Summary
Het doel van dit protocol is het isoleren van micro vaartuigen uit meerdere regio's van het centrale zenuwstelsel van lissencefische en gyrencephalic vertebraten.
Abstract
Isolatie van micro vaten van het centrale zenuwstelsel (CNS) wordt vaak uitgevoerd door het combineren van corticale weefsel van meerdere dieren, meestal knaagdieren. Deze aanpak beperkt de ondervraging van bloed-hersen barrière (BBB) eigenschappen tot de cortex en staat niet toe voor individuele vergelijking. Dit project richt zich op de ontwikkeling van een isolatiemethode die het mogelijk maakt voor de vergelijking van de neurovasculaire eenheid (NVU) uit meerdere gebieden van de CNS: cortex, cerebellum, Optic kwbe, hypothalamus, hypofyse, hersenstam, en ruggenmerg. Bovendien, dit protocol, oorspronkelijk ontwikkeld voor Murine monsters, werd met succes aangepast voor gebruik op CNS weefsels van kleine en grote gewervelde soorten waaruit we ook in staat zijn om micro vaten te isoleren van hersen halfrond witte materie. Deze methode, wanneer gekoppeld met immunolabeling, maakt kwantificering van eiwit expressie en statistische vergelijking tussen individuen, weefseltype of behandeling mogelijk. We bewees deze toepasbaarheid door veranderingen in de eiwit expressie te evalueren tijdens experimentele auto-immune encefalomyelitis (EAE), een muriene model van een neuroinflammatoire ziekte, multiple sclerose. Bovendien kunnen micro tanks die door deze methode worden geïsoleerd, onder andere worden gebruikt voor downstreamtoepassingen zoals qPCR, RNA-SEQ en Western Blot. Hoewel dit niet de eerste poging is om CZS-micro vaartuigen te isoleren zonder het gebruik van ultracentrifugatie of enzymatische dissociatie, is het uniek in zijn bedrevenheid voor de vergelijking van individuele personen en meerdere CZS-regio's. Daarom is het mogelijk voor onderzoek van een aantal verschillen die anders mogelijk onduidelijk blijven: CNS porties (cortex, cerebellum, optiek kwabben, hersenstam, hypothalamus, hypofyse, en ruggenmerg), CNS weefseltype (grijze of witte stof), individuen, experimentele behandelingsgroepen en soorten.
Introduction
Ons brein is het belangrijkste orgaan in ons lichaam. Om deze reden, houden van de hersenen homeostase ondanks externe factoren die een afwijking van normaliteit kan leiden is een prioriteit. Volgens sommige geleerden, ongeveer 400 – 500 miljoen jaar geleden1, gewervelde dieren ontwikkeld wat we nu kennen als de bloed-hersen barrière (BBB)2,3. Deze beschermende "hek" oefent de grootste invloed op homeostase van het centrale zenuwstelsel (CNS) en functies door het transport van ionen, moleculen en cellen tussen bloed en CNS parenchym strak te reguleren. Wanneer de BBB wordt verstoord, de hersenen wordt vatbaar voor toxische blootstelling, infectie, en ontsteking. Daarom, BBB dysfunctie wordt geassocieerd met vele, zo niet alle, neurologische en neurodevelopmental aandoeningen4,5,6.
De verfijnde functie van de BBB wordt toegeschreven aan de unieke CNS Microvasculatuur aan normen voldoende door de neurovasculaire eenheid (NVU)2,3. Zeer gespecialiseerde endotheliale cellen, pericytes en astrocytische eind voeten zijn de cellulaire componenten van de nvu2,3. De extracellulaire matrix gegenereerd door deze cellen is ook essentieel voor de nvu en BBB fysiologie2,3. Hoewel essentiële cellulaire en moleculaire componenten van de nvu onder gewervelde dieren worden bewaard, wordt heterogeniteit gerapporteerd bij orders en soorten7,8. Technische beperkingen belemmeren echter ons vermogen om deze verschillen in neurobiologie, biomedisch of translationeel onderzoek volledig te overwegen.
Daarom hebben we een regiospecifieke microvessel-isolatiemethode voor het CZS uitgebreid om het toepasbaar te maken op tal van soorten uit alle vijf gewervelde groepen: vissen, amfibieën, reptielen, vogels en zoogdieren. Het protocol wordt beschreven voor gebruik op kleine lissencefale en groot-gyrencephalic Vertebraten, met inbegrip van soorten met translationele relevantie9. Bovendien, we nemen andere regio's van het CZS niet eerder onderzocht in deze context, maar relevant voor neurofysiologie en met enorme klinische implicaties: de hypothalamus, hypofyse, en witte materie. Tot slot testten we de capaciteit van deze isolatiemethode als een betrouwbaar hulpmiddel om veranderingen in eiwit expressie langs de nvu en/of BBB9,10,11te identificeren. Als proof-of-concept hebben we laten zien hoe veranderingen in VCAM-1 en JAM-B-expressie tijdens EAE kunnen worden vastgesteld met behulp van de isolatiemethode gevolgd door immunofluorescentie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures van de huidige studie zijn in overeenstemming met de richtlijnen die zijn vastgesteld door de Universiteit van Californië (UC), Davis institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC). Animal Care bij UC Davis wordt gereguleerd door verschillende onafhankelijke bronnen en is volledig geaccrediteerd door de vereniging voor beoordeling en accreditatie van Laboratory Animal Care International (AAALAC) sinds 1966. De weefsels van varkens CNS werden verkregen van het UCD-departement van Dierwetenschappen, het laboratorium voor vlees wetenschappen. CNS weefsels van rhesus makaken werden verkregen van de California National Primate Research Center pathologie Department (NIH P51OD011107). Er werd geen verdoving, euthanasie of obductie uitgevoerd door laboratoriummedewerkers op varkens en makachtigen. Daarom zijn er geen specifieke aanbevelingen met betrekking tot deze kwesties.
Opmerking: deze methode is gevalideerd voor meerdere soorten, maar het opgegeven protocol komt meer rechtstreeks overeen met muizen en varkens weefsels. Details met betrekking tot de optiek kwab zijn niet van toepassing bij gebruik van zoogdier monsters. Alle biogevaarlijke materialen moeten worden behandeld in een passende faciliteit voor bioveiligheidsniveau (BSL). Alle acuut giftige materialen moeten worden behandeld onder een rook afzuigkap. Alle biologisch gevaarlijke medische afvalstoffen en acuut giftig afval moeten naar behoren worden afgevoerd.
1. voorbereiding
- Bereid oplossingen (tabel 1) ten minste één dag vooruit.
Opmerking: het is zeer moeilijk om 70 kDa molecuulgewicht (MW) dextran op te lossen. Het is efficiënter om de oplossing 's nachts te laten roeren met een paraffine film of folie. Het protocol vereist het gebruik van twee verschillende MV-2-oplossingen, afhankelijk van het onderzochte model. De 18% dextran scheidt de myeline efficiënt van de microvat pellet bij het uitvoeren van het protocol op kleine lissencefische specimens. Echter, het ontwikkelt een uitstrijkje van myeline binnen de interface van CNS weefsels van grote gyrencephalic specimens, evenals de hypothalamus en de hypofyse uit kleine specimens. Dit uitstrijkje wordt voorkomen door 20% dextran te gebruiken. - Maak goed dia's door het laden van 50 μL per put van poly-D-Lysine en laat drogen voor 2 h bij kamertemperatuur (RT), bij voorkeur in een biologische veiligheidskast-klasse 2 (BSC-2). Niet overdrogen. Spoel tweemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en bewaar in de koelkast tot het klaar is voor gebruik.
2. CNS weefsel dissectie van kleine Lissencephalic gewervelde specimen
Opmerking: het artikel toont de toepassing van het protocol op een C57BL6/J, 10 week-oud, ~ 25 g, mannelijke muis.
- Bereid de conische buizen van 2 15 mL en een micro centrifugebuis van 1,7 mL met respectievelijk 5 mL en 1 mL van de MV-1 oplossing per preparaat. Houd tubes op ijs.
- Esthetisering
- Anesthetize muizen door intraperitoneale injectie van een ketamine, xylazine, en Acepromazine anestheticum cocktail op 100/10/3 mg per kg lichaamsgewicht en spray met 70% ethanol. Bevestig anesthesie door de afwezigheid van palpebrale en pedaal reflexen te beoordelen door het aanraken van een oog en het knijpen van een voet, respectievelijk.
- Anesthetize duiven door inademing van 5% Isofluraan met behulp van een inductie anesthesie doos.
- Anesthetiseren vis en kikkers in 1% tricaïne in ofwel een vis houden watertank of amfian Ringer-oplossing (tabel van materialen), respectievelijk.
- Anesthetiseer hagedissen door te koelen bij 4 °C voorafgaand aan euthanasie.
- Onthooi het dier met een chirurgische schaar, Pel de huid weg met een tang om de schedel bloot te leggen en snijd met LaGrange-schaar door het foramen magnum (Figuur 1A).
- Dissteer de hersenen uit met een spatel en breng over naar een conische buis van 15 mL met MV-1-oplossing. Houd Tube op ijs.
- Haal de hypofyse uit de Sella turcica van de schedel met een tang en breng over naar een micro centrifugebuis van 1,7 ml met MV-1-oplossing. Houd Tube op ijs.
- Verwijder de huid en spieren om de wervelkolom bloot te leggen. Knip de ledematen, ribbenkast en inwendige organen uit (Figuur 1B).
- Ontleden het ruggenmerg door een van de twee methoden die hieronder worden beschreven. Breng vervolgens over naar een conische buis van 5 mL met MV-1-oplossing. Houd Tube op ijs.
- Voer laminectomie uit door in een rostrale migratoire naar caudale richting te snijden met LaGrange-schaar, beginnend door het halswervel foramen, totdat het lumbale koord wordt bereikt.
- Voer doorspoelen in een caudal tot rostrale richting door de lumbale Vertebrale foramen met een 18 G naald en 10 ml spuit geladen met MV-1 oplossing (Figuur 1C, D).
Let op: deze methode werkt alleen met zeer kleine specimens, meestal knaagdieren (< 100 g).
- Snijd met behulp van een ontleed bereik de durale zak van het ruggenmerg met veer schaar en verwijder de overgebleven hersenvliezen met een dubbele uitsteken (Figuur 2).
- Breng de hersenen over naar een Petri schaaltje en verwijder met een ontleed bereik de hersenvliezen met een dubbele uitsnede (Figuur 2a – C).
- Accijnzen de olfactorische bollen en thalamus met Tang, Iris schaar, en veer schaar. Gebruik de dubbele-pronged pick, verwijder de vaatvlies plexus uit alle hersenventrikels. Zorg ervoor dat u alle vaatvlies plexus verwijdert.
Let op: de vaatvlies plexus en olfactorische bollen vormen een enorme bron van verontreiniging. In tegenstelling tot de BBB, deze capillairen zijn zeer fenestrated en de resultaten van de daaropvolgende experimenten zullen worden aangetast als ze niet worden verwijderd. - Met behulp van Tang, scheiden de verschillende CNS regio's: cortex, cerebellum, hersenstam, optiek kwal (niet op zoogdieren specimens), en hypothalamus.
3. CNS weefsel dissectie van een grote Gyrencephalic gewervelde specimen
Opmerking: dit protocol maakt gebruik van varkens CNS weefsels verkregen uit een abattoir. Daarom wordt geen verdoving, euthanasie of obductie beschreven of hier getoond.
- Transport van varkens CNS weefsels in een 0,946 L (32 oz) histologie container geladen met MV-1 oplossing in een ijskist/emmer.
- Met behulp van een ontleed bereik, verwijder de hersenvliezen met een dubbele-pronged pick, Tang, Iris schaar, en veer schaar van elk CZS weefsel. Zorg ervoor dat u alle stukjes vaatvlies plexus uit de hersenventrikels verwijdert.
4. homogenisatie van het CZS-weefsel
Opmerking: het is efficiënter wanneer twee onderzoekers zich bezighouden met het homogenisatie proces: één ontleden van de hersenvliezen onder de stereoscoop en de andere die de fijngehakte weefsels homogeniseren. Op deze manier worden de weefsels snel teruggevoerd naar de ijsemmer en koud gehouden.
- Plaats elke CNS regio op een Petri schaaltje met ~ 1 mL MV-1 oplossing. Met behulp van een single-Edge Blade, gehakt het weefsel om 1 – 2 mm stukken te verkrijgen.
- Voor een klein gewervelde specimen, gebruik een 100 mm x 20 mm Petri schaaltje.
- Voor een groot gewervelde specimen, gebruik een 150 mm x 15 mm Petri schaal.
- Homogenisatie van een klein gewervelde specimen (tabel 2 en tabel 3)
- Breng de cortex, cerebellum, hersenstam, optische LOB en het ruggenmerg over naar ~ 1 mL MV-1 oplossing in een individuele 10 mL Potter-Elvehjem glas slijpmachine met een PTFE-stamper met behulp van een transfer pipet. Voeg 5 mL MV-1 oplossing toe en homogeniseren elk weefsel (~ 10 slagen). Breng aan op individuele conische buizen van 15 mL. Houd tubes op ijs.
Opmerking: voor een kleine gewervelde, 5 of 4, met of zonder optiek, respectievelijk, 10 ml Potter-elvehjem slijpmachines en 15 ml conische buizen zijn nodig. - Breng de hypothalamus en hypofyse met de Tang naar ~ 100 μL MV-1 oplossing in een individuele 1,7 mL buis en zorgvuldig homogeniseren met een glazen micro stamper. Spoel elke micro stamper af met ~ 1 mL MV-1 oplossing. Houd Tube op ijs.
Opmerking: voor een kleine gewervelde zijn 2 glazen micro pestles en 1,7 mL tubes nodig.
- Breng de cortex, cerebellum, hersenstam, optische LOB en het ruggenmerg over naar ~ 1 mL MV-1 oplossing in een individuele 10 mL Potter-Elvehjem glas slijpmachine met een PTFE-stamper met behulp van een transfer pipet. Voeg 5 mL MV-1 oplossing toe en homogeniseren elk weefsel (~ 10 slagen). Breng aan op individuele conische buizen van 15 mL. Houd tubes op ijs.
- Homogenisatie van een groot gewervelde specimen (tabel 4 en tabel 5)
- Gebruik een pipet voor overdracht en breng het fijngehakte weefsel over naar een 55 mL Potter-Elvehjem glas slijpmachine met een PTFE-stamper en Bevestig aan bovengrondse roerder. Voeg de helft van het aanbevolen volume MV-1-oplossing toe, volgens het specifieke CZS-gedeelte (tabel 5).
- Zet de Bovenroerder op zeer lage snelheid (~ 150 rpm) en beweeg de glazen buis voorzichtig op en neer voor ongeveer 30 s.
- Schakel de overhead roerder uit, voeg meer MV-1-oplossing toe en herhaal stap 4.3.2 totdat een homogene slurry wordt verkregen.
- Breng over naar een conische buis van 50 mL. Houd Tube op ijs.
- Was de molen met gedeïoniseerd water tussen de homogenisatie van het CZS-weefsel.
Opmerking: voor een groot gewervelde 5 of 4, met of zonder witte stof, respectievelijk, zijn 50 mL conische buizen nodig. Evenzo, twee (2) 15 mL conische buizen zijn nodig voor de hypothalamus en hypofyse.
5. zuivering van micro vaten
- Centrifugeer weefsel homogeniteert als gevolg van stap 4.2.1, 4.2.2 of 4.3.4 bij 2.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c. Een grote witte interface van myeline zal op de top van de pellets van de roodachtige micro vaten worden vormgegeven. Gooi de supernatants weg.
- Klein gewervelde specimen (tabel 2 en tabel 3)
- Respendeer de cortex, cerebellum, hersenstam, optische LOB en ruggenmerg pellets in 5 mL ijskoude MV-2-oplossing met een serologische Pipet van 5 mL (~ 10 flushes). Voeg 5 mL ijskoude MV-2-oplossing toe aan elke suspensie en meng zorgvuldig door de buizen te spiegelen.
- Respendeer de hypothalamus en hypofyse pellets met 1 mL MV-2 oplossing.
- Groot gewervelde specimen (tabel 4 en tabel 5)
- Voeg 20 mL ijskoude MV-2-oplossing toe aan de cortex, cerebellum, hersenstam en pellets van ruggenmerg microvaten. Resuspendeer de pellets door te mengen op een buis revolver Shaker, roeren bij 40 rpm gedurende ~ 5 min. balanceer de volumes van de conische buizen van de cortex, cerebellum, hersenstam en suspensies van het ruggenmerg door meer MV-2-oplossing toe te voegen.
- Respendeer de hypothalamus en hypofyse-microvat pellets in 5 mL MV-2-oplossing met een serologische Pipet van 5 mL (~ 10 flushes). Voeg 5 mL ijskoude MV-2-oplossing toe aan de suspensies en meng zorgvuldig door de buis te spiegelen.
- Klein gewervelde specimen (tabel 2 en tabel 3)
- Centrifugeer bij 4.400 x g gedurende 15 minuten bij 4 °c.
- Verwijder voorzichtig de dikke en dichte myeline laag op de vloeistof interface van de wanden van elke buis door de buizen langzaam te roteren en de supernatant langs de wanden te laten passeren.
- Gooi de myeline en vloeibare interface weg en DEP de binnenwand van elke buis met een spatel gewikkeld met een laag-pluis papier doekje. Voor kleine gewervelde specimens, verwijder de myeline laag uit elke hypothalamus en hypofyse buis door voorzichtig te zuigen met een pipet voor overdracht.
- Veeg overtollige vloeistof af met een gedraaid, laag pluis papier doekje. Respendeer elke pellet met 1 mL MV-3 oplossing met behulp van low-binding tips. Houd tubes op ijs.
6. elutie en filtratie van micro vaten
- Giet ijskoude MV-3 oplossing in individuele bekers voor elke CNS-regio. Bewaren bij 4 °C.
- Voor kleine gewervelde specimens, gebruik 10 mL MV-3 oplossing per 50 mL bekerglas. Een totaal van 6 – 7 bekers is noodzakelijk, afhankelijk van of de optiek kwab is opgenomen.
- Voor grote gewervelde specimens, gebruik 30 mL MV-3 oplossing per 100 mL bekerglas. Een totaal van 6 – 7 bekers is nodig, afhankelijk van of witte stof is opgenomen.
- Plaats een celzeef bovenop een conische buis van 50 mL. Gebruik één per CZS-regio. Gebruik een 100 μm zeef voor de cortex, hersenstam, optiek kwal, ruggenmerg en hypofyse. Gebruik een 70 μm celzeef voor de cerebellum en de hypothalamus.
- Bevochtig elke zeef met 1 mL ijskoude MV-3 oplossing.
- Voeg meer MV-3 oplossing toe aan de suspensies bereid in stap 5,5 met een serologische pipet tijdens het mengen om aggregaten te voorkomen. Micro vaten op de zeef zorgvuldig laden. Spoel af met ijskoude MV-3 oplossing.
- Voeg voor kleine gewervelde specimens (tabel 2 en tabel 3) 10 – 15 ml MV-3-oplossing met een serologische Pipet toe en spoel af met 5 ml MV-3-oplossing.
- Voeg voor grote gewervelde specimens 20 mL MV-3-oplossing toe met een serologische pipet en spoel met 10 mL MV-3 oplossing.
- Monteer de filtratie-eenheid door een nylon netfilter van 20 μm op een gemodificeerde filterhouder (Figuur 2D) te plaatsen, één per CZS-gebied.
- Voor kleine gewervelde specimens (tabel 2 en tabel 3), gebruik 25 mm gemodificeerde filterhouders voor de cortex, cerebellum, hersenstam, optische LOB en het ruggenmerg. Gebruik 13 mm gemodificeerde filterhouders voor de hypothalamus en hypofyse.
- Voor grote gewervelde specimens (tabel 4 en tabel 5), gebruik 47 mm gemodificeerde filterhouders voor de cortex, cerebellum, hersenstam en het ruggenmerg. Gebruik 25 mm voor de hypothalamus en hypofyse.
- Plaats het filter bovenop een conische buis van 50 mL en een natte filter met 5 mL ijskoude MV-3-oplossing, waardoor de filterhouder naar de conische buis stroomt.
- Breng de eluteerde micro vaten (vanaf stap 6,4) bovenop de 20 μm nylon netfilter en spoel de micro vaten af met 5 – 10 mL ijskoude MV-3-oplossing.
- Herstel het filter met behulp van een schone Tang en dompel het in het bekerglas met de ijskoude MV-3 oplossing, bereid in stap 6,1.
- Maak de micro vaten los van het filter door het zachtjes schudden voor ongeveer 30 s. Giet voor kleine gewervelde specimens het bekerglas in een conische buis van 15 mL. Giet voor grote gewervelde specimens het bekerglas in een conische buis van 50 mL.
- Centrifugeer bij 2.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c en breng de pellet in 1 ml IJSKOUDE MV-3-oplossing door met een laag bindende pipetpunt.
- Voor kleine gewervelde specimens, breng de suspensie (vanaf stap 6,10) over in een micro centrifugebuis van 1,7 mL en centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c.
Opmerking: deze spin wordt uitgevoerd op een tafel-centrifuge op maximale snelheid (~ 20.000 x g) om een robuuste opbrengst te garanderen. - Voor grote gewervelde specimens, breng de suspensie van stap 6,10 over in een micro centrifugebuis van 5,0 mL, Voeg 4 mL MV-3-oplossing toe en centrifugeer bij 2.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c.
- Voor kleine gewervelde specimens, breng de suspensie (vanaf stap 6,10) over in een micro centrifugebuis van 1,7 mL en centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c.
7. immunokleuring
Opmerking: de kleuring van HEMA Oxylin en eosine (H & E) werd uitgevoerd op reptielen, amfian en visspecimens als een proof-of-concept van de haalbaarheid van het protocol. Daarom is er geen aanbeveling voor immunolabeling voor deze specimens.
- Verwijder de supernatant van de micro centrifugebuizen.
- Rebreng de pellet in 1x steriele PBS met een laag bindende pipetpunt (tabel met materialen). Houd de micro vaten van het vormen van aggregaten door meerdere malen te pipetten. Gebruik voor kleine gewervelde specimens (tabel 3) ~ 100 μl – 2000 μl volgens de korrelgrootte. Gebruik bij grote gewervelde specimens (tabel 5) ~ 1.000 μl – 4000 μl volgens de korrelgrootte.
- Gebruik een low-binding pipetpunt, breng de micro vaten over naar goed dia's, wees voorzichtig om ze toe te voegen aan het midden van elke put, waarbij de zijwanden worden vermeden.
- Stel de goed glijbanen, blootgelegd, in een BSC-2, en laat drogen voor 20 aan 30 min bij RT.
Opmerking: een relatief hoog volume van 1x PBS wordt gebruikt om geaggregeerde vorming te voorkomen. Daarom is het noodzakelijk om de glaasjes voorafgaand aan fixatie te laten drogen om ervoor te zorgen dat de micro vaten worden vastgehouden door de poly-D-Lysine coating. - Verwijder de resterende 1x PBS door pipetteren met een pipet voor overdracht, voeg 200 μL van 4% Paraformaldehyde (PFA) toe en inbroed gedurende 30 minuten bij RT.
- Pipetteer de fixatieve oplossing en spoel 3x met 200 μL 1x PBS gedurende 5 minuten bij RT.
Opmerking: H & E kleuring op vissen, amfian, en reptiel CNS micro vaartuigen werd uitgevoerd op dit punt. - Voeg 200 μL blokkerende buffer toe aan de put-Slide en inincubatie voor 60 min bij 37 °C.
- Verwijder de blokkerende buffer met een pipet voor overdracht en voeg 200 μL van de cocktail van het primaire antilichaam toe in antilichaam verdunningsmiddel (tabel met materialen). Incuberen bij 4 °C 's nachts.
- Pipetteer de cocktail van het primaire antilichaam en spoel 3x met 200 μL 1x PBS gedurende 5 minuten bij RT.
- Laad de cocktail van het secundaire antilichaam (tabel met materialen), verdund in 1x PBS, en inincuberen voor 2 uur bij RT, beschermd tegen licht.
- Pipetteer de cocktail van het secundaire antilichaam en was 3x met 200 μL 1x PBS gedurende 5 minuten bij RT, beschermd tegen licht. Na de laatste Wash los het frame van de goed-Slide en dep-droog elke overmaat 1x PBS met een laag pluis papier doekje.
- Voeg een dekslip, vloeibaar antifade inbedmiddel medium, en 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) voor nucleaire kleuring. Laat 's nachts drogen op RT beschermd tegen licht.
- Eenmaal droog, blijf beschermd tegen licht op een Slide box bij 4 °C tot het klaar is voor confocale microscopie en data-acquisitie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Micro vaten geïsoleerd uit Murine CNS toonde alle intrinsieke cellulaire componenten van de neurovasculaire eenheid2,3. Met behulp van ofwel bloedplaatjes endotheliale cel adhesie molecuul-1 (PECAM, ook bekend als CD31) of isolectine IB4 (een glycoproteïne dat de endotheel cel glycocalyx bindt) voor endotheel cellen, trombocyten afgeleide groeifactor-β (PDGFRβ) of neuron-glial antigeen 2 (NG2) voor pericytes en aquaporin-4 (AQP4) voor astrocytische eind voeten (Figuur 3a, B) toont aan dat deze intrinsieke componenten aanwezig zijn in geïsoleerde micro vaten. CZS-regio's zichtbaar zijn de corticale micro vaten (Figuur 3B), cerebellum (Figuur 3C), hypofyse (Figuur 3D), hypothalamus (Figuur 3E), hersenstam (Figuur 3F) en ruggenmerg (Figuur 3G). Alle toonde uitdrukking van deze canonieke markeringen.
Evenzo toonden de micro vaten expressie van hecht verbinding eiwit VE-cadherin (Figuur 4A, C), nauwe junctie eiwitten Claudin-5 en zonula OCCLUDENS-1 (CLDN5 en zo-1, Figuur 4a, D), tricellulair Junction proteïne Angulin-1 (Figuur 4a, E) en apicobasal markers C-X-C motief CHEMOKINE LIGAND 12 en gamma-glutamyltransferase 1 (CXCL12 en GGT1, Figuur 4a, F). Deze bevindingen zijn relevant omdat deze eiwitten indicatoren zijn van cruciale BBB-specifieke eigenschappen9,12,13,14. Een beperkte aanwezigheid van astrocyten, oligodendrocyten, en neuronen die het gliale fibrillair zure eiwit (GFAP, Figuur 4B, C, G), Oligodendrocyt specifiek eiwit (OSP, Figuur 4b, g) en Neurofilament-medium (NFM, figuur 4b, H) uitdrukken, tonen aan dat geïsoleerde micro vaten verwaarloosde sporen van ongewenste niet-neurovasculaire eenheids cellen hadden. Bovendien was de meerderheid van de micro vaten verstoken van de uitdrukking van de α-gladde spier actine (αsma, Figuur 5B, C). Dit is relevant omdat αsma een marker is voor gladde spiercellen die geassocieerd zijn met arteriolen en venulen (Figuur 5a), wat aangeeft dat dit isolatie protocol selectief gericht is op kleine kaliber micro vaten15.
Micro vaten verkregen uit andere kleine lissencephalische gewervelde dieren delen een aantal morfologische kenmerken, zoals te zien in vissen (kikker en hagedis niet getoond) en aviaire micro vaten. Dit suggereert dat deze methode nuttig is voor het verder karakteriseren van verschillen in de NVU tussen soorten (Figuur 6). Bovendien vertoonden aviaire CZS-micro vaten (Figuur 6H – N) Kruisreactiviteit met veel van de antilichamen die voor mens en muis zijn ontwikkeld. Dit stimuleert verder onderzoek naar aviaire specimens voor biologische en biomedische BBB-studies. We observeerden vergelijkbare resultaten toen we micro vaartuigen geïsoleerd van varkens en makachtigen, twee gyrencefische soorten (Figuur 7). Alleen NVU-canonieke markeringen in varkens microvaten worden weergegeven. Naast de bovengenoemde CZS-regio's konden we micro vaten isoleren van periventriculaire witte stof (Figuur 7B). Dit is relevant omdat witte materie betrokken is bij neuroinflammatoire aandoeningen (bijv. multiple sclerose16,17,18).
We wilden erachter te komen of deze methode kan worden gebruikt als een betrouwbare tool om te bepalen van veranderingen in eiwit expressie. Wetende dat VCam-1 en jam-B betrokken zijn geweest bij het neuroinflammatoire proces bij het ruggenmerg tijdens EAE, hebben we besloten om de uitdrukking van deze eiwitten te kwantificeert in piek-en chronische stadia van EAE en Sham-Control muizen (10 weken-oude C57BL/6j muizen)9,10,11. Om dit te doen, hebben we de willekeurige eenheid van intensiteit (AUI) gemeten langs de diameter van de micro vaten. Vervolgens, met behulp van een drempel van ≤ 20 AUI voor DAPI, we berekend het gebied onder de curve (AUC) voor VE-cadherin, VCAM-1, en JAM-B voor 50 micro vaten per CNS regio (Figuur 8a, B). Tot slot voerden we een tweeweg ANOVA uit, gevolgd door de post-hoc test van Sidak om de statistische significantie van veranderingen in eiwit expressie te bepalen.
Zoals verwacht, observeerden we een toename van VCAM-1 en JAM-B langs ruggenmerg micro vaartuigen tijdens de piek van EAE (Figuur 8D, E). Echter, we waargenomen veranderingen in andere regio's van het CZS niet eerder gerapporteerd voor EAE. VCAM-1 aanzienlijk toegenomen in hypofyse micro schepen en daalde in de hypothalamus en hersenstam micro vaten. Er waren veranderingen tijdens chronische EAE in alle CZS-weefsels (Figuur 8D). JAM-B significant toegenomen in de hypothalamus en hypofyse micro schepen tijdens chronische EAE (Figuur 8E). Belangwekkend, we waargenomen veranderingen in ve-cadherin langs micro vaten geïsoleerd van de hypothalamus en hersenstam tijdens de piek van EAE, het cerebellum tijdens chronische EAE (Figuur 8C), en een afname van de hypofyse microvat breedte tijdens piek en chronische EAE. Over het algemeen suggereert deze gegevens dat deze methode voor het isoleren van micro vaten een nuttig hulpmiddel is om veranderingen in regionale eiwit expressie patronen te karakteriseren tijdens de gezondheid en ziekte.
Figuur 1: efficiënt ruggenmerg dissectie zonder laminectomie. Dissectie van het ruggenmerg van kleine gewervelde specimens (tot 100 g) wordt sneller en efficiënter uitgevoerd door het snoer in een caudal over te spoelen in de richting van de rostrale migratoire doorheen het wervel foramen. Met behulp van ontleden schaar wordt het hoofd verwijderd door het Atlas gewricht en wordt de wervelkolom uitgesneden door de heup (A). Alle remaing organen worden verwijderd, waardoor alleen de wervelkolom (B). Het ruggenmerg in de foramen voor de lumbale wervelkolom verschijnt als een zeer kleine witte cirkel (< 1 mm diameter) in vergelijking met de breedte van het cervicale snoer (B, gele pijlen). Het houden van een smalle opening bij de lumbale Vertebrale foramen vergemakkelijkt een drukgradiënt van de lumbale naar cervicale wervelkolom bij het spoelen met een 18 G naald en 10 CC spuit geladen met 1x PBS (C en D). Eenmaal gespoeld, het ruggenmerg (D, gele pijl) is bijna volledig devotie van de durale SAC, en alleen Pia moet worden verwijderd onder het ontleed bereik. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: dubbel-pronged pick ontleden tool en gemodificeerde filterhouder. Deze 11 cm lange ontleden tool (a) heeft twee zeer scherpe, bijna horizontaal tegengestelde punten, 2 mm tip-to-tip (B). Door zachte neerwaartse druk toe te passen en iets rechtsom te draaien (C), sluiten de punten zich horizontaal in de hersenvliezen zodat ze naar boven kunnen worden gehesen. Dit is vooral handig bij het verwijderen van de hersenvliezen uit het cerebellum, omdat het toegang geeft tot de diepte van de cerebelli folia. Het is ook zeer nuttig bij het verwijderen van de hersenvliezen van corticale weefsel, vooral gyrencephalic. In dit geval is de PIA sterk ingebed met een hoog kaliber vasculatuur die de zuiverheid van de microsevessel isolatie in gevaar zal brengen. Evenzo vergemakkelijkt het de verwijdering van de vaatvlies plexus, die de meest waarschijnlijke bron van verontreiniging is. Filter houders van 47 mm, 25 mm en 13 mm diameter werden laser gesneden om de inlaat connector (D) uit het bovenste compartiment (E) te verwijderen, maar de zeef component (G) te behouden. Deze modificatie toegestaan voor de montage van een filtereenheid (I,J) door het plaatsen van de 20 μm nylon filter net over de zeef en het onderste deel (G,H), het vastzetten van het net op zijn plaats bij het schroeven van het bovenste deel (E). Alleen de 25 mm filterhouder wordt getoond. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Micro vaten geïsoleerd uit meerdere CZS-regio's uitgedrukt canonieke neurovasculaire eenheids markers. A) met behulp van immunolabeling en confocale microscopie worden intrinsieke cellulaire componenten van de nvu gebruikt om volwassen (8 – 14 week oude C57BL/6j) MURINE CNS micro vaten te identificeren. Zoals te zien op het samenvoegen afbeelding voor corticale micro vaten (B), boven de individuele confocale beelden voor de endotheliale cel marker CD31 (wit), Pericyte marker PDGFRβ (rood), en astrocytische end-Feet marker AQP4 (groen) al deze cellulaire componenten worden bewaard. Merk op dat de intieme relatie tussen endotheliale cellen en pericytes ervoor zorgt dat ze magenta lijken op de samengevoegde foto, terwijl de astrocytische eind voeten een halo rond hen lijken te hebben (B). Hetzelfde patroon van de expressie wordt waargenomen voor het cerebellum (C), hypofyse (D), hypothalamus (E), hersenstam (F), en ruggenmerg (G, DAPI, nucleaire vlek = blauw; schaalbalk = 10 μm). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Micro vaten uitgedrukt eiwitten die zijn gekoppeld aan BBB-specifieke eigenschappen. Endotheliale cellen binnen de neurovasculaire eenheid (NVU) worden ook beschreven door de eiwitten die zijn gekoppeld aan hun intrinsieke barrière-eigenschappen (A). Zoals te zien in de figuur, endotheel cellen hebben knooppunten gemaakt van VE-cadherin, CLDN5, ZO-1 (a, geel), en angulin-1 (a, Teal). Ze vertonen ook apicobasale polariteit aan meerdere eiwitten, waaronder GGT-1 en CXCL12 (a, groen en rood). Neuronen, oligodendrocyten en organen van de astrocyten-cel kunnen in de geïsoleerde micro vaten worden opgenomen, hoewel ze niet intrinsiek zijn voor de NVU (B). Deze zijn herkenbaar aan de uitdrukking van NFM (rood), OSP (cyaan) en GFAP (Lime groen), respectievelijk (B). Consistent met deze, onze geïsoleerde micro vaten uitgedrukt hecht eiwit VE-cadherin (C, rood), nauwe Junction eiwitten CLDN5 en zo-1 (D, rood en groen, respectievelijk, Merge = geel), TRICELLULAIRE Junction proteïne lsr (E, groen), en APICOBASAL markers CXCL12 en GGT1 (F, rood en groen, respectievelijk). Ze vertoonden ook beperkte hoeveelheden GFAP (A, groen, g, wit), OSP (G, groen) en NFM (H, rood), wat een verwaarloosbare retentie van niet-neurovasculaire eenheids cellen suggereert (DAPI, Nuclear Stain = Blue; schaalbalk = 10 μm). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: de meeste geïsoleerde micro vaten uiten geen αSMA. De neurovasculaire eenheid vertoont een verfijnde overgang van Arteriole-capillaire-venule (a). αSMA-anulaire expressie identificeert de Arteriole duidelijk, en aangezien het de capillaire, αSMA (b, Red) expressie wordt vermindert, bloot de muurschildering marker ng2 (b, groen). We hebben de diameter van αSMA + en αSMA-vaten gemeten (witte haakjes, n = 20), om ze te onderscheiden als arteriolen of capillairen (DAPI, nucleair Stain = blauw, schaalbalk = 10 μm). Een ongepaarde t-test analyse van de diameter van αSMA + en αSMA-vaten toonde een hoge statistische significantie (C, αsma + = rood, αsma-rood/groen, * * * * p < 0,0001). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: succesvolle isolatie van CZS-micro vaartuigen van andere lissencefische soorten. Het CNS werd geoogst uit een wild gevangen kikker (8,2 cm), hagedis (12,7 cm), tank-verhoogde regenboogforel (2 jaar oud, 35,6 cm) en Aviary-verhoogde duif (9 maanden-oud, ~ 300 g). De micro vaten van de kikker, de vis en de hagedis werden bevlekt door H & E (alleen micro vaten van forel worden getoond, schaalbalk = 20 μm). Duif micro schepen waren immunolabeled. We waren in staat om te identificeren van micro schepen op alle regio's als gelabeld op de vis en duif CNS contouren: cortex (A en H), optiek LOB (B en I), cerebellum (C en J), hypofyse (D en L), hypothalamus (E en K), hersenstam (F en M), en ruggenmerg (G en N) Daarnaast waren we in staat om endotheel cellen te identificeren met isolectine IB4 (wit), astrocytische eind voeten met AQP4 (groen) en aangrenzende neuronen met NFM (rood) uit de geïsoleerde micro vaten van de duif (DAPI, Nuclear Stain = Blue, schaalbalk = 10 μm). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: isolatie van CZS-micro vaartuigen van gyrencefische soorten. De hersenen en het ruggenmerg werden ontleed van een gefokte varken (~ 6 maanden-oud, ~ 120 kg) voor het isoleren van micro vaten en immunolabeling. We waren in staat om micro schepen te identificeren positief gelabeld voor IB4 (wit), pdgfrβ (rood), en AQP4 (groen) op alle regio's van varkens CNS: cortex (A), periventriculaire witte stof (B), cerebellum (C), hypofyse (D), hypothalamus (E), hersenstam (F), en ruggenmerg (G, DAPI, nucleaire vlek = blauw, schaalbalk = 10 μm). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 8: voorbeeld van een andere toepassing van het CZS-micro vaartuig isolatie. De expressie van JAB-B en VCAM-1 werd gekwantificeerd voor Murine EAE-micro vaartuigen. Willekeurige eenheden van intensiteit (AUI) werden gemeten voor de cortex, cerebellum, hypothalamus, hypofyse, hersenstam en het ruggenmerg van muizen in piek-en chronische stadia van EAE, met Sham als controle (n = 4). Voor elke regio CNS werden twaalf micro vaten geëvalueerd per muis om de AUI per fluorochrome en de diameter van het micro vat (A) te bepalen. Witte haakjes tonen voorbeelden van de confocale Microscoop software meetinstrument gebruikt om te bepalen AUI voor VCAM-1 (wit), VE-cadherin (groen), JAM-B (rood), en DAPI (blauw, schaal Bar = 10 μm). Vervolgens werden de resulterende AUI uitgezet tegen de diameter in micron (B) om het oppervlak onder de curve (AUC) voor elk immunolabeled eiwit te berekenen als een schatting van de eiwit expressie. De gemiddelde AUC per groep werd vervolgens geanalyseerd door twee richtings-ANOVA, gevolgd door de post hoc test van Sidak, voor een totaal van 48 micro vaten per CZS-regio. Met uitzondering van de micro vaten van de hypofyse, we waargenomen geen grote verschillen tussen de diameter van de microvat geassocieerd met de ziektestatus (c, INSERT), maar een significante afname van ve-cadherin uitdrukking uit de hypothalamus en hersenstam in EAE muizen (c). Vergelijkbare statistische analyse toonde een significante toename voor VCAM-1 (D) en jam-B (E) aan het ruggenmerg, consistent met neuroinflammatoire status tijdens de piek van EAE. Interessant, we ook waargenomen veranderingen voor VCAM-1 op de hypothalamus, hypofyse, en hersenstam. Deze resultaten worden onderzocht (zwarte balken en stippen = Sham, Rode staven en stippen = piek EAE, zalm repen en stippen = chronische EAE, * p < 0,05, @p < 0,01, #p < 0,001 en & p < 0,0001). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| MV-1 | 10 mM HEPES |
| in 1x Hank de uitgebalanceerde zoutoplossing (HBSS) met calcium en magnesium | |
| MV-2 | 18% 70 kDa moleculair gewicht (MW) dextran |
| in 10 mM HEPES/HBSS (MV-1) | |
| MV-2 | 20% 70 kDa MW dextran |
| in 10 mM HEPES/HBSS (MV-1) | |
| MV-3 | 1% boviene serumalbumine (BSA) |
| in 10 mM HEPES/HBSS (MV-1) | |
| Fixative | 4% Paraformaldehyde (PFA) |
| in 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,4 | |
| Wasbuffer | 1x PBS pH 7,4 |
| Permeabilization & blokkerende buffer | 10% BSA |
| 0,25% nonionische oppervlakteactieve stof | |
| in 1x PBS pH 7,4 | |
| Antilichaam verdunent | 5% BSA |
| 0,25% nonionische oppervlakteactieve stof | |
| in 1x PBS pH 7,4 |
Tabel 1: oplossingen die in het protocol worden gebruikt.
| Stap (en) | Actie |
| 4,1 en 4.1.1 | Mince in MV-1 oplossing met een single-Edge Blade |
| 4,2 tot 4.2.2 | Homogeniseren in MV-1 oplossing met behulp van een Potter-ELVJ PTFE of micro tube stamper |
| 5,1 | Spin bij 2.000 x g, 4 °c, 10 min |
| 5.1.1 tot 5.1.1.2 | Resubreng de pellet in MV-2 oplossing |
| 5,2 | Spin bij 4.400 x g, 4 °c, 15 min |
| 5,3 tot en met 5,5 | Respendeer de pellet met 1 mL MV-3 oplossing |
| 6,2 tot 6.4.1 | Elute over een conische buis van 50 mL door middel van een celzeef en spoel met MV-3-oplossing |
| 6,5, 6.5.1, 6,6 en 6,7 | Filter met een nylon net van 20 μm op de gemodificeerde filterhouder |
| 6,8 | Laad het nylon net in het 50 mL bekerglas met 10 mL MV-3 oplossing en schud gedurende 30 sec. |
| 6,9 tot en met 6,10 | Decanterende in een conische buis van 15 mL en spin bij 2.000 x g, 4 °c, 5 min |
| 6,10 | Respenderen in 1 mL MV-3 oplossing |
| 6.10.1 | Overbrengen naar een 1,7 mL micro tube en spin bij 20.000 x g, 4 °c, 5 min |
| 7,1 tot en met 7,3 | Respendeer in 1x PBS en laad in goed glijbanen |
Tabel 2: indeling voor kleine gewervelde micro vaten isolatie. Deze grafiek is een verkorte versie van het protocol bij gebruik van een lissencephalic specimen.
| Stap (en) | Oplossing | Actie | CTX | Cbl | Opt | Bst | Sc | HYP | Pit |
| 4,1 | MV-1 | Gehakt op gerecht | 100 mm x 20 mm Petri schaaltje, 1 mL | N/a | |||||
| 4.2.1 en 4.2.2 | MV-1 | Homogeniseren | 5 mL, 10 mL Potter-Elvehjem met stamper | 1 mL, micro stamper | |||||
| 5.1.1.1 en 5.1.1.2 | MV-2 | Resuspendeer | 5 mL + 5 mL, 18% dextran | 1 mL, 20% dextran | |||||
| 5,5 en 6.4.1 | MV-3 | Resuspendeer | 1 mL + 10-15 mL | 1 mL | |||||
| 6,2 en 6.4.1 | MV-3 | Zeef maat | 100 μm | 70 μm | 100 μm | 70 μm | 100 μm | ||
| Spoelen | 5 mL | ||||||||
| 6,5, 6.5.1 en 6,7 | MV-3 | Filter grootte, spoelen | 25 mm filter, 10 mL | 13 mm, 5 mL | |||||
| 6,8 | MV-3 | Schudden op bekerglas | 10 mL | ||||||
| 6,10 | MV-3 | Resuspendeer | 1 mL | ||||||
| 7,2 | 1x PBS | Resuspendeer | 1,5 tot 2,0 mL | 0,5 tot 1,0 mL | 0,1 tot 0,2 mL | ||||
| 7,3 | 1x PBS | Belasting per put | 200 μL | 100 μL | 25 tot 50 μL | ||||
| CTX = cortex, CBL = cerebellum, BST = hersenstam, OPT = optische LOB (niet aanwezig bij zoogdieren), HYP = hypothalamus, PIT = hypofyse, SC = ruggenmerg. Aanbevolen volumes zijn voor hele weefsel van dieren, variërend in grootte van 20 g (jonge muis) tot 800 g (volwassen rat). | |||||||||
Tabel 3: Aanbevolen volume/grootte. Deze omtrek heeft de aanbevolen hoeveelheid oplossingen voor het gebruik van een kleine gewervelde specimen variërend van ~ 20 – ~ 800 g, of meer in het bijzonder, de ~ 25 g muis weergegeven op de video. De uiteindelijke aanpassing van de benodigde volumes moet door de onderzoeker worden bepaald aan de hand van de specifieke hoeveelheid NAT weefsel die na dissectie is verkregen. Praktijk en probleemoplossing worden sterk aanbevolen. CTX = cortex, CBL = cerebellum, BST = hersenstam, OPT = optische LOB (niet aanwezig bij zoogdieren), HYP = hypothalamus, PIT = hypofyse, SC = ruggenmerg.
| Stap (en) | Actie |
| 4,1 en 4.1.2 | Mince in MV-1 met een enkelsnijkant blad |
| 4,3 tot 4.3.4 | Homogeniseren in MV-1-oplossing met behulp van een Potter-Elvehjem-molen met een PTFE-stamper |
| 5,1 | Spin bij 2.000 x g, 4 °c, 10 min |
| 5.1.2 tot 5.1.2.2 | Resubreng de pellet in MV-2 oplossing |
| 5,2 | Spin bij 4.400 x g, 4 °c, 15 min |
| 5,3 tot en met 5,5 | Respendeer de pellet met 1 mL MV-3 oplossing |
| 6,2 tot en met 6,4 en 6.4.2 | Elute over een conische buis van 50 mL door middel van een celzeef en spoel met MV-3-oplossing |
| 6,5, 6.5.2, 6,6 en 6,7 | Filter met een nylon net van 20 μm op de gemodificeerde filterhouder |
| 6,8 | Laad het nylon net in een bekerglas van 50 mL met 30 mL MV-3 oplossing en schud gedurende 30 sec. |
| 6,9 en 6,10 | Decanterende in een conische buis van 50 mL en spin bij 2.000 x g, 4 °c, 5 min |
| 6,10 | Respenderen in 1 mL MV-3 oplossing |
| 6.10.2 | Overbrengen naar een 5 mL micro tube en spin bij 2.000 x g, 4 °c, 5 min |
| 7,1 tot en met 7,3 | Respendeer in 1x PBS en laad in goed glijbanen |
Tabel 4: indeling voor het isoleren van grote gewervelde micro schepen. Deze grafiek is een verkorte versie van het protocol bij gebruik van een gyrencephalic-specimen.
| Stap (en) | Een | Actie | CTX | Cbl | Wm | Bst | Sc | HYP | Pit |
| 4,1 | MV-1 | Gehakt op gerecht | 3 − 5 mL | 1 mL | |||||
| 4,3 tot 4.3.4 | MV-1 | Homogeniseren | 20 − 30 mL, 55 mL Potter-Elvehjem met stamper & bovenbeen roerder | 5 mL, 10 mL Potter-Elvehjem met stamper | |||||
| 5.1.2 tot 5.1.2.2 | MV-2 | Resuspendeer | > 20 mL, 20% dextran | 5 mL + 5 mL, 20% dextran | |||||
| 5,5, 6,4 en 6.4.2 | MV-3 | Resuspendeer | 1 mL + 20 mL | 1 mL + 10 mL | |||||
| 6,2 en 6.4.2 | MV-3 | Zeef maat | 100 μm | 70 μm | 100 μm | 70 μm | 100 μm | ||
| Spoelen | 10 mL | ||||||||
| 6,5, 6.5.2 en 6,7 | MV-3 | Filter grootte, spoelen | 47 mm filter, 10 mL | 25 mm, 10 mL | |||||
| 6,8 | MV-3 | Schudden op bekerglas | 30 mL | ||||||
| 6,10 en 6.10.2 | MV-3 | Resuspendeer | 1 mL + 4 mL | ||||||
| 7,2 | 1x PBS | Resuspendeer | 2,0 tot 4,0 mL | 1,0 tot 2,0 mL | |||||
| 7,3 | 1x PBS | Belasting per put | 200 μL | 100 μL | |||||
| CTX = cortex, CBL = cerebellum, WM = witte stof, BST = hersenstam, HYP = hypothalamus, PIT = hypofyse, SC = ruggenmerg. Aanbevolen volumes zijn voor monsters van ~ 45 cm3 voor CTX, CBL, BST en SC hele Hyp en pit. | |||||||||
Tabel 5: Aanbevolen volume/grootte. Deze omtrek heeft de aanbevolen hoeveelheid oplossingen voor het gebruik van een groot gewervelde specimen. Specifieker, het is van toepassing op CZS weefsel biopsieën van ~ 45 cm3 voor cortex, cerebellum, witte materie, hersenstam, ruggenmerg, en de hele hypothalamus en hypofyse, zoals weergegeven op de video. De uiteindelijke aanpassing van de benodigde volumes moet door de onderzoeker worden bepaald aan de hand van de specifieke hoeveelheid NAT weefsel die na dissectie is verkregen. Praktijk en probleemoplossing worden sterk aanbevolen. CTX = cortex, CBL = cerebellum, WM = witte stof, BST = hersenstam, HYP = hypothalamus, PIT = hypofyse, SC = ruggenmerg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De BBB omvat de unieke eigenschappen van de hersenen microcirculatiebed endotheliale cellen in combinatie met een verfijnde architectuur van strakke-, aanhangers-, "Peg-socket"-knooppunten, en adhesie plaques kritisch voor CNS homeostase2,3,19. Endotheliale cellen eigenschappen worden geïnduceerd en onderhouden door pericytes en de omringende astroglia eind-voet processen2,3,19. BBB Microvasculatuur toont polariteit (d.w.z. het asymmetrische expressie patroon van eiwitten gelokaliseerd op luminal of abluminale endotheliale celoppervlakken)20. Hoewel dit kort kan de BBB definiëren, in werkelijkheid blijft het een van de meest raadselachtige begrippen in de neurowetenschappen. Zo kunnen regionale, geslachts-en leeftijdsverschillen binnen de nvu regionale kwetsbaarheden in het CZS uitleggen aan trauma, toxiciteit, infectie en ontsteking, wat grote klinische gevolgen kan hebben3,5,6. Een ander obstakel in het begrijpen van de BBB is de verschillen waargenomen tussen meerdere taxa7,8. Een van de belangrijkste hindernissen van het begrijpen en onderzoeken van de BBB is precies de moeilijkheid die verband houdt met de isolatie van de NVU die de BBB omvat, terwijl het nog steeds zijn barrière-specifieke eigenschappen14.
In een poging om ons begrip van de BBB, CNS-regionale verschillen, evenals soorten verschillen te versnellen, hebben we eerder gepubliceerde methoden aangepast. We hebben deze met succes aangepast, in het bijzonder Boulay et al.21, om micro vaten te verkrijgen van enkelvoudige corticale, cerebellaire, hypothalamische, hypofyse, hersenstam en spinale weefsels op een groot aantal lissencephalische kleine gewervelde dieren: vissen, amfibieën, reptielen, vogels en zoogdieren (Figuur 3, Figuur 4, Figuur 5en figuur Een voordeel van deze methode is dat de aanpassingen zijn gebaseerd op de totale grootte van CNS weefsel: de onderzoeker kiest de hoeveelheid oplossing, grootte van weefsel slijper, conische buis, filterhouders, etc. volgens het natte weefsel, ongeacht de soort, geslacht, en leeftijd. In onze ervaring met immunolabeling levert een ~ 20 g-specimen voldoende micro vaten voor een 8-put-glijbaan per cortex, cerebellum, optische LOB, hersenstam en ruggenmerg en een halve 8-put-Slide per hypothalamus en hypofyse. Echter, de opbrengst van corticale en optische LOB is veel hoger in vergelijking met cerebellum, hersenstam, en ruggenmerg.
Zoals getoond, hebben we de nodige aanpassingen uitgevoerd voor isolatie en immunolabeling van CZS-micro vaartuigen van varkens en makaak, grotere gyrencefische zoogdieren die relevanter zijn voor translationeel onderzoek (Figuur 7). Met name, we waren in staat om te omvatten periventriculaire witte materie op deze soorten alleen. Omdat het CZS bij deze dieren groter is, hebben we genoeg witte stof verzameld om ons in staat te stellen een microvat pellet van de myeline laag te scheiden tijdens de tweede centrifugeren (stap 5,3, MV-2 met 20% dextran). We speculeren dat een kritische massa nodig is om te kunnen bereiken deze scheiding en we zijn actief op zoek naar het verkrijgen van een soortgelijk resultaat met Murine CNS weefsel.
Hoewel weggelaten omwille van de eenvoud, hebben we wel immunolabeling uitgevoerd buiten de nvu-canonieke markers op aviaire, porcine en makaak-micro schepen. Met name alle soorten deelden cellulaire en moleculaire markers eerder geïdentificeerd op Murine monsters als relevant voor BBB functie (junctionele eiwitten VE-cadherin, CLDN5, ZO-1, en LSR en apicobasal markers CXCL12 en GGT1) of in de nabijheid van NVU (NFM, OSP, en GFAP). Nogmaals, deze bevindingen moedigen het gebruik van deze methode op andere soorten aan om NVU-orthologie en divergentie tussen soorten verder te identificeren. Het opent ook de mogelijkheid voor verder onderzoek naar NVU-stam, geslacht en leeftijdsverschillen binnen dezelfde soort en de haalbaarheid van het gebruik van andere organismen voor BBB-biomedisch onderzoek. We tonen ook bewijs van een succesvol gebruik van deze microvessel-isolatiemethode om veranderingen in eiwit uitdrukkings niveaus te kwantificering tijdens neuro ontsteking (Figuur 8). Hoewel we dit experiment als een proof-of-concept uitgevoerd, wordt de aanpak die hier wordt gebruikt op dit moment uitgebreid uitgebuit in ons laboratorium. We zijn voorstander van deze benadering ten opzichte van andere kwantitatieve methodes (bijv. Western Blot) omdat we ons niet alleen willen concentreren op het uitdrukkings niveau, maar op de relatieve eiwit abundantie, verplaatsing van CXCL12 en andere apicobasale eiwitten, koppeling van junctieve eiwitten, enz., binnen de gecompliceerde verschijning van micro vaartuigen van CNS9,13,22. Evenzo zijn we op dit moment bezig met het oplossen van onze methode voor andere toepassingen, zoals verdere isolatie van nvu-cellulaire componenten (endotheel cellen en pericytes), RNA-SEQ en proteomica23,24,25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dr. Cruz-Orengo werd gesteund door de Universiteit van Californië, Davis, de school van de veterinaire geneeskunde start up fondsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS | ThermoFisher | BP39920 | Used for blocking and antibody diluent. |
| 20% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | Used as fixative (4% PFA) |
| 70,000 MW Dextran | Millipore Sigma | 9004-54-0 | Used for MV-2 solution |
| Adson Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11006-12 | Used for removal of muscle and skin |
| Adson Forceps, student quality | FST | 91106-12 | Same as above but cheaper |
| Bovine serum albumin (BSA) | Millipore Sigma | A7906-100G | Used for MV-3 solution, blocking and antibody diluent |
| Corning 100 μm Cell strainer | Millipore Sigma | CLS431752-50EA | |
| Corning 70 μm Cell strainer | Millipore Sigma | CLS431751-50EA | |
| Corning Deskwork low-binding tips | Millipore Sigma | CLS4151 | Same as below but cheaper. |
| Cultrex Poly-D-Lysine | R&D | 3439-100-01 | Used for slide coating |
| Donkey anti-Goat IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21432 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Mouse IgG-ALEXA 488 | Thermo | A21202 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 488 | Thermo | A21206 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 647 | Thermo | A31573 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rat IgG-DyLight 650 | Thermo | SA5-10029 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Double-Pronged Tissue Pick | FST | 18067-11 | Used for removal of meninges and choroid plexus |
| Dumont #3c Forceps | FST | 11231-20 | Used for more delicate and/or small CNS tissue handling (like pituitary) |
| Dumont #7 Forceps | FST | 11274-20 | Used for CNS tisssue dissection and handling |
| Dumont #7 Forceps, student | FST | 91197-00 | Same as above but cheaper |
| ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Tips | Eppendorf | 22493008 | Better quality than the tips above (more expensive). |
| Extra Fine Graefe Forceps, serrated | FST | 11151-10 | Used for bone removal |
| Fine Scissors, sharp | FST | 14060-09 | Used for removal of pig and macaque dural sac |
| Glass Pestle 1.5 mL Microcentrifuge Tube Tissue Grinder Homogenizer, Pack of 10 | Chang Bioscience Inc. (eBay) | GP1.5_10 | Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Goat anti-CXCL12, biotinylated | PeproTech | 500-P87BGBT | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution: 1:20. |
| Goat anti-JAM-B | R&D | AF1074 | Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 488 | Thermo | A11001 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21424 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-PDGFRβ | R&D | AF1042 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Goat anti-Rabbit IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21249 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Rabbit IgG-DyLight 488 | Thermo | 35552 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Rat IgG-DyLight 650 | Thermo | SA5-10021 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Graefe Forceps, curved tip, 1X2 teeth | FST | 11054-10 | Use for nylon filter net holding and shaking |
| HBSS, 1X buffer with calcium and magnesium | Corning | 21-022-CM | Used for MV-1 solution |
| HEPES, 1M liquid buffer | Corning | 25-060-CI | Used for MV-1 solution |
| Isolectin GS-IB4-Biotin-XX | ThermoFisher Scientific (Thermo) | I21414 | Glycoprotein isolated from legume Griffonia simplicifolia that binds D-galactosyl residues of endothelial cell glycocalysx. Used for avian and porcine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| LaGrange Scissors, serrated | FST | 14173-12 | Used for skull dissection and laminectomy (except pig and macaque) |
| Millicell EZ slide 8-well unit | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| Mouse anti-CLDN5 | Thermo | 35-2500 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-GGT1 | Abcam | ab55138 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-Human CD31 | R&D | BBA7 | Used as primary antibody on primate CNS microvessels. Recommended concentration: 16.5 μg/mL. |
| Mouse anti-NFM | Thermo | RMO-270 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-αSMA | Thermo | MA5-11547 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Nylon Filter Net, roll | Millipore Sigma | NY6000010 | Laser-cut to 13 mm diameter filter net discs. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Nylon Filter Nets, 25 mm | Millipore Sigma | NY2002500 | Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Nylon Filter Nets, 47 mm | Millipore Sigma | NY2004700 | Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | ThermoFisher | P36935 | Used to coverslip slides. |
| Rabbit anti-AQP4 | Millipore Sigma | A5971 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rabbit anti-LSR | Millipore Sigma | SAB2107967 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rabbit anti-NG2 | Millipore Sigma | AB5320 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rabbit anti-OSP | Abcam | ab53041 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 1 μg/mL. |
| Rabbit anti-VE-Cadherin | Abcam | ab33168 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rabbit anti-ZO-1 | Thermo | 61-7300 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rat anti-CD31 | Becton Dickinson | BD 550274 | Used as primary antibody for murine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rat anti-GFAP | Thermo | 13-0300 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rat anti-VCAM-1 | Becton Dickinson | BD 553329 | Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Sterile Ringer's Solution, Frog | Aldon Corporation | IS5066 | Used for amfibian anesthesia |
| Streptavidin-ALEXA 555 | Thermo | S32355 | Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500. |
| Streptavidin-ALEXA 647 | Thermo | S32357 | Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500. |
| Surgical Scissors, sharp | FST | 14002-12 | Used for removal of muscle and skin |
| Surgical Scissors, sharp-blunt | FST | 14001-16 | Used for decapitation (except pig and macaque) |
| Swinnex Filter Holder, 13 mm | Millipore Sigma | SX0001300 | Modified by laser-cut. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Swinnex Filter Holder, 25 mm | Millipore Sigma | SX0002500 | Modified by laser-cut. Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Swinnex Filter Holder, 47 mm | Millipore Sigma | SX0004700 | Modified by laser-cut. Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
| Triton X-100 | ThermoFisher | 50-165-7277 | Used for blocking and antibody diluent. |
| Wheaton 120 Vac Overhead Stirrer | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 62400-904 (DWK #903475) | Used for macaque and pig CNS tissues with 55 mL tissue grinder, except hypothalamus and pituitary. |
| Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 10 mL | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 14231-384 (DWK #357979) | Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 55 mL | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 14231-372 (DWK #357994) | Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
References
- Bundgaard, M., Abbott, N. J. All vertebrates started out with a glial blood-brain barrier 4-500 million years ago. Glia. 56, 699-708 (2008).
- Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a020412 (2015).
- Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).
- Kealy, J., Greene, C., Campbell, M. Blood-brain barrier regulation in psychiatric disorders. Neuroscience Letters. , (2018).
- Sweeney, M. D., Kisler, K., Montagne, A., Toga, A. W., Zlokovic, B. V. The role of brain vasculature in neurodegenerative disorders. Nature Neuroscience. 21, 1318-1331 (2018).
- Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back. Physiological Reviews. 99, 21-78 (2019).
- Wilhelm, I., Nyul-Toth, A., Suciu, M., Hermenean, A., Krizbai, I. A. Heterogeneity of the blood-brain barrier. Tissue Barriers. 4, e1143544 (2016).
- O'Brown, N. M., Pfau, S. J., Gu, C. Bridging barriers: a comparative look at the blood-brain barrier across organisms. Genes & Development. 32, 466-478 (2018).
- Cruz-Orengo, L., et al. CXCR7 influences leukocyte entry into the CNS parenchyma by controlling abluminal CXCL12 abundance during autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 208, 327-339 (2011).
- Serres, S., et al. VCAM-1-targeted magnetic resonance imaging reveals subclinical disease in a mouse model of multiple sclerosis. FASEB Journal. 25, 4415-4422 (2011).
- Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
- Sohet, F., et al. LSR/angulin-1 is a tricellular tight junction protein involved in blood-brain barrier formation. Journal of Cell Biology. 208, 703-711 (2015).
- Cruz-Orengo, L., et al. Enhanced sphingosine-1-phosphate receptor 2 expression underlies female CNS autoimmunity susceptibility. Journal of Clinical Investigation. 124, 2571-2584 (2014).
- Dayton, J. R., Franke, M. C., Yuan, Y., Cruz-Orengo, L. Straightforward method for singularized and region-specific CNS microvessels isolation. Journal of Neuroscience Methods. 318, 17-33 (2019).
- Smyth, L. C. D., et al. Markers for human brain pericytes and smooth muscle cells. Journal of Chemical Neuroanatomy. 92, 48-60 (2018).
- Granberg, T., et al. In vivo characterization of cortical and white matter neuroaxonal pathology in early multiple sclerosis. Brain. 140, 2912-2926 (2017).
- Datta, G., et al. Neuroinflammation and its relationship to changes in brain volume and white matter lesions in multiple sclerosis. Brain. 140, 2927-2938 (2017).
- Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging Techniques to Assess Inflammation in Multiple Sclerosis. Neuroscience. 403, 4-16 (2019).
- Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).
- Cornford, E., Hyman, S. Localization of brain endothelial luminal and abluminal transporters with immunogold electron microscopy. NeuroRx. 2, 27-43 (2005).
- Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M. Purification of Mouse Brain Vessels. Journal of Visualized Experiments. , 53208 (2015).
- Paul, D., Cowan, A. E., Ge, S., Pachter, J. S. Novel 3D analysis of Claudin-5 reveals significant endothelial heterogeneity among CNS microvessels. Microvascular Research. , (2012).
- Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. Journal of Neuroscience Methods. 207, 80-85 (2012).
- Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
- Bourassa, P., Tremblay, C., Schneider, J. A., Bennett, D. A., Calon, F. Beta-amyloid pathology in human brain microvessel extracts from the parietal cortex: relation with cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 137, 801-823 (2019).
- Porte, B., et al. Proteomic and transcriptomic study of brain microvessels in neonatal and adult mice. PLoS One. 12, e0171048 (2017).
