (20.000 x g) per garantire una resa robusta. - Per grandi campioni di vertebrati, trasferire la sospensione dalla fase 6,10 in un tubo di microcentrifuga da 5,0 mL, aggiungere 4 mL di soluzione MV-3 e centrifugare a 2.000 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
- Per piccoli campioni di vertebrati, trasferire la sospensione (dal passo 6.10) in un tubo di microcentrifuga di 1,7 mL e centrifugare a 20.000 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
7. Immunostaining
NOTA: la colorazione ematossia e eosina (H&E) è stata eseguita su rettili, anfibi e campioni di pesce come prova di concetto della fattibilità del protocollo. Pertanto, non vi è alcuna raccomandazione per l'immunoetichettatura per questi campioni.
- Rimuovere il supernatante dai tubi di microcentrifuga.
- Risospendere il pellet in PBS sterile 1x utilizzando una punta pipetta a basso legame (Tabella dei materiali). Impedire ai micronavi di formare aggregati tramite pipettaggio più volte. Per i piccoli campioni di vertebrati (tabella 3),utilizzare 100 - L-2.000 - L a seconda della dimensione del pellet. Per i campioni vertebrati di grandi dimensioni (Tabella 5),utilizzare 1.000 USD l-4.000 - L in base alle dimensioni del pellet.
- Utilizzando una punta pipetta a bassa rilegatura, trasferire i microrecipient in vetrini di pozzi, facendo attenzione ad aggiungerli al centro di ogni pozzo, evitando le pareti laterali.
- Impostare i vetrini del pozzo, scoperti, all'interno di un BSC-2, e lasciare asciugare per 20-30 min a RT.
NOTA: Un volume relativamente elevato di 1x PBS viene utilizzato per evitare la formazione di aggregati. Per questo motivo, è necessario lasciare asciugare i vetrini prima della fissazione per assicurarsi che i microrecipienti siano tenuti dal rivestimento polid-lysina. - Rimuovere il residuo 1x PBS con una pipetta di trasferimento, aggiungere 200 -L di 4% di paraformaldeide (PFA) e incubare per 30 min a RT.
- Pipette fuori la soluzione fixativa e lavare 3x con 200 s L di 1x PBS per 5 min a RT.
NOTA: a questo punto è stata eseguita la colorazione H&E su pesci, microvessels anfibi e rettili cnsp. - Aggiungere 200 l di tampone di bloccante al vetrino del pozzo e incubare per 60 min a 37 gradi centigradi.
- Rimuovere il buffer di blocco con una pipetta di trasferimento e aggiungere 200 l del cocktail anticorpale primario in diluente anticorpo (Tabella dei materiali). Incubare a 4 gradi centigradi.
- Pipette fuori il cocktail anticorpale primario e lavare 3x con 200 l- l di 1x PBS per 5 min a RT.
- Caricare il cocktail anticorpale secondario (Tabella dei materiali) diluito in 1x PBS e incubare per 2 h a RT, protetto dalla luce.
- Pipette fuori il cocktail anticorpo secondario e lavare 3x con 200 l- l of 1x PBS per 5 min a RT, protetto dalla luce. Dopo l'ultimo lavaggio staccare il telaio del pozzo-slide e asciugare blot-secco eventuali in eccesso 1x PBS con una salvietta di carta a bassa pelnella.
- Aggiungere un coverslip, un mezzo di montaggio liquido anti-dissolvenza e 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) per la colorazione nucleare. Lasciare asciugare per tutta la notte a RT protetto dalla luce.
- Una volta asciutto, tenere al protetto dalla luce su una scatola di scorrimento a 4 gradi centigradi fino a quando non si è pronti per la microscopia confocale e l'acquisizione dei dati.
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Representative Results
I microvessels isolati dal SNC murino hanno mostrato tutti i componenti cellulari intrinseci dell'unità neurovascolare2,3. Utilizzando sia platelete endoteliale aderenazione delle cellule-1 (PECAM, noto anche come CD31) o isolettica IB4 (una glicoproteina che lega il glicocalyx cellule endotelialiali) per le cellule endoteliali, il fattore di crescita derivato dalle piastrine - (PDGFR) o l'antigene neurone-gliale 2 (NG2) per periciti e acquaporina-4 (AQP4) per i piedi finali astrociti (Figura3,B) dimostra che questi componenti intrinseci sono presenti in micronavi isolate. Le regioni CNS visibili includono i micronavi corticali (Figura 3B), il cervelletto (Figura 3C), l'ipofisi (Figura 3D), l'ipotalamo ( Figura3E), il tronco encefalico (Figura 3F) e il midollo spinale (Figura 3G). Tutti hanno mostrato l'espressione di questi marcatori canonici.
Allo stesso modo, i microvessels hanno mostrato l'espressione della proteina giunzione aderenti VE-cadherin (Figura 4A,C), proteine di giunzione strette claudin-5 e zonula occludens-1 (CLDN5 e zo-1, Figura 4A,D), proteina giunzione tricellulare angulin-1(Figura 4A,E) e marcatori apicobasal Motivo chemiokine ligando 12 e gamma-glutamyltransferase 1 (CXCL12 e GGT1, Figura 4A,F). Questi risultati sono rilevanti perché queste proteine sono indicatori di proprietà fondamentali specifiche BBB9,12,13,14. Una presenza limitata di astrociti, oligodendrociti e neuroni che esprimono proteine acide fibrillari gliali (GFAP, Figura 4B,C,G), oligodendrociti specifiche proteine (OSP, Figura 4B,G) e neuroment-medium (NFM, Figura 4Bfila,H), dimostra che le microvasa isolate avevano tracce trascurabili di cellule non cardiovascolari indesiderate. Inoltre, la maggior parte dei microvasi erano privi dell'espressione dell'actina muscolare s-liscio (zMA, Figura 5B,C). Ciò è rilevante perché la SMA è un marcatore per le cellule muscolari lisce associate ad arteriole e venule (Figura 5A), che indica che questo protocollo di isolamento si rivolge selettivamente a microvasi di piccolo calibro15.
Le microvessels ottenute da altri piccoli vertebrati lissencefalici condividono alcune caratteristiche morfologiche, come si riscontrano nei pesci (rana e lucertola non mostrati) e nei microvasi aviari. Ciò suggerisce che questo metodo è utile per un'ulteriore caratterizzazione delle differenze in NVU tra specie (Figura 6). Inoltre, le microvessels aviaria del CNS(Figura 6H-N) hanno mostrato la interrioattività incrociata con molti degli anticorpi sviluppati per l'uomo e il topo. Ciò incoraggia un'ulteriore indagine di campioni aviari per studi BBB biologici e biomedici. Abbiamo osservato risultati simili quando abbiamo isolato microvessels da maiali e macachi, due specie girocefaliche (Figura 7). Vengono mostrati solo i marcatori canonici NVU nei micronavi porcini. Oltre alle suddette regioni del SNC, siamo stati in grado di isolare le micronavi dalla materia bianca periventricolare (Figura 7B). Ciò è rilevante perché la materia bianca è implicata in condizioni neuroinfiammatorie (ad esempio, la sclerosi multipla16,17,18).
Volevamo scoprire se questo metodo potesse essere utilizzato come strumento affidabile per determinare i cambiamenti nell'espressione proteica. Sapendo che VCAM-1 e JAM-B sono stati implicati nel processo neuroinfiammatorio al midollo spinale durante l'EAE, abbiamo deciso di quantificare l'espressione di queste proteine nelle fasi di punta e croniche di EAE e topi di controllo della farsa (10 settimane-vecchio C57BL/6J topi)9,10,11. Per fare questo, abbiamo misurato l'unità arbitraria di intensità (AUI) lungo il diametro dei microvasi. Quindi, utilizzando una soglia di 20 AUI per DAPI, abbiamo calcolato l'area sotto la curva (AUC) per VE-cadherin, VCAM-1 e JAM-B per 50 micronavi per regione CNS (Figura 8A,B). Infine, abbiamo eseguito ANOVA bidirezionale seguito dal test post-hoc di Sidak per determinare il significato statistico dei cambiamenti nell'espressione proteica.
Come previsto, abbiamo osservato un aumento del VCAM-1 e JAM-B lungo i micronavi del midollo spinale durante il picco dell'EAE (Figura 8D,E). Tuttavia, abbiamo osservato cambiamenti in altre regioni del SNC non precedentemente segnalate per l'EAE. VCAM-1 è aumentato significativamente nelle micronavi ipofisarie e è diminuito nelle micronavi dell'ipotalamo e del tronco encefalico. Ci sono stati cambiamenti durante l'EAE cronico in tutti i tessuti CNS (Figura 8D). JAM-B ha aumentato significativamente nell'ipotalamo e micronavi ipofisaria durante l'EAE cronico (Figura 8E). È interessante notare che abbiamo osservato cambiamenti nel VE-cadherin lungo microvessel isolati dall'ipotalamo e dal tronco encefalico durante il picco dell'EAE, il cervelletto durante l'EAE cronico (Figura 8C) e una diminuzione della larghezza dei micropochi ipofisari durante il picco e l'EAE cronico. Nel complesso, questi dati suggeriscono che questo metodo di isolamento dei microrecipient è uno strumento utile per caratterizzare i cambiamenti nei modelli di espressione proteica regionale durante la salute e la malattia.
Figura 1: Dissezione efficiente del midollo spinale senza laminectomia. La dissezione del midollo spinale da piccoli campioni di vertebrati (fino a 100 g) viene eseguita più velocemente e in modo più efficiente scaricando il cavo in un caudale in direzione rostrale in tutto il forame vertebrale. Utilizzando forbici dissetanti la testa viene rimossa dall'articolazione dell'atlante e la colonna vertebrale viene tagliata dall'anca (A). Tutti gli organi remaing vengono rimossi, lasciando solo la colonna vertebrale (B). Il midollo spinale all'interno del forame vertebrale lombare appare come un cerchio bianco molto piccolo (<1 mm di diametro) rispetto alla larghezza del cavo cervicale (B, frecce gialle). Mantenere un'apertura stretta al forame vertebrale lombare facilita un gradiente di pressione dallo zombi alla colonna vertebrale cervicale durante il lavaggio con un ago da 18 G e una siringa da 10 cc caricata con 1x PBS (C e D). Una volta lavato, il midollo spinale (D, freccia gialla) è quasi totalmente privo del sacco durale, e solo pia deve essere rimosso sotto il mirino di dissezione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: strumento di seziono a doppio campo e supporto del filtro modificato. Questo strumento di sezionatura lungo 11 cm (A) ha due punti molto nitidi, quasi orizzontalmente opposti, da punta a punta (B). Applicando una leggera pressione verso il basso e torcendo leggermente in senso orario (C), i punti si incorporano orizzontalmente nelle meningi in modo che possano essere sollevati verso l'alto. Ciò è particolarmente utile quando si rimuovono le meningi dal cervelletto, perché consente l'accesso alla profondità della folia cerebelli. È anche molto utile quando si rimuovono le meningi dal tessuto corticale, in particolare gyrencephalic. In questo caso, la pia è altamente incorporata con vascolatura di alto calibro che comprometterà la purezza dell'isolamento del recipiente. Allo stesso modo, facilita la rimozione del plesso coroideo, che è la più antica fonte di contaminazione. I supporti del filtro di 47 mm, 25 mm e 13 mm di diametro sono stati tagliati al laser per rimuovere il connettore di inserimento (D) dal vano superiore (E), ma mantenere il componente setaccio (G). Questa modifica ha permesso l'assemblaggio di un'unità di filtro (I,J) posizionando la rete di filtro in nylon 20 m sopra il setaccio e la parte inferiore (G,H), fissando la rete in posizione quando avvitala parte superiore (E). Viene visualizzato solo il supporto del filtro da 25 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: I microvessels isolati da più regioni del SNC hanno espresso marcatori di unità neurovascolare canonici. (A) Utilizzando l'immunoetichettatura e la microscopia confocale, i componenti cellulari intrinseci dell'NVU vengono utilizzati per identificare le micronavi cnNC adulte (8-14 settimane C57BL/6J). Come si vede nell'immagine di unione per i microvasi corticali (B), sopra le singole immagini confocali per il marcatore di cellule endoteliali CD31 (bianco), marcatore pericito PDGFR (rosso) e marcatore astrocitico di estremità AQP4 (verde) tutti questi componenti cellulari vengono mantenuti. Si noti che la relazione intima tra cellule endoteliali e periciti le fa apparire magenta sull'immagine fusa, mentre i piedi finali astrociti sembrano avere un alone che li circonda (B). Lo stesso schema di espressione viene osservato per il cervelletto (C), l'ipofisi (D), l'ipotalamo (E), il tronco encefalico (F) e il midollo spinale (G, DAPI, macchia nucleare - blu; barra della scala - 10 m). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Microvessels ha espresso proteine associate a proprietà specifiche di BBB. Le cellule endoteliali all'interno dell'unità neurovascolare (NVU) sono descritte anche dalle proteine associate alle loro proprietà intrinseche di barriera (A). Come si vede nella figura, le cellule endoteliali hanno giunzioni di VE-cadherin, CLDN5, zo-1 (A, giallo) e angulin-1 (A, teal). Essi mostrano anche polarità apicobasale a più proteine tra cui GGT-1 e CXCL12 (A, verde e rosso). Neuroni, oligodendrociti e corpi cellulari astrociti possono essere inclusi nei microvasi isolati, anche se non sono intrinseci alla NVU (B). Questi sono identificabili dall'espressione di NFM (rosso), OSP (ciano) e GFAP (verde lime), rispettivamente( B). Coerentemente con questi, i nostri microvessels isolati hanno espresso la proteina VE-cadherin (C, rossa), le proteine di giunzione strette CLDN5 e -O-1(D, rosso e verde, rispettivamente, unire il giallo), la proteina giunzione tricellulare LSR (E, verde) e i marcatori apicobasal CXCL12 e GGT1(f, rosso e verde). Hanno anche esibito quantità limitate di GFAP (A, verde, G, bianco), OSP (G, verde) e NFM (H, rosso), suggerendo la conservazione trascurabile di cellule unità non neurovascolari (DAPI, macchia nucleare - blu; barra della scala - 10 m). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: La maggior parte dei micronavi isolati non esprime la SMA. L'unità neurovascolare presenta una sofisticata transizione da arteriole-capillare-venule (A). L'espressione anulare SMA identifica chiaramente l'arterile e, man mano che diventa capillare, diminuisce l'espressione sMA (B,rossa), esponendo il marcatore murale NG2 (B, verde). Abbiamo misurato il diametro dei vasi di sMA e sMA (parentesi bianche, n - 20), per distinguerli come arterioli o capillari (DAPI, macchia nucleare , barra della scala blu, 10 m). L'analisi di un test t non accoppiata del diametro delle navi di sMA e di sMA ha mostrato un'elevata rilevanza statistica(C, sMA , rosso/verde, lt; 0,0001). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Isolamento riuscito dei microcascas CNS da altre specie lissencephalic. Il CNS è stato raccolto da una rana selvatica (8,2 cm), lucertola (12,7 cm), trota imaagia allevata da un serbatoio (2 anni, 35,6 cm) e piccione aviaria (9 mesi, 300 g). I microvasi della rana, dei pesci e della lucertola sono stati macchiati da H&E (vengono mostrati solo i microvasi della trota, la barra della bilancia n. 20 m). Le microvessels di piccione sono state immunoetichettate. Siamo stati in grado di identificare microvessels su tutte le regioni come etichettati sui contorni del SNC di pesce e piccione: corteccia (A e H),lobo ottico (B e I),cervelletto ( C e J), iptuitario (D e L), ipotalamo (E e K), tronco cerebrale (F e M), e midollo spinale (G e N). Inoltre, siamo stati in grado di identificare cellule endoteliali con isoletina IB4 (bianco), piedi finali astrociti con AQP4 (verde) e neuroni adiacenti con NFM (rosso) dalle micronavi isolate del piccione (DAPI, macchia nucleare - blu, barra della scala - 10 m). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Isolamento dei microvasi di SNC dalle specie gyrencephalic. Il cervello e il midollo spinale sono stati sezionati da un maiale allevato in fattoria (6 mesi fa, 120 kg) per l'isolamento dei microrecipienti e l'immunolabeling. Siamo stati in grado di identificare positivamente le micronavi etichettate per IB4 (bianco), PDGFR , (rosso) e AQP4 (verde) su tutte le regioni del CNS porcina: corteccia (A), materia bianca periventricolare (B), cerebellum (C), ipofisare (D), ipothalamus (E), tronco encefalico (F), e midollo spinale (G, DAPI, macchia nucleare - blu, barra della scala - 10 m). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Esempio di altra applicazione dell'isolamento dei microrecipient sCIL. L'espressione di JAB-B e VCAM-1 è stata quantificata per le micronavi murine EAE. Le unità arbitrarie di intensità (AUI) sono state misurate per la corteccia, il cervelletto, l'ipotalamo, l'ipofisi, il tronco encefalico e il midollo spinale dei topi in picchi e stadi cronici dell'EAE, con finzione come controllo (n ). Per ogni regione del SNC, sono stati valutati dodici microvasi per topo per determinare l'AUI per fluorocro e il diametro del microvaso (A). Le parentesi bianche mostrano esempi dello strumento di misurazione del software al microscopio confocale utilizzato per determinare l'AUI per VCAM-1 (bianco), VE-cadherin (verde), JAM-B (rosso) e DAPI (blu, barra della scala - 10 m). Quindi, l'AUI risultante è stata tracciata rispetto al diametro in micron (B) per calcolare l'area sotto la curva (AUC) per ogni proteina immunoetichettata come stima dell'espressione della proteina. L'AUC media per gruppo è stata poi analizzata da ANOVA bidirezionale, seguita dal test post hoc di Sidak, per un totale di 48 microvessels per regione CNS. Fatta eccezione per i microvasi ipofisari, non abbiamo osservato grandi differenze tra il diametro dei microrecipient associati allo stato della malattia (C, inserto), ma una significativa diminuzione dell'espressione VE-cadherin dall'ipotalamo e dal tronco encefalico nei topi EAE (C). Analisi statistiche simili hanno mostrato un aumento significativo per VCAM-1 (D) e JAM-B (E) al midollo spinale, coerente con lo stato neuroinfiammatorio durante il picco dell'EAE. È interessante notare che, abbiamo anche osservato cambiamenti per VCAM-1 all'ipotalamo, ipofisaria, e tronco encefalico. Questi risultati sono in fase di studio (barre e punti neri, finta, barre rosse e punti, picco EAE, barre di salmone e punti, EAE croniche, p<0,05, @p<0.01, #p<0.001 e &p<0.0001). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| MV-1 | 10 m HEPES |
| nella soluzione di sale equilibrato di 1x Hank (HBSS) con calcio e magnesio | |
| MV-2 | 18% 70 kDa peso molecolare (MW) dextran |
| in 10 m HEPES/HBSS (MV-1) | |
| MV-2 | 20% 70 kDa MW dextran |
| in 10 m HEPES/HBSS (MV-1) | |
| MV-3 | Albumina del siero bovino 1% (BSA) |
| in 10 m HEPES/HBSS (MV-1) | |
| Fissativo | 4% paraformaldeide (PFA) |
| in 1x salina con buffer fosfato (PBS) pH 7.4 | |
| Buffer di lavaggio | 1x PBS pH 7,4 |
| Permeabilizzazione e buffer di blocco | 10% BSA |
| 0,25% di sovraffattotore nonionico | |
| in 1x PBS pH 7.4 | |
| Diluente anticorpale | 5% BSA |
| 0,25% di sovraffattotore nonionico | |
| in 1x PBS pH 7.4 |
Tabella 1: Soluzioni utilizzate nel protocollo.
| Passaggio/i | Azione |
| 4.1 e 4.1.1 | Mince nella soluzione MV-1 con una lama a spigolo singolo |
| da 4.2 a 4.2.2 | Omogeneizzare nella soluzione MV-1 utilizzando un pestello Potter-ELVJ PTFE o microtubo |
| 5.1 | Rotazione a 2.000 x g,4 gradi centigradi, 10 min |
| da 5.1.1 a 5.1.1.2 | Risospendere il pellet nella soluzione MV-2 |
| 5.2 | Rotazione a 4.400 x g, 4 gradi centigradi, 15 min |
| da 5,3 a 5,5 | Risospendere il pellet con 1 mL di soluzione MV-3 |
| da 6,2 a 6,4,1 | Eluire su un tubo conico da 50 mL attraverso un colino cellulare e risciacquare con soluzione MV-3 |
| 6,5, 6.5.1, 6.6 e 6.7 | Filtro con rete di nylon da 20 m sul supporto del filtro modificato |
| 6.8 | Caricare la rete di nylon nel becher da 50 mL con 10 mL di soluzione MV-3 e agitare per 30 s |
| Da 6,9 a 6,10 | Decant in un tubo conico da 15 mL e girare a 2.000 x g, 4 gradi centigradi, 5 min |
| 6.10 | Risospendi in 1 mL di soluzione MV-3 |
| 6.10.1 | Trasferire su un microtubo da 1,7 ml e girare a 20.000 x g, 4 gradi centigradi, 5 min |
| da 7.1 a 7.3 | Risospendere in 1x PBS e caricare in vetrini ben |
Tabella 2: Layout per l'isolamento di piccoli micronavi vertebrati. Questo grafico è una versione abbreviata del protocollo quando si utilizza un campione lissencephalico.
| Passaggio/i | Soluzione | Azione | Ctx | Cbi | Optare | Bst | M.b | Hyp | fossa |
| 4.1 | MV-1 | Mito sul piatto | 100 mm x 20 mm piatto Petri, 1 mL | n/a | |||||
| 4.2.1 e 4.2.2 | MV-1 | Omogeneizzare | 5 mL, 10 mL Potter-Elvehjem con pestello | 1 mL, micropestle | |||||
| 5.1.1.1 e 5.1.1.2 | MV-2 | Risospendere | 5 mL : 5 mL, 18% Dextran | 1 mL, 20% dextran | |||||
| 5,5 e 6,4,1 | MV-3 | Risospendere | 1 mL e 10-15 mL | 1 mL | |||||
| 6.2 e 6.4.1 | MV-3 | Dimensioni del colino | 100 m | 70 m | 100 m | 70 m | 100 m | ||
| Sciacquare | 5 mL | ||||||||
| 6,5, 6.5.1 e 6.7 | MV-3 | Dimensione del filtro, risciacquo | Filtro da 25 mm, 10 mL | 13 mm, 5 mL | |||||
| 6.8 | MV-3 | Agitare sul becher | 10 mL | ||||||
| 6.10 | MV-3 | Risospendere | 1 mL | ||||||
| 7.2 | 1x PBS | Risospendere | Da 1,5 a 2,0 mL | Da 0,5 a 1,0 mL | Da 0,1 a 0,2 mL | ||||
| 7.3 | 1x PBS | Carico per pozzo | 200 l | 100 ll | Da 25 a 50 l. | ||||
| CTX - corteccia, CBL , cervelletto, BST , tronco encefalico, OPT , lobo ottico (non presente nei mammiferi), HYP , hypotalamo, PIT , pituitary, SC - midollo spinale. I volumi consigliati sono per tessuti interi da animali di dimensioni variabili da 20 g (topo giovane) a 800 g (ratto adulto). | |||||||||
Tabella 3: Volume/dimensione consigliati. Questo schema ha il volume consigliato di soluzioni per l'utilizzo di un piccolo campione di vertebrati che va da 20 a 800 g, o più specificamente, il mouse da 25 g mostrato sul video. La regolazione finale dei volumi necessari deve essere determinata dal ricercatore in base alla quantità specifica di tessuto bagnato ottenuta dopo la dissezione. La pratica e la risoluzione dei problemi sono altamente raccomandate. CTX - corteccia, CBL , cervelletto, BST , tronco encefalico, OPT , lobo ottico (non presente nei mammiferi), HYP , hypotalamo, PIT , pituitary, SC - midollo spinale.
| Passaggio/i | Azione |
| 4.1 e 4.1.2 | Mince in MV-1 con una lama a bordo singolo |
| da 4,3 a 4,3,4 | Omogeneizzare nella soluzione MV-1 utilizzando un macinino Potter-Elvehjem con un pestello PTFE |
| 5.1 | Rotazione a 2.000 x g,4 gradi centigradi, 10 min |
| da 5.1.2 a 5.1.2.2 | Risospendere il pellet nella soluzione MV-2 |
| 5.2 | Rotazione a 4.400 x g, 4 gradi centigradi, 15 min |
| da 5,3 a 5,5 | Risospendere il pellet con 1 mL di soluzione MV-3 |
| da 6,2 a 6,4 e 6,4,2 | Eluire su un tubo conico da 50 mL attraverso un colino cellulare e risciacquare con soluzione MV-3 |
| 6,5, 6,5,2, 6,6 e 6,7 | Filtro con rete di nylon da 20 m sul supporto del filtro modificato |
| 6.8 | Caricare la rete di nylon in un becher da 50 mL con 30 mL di soluzione MV-3 e agitare per 30 s |
| 6.9 e 6.10 | Decant in un tubo conico da 50 mL e girare a 2.000 x g, 4 gradi centigradi, 5 min |
| 6.10 | Risospendi in 1 mL di soluzione MV-3 |
| 6.10.2 | Trasferire su un microtubo da 5 mL e girare a 2.000 x g, 4 . |
| da 7.1 a 7.3 | Risospendere in 1x PBS e caricare in vetrini ben |
Tabella 4: Layout per l'isolamento di micronavi vertebrati di grandi dimensioni. Questo grafico è una versione abbreviata del protocollo quando si utilizza un campione di gyrencephalic.
| Passaggio/i | Soution | Azione | Ctx | Cbi | Wm | Bst | M.b | Hyp | fossa |
| 4.1 | MV-1 | Mito sul piatto | 3-5 mL | 1 mL | |||||
| da 4,3 a 4,3,4 | MV-1 | Omogeneizzare | 20-30 mL, 55 mL Potter-Elvehjem con pestello e stirrer in testa | 5 mL, 10 mL Potter-Elvehjem con pestello | |||||
| da 5.1.2 a 5.1.2.2 | MV-2 | Risospendere | >20 mL, 20% dextran | 5 mL : 5 mL, 20% dextran | |||||
| 5.5, 6.4 e 6.4.2 | MV-3 | Risospendere | 1 mL e 20 mL | 1 mL e 10 mL | |||||
| 6.2 e 6.4.2 | MV-3 | Dimensioni del colino | 100 m | 70 m | 100 m | 70 m | 100 m | ||
| Sciacquare | 10 mL | ||||||||
| 6,5, 6.5.2 e 6.7 | MV-3 | Dimensione del filtro, risciacquo | Filtro da 47 mm, 10 mL | 25 mm, 10 mL | |||||
| 6.8 | MV-3 | Agitare sul becher | 30 mL | ||||||
| 6.10 e 6.10.2 | MV-3 | Risospendere | 1 mL e 4 mL | ||||||
| 7.2 | 1x PBS | Risospendere | Da 2,0 a 4,0 mL | Da 1,0 a 2,0 mL | |||||
| 7.3 | 1x PBS | Carico per pozzo | 200 l | 100 ll | |||||
| CTX - corteccia, CBL , cervelletto, WM , materia bianca, BST , tronco encefalico, HYP , ipotalamo, PIT , pituitario, SC , midollo spinale. I volumi consigliati sono per campioni di 45 cm3 per CTX, CBL, BST e SC interi HYP e PIT. | |||||||||
Tabella 5: Volume/dimensione consigliati. Questo contorno ha il volume consigliato di soluzioni per l'utilizzo di un grande campione di vertebrati. Più specificamente, si applica alle biopsie tissutali del CNS di 45 cm3 per corteccia, cervelletto, materia bianca, tronco encefalico, midollo spinale e all'intero ipotalamo e iptuitario, come mostrato nel video. La regolazione finale dei volumi necessari deve essere determinata dal ricercatore in base alla quantità specifica di tessuto bagnato ottenuta dopo la dissezione. La pratica e la risoluzione dei problemi sono altamente raccomandate. CTX - corteccia, CBL , cervelletto, WM , materia bianca, BST , tronco encefalico, HYP , ipotalamo, PIT , pituitario, SC , midollo spinale.
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Discussion
Il BBB include le proprietà uniche delle cellule endoteliali di microvascolatura cerebrale accoppiate da una sofisticata architettura di stretto, aderenti-, "peg-socket" - giunzioni, e placche di adesione critiche per l'omeostasi CNS2,3,19. Le proprietà delle cellule endote sono indotte e mantenute dai periciti e dall'astroglia circostante i processi di fine piede2,3,19. La microvascolatura BBB mostra la polarità (cioè il modello di espressione asimmetrica delle proteine localizzate su superfici cellulari endoteliali luminari o abluminali)20. Mentre questo può definire brevemente il BBB, in realtà rimane una delle nozioni più enigmatiche in neuroscienza. Ad esempio, le differenze regionali, sessuali e di età all'interno della NVU possono spiegare le vulnerabilità regionali del CNS a traumi, tossicità, infezione e infiammazione, che possono avere gravi conseguenze cliniche3,5,6. Un altro ostacolo nella comprensione della BBB sono le differenze osservate tra i taxa multipli7,8. Uno dei principali ostacoli di comprensione e di indagine della BBB è proprio la difficoltà legata all'isolamento della NVU che comprende la BBB, pur mantenendo le sue proprietà specifiche della barriera14.
Nel tentativo di accelerare la nostra comprensione delle differenze BBB, CNS-regionali, così come le differenze di specie, abbiamo adattato i metodi pubblicati in precedenza. Abbiamo adattato con successo questi, in particolare Boulay et al.21, per ottenere microvessels da singolo corticale, cerebellare, ipotalalamico, ipofiliare, tronco encefacco, e tessuti spinali su una miriade di piccoli vertebrati lissencephalici: pesci, anfibi, rettili, uccelli, e mammiferi (Figura 3, Figura 4, Figura 5 ). Un vantaggio di questo metodo è che i suoi adattamenti si basano sulla dimensione complessiva del tessuto CNS: il ricercatore sceglie la quantità di soluzione, la dimensione della smerigliatrice tissutale, tubo conico, porta filtri, ecc in base al tessuto bagnato, indipendentemente dalle specie, dal sesso e dall'età. Nella nostra esperienza con l'immunoetichettatura, un campione da 20 g produce abbastanza microvessels per un 8 pozzi per corteccia, cervelletto, lobo ottico, tronco encefalico e midollo spinale e mezzo scivolo di 8 pozzetti per ipotalamo e ipofisi. Tuttavia, la resa del lobo corticale e ottico è molto più alta rispetto al cervelletto, al tronco encefalico e al midollo spinale.
Come dimostrato, abbiamo eseguito gli adattamenti necessari per l'isolamento e l'immunoetichettatura di microvessels CNS di suini e macachi, mammiferi ginecofili più grandi che sono più rilevanti per la ricerca traslazionale (Figura 7). In particolare, siamo stati in grado di includere la materia bianca periventricolare solo su queste specie. Poiché il CnS in questi animali è più grande, abbiamo raccolto abbastanza materia bianca da permetterci di separare un pellet di microvessel dallo strato di mielina durante la seconda centrifugazione (passaggio 5.3, MV-2 con 20% dextran). Ipotizziamo che sia necessaria una massa critica per essere in grado di achive questa separazione e stiamo attivamente cercando come ottenere un risultato simile con il tessuto SNC murino.
Anche se omessi per semplicità, abbiamo eseguito l'immunoetichettatura oltre i marcatori canonici NVU su microvasi aviari, porcina e macachi. In particolare, tutte le specie hanno condiviso marcatori cellulari e molecolari precedentemente identificati su campioni di murini come rilevanti per la funzione BBB (proteine di giunzione VE-cadherin, CLDN5, zo-1, e marcatori LSR e apicobasal CXCL12 e GGT1) o in prossimità di NVU (NFM, OSP e GFAP). Ancora una volta, questi risultati incoraggiano l'uso di questo metodo su altre specie per identificare ulteriormente l'ortologica NVU e la divergenza tra le specie. Apre inoltre l'opportunità di ulteriori indagini sul ceppo NVU, sul sesso e sulle differenze di età all'interno della stessa specie e sulla fattibilità di utilizzare altri organismi per la ricerca biomedica BBB. Dimostriamo anche un uso efficace di questo metodo di isolamento dei microrecipienti per quantificare i cambiamenti nei livelli di espressione delle proteine durante la neuroinfiammazione (Figura 8). Anche se abbiamo eseguito questo esperimento come prova di concetto, l'approccio qui utilizzato è attualmente ampiamente sfruttato nel nostro laboratorio. Preferiamo questo approccio rispetto ad altri metodi quantitativi (ad esempio, macchia occidentale) perché vogliamo concentrarci non solo sul livello di espressione ma sull'abbondanza relativa di proteine, la delocalizzazione di CXCL12 e altre proteine apicobasali, il collegamento di proteine giunzionali, ecc., all'interno del complicato aspetto dei microvasi CNS9,13,22. Allo stesso modo, stiamo attualmente risolvendo il nostro metodo per altre applicazioni, come l'ulteriore isolamento dei componenti cellulari NVU (cellule endoteliali e periciti), RNA-seq, e proteomica23,24,25,26.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Dr. Cruz-Orengo è stato sostenuto dalla University of California, Davis, School of Veterinary Medicine Start Up Funds.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS | ThermoFisher | BP39920 | Used for blocking and antibody diluent. |
| 20% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | Used as fixative (4% PFA) |
| 70,000 MW Dextran | Millipore Sigma | 9004-54-0 | Used for MV-2 solution |
| Adson Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11006-12 | Used for removal of muscle and skin |
| Adson Forceps, student quality | FST | 91106-12 | Same as above but cheaper |
| Bovine serum albumin (BSA) | Millipore Sigma | A7906-100G | Used for MV-3 solution, blocking and antibody diluent |
| Corning 100 μm Cell strainer | Millipore Sigma | CLS431752-50EA | |
| Corning 70 μm Cell strainer | Millipore Sigma | CLS431751-50EA | |
| Corning Deskwork low-binding tips | Millipore Sigma | CLS4151 | Same as below but cheaper. |
| Cultrex Poly-D-Lysine | R&D | 3439-100-01 | Used for slide coating |
| Donkey anti-Goat IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21432 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Mouse IgG-ALEXA 488 | Thermo | A21202 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 488 | Thermo | A21206 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 647 | Thermo | A31573 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rat IgG-DyLight 650 | Thermo | SA5-10029 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Double-Pronged Tissue Pick | FST | 18067-11 | Used for removal of meninges and choroid plexus |
| Dumont #3c Forceps | FST | 11231-20 | Used for more delicate and/or small CNS tissue handling (like pituitary) |
| Dumont #7 Forceps | FST | 11274-20 | Used for CNS tisssue dissection and handling |
| Dumont #7 Forceps, student | FST | 91197-00 | Same as above but cheaper |
| ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Tips | Eppendorf | 22493008 | Better quality than the tips above (more expensive). |
| Extra Fine Graefe Forceps, serrated | FST | 11151-10 | Used for bone removal |
| Fine Scissors, sharp | FST | 14060-09 | Used for removal of pig and macaque dural sac |
| Glass Pestle 1.5 mL Microcentrifuge Tube Tissue Grinder Homogenizer, Pack of 10 | Chang Bioscience Inc. (eBay) | GP1.5_10 | Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Goat anti-CXCL12, biotinylated | PeproTech | 500-P87BGBT | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution: 1:20. |
| Goat anti-JAM-B | R&D | AF1074 | Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 488 | Thermo | A11001 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21424 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-PDGFRβ | R&D | AF1042 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Goat anti-Rabbit IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21249 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Rabbit IgG-DyLight 488 | Thermo | 35552 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Rat IgG-DyLight 650 | Thermo | SA5-10021 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Graefe Forceps, curved tip, 1X2 teeth | FST | 11054-10 | Use for nylon filter net holding and shaking |
| HBSS, 1X buffer with calcium and magnesium | Corning | 21-022-CM | Used for MV-1 solution |
| HEPES, 1M liquid buffer | Corning | 25-060-CI | Used for MV-1 solution |
| Isolectin GS-IB4-Biotin-XX | ThermoFisher Scientific (Thermo) | I21414 | Glycoprotein isolated from legume Griffonia simplicifolia that binds D-galactosyl residues of endothelial cell glycocalysx. Used for avian and porcine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| LaGrange Scissors, serrated | FST | 14173-12 | Used for skull dissection and laminectomy (except pig and macaque) |
| Millicell EZ slide 8-well unit | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| Mouse anti-CLDN5 | Thermo | 35-2500 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-GGT1 | Abcam | ab55138 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-Human CD31 | R&D | BBA7 | Used as primary antibody on primate CNS microvessels. Recommended concentration: 16.5 μg/mL. |
| Mouse anti-NFM | Thermo | RMO-270 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-αSMA | Thermo | MA5-11547 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Nylon Filter Net, roll | Millipore Sigma | NY6000010 | Laser-cut to 13 mm diameter filter net discs. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Nylon Filter Nets, 25 mm | Millipore Sigma | NY2002500 | Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Nylon Filter Nets, 47 mm | Millipore Sigma | NY2004700 | Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | ThermoFisher | P36935 | Used to coverslip slides. |
| Rabbit anti-AQP4 | Millipore Sigma | A5971 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rabbit anti-LSR | Millipore Sigma | SAB2107967 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rabbit anti-NG2 | Millipore Sigma | AB5320 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rabbit anti-OSP | Abcam | ab53041 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 1 μg/mL. |
| Rabbit anti-VE-Cadherin | Abcam | ab33168 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rabbit anti-ZO-1 | Thermo | 61-7300 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rat anti-CD31 | Becton Dickinson | BD 550274 | Used as primary antibody for murine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rat anti-GFAP | Thermo | 13-0300 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rat anti-VCAM-1 | Becton Dickinson | BD 553329 | Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Sterile Ringer's Solution, Frog | Aldon Corporation | IS5066 | Used for amfibian anesthesia |
| Streptavidin-ALEXA 555 | Thermo | S32355 | Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500. |
| Streptavidin-ALEXA 647 | Thermo | S32357 | Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500. |
| Surgical Scissors, sharp | FST | 14002-12 | Used for removal of muscle and skin |
| Surgical Scissors, sharp-blunt | FST | 14001-16 | Used for decapitation (except pig and macaque) |
| Swinnex Filter Holder, 13 mm | Millipore Sigma | SX0001300 | Modified by laser-cut. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Swinnex Filter Holder, 25 mm | Millipore Sigma | SX0002500 | Modified by laser-cut. Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Swinnex Filter Holder, 47 mm | Millipore Sigma | SX0004700 | Modified by laser-cut. Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
| Triton X-100 | ThermoFisher | 50-165-7277 | Used for blocking and antibody diluent. |
| Wheaton 120 Vac Overhead Stirrer | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 62400-904 (DWK #903475) | Used for macaque and pig CNS tissues with 55 mL tissue grinder, except hypothalamus and pituitary. |
| Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 10 mL | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 14231-384 (DWK #357979) | Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 55 mL | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 14231-372 (DWK #357994) | Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
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