Summary
Целью данного протокола является изоляция микрососудов из нескольких областей центральной нервной системы лиссенцефалических и гиренцефалических позвоночных.
Abstract
Изоляция микрососудов из центральной нервной системы (ЦНС) обычно осуществляется путем объединения корковых тканей от нескольких животных, чаще всего грызунов. Такой подход ограничивает анализ свойств гематоэнцефалического барьера (BBB) коре и не позволяет проводить индивидуальное сравнение. Этот проект фокусируется на разработке метода изоляции, который позволяет сравнивать нервно-сосудистую единицу (НВУ) из нескольких областей ЦНС: коры головного мозга, мозжечка, зрительного толка, гипоталамуса, гипофиза, ствола головного мозга и спинного мозга. Кроме того, этот протокол, первоначально разработанный для образцов мурин, был успешно адаптирован для использования в тканях ЦНС от малых и крупных позвоночных видов, из которых мы также можем изолировать микрососуды из белого вещества полушария мозга. Этот метод, в паре с иммуномаркировкой, позволяет количественно определить экспрессию белка и статистическое сравнение между людьми, типом ткани или лечением. Мы доказали эту применимость, оценив изменения экспрессии белка во время экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (EAE), моринмодели нейровоспалительных заболеваний, рассеянного склероза. Кроме того, микрососуды, изолированные этим методом, могут быть использованы, в частности, для таких приложений, как qPCR, RNA-seq и Western blot. Несмотря на то, что это не первая попытка изолировать микрососуды ЦНС без использования ультрацентрифюгации или ферментативной диссоциации, она уникальна по своей искусности для сравнения отдельных лиц и нескольких регионов ЦНС. Таким образом, это позволяет исследует целый ряд различий, которые в противном случае могут оставаться неясными: части ЦНС (кора, мозжечок, оптическая доля, ствол мозга, гипоталамус, гипофиза и спинного мозга), тип ткани ЦНС (серое или белое вещество), лица, экспериментальных групп лечения и видов.
Introduction
Наш мозг является самым важным органом в нашем теле. По этой причине, сохраняя гомеостаз мозга, несмотря на внешние факторы, которые могут вызвать отклонение от нормальной жизни является приоритетом. По мнению некоторых ученых, около 400-500 миллионов лет назад1, позвоночных животных разработали то, что мы теперь знаем, как гематоэнцефалический барьер (BBB)2,3. Этот защитный "забор" оказывает наибольшее влияние на центральную нервную систему (ЦНС) гомеостаза и функции, плотно регулируя транспорт ионов, молекул и клеток между кровью и ЦНС parenchyma. Когда BBB нарушается, мозг становится восприимчивым к токсическим воздействием, инфекции и воспаления. Таким образом, дисфункция BBB связана со многими, если не со всеми, неврологическими и нейроразвития расстройств4,5,6.
Сложная функция BBB приписывается уникальной микроваскулярной ЦНС, соответствующей нервно-сосудистому блоку (НВУ)2,3. Высокоспециализированные эндотелиальные клетки, перициты и астроцитарные конечные ноги являются клеточными компонентами NVU2,3. Внеклеточная матрица, генерируемая этими клетками, также имеет важное значение для физиологии NVU и BBB2,3. Хотя основные клеточные и молекулярные компоненты НВУ сохраняются среди позвоночных, неоднородность сообщается среди заказов и видов7,8. Тем не менее, технические ограничения препятствуют нашей способности в полной мере рассмотреть эти различия в нейробиологии, биомедицинских или трансляционных исследований.
Из-за этого мы расширили метод микрососуд-изоляцию цНС, чтобы сделать его применимым к многочисленным видам из всех пяти позвоночных групп: рыбам, земноводным, рептилиям, птицам и млекопитающим. Протокол описан для использования на мелко-лиссенцефалических и крупногирецефалических позвоночных, в том числе видов с переводной релевантности9. Кроме того, мы включаем другие регионы ЦНС, ранее не исследованные в этом контексте, но имеющие отношение к нейрофизиологии и с огромными клиническими последствиями: гипоталамус, гипофиз и белое вещество. Наконец, мы проверили способность этого метода изоляции в качестве надежного инструмента для выявления изменений в экспрессии белка вдоль NVU и / или BBB9,10,11. В качестве доказательства концепции мы показали, как определить изменения в экспрессии VCAM-1 и JAM-B во время EAE с помощью метода изоляции с последующей иммунофлуоресценцией.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры настоящего исследования соответствуют руководящим принципам, установленным Калифорнийским университетом (UC), Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Дэвиса (IACUC). Уход за животными в UC Davis регулируется несколькими независимыми ресурсами и с 1966 года полностью аккредитован Ассоциацией по оценке и аккредитации Организации По уходу за животными (AAALAC). Ткани свиной ЦНС были получены в отделе наук о животных UCD, в лаборатории мясных наук. Ткани ЦНС от макаки-изреусов были получены из Калифорнийского национального научно-исследовательского центра патологии (NIH P51OD011107). Никакой анестезии, эвтаназии или некропсии сотрудники лаборатории не проводили на свиньях и макаках. Поэтому никаких конкретных рекомендаций по этим вопросам не существует.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод был проверен для нескольких видов, но предоставленный протокол более непосредственно соответствует мышечной и свиной ткани. Детали, относящиеся к оптической доле, не применяются при использовании образцов млекопитающих. Все биоопасные материалы должны обрабатываться на соответствующем объекте уровня биобезопасности (BSL). Все остро токсичные материалы должны быть обработаны под дымом капот. Все биоопасные медицинские отходы и остро токсичные отходы должны быть утилизированы должным образом.
1. Подготовка
- Подготовьте решения(таблица 1)по крайней мере на один день вперед.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очень трудно растворить 70 kDa молекулярного веса (MW) dextran. Это более эффективно, чтобы раствор перемешивать на ночь покрыты либо парафина пленки или фольги. Протокол требует использования двух различных решений MV-2 в зависимости от исследуемого образца. 18% дексенов эффективно отделяет миелин от гранул микрососуд при выполнении протокола о малых лиссенцефалических образцов. Тем не менее, он развивается мазок миелина в интерфейсе тканей ЦНС из крупных гиренцефалических образцов, а также гипоталамуса и гипофиза из мелких образцов. Этот мазок предотвращается с помощью 20% dextran. - Подготовка хорошо слайдов, загрузив 50 л на скважину поли-D-лизин и дайте высохнуть в течение 2 ч при комнатной температуре (RT), предпочтительно в биологической безопасности шкаф-класса 2 (BSC-2). Не переутомитесь. Промыть дважды фосфат-буфером сольников (PBS) и держать в холодильнике до готовности к использованию.
2. Рассечение тканей ЦНС от малых лиссенцефических позвоночных Specimen
ПРИМЕЧАНИЕ: В статье показано применение протокола на C57BL6/J, 10 недель, 25 г, мужская мышь.
- Подготовьте две конические трубки мощностью 15 мл и микроцентрифуговую трубку мощностью 1,7 мл с 5 мл и 1 мл, соответственно, раствором MV-1 на один образец. Держите трубки на льду.
- Анестезия
- Анестезия мышей путем интраперитонеальной инъекции кетамина, ксилазина и ацепромазина анестезирует коктейль на 100/10/3 мг на кг веса тела и спрей с 70% этанола. Подтвердите анестезию, оценив отсутствие пальпебраальных и педалей рефлексов, касаясь глаза и щипать ногу, соответственно.
- Обезболивайте голубей путем вдыхания 5% изофларанса с помощью индукционной анестезии.
- Обезболилизировать рыбу и лягушек в 1% трикаин в любой рыбы, держащей резервуар для воды или раствор амфибии Ringer(Таблица материалов), соответственно.
- Анестезируйте ящериц путем охлаждения при 4 градусах Цельсия до эвтаназии.
- Обезглавить животное хирургическими ножницами, очистить кожу щипками, чтобы разоблачить череп, и вырезать ножницами LaGrange через передний магнум (Рисунок 1A).
- Вскрыть мозг с помощью шпателя и переложить на коническую трубку 15 мл с раствором MV-1. Держите трубку на льду.
- Извлеките гипофиз из черепа sella turcica с щипками и перенесите в микроцентрифугную трубку 1,7 мл с раствором MV-1. Держите трубку на льду.
- Удалите кожу и мышцы, чтобы разоблачить позвоночный столб. Вырежьте конечности, грудную клетку и внутренние органы(рисунок 1B).
- Вскрыть спинной мозг одним из двух методов, описанных ниже. Затем перенесите на коническую трубку 5 мл с раствором MV-1. Держите трубку на льду.
- Выполните ламинэктомии, разрезая в рострале к каудальное направление с ножницами LaGrange, начиная через шейные позвоночные форамены,до достижения поясничного шнура.
- Выполните промывку в каудальском к ростральное направление по всему поясничному позвоночному фораму с 18 G иглой и шприцем 10 мл, загруженным раствором MV-1(рисунок 1C,D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод работает только с очень мелкими особями, в основном с грызунами (lt;100 g).
- Используя рассекающий прицел, вырежьте дурацком из спинного мозга с помощью пружинных ножниц и удалите оставшиеся оранжеры с двусторонним выбором(рисунок 2).
- Перенесите мозг в чашку Петри и, используя рассекающий прицел, удалите оболёны с двусторонним выбором(рисунок 2A-C).
- Акциз обонятельные луковицы и таламус с щипками, ножницами радужной оболочки глаза, и весной ножницы. Используя двусторонний выбор, удалите сосплетение со всех желудочков головного мозга. Убедитесь в том, чтобы удалить все сосудистого сплетения.
ПРИМЕЧАНИЕ: сосудистое сплетение и обонятельные луковицы являются массивным источником загрязнения. В отличие от BBB, эти капилляры сильно фенестированы и результаты последующих экспериментов будут скомпрометированы, если они не будут удалены. - Используя щипцы, отделяйте различные области ЦНС: кора, мозжечок, ствол мозга, оптика (не на образцах млекопитающих) и гипоталамус.
3. Рассечение тканей ЦНС от большого гирецефалического позвоночных образцов
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол использует свиные ткани ЦНС, полученные из скотобойни. Поэтому здесь не описана ни анестезия, ни эвтаназия, ни некропсия.
- Транспорт свиной ткани ЦНС в 0,946 л (32 унции) гистологии контейнер загружен с MV-1 раствор внутри льда груди / ведро.
- Используя рассекающий прицел, удалите оболочки с двусторонним подбором, щипцами, ножницами радужной оболочки глаза и пружинными ножницами из каждой ткани ЦНС. Убедитесь в том, чтобы удалить любые кусочки сосудистого сплетения из желудочков головного мозга.
4. Гомогенизация тканей ЦНС
ПРИМЕЧАНИЕ: Это более эффективно, когда два следователя участвуют в процессе гомогенизации: один вскрытия оплодотворения под стереоскопом, а другой гомогенизации рубленых тканей. Таким образом, ткани быстро возвращаются в ведро со льдом и сохраняются в холоде.
- Поместите каждый регион ЦНС на чашку Петри с раствором MV-1 в размере 1 мл. Используя одногранное лезвие, фарш ткани для получения 1-2 мм штук.
- Для небольшого образца позвоночных используйте тарелку 100 мм x 20 мм Петри.
- Для большого образца позвоночных используйте 150 мм х 15 мм чашку Петри.
- Гомогенизация мелкого позвоночным образца(Таблица 2 и Таблица 3)
- Передача коры, мозжечка, ствола мозга, оптической доли и спинного мозга до 1 мл раствора MV-1 в индивидуальном 10 мл Поттер-Elvehjem стеклянной ткани шлифовальный станок с пестиком PTFE с помощью передачи пипетки. Добавьте 5 мл раствора MV-1 и гомогенизируют каждую ткань (10 ударов). Передача на отдельные 15 мл конических труб. Держите трубки на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для маленьких позвоночных, 5 или 4, с или без оптической доли, соответственно, 10 мл Поттер-Elvehjem шлифовальные машины и 15 мл конических трубок необходимы. - Перенесите гипоталамус и гипофиз с щипками в раствор MV-1 в индивидуальной трубке мощностью 1,7 мл и тщательно гомогенизируйте стеклянным микропестом. Промыть каждый микропест с помощью 1 мл раствора MV-1. Держите трубку на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для маленьких позвоночных, 2 стеклянных микропеша и 1,7 мл трубок необходимы.
- Передача коры, мозжечка, ствола мозга, оптической доли и спинного мозга до 1 мл раствора MV-1 в индивидуальном 10 мл Поттер-Elvehjem стеклянной ткани шлифовальный станок с пестиком PTFE с помощью передачи пипетки. Добавьте 5 мл раствора MV-1 и гомогенизируют каждую ткань (10 ударов). Передача на отдельные 15 мл конических труб. Держите трубки на льду.
- Гомогенизация большого образца позвоночных(Таблица 4 и Таблица 5)
- Используя передачу пипетки, передача измельченных тканей в 55 мл Поттер-Elvehjem стеклянной ткани шлифовальный станок с пестиком PTFE и прикрепить к накладным мешалку. Добавьте половину рекомендуемого объема раствора MV-1, в соответствии с конкретной частью ЦНС, будучи однородной(таблица 5).
- Включите накладной мешалку на очень низкой скорости (150 об/мин) и осторожно перемещать стеклянную трубку вверх и вниз в течение примерно 30 с.
- Выключите накладные мешалки, добавьте больше раствора MV-1 и повторите шаг 4.3.2 до получения однородной суспензии.
- Перенесите на коническую трубку 50 мл. Держите трубку на льду.
- Вымойте мясорубку деионизированной водой между каждой гомогенизации тканей ЦНС.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для большого позвоночного 5 или 4, с или без белого вещества, соответственно, 50 мл конических труб необходимы. Кроме того, для гипоталамуса и гипофиза необходимы две (2) 15 мл конических трубки.
5. Очистка микросудов
- Центрифуги ткани гомогенаты в результате шага 4.2.1, 4.2.2, или 4.3.4 на 2000 х г в течение 10 мин при 4 градусах По Цельсию. Большой белый интерфейс миелина образуется на верхней части гранул ыхщетов красноватых микрососудов. Откажитесь от супернационтов.
- Малый образец позвоночных(Таблица 2 и Таблица 3)
- Отрептуйте кору, мозжечок, ствол мозга, оптику и гранулы спинного мозга в 5 мл ледяного раствора MV-2 с серологической пипеткой 5 мл (10 смывов). Добавьте 5 мл ледяного раствора MV-2 к каждой подвеске и тщательно перемешайте, перевернув трубки.
- Отрежь гипоталамус и гранулы гипофиза с 1 мл раствора MV-2.
- Большой образец позвоночных(Таблица 4 и таблица 5)
- Добавьте 20 мл ледяного раствора MV-2 в коре головного мозга, мозжечок, ствол мозга и микрососуд спинного мозга. Resuspend гранулы, смешивая на трубе револьвер шейкер, помешивая при 40 об/мин в течение 5 мин. Баланс конических труб объемов коры, мозжечка, ствола мозга и спинного мозга суспензий, добавив больше MV-2 решение.
- Отдохните гипоталамус и гранулы микрососуди для гипофиза в 5 мл раствора MV-2 с серологическим пипеткой мощностью 5 мл (10 смывов). Добавьте 5 мл ледяного раствора MV-2 в подвески и тщательно перемешайте, перевернув трубку.
- Малый образец позвоночных(Таблица 2 и Таблица 3)
- Центрифуга при 4400 х г в течение 15 мин при 4 градусах Цельсия.
- Тщательно отсоедините толстый и плотный слой миелина на жидком интерфейсе от стен каждой трубки, медленно вращая трубки и позволяя супернатанту проходить вдоль стен.
- Откажитесь от миелина и жидкого интерфейса и промойте внутреннюю стенку каждой трубки шпателем, завернутым с низкой салфеткой бумаги. Для небольших образцов позвоночных, удалить слой миелина из каждого гипоталамуса и гипофиз трубки путем всасывания тщательно с передачей пипетки.
- Протрите лишнюю жидкость с витой низкой ворсовой бумаги протрите. Отдохните каждую гранулу 1 мл раствора MV-3 с помощью низкосвязывающих наконечников. Держите трубки на льду.
6. Микрососуд Элюцион и фильтрация
- Налейте ледяной раствор MV-3 в отдельные клювы для каждого региона ЦНС. Хранить при 4 градусах по Цельсию.
- Для небольших образцов позвоночных используйте 10 мл раствора MV-3 на 50 мл стакана. В общей сложности 6-7 клювов необходимо в зависимости от того, включена оптическая доли.
- Для крупных образцов позвоночных используйте 30 мл раствора MV-3 на 100 мл стакана. В общей сложности 6-7 клювов необходимо в зависимости от того, включено ли белое вещество.
- Поместите ситечко на 50 мл конической трубки. Используйте один в регионе ЦНС. Используйте 100 мкм ситечко для коры головного мозга, оптической доли, спинного мозга и гипофиза. Используйте 70 мкм ситечко для мозжечка и гипоталамуса.
- Влажный каждый ситечко с 1 мл ледяного раствора MV-3.
- Добавьте больше раствора MV-3 к подвескам подготовленным в шаге 5.5 с серологическим пипеткой пока смешиваюя для того чтобы во избежание агрегаты. Тщательно загрузите микрососуды поверх ситечко. Промыть раствором гололедица MV-3.
- Для мелких образцов позвоночных(таблица 2 и таблица 3)добавьте 10-15 мл раствора MV-3 с серологической пипеткой и промойте 5 мл раствора MV-3.
- Для крупных образцов позвоночных добавьте 20 мл раствора MV-3 с серологической пипеткой и промыть 10 мл раствора MV-3.
- Соберите единицу фильтрации, поместив 20 мкм нейлоновый сетчатый фильтр на измененном держателе фильтра(рисунок 2D),по одному на область ЦНС.
- Для небольших образцов позвоночных(таблица 2 и таблица 3)используйте 25-мм модифицированные держатели фильтров для коры головного мозга, мозжечка, ствола мозга, оптовика и спинного мозга. Используйте 13 мм модифицированные держатели фильтров для гипоталамуса и гипофиза.
- Для крупных образцов позвоночных(Таблица 4 и Таблица 5)используйте 47-мм модифицированные держатели фильтров для коры головного мозга, мозжечка, ствола головного мозга и спинного мозга. Используйте 25 мм для гипоталамуса и гипофиза.
- Поместите фильтр поверх конической трубки 50 мл и влажный фильтр с 5 мл ледяного раствора MV-3, чтобы буфер вылил держатель фильтра в коническую трубку.
- Перенесите элютированные микрососуды (от шага 6.4) поверх 20 мл нейлонового сетального фильтра и промыть микрососуды раствором 5-10 мл ледяного MV-3.
- Восстановите фильтр с помощью чистых щипц и погрузите его в стакан, содержащий ледяной раствор MV-3, подготовленный в шаге 6.1.
- Отсоедините микрососуды от фильтра, встряхивая его осторожно около 30 с. Для небольших образцов позвоночных, залить содержание стакана в 15 мл конической трубки. Для крупных образцов позвоночных, залить содержание стакана в 50 мл конической трубки.
- Центрифуга при 2000 х г в течение 5 мин при 4 градусах По Цельсию и повторно йен гранулы в 1 мл ледяного раствора MV-3 с помощью низкосвязывающего наконечника пипетки.
- Для небольших образцов позвоночных перенесите суспензию (от шага 6.10) в микроцентрифуговую трубку 1,7 мл и центрифугу при 20 000 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот спин выполняется на скамейке центрифуги на максимальной скорости (20000 х г),чтобы обеспечить уверенный выход. - Для крупных образцов позвоночных перенесите подвеску со ступени 6.10 в микроцентрифугную трубку 5,0 мл, добавьте 4 мл раствора MV-3 и центрифугу при 2000 х г на 5 мин при 4 градусах Цельсия.
- Для небольших образцов позвоночных перенесите суспензию (от шага 6.10) в микроцентрифуговую трубку 1,7 мл и центрифугу при 20 000 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия.
7. Иммуностоина
ПРИМЕЧАНИЕ: Гематоксилин и эозин (Н И Е) окрашивание было выполнено на рептилий, земноводных и рыб образцов в качестве доказательства концепции протокола осуществимости. Таким образом, нет рекомендации для иммуномаркировки для этих образцов.
- Удалите супернатант из микроцентрифуговых труб.
- Resuspend гранулы в 1x стерильных PBS с помощью низкосвязывающих пипетка отзыв (Таблица материалов). Держите микрососуды от формирования агрегатов путем pipetting несколько раз. Для мелких образцов позвоночных(Таблица 3),используйте 100 qL-2,000 qL в зависимости от размера гранул. Для крупных образцов позвоночных(Таблица 5),используйте 1000 л-л-4000 л в зависимости от размера гранул.
- Используя низкосвязный наконечник пипетки, перенесите микрососуды на хорошо слайды, стараясь добавить их в центр каждого колодца, избегая боковальок.
- Установите хорошо слайды, обнаружили, внутри BSC-2, и дайте высохнуть в течение 20 до 30 минут на RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Относительно большой объем 1x PBS используется, чтобы избежать совокупного образования. Из-за этого необходимо, чтобы горки высохли до фиксации, чтобы убедиться, что микрососуды удерживаются поли-D-лизинпокрытие покрытие. - Удалите остаточный 1x PBS путем пипетки с передачей пипетки, добавить 200 зл/ 4% параформальдегида (PFA) и инкубировать в течение 30 мин на RT.
- Pipette из фиксаторного решения и мыть 3x с 200 Л Л 1x PBS в течение 5 минут на RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Н И E окрашивания на рыбу, земноводных и рептилий CNS микросудов была выполнена в этой точке. - Добавьте 200 qL блокирующего буфера к слайду скважины и инкубируйте в течение 60 минут при 37 градусах Цельсия.
- Удалите блокирующий буфер с помощью пересадочных пипетки и добавьте 200 злицита первичного антитела в разбавитель антител(Таблица материалов). Инкубировать при 4 градусах Цельсия на ночь.
- Pipette из первичного антитела коктейль и мыть 3x с 200 Злт 1x PBS в течение 5 минут на RT.
- Загрузите вторичный коктейль из антител(Таблица материалов),разбавленное в 1x PBS и инкубировать по 2 ч при РТ, защищенном от света.
- Pipette из вторичного коктейля антитела и мыть 3x с 200 Злт 1x PBS в течение 5 минут на RT, защищены от света. После последней стирки отсоединить хорошо слайд кадр и пятно сухой любой избыток 1x PBS с низкой салфеткой бумаги ворса.
- Добавьте coverslip, жидкий antifade монтант среды, и 4 ",6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) для ядерного окрашивания. Дайте высохнуть на ночь на RT защищены от света.
- После высыхания, держать защищены от света на слайд-бокс на 4 кв До тех пор, пока готовы к конфокальной микроскопии и сбора данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Микрососуды, изолированные от минины ЦНС, показали все внутренние клеточные компоненты нервно-сосудистого блока2,3. Использование либо тромбоцитов эндотелиальной клетки адгезионной молекулы-1 (PECAM, также известный как CD31) или изолектин IB4 (гликопротеин, который связывает эндотелиальной клетки гликоколикс) для эндотелиальных клеток, тромбоциты, полученные факторроста -- (PDGFR) или нейрон-глиальный антиген 2 (NG2) для перицитов и аквапорин-4 (АЗП4) для астроцитарных конечных ног(рисунок 3A,B) показывает, что эти внутренние компоненты присутствуют в изолированных микрососудах. CnS регионов видимых включают корковых микрососудов(рисунок 3B), мозжечок (Рисунок 3C), гипофиза (Рисунок 3D), гипоталамус (Рисунок 3E), ствол мозга (Рисунок 3F), и спинного мозга (Рисунок 3G). Все показали выражение этих канонических маркеров.
Аналогичным образом, микрососуды показали выражение адептов соединения белка VE-кадерин (Рисунок 4A, C), плотные белки соединения claudin-5 и zonula occludens-1 (CLDN5 и ЗО-1, Рисунок 4A,D), трехклеточный стыковой белок ангулин-1 (Рисунок 4A, E) и apicobasal маркеры C-X-C мотив chemokine лиганд 12 и гамма-глутамилтрансферазы 1 (CXCL12 и GGT1, Рисунок 4A,F). Эти выводы актуальны, потому что эти белки являются индикаторами ключевых Свойств BBB-специфических9,12,13,14. Ограниченное присутствие астроцитов, олигодендроцитов и нейронов, выражающих скользящий фибриллярный кислотный белок (GFAP, Рисунок 4B,C),олигодендроцит специфический белок (OSP, Рисунок 4B,G)и нейрофиламент-средний (NFM, Рисунок 4B, H),соответственно, демонстрирует, что изолированные микрососуды имели незначительные следы несосудных несосудных несосудных несосудных несосудных несосудных несосудных несосудных. Кроме того, большинство микрососудов были лишены выражения плавного мышечного актива (ЗСМА, Рисунок 5В, С). Это актуально, потому что ЗСМА является маркером для гладких мышечных клеток, связанных с артериолями и венами(рисунок 5A), указывая, что этот протокол изоляции избирательно нацелен на малые микрососуды калибра15.
Микрососуды, полученные от других мелких лиссенцефалических позвоночных, имеют некоторые морфологические особенности, как это видно на примере рыб (лягушка и ящерица не показаны) и птичьих микрососудов. Это говорит о том, что этот метод полезен для дальнейшей характеристики различий в НВУ между видами(рисунок 6). Кроме того, птичьи микрососуды ЦНС(рисунок 6H-N) показали перекрестную активность со многими антителами, разработанными для человека и мыши. Это способствует дальнейшему изучению образцов птиц для биологических и биомедицинских исследований BBB. Мы наблюдали аналогичные результаты, когда мы выделили микрососуды от свиней и макак, двух гирренцефалических видов(рисунок 7). Отображаются только канонические маркеры НВУ в свиных микрососудах. В дополнение к вышеупомянутым регионам ЦНС, мы смогли изолировать микрососуды от перивентрикулярного белого вещества(рисунок 7B). Это актуально, потому что белое вещество вовлечено в нейровоспалительные заболевания (например, рассеянный склероз16,17,18).
Мы хотели выяснить, можно ли использовать этот метод в качестве надежного инструмента для определения изменений в экспрессии белка. Зная, что VCAM-1 и JAM-B были вовлечены в нейровоспалительный процесс на спинном мозге во время EAE, мы решили количественно экспрессии этих белков на пиковых и хронических стадиях EAE и фиктивных мышей (10 недельных C57BL/6J мышей)9,10,11. Для этого мы измерили произвольную единицу интенсивности (АУИ) вдоль диаметра микрососудов. Затем, используя порог в 20 auI для DAPI, мы вычислили область под кривой (AUC) для VE-кадхерин, VCAM-1 и JAM-B для 50 микросудов на регион ЦНС(рисунок 8A,B). Наконец, мы провели двустороннюю ANOVA, а затем послеояженый тест Сидака для определения статистической значимости изменений в экспрессии белка.
Как и ожидалось, мы наблюдали увеличение VCAM-1 и JAM-B вдоль микрососудов спинного мозга во время пика EAE(рисунок 8D, E). Тем не менее, мы наблюдали изменения в других регионах ЦНС, ранее не сообщалось для EAE. VCAM-1 значительно увеличился в микрососудах гипофиза и уменьшился в гипоталамусе и микрососудах ствола мозга. Были изменения во время хронического EAE во всех тканях ЦНС(Рисунок 8D). JAM-B значительно увеличился в гипоталамусе и гипофизе микрососудов во время хронического EAE(рисунок 8E). Интересно, что мы наблюдали изменения в VE-кадерин вдоль микросудов, изолированных от гипоталамуса и ствола мозга во время пика EAE, мозжечка во время хронического EAE(рисунок 8C), и снижение ширины микрососудов гипофиза во время пика и хронического EAE. В целом, эти данные свидетельствуют о том, что этот метод изоляции микрососудов является полезным инструментом для характеристики изменений в региональных моделей экспрессии белка во время здоровья и болезней.
Рисунок 1: Эффективное вскрытие спинного мозга без ламинэктомии. Рассечение спинного мозга от мелких образцов позвоночных (до 100 г) выполняется быстрее и эффективнее путем промывки шнура в каудальном к ростральному направлению по всему позвоночному предуму. С помощью рассеченных ножниц голова удаляется атласным суставом, а позвоночник вырезается бедром(А). Все оставшиеся органы удаляются, оставляя только позвоночник(B). Спинной мозг в поясничном позвоночном предсердии выглядит как очень маленький белый круг (диаметрю 1 мм) по сравнению с шириной шейного мозга(B,желтые стрелки). Ведение узкого отверстия в поясничных позвоночных foramen облегчает градиент давления от поясничного отдела к шейнотделу позвоночника при промывке с 18 G иглы и 10 cc шприц загружен 1x PBS (C и D). После промывки, спинной мозг(D, желтая стрелка) почти полностью лишен ыральных мешок, и только пиа должна быть удалена под рассекать области. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Двойной выбор вскрытия инструмент и модифицированный держатель фильтра. Этот инструмент для вскрытия длиной 11 см(A)имеет две очень острые, почти горизонтально противоположные точки, 2 мм наконечником к кончику(B). Применяя мягкое понижательное давление и слегка скручивая по часовой стрелке (C), точки встраиваются горизонтально в оболонь, чтобы их можно было поднять вверх. Это особенно полезно при удалении орел из мозжечка, так как позволяет попасть в глубину мозжечковой фолии. Это также очень полезно при удалении оболей из корковой ткани, особенно гиренцефалии. В этом случае пиа сильно встроена в сосуды высокого калибра, что поставит под угрозу чистоту изоляции микросесодер. Кроме того, он облегчает удаление сосудистого сплетения, которое является наиболее похожим источником загрязнения. Держатели фильтра 47 мм, 25 мм и диаметром 13 мм были лазерной разреза, чтобы удалить впускной разъем(D) из верхнего отсека (E), но сохранить сито компонента (G). Эта модификация позволила для сборки фильтра единицы(I,J) путем размещения 20 мкм нейлоновой фильтр сети над сито и нижней части (G,H), обеспечение сети на месте при завинчивании верхней части (E). Отображается только 25-мм держатель фильтра. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Микрососуды, изолированные из нескольких областей ЦНС, выражают канонические нейрососудистые маркеры. (A) Использование иммуномаркировки и конфокальной микроскопии, внутренние клеточные компоненты НВУ используются для выявления взрослых (8-14 недельный C57BL/6J) микрососудов Murine CNS. Как видно на изображении слияния для корковых микрососудов(B),над отдельными конфокальными изображениями для эндотелиального клеточного маркера CD31 (белого цвета), перицитного маркера PDGFR (красный), и астроцитарного маркера конечных ног АЗП4 (зеленый) все эти клеточные компоненты сохраняются. Обратите внимание, что интимные отношения между эндотелиальных клеток и перицитов сделать их появляются пурпурные на слитом картине, в то время как астроцитарные конца ноги, как представляется, ореол окружающих их (B). Такая же картина выражения наблюдается для мозжечка (C), гипофиз (D), гипоталамус (E), ствол мозга (F), и спинного мозга (G, DAPI, ядерное пятно и синий; шкала бар 10 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Микрососуды выражали белки, связанные с свойствами BBB-специфических. Эндотелиальные клетки в нервно-сосудистой единицы (НВУ) также описаны белками, связанными с их свойствами внутренних барьеров(A). Как видно на рисунке, эндотелиальные клетки имеют соединения из VE-кадхерин, CLDN5, ЗО-1(A, желтый), и ангулин-1(A, чирок). Они также демонстрируют apicobasal полярность к множественным протеинам включая GGT-1 и CXCL12 (A,зеленый цвет и красный цвет). Нейроны, олигодендроциты и астроцитовые тела могут быть включены в изолированные микрососуды, хотя они не присущи НВУ(B). Они идентифицируются по выражению NFM (красный), OSP (циань), и GFAP (лайм зеленый), соответственно (B). В соответствии с ними, наши изолированные микрососуды выразили приверженцы белка VE-cadherin(C, красный), плотные белки соединения CLDN5 и ЗО-1(D, красный и зеленый, соответственно, слияние и желтый), трехклеточный протеин соединения ЛСР(E, зеленый), и apicobasal маркеры CXCL12 и GGT1(F, красный и зеленый, соответственно). Они также продемонстрировали ограниченное количество GFAP(A,зеленый, G, белый), OSP(G, зеленый), и NFM (H, красный), предлагая незначительное удержание не-нейрососудистых единиц клеток (DAPI, ядерное пятно и синий; шкала бар 10 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Большинство изолированных микрососудов не выражают ЗСМА. Нейрососудистый блок демонстрирует сложный переход от артериол-капиллярно-венул(A). Анулярное выражение sMA четко идентифицирует артериол, и, как он становится капилляром, выражение SMA (B, красный уменьшается, подвергая фрески маркер NG2 (B, зеленый). Мы измерили диаметр сосудов «SMA» и «SMA» (белые скобки, n no 20), чтобы отличить их от артериол или капилляров (DAPI, ядерное пятно и синий, шкала бар No 10 мкм). Непарный t-тестовый анализ диаметра сосудов «SMA» и «SMA-» показал высокую статистическую значимость(C,«SMA» - красный, «SMA- красный/зеленый», «p»lt; 0.0001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Успешная изоляция микрососудов ЦНС от других лиссенцефалических видов. ЦНС был собран из дикой лягушки (8,2 см), ящерицы (12,7 см), выращенной в цидж радужной форели (2 года, 35,6 см) и вольера-голубя (9 месяцев, 300 г). Микрососуды от лягушки, рыбы и ящерицы были окрашены Н И Е (показаны только микрососуды из форели, шкала бар 20 мкм). Голубиные микрососуды были иммуномаркированы. Мы смогли определить микрососуды на всех регионах, как помечены на рыбу и голубя ЦНС очертания: кора (A и H), оптическая доли (B и I), мозжечок (C и J), гипофиза (D и L), гипоталамус (E и K), ствол мозга (F и M), и спинного мозга (G и N). Кроме того, мы смогли определить эндотелиальные клетки с изолектином IB4 (белый), астроцитарный конец ноги с АЗП4 (зеленый), и прилегающих нейронов с NFM (красный) из голубя изолированных микрососудов (DAPI, ядерное пятно и синий, шкала бар 10 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: Изоляция микросолей ЦНС от гирренцефалических видов. Мозг и спинной мозг были вскрыты от фермы поднял свиньи (6 месяцев, 120 кг) для микрососудизоляции и иммуномаркировки. Мы смогли определить микрососуды положительно помечены для IB4 (белый), PDGFR (красный), и АЗП4 (зеленый) на всех регионах свиной ЦНС: кора(A), periventricular белое вещество (B), мозжечок (C), гипофиза (D), гипоталамус (E), ядерное пятно и синий, шкала бар 10 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 8: Пример другого применения изоляции микросудов ЦНС. Выражение JAB-B и VCAM-1 было количественно для микросудов Murine EAE. Произвольные единицы интенсивности (AUI) были измерены для коры головного мозга, мозжечка, гипоталамуса, гипофиза, ствола мозга и спинного мозга мышей на пиковых и хронических стадиях EAE, с фиктивным как контроль (n No 4). Для каждого региона ЦНС, двенадцать микросудов были оценены на мышь, чтобы определить AUI на фторхром и диаметр микрососуд (A). Белые скобки показывают примеры конфокального микроскопа программного измерительного инструмента, используемого для определения AUI для VCAM-1 (белый), VE-кадерин (зеленый), JAM-B (красный), и DAPI (синий, шкала бар 10 мкм). Затем, в результате АУИ были построены против диаметра в микронах (B) для расчета области под кривой (AUC) для каждого иммуномаркированного белка в качестве оценки экспрессии белка. Среднее aUC на группу затем анализировалось двусторонним ANOVA, за которым следовал пост-специальный тест Сидака, в общей сложности 48 микросудов в регионе ЦНС. За исключением микрососудов гипофиза, мы не наблюдали никаких серьезных различий между диаметром микрососудов, связанных со статусом заболевания(C,вставить), но значительное снижение VE-кадерин выражение от гипоталамуса и ствола мозга у мышей EAE (C). Аналогичный статистический анализ показал значительное увеличение для VCAM-1 (D) и JAM-B (E) на спинном мозге, в соответствии с нейровоспалительным статусом в пик ЕАЕ. Интересно, что мы также наблюдали изменения для VCAM-1 в гипоталамусе, гипофизах и стволе мозга. Эти результаты находятся под следствием (черные полосы и точки - обман, красные полосы и точки - пик EAE, лососевые бары и точки - хронический EAE, "p'lt;0.05", @p-lt;0.01, #p и 0.001, и и p'amp;0.0001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| MV-1 | 10 мМ HEPES |
| в сбалансированном солейном растворе 1x Hank (HBSS) с кальцием и магнием | |
| MV-2 | 18% 70 kDa молекулярный вес (MW) dextran |
| в 10 мМ HEPES/HBSS (MV-1) | |
| MV-2 | 20% 70 кДа МВт dextran |
| в 10 мМ HEPES/HBSS (MV-1) | |
| MV-3 | 1% бычьей сыворотки альбумина (BSA) |
| в 10 мМ HEPES/HBSS (MV-1) | |
| Фиксивативный | 4% параформальдегид (PFA) |
| в 1x фосфат-буферный солен (PBS) рН 7.4 | |
| Буфер мытья | 1x PBS рН 7,4 |
| Пермяки и блокирование буфера | 10% BSA |
| 0,25% неионический сурфактант | |
| в 1x PBS рН 7,4 | |
| Дилун антител | 5% BSA |
| 0,25% неионический сурфактант | |
| в 1x PBS рН 7,4 |
Таблица 1: Решения, используемые в протоколе.
| Шаг (ы) | Действий |
| 4.1 и 4.1.1.1 | Фарш в растворе MV-1 с одногранным лезвием |
| от 4,2 до 4,2,2 | Гомогенизировать в растворе MV-1 с помощью Potter-ELVJ PTFE или микротрубки пестика |
| 5.1 | Спин при 2000 х г,4 кв. м, 10 мин |
| от 5.1.1 до 5.1.1.2 | Повторная отмена гранул в растворе MV-2 |
| 5.2 | Спин при 4400 х г,4 кв. м, 15 мин |
| от 5,3 до 5,5 | Отрежь гранулы 1 мл раствора MV-3 |
| от 6,2 до 6,4,1 | Выщелачить над 50 мл конической трубки через клеточный ситечко и промыть раствором MV-3 |
| 6.5, 6.5.1, 6.6 и 6.7 | Фильтр с нейлоновой сеткой номинала 20 мм на модифицированном держателе фильтра |
| 6.8 | Загрузите нейлоновую сетку в стакан 50 мл с 10 мл раствора MV-3 и встряхните в течение 30 с |
| От 6,9 до 6,10 | Декант в 15 мл конической трубки и спина на 2000 х г, 4 КК, 5 мин |
| 6.10 | Повторное витое в 1 мл раствора MV-3 |
| 6.10.1 | Перенесите на микротрубку 1,7 мл и закрутите при 20 000 х г,4 кв.м. |
| от 7,1 до 7,3 | Resuspend в 1x PBS и нагрузка в хорошо слайды |
Таблица 2: Укладка для изоляции микрососудов для мелких позвоночных. Эта диаграмма представляет собой сокращенную версию протокола при использовании лиссенцефалического образца.
| Шаг (ы) | Решение | Действий | Ctx | Кбр | Выбрать | Bst | Sc | Hyp | Яму |
| 4.1 | MV-1 | Фарш на блюде | 100 мм х 20 мм Петри блюдо, 1 мл | n/a | |||||
| 4.2.1 и 4.2.2 | MV-1 | Гомогенизации | 5 мл, 10 мл Поттер-Эльвехьем с пестиком | 1 мл, микропестр | |||||
| 5.1.1.1 и 5.1.1.2 | MV-2 | Приостановить | 5 мл ю 5 мл, 18% Dextran | 1 мл, 20% дэксн | |||||
| 5,5 и 6,4,1 | MV-3 | Приостановить | 1 мл 10-15 мл | 1 мл | |||||
| 6,2 и 6,4,1 | MV-3 | Размер ситектора | 100 мкм | 70 мкм | 100 мкм | 70 мкм | 100 мкм | ||
| Промыть | 5 мл | ||||||||
| 6.5, 6.5.1 и 6.7 | MV-3 | Размер фильтра, промыть | 25 мм фильтр, 10 мл | 13 мм, 5 мл | |||||
| 6.8 | MV-3 | Встряхнуть на стакан | 10 мл | ||||||
| 6.10 | MV-3 | Приостановить | 1 мл | ||||||
| 7.2 | 1x PBS | Приостановить | от 1,5 до 2,0 мл | от 0,5 до 1,0 мл | от 0,1 до 0,2 мл | ||||
| 7.3 | 1x PBS | Нагрузка на скважину | 200 зл. | 100 л | от 25 до 50 л л | ||||
| CTX - кора головного мозга, CBL - мозжечок, BST - ствол мозга, ОПТ - оптическая доли (не присутствуют у млекопитающих), HYP - гипоталамус, PIT - гипофиза, SC и спинного мозга. Рекомендуемые объемы для целых тканей от животных размером от 20 г (молодая мышь) до 800 г (взрослая крыса). | |||||||||
Таблица 3: Рекомендуемый объем/размер. Этот план имеет рекомендуемый объем решений для использования небольшого образца позвоночных, начиная от 20 -800 г, или, более конкретно, мыши, показанной на видео. Окончательная корректировка необходимых объемов должна быть определена исследователем в зависимости от конкретного количества влажной ткани, полученной после вскрытия. Настоятельно рекомендуется практика и устранение неполадок. CTX - кора головного мозга, CBL - мозжечок, BST - ствол мозга, ОПТ - оптическая доли (не присутствуют у млекопитающих), HYP - гипоталамус, PIT - гипофиза, SC и спинного мозга.
| Шаг (ы) | Действий |
| 4.1 и 4.1.2 | Фарш в MV-1 с одногранным лезвием |
| от 4,3 до 4,3,4 | Гомогенизировать в растворе MV-1 с помощью мясорубки Поттер-Эльвехем с пестевым пте |
| 5.1 | Спин при 2000 х г,4 кв. м, 10 мин |
| от 5.1.2 до 5.1.2.2 | Повторная отмена гранул в растворе MV-2 |
| 5.2 | Спин при 4400 х г,4 кв. м, 15 мин |
| от 5,3 до 5,5 | Отрежь гранулы 1 мл раствора MV-3 |
| от 6,2 до 6,4 и 6,4,2 | Выщелачить над 50 мл конической трубки через клеточный ситечко и промыть раствором MV-3 |
| 6.5, 6.5.2, 6.6 и 6.7 | Фильтр с нейлоновой сеткой номинала 20 мм на модифицированном держателе фильтра |
| 6.8 | Загрузите нейлоновую сетку в стакан объемом 50 мл с 30 мл раствора MV-3 и встряхните в течение 30 с |
| 6,9 и 6,10 | Декант в 50 мл конической трубки и спина на 2000 х г, 4 КК, 5 мин |
| 6.10 | Повторное витое в 1 мл раствора MV-3 |
| 6.10.2 | Перенесите на микротрубку 5 мл и закрутите при 2000 х г,4 кв. м, 5 мин |
| от 7,1 до 7,3 | Resuspend в 1x PBS и нагрузка в хорошо слайды |
Таблица 4: Укладка для изоляции крупных позвоночных микрососудов. Эта диаграмма представляет собой сокращенную версию протокола при использовании гиренцефалического образца.
| Шаг (ы) | Сотион | Действий | Ctx | Кбр | Wm | Bst | Sc | Hyp | Яму |
| 4.1 | MV-1 | Фарш на блюде | 3-5 мл | 1 мл | |||||
| от 4,3 до 4,3,4 | MV-1 | Гомогенизации | 20-30 мл, 55 мл Поттер-Эльвехьем с пестиком и накладным мешалкой | 5 мл, 10 мл Поттер-Эльвехьем с пестиком | |||||
| от 5.1.2 до 5.1.2.2 | MV-2 | Приостановить | 20 мл, 20% дэксн | 5 мл ю 5 мл, 20% dextran | |||||
| 5.5, 6.4 и 6.4.2 | MV-3 | Приостановить | 1 мл 20 мл | 1 мл и 10 мл | |||||
| 6,2 и 6,4,2 | MV-3 | Размер ситектора | 100 мкм | 70 мкм | 100 мкм | 70 мкм | 100 мкм | ||
| Промыть | 10 мл | ||||||||
| 6.5, 6.5.2 и 6.7 | MV-3 | Размер фильтра, промыть | 47 мм фильтр, 10 мл | 25 мм, 10 мл | |||||
| 6.8 | MV-3 | Встряхнуть на стакан | 30 мл | ||||||
| 6.10 и 6.10.2 | MV-3 | Приостановить | 1 мл и 4 мл | ||||||
| 7.2 | 1x PBS | Приостановить | от 2,0 до 4,0 мл | от 1,0 до 2,0 мл | |||||
| 7.3 | 1x PBS | Нагрузка на скважину | 200 зл. | 100 л | |||||
| CTX - кора головного мозга, CBL - мозжечок, WM - белое вещество, BST - ствол мозга, ГИП - гипоталамус, PIT - гипофиз, SC и спинной мозг. Рекомендуемые объемы для образцов 45 см3 для CTX, CBL, BST и SC целом HYP и PIT. | |||||||||
Таблица 5: Рекомендуемый объем/размер. Этот план имеет рекомендуемый объем растворов для использования большого образца позвоночных. Более конкретно, это относится к биопсии тканей ЦНС в размере 45 см3 для коры головного мозга, мозжечка, белого вещества, ствола мозга, спинного мозга, а также всего гипоталамуса и гипофиза, как показано на видео. Окончательная корректировка необходимых объемов должна быть определена исследователем в зависимости от конкретного количества влажной ткани, полученной после вскрытия. Настоятельно рекомендуется практика и устранение неполадок. CTX - кора головного мозга, CBL - мозжечок, WM - белое вещество, BST - ствол мозга, ГИП - гипоталамус, PIT - гипофиз, SC и спинной мозг.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BBB включает в себя уникальные свойства микроваскулярных эндотелиальных клеток мозга в сочетании с сложной архитектурой плотных, придерживающихся, "пег-розетки" - узлов, и адгезионные бляшки, критически важные для ЦНС гомеостаза2,3,19. Свойства эндотелиальных клеток индуцируются и поддерживаются перицитами и окружающими астроглией процессами конца фута2,3,19. Микроваскулатура BBB отображает полярность (т.е. асимметричный экспрессионный узор белков, локализованных на светящихся или аблюминальных эндотелиальных клеточных поверхностях)20. Хотя это может кратко определить BBB, в действительности он остается одним из самых загадочных понятий в неврологии. Например, региональные, половые и возрастные различия в НВУ могут объяснить региональную уязвимость ЦНС к травмам, токсичности, инфекции и воспалению, которые могут иметь серьезные клинические последствия3,5,6. Еще одним препятствием в понимании BBB является различия, наблюдаемые между несколькими таксонами7,8. Одним из основных препятствий для понимания и расследования BBB является именно трудность, связанная с изоляцией НВУ, которая охватывает BBB, сохраняя при этом свои барьерные свойства14.
В попытке ускорить наше понимание BBB, ЦНС-региональных различий, а также различий в видах, мы адаптировали ранее опубликованные методы. Мы успешно адаптировали эти, в частности Boulay et al.21, для получения микрососудов из одной корковой, мозжечковой, гипоталамической, гипофиза, ствола мозга и тканей позвоночника на множестве лиссенцефалических мелких позвоночных: рыб, земноводных, рептилий, птиц и млекопитающих(рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, и рисунок 6). Одним из преимуществ этого метода является то, что его адаптация основана на общем размере ткани ЦНС: исследователь выбирает количество раствора, размер мясорубки ткани, конической трубки, держателей фильтров и т.д. в зависимости от влажной ткани, независимо от вида, пола и возраста. По нашему опыту с иммуномаркировкой, образец 20 г дает достаточно микрососудов для 8 хорошо слайд на кору, мозжечок, оптическая доли, ствол мозга, и спинной мозг и половина 8 хорошо слайд на гипоталамус и гипофиза. Тем не менее, урожайность корковой и зрительной доли гораздо выше по сравнению с мозжечком, стволом мозга и спинного мозга.
Как показано, мы провели необходимые адаптации для изоляции и иммуномаркировки микрососудов ЦНС свиней и макаки, более крупных гирренцефалических млекопитающих, которые более актуальны для трансляционных исследований(рисунок 7). Примечательно, что мы смогли включить перивентрикулярное белое вещество только на этих видах. Так как ЦНС у этих животных больше, мы собрали достаточно белого вещества, чтобы отделить гранулы микрососуд от слоя миелина во время второго центрифугирования (шаг 5.3, MV-2 с 20% dextran). Мы полагаем, что критическая масса необходима, чтобы быть в состоянии достигнуть этого разделения, и мы активно ищем, как получить аналогичный результат с тканью murine CNS.
Хотя опускались ради простоты, мы действительно выполняли иммуномаркировку за пределами канонических маркеров НВУ на птичьих, свиных и макаковых микрососудах. Примечательно, что все виды разделяют клеточные и молекулярные маркеры, ранее идентифицированные на образцах мурина, как соответствующие для функции BBB (связные белки VE-cadherin, CLDN5, ЗО-1, и ЛСР, а также апикобазаальные маркеры CXCL12 и GGT1) или в непосредственной близости от NVU (NFM, OSP и GFAP). Опять же, эти выводы поощряют использование этого метода на других видах для дальнейшего выявления НВУ ортологии и расхождения между видами. Это также открывает возможность для дальнейшего изучения штамма НВУ, пола и возрастных различий в рамках одного и того же вида и возможности использования других организмов для биомедицинских исследований BBB. Мы также показываем доказательства успешного использования этого метода микрососуд-изоляции для количественной оценки изменений в уровнях экспрессии белка во время нейровоспаления(рисунок 8). Несмотря на то, что мы провели этот эксперимент в качестве доказательства концепции, подход, используемый здесь, в настоящее время широко используется в нашей лаборатории. Мы выступаем за такой подход по сравнению с другими количественными методами (например, западная поместье), потому что мы хотим сосредоточиться не только на уровне экспрессии, но и на относительном изобилии белка, перемещении CXCL12 и других апикобазальных белков, связывании связывающих белков и т.д., в сложном виде микрососудов ЦНС9,13,22. Аналогичным образом, в настоящее время мы непочинный наш метод для других приложений, таких как дальнейшая изоляция NVU клеточных компонентов (эндотелиальных клеток и перицитов), РНК-сек, и протеомика23,24,25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Д-р Круз-Оренго был поддержан Калифорнийским университетом, Дэвис, Школа ветеринарной медицины Запуска средств.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS | ThermoFisher | BP39920 | Used for blocking and antibody diluent. |
| 20% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | Used as fixative (4% PFA) |
| 70,000 MW Dextran | Millipore Sigma | 9004-54-0 | Used for MV-2 solution |
| Adson Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11006-12 | Used for removal of muscle and skin |
| Adson Forceps, student quality | FST | 91106-12 | Same as above but cheaper |
| Bovine serum albumin (BSA) | Millipore Sigma | A7906-100G | Used for MV-3 solution, blocking and antibody diluent |
| Corning 100 μm Cell strainer | Millipore Sigma | CLS431752-50EA | |
| Corning 70 μm Cell strainer | Millipore Sigma | CLS431751-50EA | |
| Corning Deskwork low-binding tips | Millipore Sigma | CLS4151 | Same as below but cheaper. |
| Cultrex Poly-D-Lysine | R&D | 3439-100-01 | Used for slide coating |
| Donkey anti-Goat IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21432 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Mouse IgG-ALEXA 488 | Thermo | A21202 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 488 | Thermo | A21206 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 647 | Thermo | A31573 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rat IgG-DyLight 650 | Thermo | SA5-10029 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Double-Pronged Tissue Pick | FST | 18067-11 | Used for removal of meninges and choroid plexus |
| Dumont #3c Forceps | FST | 11231-20 | Used for more delicate and/or small CNS tissue handling (like pituitary) |
| Dumont #7 Forceps | FST | 11274-20 | Used for CNS tisssue dissection and handling |
| Dumont #7 Forceps, student | FST | 91197-00 | Same as above but cheaper |
| ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Tips | Eppendorf | 22493008 | Better quality than the tips above (more expensive). |
| Extra Fine Graefe Forceps, serrated | FST | 11151-10 | Used for bone removal |
| Fine Scissors, sharp | FST | 14060-09 | Used for removal of pig and macaque dural sac |
| Glass Pestle 1.5 mL Microcentrifuge Tube Tissue Grinder Homogenizer, Pack of 10 | Chang Bioscience Inc. (eBay) | GP1.5_10 | Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Goat anti-CXCL12, biotinylated | PeproTech | 500-P87BGBT | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution: 1:20. |
| Goat anti-JAM-B | R&D | AF1074 | Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 488 | Thermo | A11001 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21424 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-PDGFRβ | R&D | AF1042 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Goat anti-Rabbit IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21249 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Rabbit IgG-DyLight 488 | Thermo | 35552 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Rat IgG-DyLight 650 | Thermo | SA5-10021 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Graefe Forceps, curved tip, 1X2 teeth | FST | 11054-10 | Use for nylon filter net holding and shaking |
| HBSS, 1X buffer with calcium and magnesium | Corning | 21-022-CM | Used for MV-1 solution |
| HEPES, 1M liquid buffer | Corning | 25-060-CI | Used for MV-1 solution |
| Isolectin GS-IB4-Biotin-XX | ThermoFisher Scientific (Thermo) | I21414 | Glycoprotein isolated from legume Griffonia simplicifolia that binds D-galactosyl residues of endothelial cell glycocalysx. Used for avian and porcine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| LaGrange Scissors, serrated | FST | 14173-12 | Used for skull dissection and laminectomy (except pig and macaque) |
| Millicell EZ slide 8-well unit | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| Mouse anti-CLDN5 | Thermo | 35-2500 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-GGT1 | Abcam | ab55138 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-Human CD31 | R&D | BBA7 | Used as primary antibody on primate CNS microvessels. Recommended concentration: 16.5 μg/mL. |
| Mouse anti-NFM | Thermo | RMO-270 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-αSMA | Thermo | MA5-11547 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Nylon Filter Net, roll | Millipore Sigma | NY6000010 | Laser-cut to 13 mm diameter filter net discs. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Nylon Filter Nets, 25 mm | Millipore Sigma | NY2002500 | Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Nylon Filter Nets, 47 mm | Millipore Sigma | NY2004700 | Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | ThermoFisher | P36935 | Used to coverslip slides. |
| Rabbit anti-AQP4 | Millipore Sigma | A5971 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rabbit anti-LSR | Millipore Sigma | SAB2107967 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rabbit anti-NG2 | Millipore Sigma | AB5320 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rabbit anti-OSP | Abcam | ab53041 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 1 μg/mL. |
| Rabbit anti-VE-Cadherin | Abcam | ab33168 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rabbit anti-ZO-1 | Thermo | 61-7300 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rat anti-CD31 | Becton Dickinson | BD 550274 | Used as primary antibody for murine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rat anti-GFAP | Thermo | 13-0300 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rat anti-VCAM-1 | Becton Dickinson | BD 553329 | Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Sterile Ringer's Solution, Frog | Aldon Corporation | IS5066 | Used for amfibian anesthesia |
| Streptavidin-ALEXA 555 | Thermo | S32355 | Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500. |
| Streptavidin-ALEXA 647 | Thermo | S32357 | Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500. |
| Surgical Scissors, sharp | FST | 14002-12 | Used for removal of muscle and skin |
| Surgical Scissors, sharp-blunt | FST | 14001-16 | Used for decapitation (except pig and macaque) |
| Swinnex Filter Holder, 13 mm | Millipore Sigma | SX0001300 | Modified by laser-cut. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Swinnex Filter Holder, 25 mm | Millipore Sigma | SX0002500 | Modified by laser-cut. Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Swinnex Filter Holder, 47 mm | Millipore Sigma | SX0004700 | Modified by laser-cut. Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
| Triton X-100 | ThermoFisher | 50-165-7277 | Used for blocking and antibody diluent. |
| Wheaton 120 Vac Overhead Stirrer | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 62400-904 (DWK #903475) | Used for macaque and pig CNS tissues with 55 mL tissue grinder, except hypothalamus and pituitary. |
| Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 10 mL | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 14231-384 (DWK #357979) | Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 55 mL | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 14231-372 (DWK #357994) | Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
References
- Bundgaard, M., Abbott, N. J. All vertebrates started out with a glial blood-brain barrier 4-500 million years ago. Glia. 56, 699-708 (2008).
- Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a020412 (2015).
- Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).
- Kealy, J., Greene, C., Campbell, M. Blood-brain barrier regulation in psychiatric disorders. Neuroscience Letters. , (2018).
- Sweeney, M. D., Kisler, K., Montagne, A., Toga, A. W., Zlokovic, B. V. The role of brain vasculature in neurodegenerative disorders. Nature Neuroscience. 21, 1318-1331 (2018).
- Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back. Physiological Reviews. 99, 21-78 (2019).
- Wilhelm, I., Nyul-Toth, A., Suciu, M., Hermenean, A., Krizbai, I. A. Heterogeneity of the blood-brain barrier. Tissue Barriers. 4, e1143544 (2016).
- O'Brown, N. M., Pfau, S. J., Gu, C. Bridging barriers: a comparative look at the blood-brain barrier across organisms. Genes & Development. 32, 466-478 (2018).
- Cruz-Orengo, L., et al. CXCR7 influences leukocyte entry into the CNS parenchyma by controlling abluminal CXCL12 abundance during autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 208, 327-339 (2011).
- Serres, S., et al. VCAM-1-targeted magnetic resonance imaging reveals subclinical disease in a mouse model of multiple sclerosis. FASEB Journal. 25, 4415-4422 (2011).
- Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
- Sohet, F., et al. LSR/angulin-1 is a tricellular tight junction protein involved in blood-brain barrier formation. Journal of Cell Biology. 208, 703-711 (2015).
- Cruz-Orengo, L., et al. Enhanced sphingosine-1-phosphate receptor 2 expression underlies female CNS autoimmunity susceptibility. Journal of Clinical Investigation. 124, 2571-2584 (2014).
- Dayton, J. R., Franke, M. C., Yuan, Y., Cruz-Orengo, L. Straightforward method for singularized and region-specific CNS microvessels isolation. Journal of Neuroscience Methods. 318, 17-33 (2019).
- Smyth, L. C. D., et al. Markers for human brain pericytes and smooth muscle cells. Journal of Chemical Neuroanatomy. 92, 48-60 (2018).
- Granberg, T., et al. In vivo characterization of cortical and white matter neuroaxonal pathology in early multiple sclerosis. Brain. 140, 2912-2926 (2017).
- Datta, G., et al. Neuroinflammation and its relationship to changes in brain volume and white matter lesions in multiple sclerosis. Brain. 140, 2927-2938 (2017).
- Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging Techniques to Assess Inflammation in Multiple Sclerosis. Neuroscience. 403, 4-16 (2019).
- Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).
- Cornford, E., Hyman, S. Localization of brain endothelial luminal and abluminal transporters with immunogold electron microscopy. NeuroRx. 2, 27-43 (2005).
- Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M. Purification of Mouse Brain Vessels. Journal of Visualized Experiments. , 53208 (2015).
- Paul, D., Cowan, A. E., Ge, S., Pachter, J. S. Novel 3D analysis of Claudin-5 reveals significant endothelial heterogeneity among CNS microvessels. Microvascular Research. , (2012).
- Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. Journal of Neuroscience Methods. 207, 80-85 (2012).
- Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
- Bourassa, P., Tremblay, C., Schneider, J. A., Bennett, D. A., Calon, F. Beta-amyloid pathology in human brain microvessel extracts from the parietal cortex: relation with cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 137, 801-823 (2019).
- Porte, B., et al. Proteomic and transcriptomic study of brain microvessels in neonatal and adult mice. PLoS One. 12, e0171048 (2017).
