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Neuroscience

Aislamiento confiable de microvasculares del sistema nervioso central en cinco grupos de vertebrados

Published: January 12, 2020 doi: 10.3791/60291
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1
1Department of Anatomy, Physiology and Cell Biology, University of California Davis, 2University of Veterinary Medicine Hannover Foundation
* These authors contributed equally

Summary

El objetivo de este protocolo es aislar los microvasculares de múltiples regiones del sistema nervioso central de vertebrados lisencéfalos y gyrencéfalos.

Abstract

El aislamiento de los microvasculares del sistema nervioso central (SNC) se realiza comúnmente mediante la combinación de tejido cortical de múltiples animales, la mayoría de las veces roedores. Este enfoque limita el interrogatorio de las propiedades de la barrera hematoencefálica (BBB) a la corteza y no permite la comparación individual. Este proyecto se centra en el desarrollo de un método de aislamiento que permite la comparación de la unidad neurovascular (NVU) de múltiples regiones del SNC: corteza, cerebelo, lóbulo óptico, hipotálamo, hipófisis, tronco encefálico y médula espinal. Además, este protocolo, desarrollado originalmente para muestras murinas, fue adaptado con éxito para su uso en tejidos del SNC de especies de vertebrados pequeños y grandes de los que también somos capaces de aislar microvas de la materia blanca del hemisferio cerebral. Este método, cuando se combina con inmunoetiquetado, permite la cuantificación de la expresión de proteínas y la comparación estadística entre individuos, tipo de tejido o tratamiento. Demostramos esta aplicabilidad evaluando los cambios en la expresión de proteínas durante la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), un modelo murino de una enfermedad neuroinflamatoria, esclerosis múltiple. Además, los microbuques aislados por este método podrían utilizarse para aplicaciones posteriores como qPCR, RNA-seq y Western blot, entre otros. Aunque este no es el primer intento de aislar los microrridos del SNC sin el uso de ultracentrifugación o disociación enzimática, es único en su adecuación para la comparación de individuos individuales y múltiples regiones del SNC. Por lo tanto, permite la investigación de una gama de diferencias que de otro modo pueden permanecer oscuras: porciones del SNC (córtex, cerebelo, lóbulo óptico, tronco encefálico, hipotálamo, hipófisis y médula espinal), tipo de tejido del SNC (materia gris o blanca), individuos, grupos de tratamiento experimental, y las especies.

Introduction

Nuestro cerebro es el órgano más importante de nuestro cuerpo. Por esta razón, mantener la homeostasis cerebral a pesar de factores externos que pueden desencadenar una desviación de la normalidad es una prioridad. Según algunos eruditos, hace unos 400-500 millones de años1, los animales vertebrados desarrollaron lo que ahora conocemos como la barrera hematoencefálica (BBB)2,3. Esta "cerca" protectora ejerce la mayor influencia sobre la homeostasis del sistema nervioso central (SNC) y funciona regulando estrechamente el transporte de iones, moléculas y células entre la sangre y el parénquima del SNC. Cuando el BBB se interrumpe, el cerebro se vuelve susceptible a la exposición tóxica, infección, y la inflamación. Por lo tanto, la disfunción BBB se asocia con muchos, si no todos, trastornos neurológicos y neurodesarrollo4,5,6.

La sofisticada función del BBB se atribuye a la microvasculatura única del SNC conformada por la unidad neurovascular (NVU)2,3. Células endoteliales altamente especializadas, pericitas y pies de punta astrocíticos son los componentes celulares de la NVU2,3. La matriz extracelular generada por estas células también es esencial para la fisiología NVU y BBB2,3. Aunque los componentes celulares y moleculares esenciales de la NVU se conservan entre los vertebrados, la heterogeneidad se reporta entre las órdenes y las especies7,8. Sin embargo, las limitaciones técnicas impiden nuestra capacidad de considerar plenamente estas diferencias en la neurobiología, la investigación biomédica o traslacional.

Debido a esto, ampliamos un método de aislamiento de microbuques específico de la región del SNC para hacerlo aplicable a numerosas especies de los cinco grupos de vertebrados: peces, anfibios, reptiles, aves y mamíferos. El protocolo se describe para su uso en vertebrados lisencéfalos y grandes, incluidas las especies con relevancia traslacional9. Además, incluimos otras regiones del SNC no investigadas antes en este contexto, pero relevantes para la neurofisiología y con tremendas implicaciones clínicas: el hipotálamo, la hipófisis y la materia blanca. Por último, probamos la capacidad de este método de aislamiento como una herramienta fiable para identificar cambios en la expresión proteica a lo largo de la NVU y/o BBB9,10,11. Como prueba de concepto, mostramos cómo determinar los cambios en la expresión VCAM-1 y JAM-B durante EAE utilizando el método de aislamiento seguido de inmunofluorescencia.

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Protocol

Todos los procedimientos del presente estudio están de acuerdo con las directrices establecidas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de California (UC). El cuidado de animales en UC Davis está regulado por varios recursos independientes y ha sido totalmente acreditado por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care International (AAALAC) desde 1966. Los tejidos del SNC porcino se obtuvieron del Departamento de Ciencias Animales de la UCD, Laboratorio de Ciencias de la Carne. Los tejidos del SNC de los macacos de rhesus se obtuvieron del Departamento Nacional de Patología del Centro Nacional de Investigación de Primates de California (NIH P51OD011107). El personal del laboratorio no realizó anestesia, eutanasia ni necropsia en cerdos y macacos. Por lo tanto, no hay recomendaciones particulares sobre estas cuestiones.

NOTA: Este método fue validado para múltiples especies, pero el protocolo proporcionado corresponde más directamente a los tejidos de ratón y porcino. Los detalles relativos al lóbulo óptico no se aplican cuando se utilizan especímenes de mamíferos. Todos los materiales biopeligrosos deben manipularse en una instalación adecuada para el nivel de bioseguridad (BSL). Todos los materiales agudamente tóxicos deben manipularse debajo de una campana de humos. Todos los residuos médicos biopeligrosos y los residuos tóxicos agudos deben eliminarse adecuadamente.

1. Preparación

  1. Preparar soluciones (Tabla 1) con al menos un día de antelación.
    NOTA: Es muy difícil disolver 70 kDa de peso molecular (MW) dextran. Es más eficiente dejar que la solución se revuelva durante la noche cubierta con película de parafina o papel de aluminio. El protocolo requiere el uso de dos soluciones MV-2 diferentes dependiendo de la muestra bajo investigación. El 18% dextran separa eficientemente la mielina del pellet de microvas al realizar el protocolo en pequeñas muestras lissencéfalas. Sin embargo, desarrolla un frotis de mielina dentro de la interfaz de los tejidos del SNC a partir de grandes muestras gyrencéfalos, así como el hipotálamo y la hipófisis de pequeños especímenes. Este frotis se previene mediante el uso de 20% dextran.
  2. Preparar los toboganes bien cargando 50 ml por pozo de poli-D-lisina y dejar secar durante 2 horas a temperatura ambiente (RT), preferiblemente en un armario de seguridad biológica de clase 2 (BSC-2). No se seque demasiado. Enjuague dos veces con solución salina con fosfato (PBS) y guárdela en el refrigerador hasta que esté lista para usar.

2. Disección de tejido del SNC del espécimen de vertebrado lisencéfalo pequeño

NOTA: El artículo muestra la aplicación del protocolo en un Ratón macho C57BL6/J, de 10 semanas de edad, 25 g.

  1. Preparar dos tubos cónicos de 15 ml y un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml con 5 ml y 1 ml, respectivamente, de solución MV-1 por muestra. Mantenga los tubos en el hielo.
  2. Anestesia
    1. Anestetizar ratones por inyección intraperitoneal de un cóctel de ketamina, xilazina y anestésico de acepromaz a 100/10/3 mg por kg de peso corporal y rociar con 70% de etanol. Confirme la anestesia evaluando la ausencia de reflejos palpebrales y de pedales tocando un ojo y pellizcando un pie, respectivamente.
    2. Anestetizar palomas por inhalación de 5% isoflurano utilizando una caja de anestesia de inducción.
    3. Anestetizar peces y ranas en 1% Tricaína en un tanque de agua de pescado o solución de Anfibio Ringer(Tabla de Materiales),respectivamente.
    4. Anestetiza los lagartos enfriándose a 4oC antes de la eutanasia.
  3. Decapitar al animal con tijeras quirúrgicas, pelar la piel con fórceps para exponer el cráneo, y cortar con tijeras LaGrange a través del foramen magnum (Figura 1A).
  4. Diseccionar el cerebro con una espátula y transferirlo a un tubo cónico de 15 ml con solución MV-1. Mantenga el tubo en el hielo.
  5. Recuperar la hipófisis de la sella turcica del cráneo con fórceps y transferir a un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml con solución MV-1. Mantenga el tubo en el hielo.
  6. Retire la piel y el músculo para exponer la columna vertebral. Cortar las extremidades, la caja torácica y los órganos internos(Figura 1B).
  7. Diseccionar la médula espinal por uno de los dos métodos descritos a continuación. A continuación, transfiera a un tubo cónico de 5 ml con solución MV-1. Mantenga el tubo en el hielo.
    1. Realizar laminectomía cortando en una dirección rostral a caudal con tijeras LaGrange, comenzando a través del foramen vertebralcervical, hasta llegar al cordón lumbar.
    2. Realizar el lavado en una dirección caudal a rostral a lo largo del foramen vertebral lumbar con una aguja de 18 G y una jeringa de 10 ml cargada con solución MV-1(Figura 1C,D).
      NOTA: Este método sólo funciona con especímenes muy pequeños, en su mayoría roedores (<100 g).
  8. Usando un endoscopio, corte el saco dural de la médula espinal con tijeras de resorte y retire las meninges restantes con un pico de doble punta(Figura 2).
  9. Transfiera el cerebro a una placa de Petri y, usando un endoscopio de diselación, retire las meninges con un pico de doble punta(Figura 2A–C).
  10. Exijo los bulbos olfativos y el tálamo con fórceps, tijeras de iris y tijeras de resorte. Usando la selección de doble punta, retire el plexo coroides de todos los ventrículos cerebrales. Asegúrese de quitar todo el plexo coroides.
    NOTA: El plexo coroideo y las bombillas olfativas son una fuente masiva de contaminación. A diferencia del BBB, estos capilares están altamente fenestrados y los resultados de los experimentos posteriores se verán comprometidos si no se eliminan.
  11. Usando fórceps, separe las distintas regiones del SNC: corteza, cerebelo, tronco encefálico, lóbulo óptico (no en muestras de mamíferos) e hipotálamo.

3. Disección de tejido del SNC de un espécimen de vertebrado gyrencéfalo grande

NOTA: Este protocolo utiliza tejidos del SNC porcinos obtenidos de un matadero. Por lo tanto, no se describe ni muestra anestesia, eutanasia o necropsia aquí.

  1. Transporte los tejidos del SNC porcino en un recipiente de histología de 0,946 L (32 oz) cargado con solución MV-1 dentro de un cofre de hielo/cubo.
  2. Usando un endoscopio, retire las meninges con un pico de doble punta, fórceps, tijeras de iris y tijeras de resorte de cada tejido del SNC. Asegúrese de eliminar cualquier pedazo del plexo coroides de los ventrículos cerebrales.

4. Homogeneización del tejido del SNC

NOTA: Es más eficiente cuando dos investigadores participan en el proceso de homogeneización: uno disecing las meninges bajo el estereoscopio y el otro homogeneizar los tejidos picados. De esta manera, los tejidos se devuelven rápidamente al cubo de hielo y se mantienen fríos.

  1. Coloque cada región de CNS en una placa Petri con solución MV-1 de 1 ml de solución. Usando una hoja de un solo borde, pique el tejido para obtener piezas de 1-2 mm.
    1. Para una pequeña muestra de vertebrados, utilice una placa Petri de 100 mm x 20 mm.
    2. Para una muestra de vertebrado grande, utilice una placa Petri de 150 mm x 15 mm.
  2. Homogeneización de un pequeño espécimen vertebrado(Tabla 2 y Tabla 3)
    1. Transfiera la corteza, el cerebelo, el tronco encefálico, el lóbulo óptico y la médula espinal a 1 ml de solución MV-1 en una trituradora individual de tejido de vidrio Potter-Elvehjem de 10 ml con una plaga de PTFE utilizando una pipeta de transferencia. Añadir 5 ml de solución MV-1 y homogeneizar cada tejido (10 golpes). Traslado a tubos cónicos individuales de 15 ml. Mantenga los tubos en el hielo.
      NOTA: Para un vertebrado pequeño, 5 o 4, con o sin lóbulo óptico, respectivamente, se necesitan 10 mL de amoladoras Potter-Elvehjem y tubos cónicos de 15 ml.
    2. Transfiera el hipotálamo y la hipófisis con fórceps a 100 l de solución MV-1 en un tubo individual de 1,7 ml y homogeneice cuidadosamente con un micropsto de vidrio. Enjuague cada micropstel con 1 ml de solución MV-1. Mantenga el tubo en el hielo.
      NOTA: Para un vertebrado pequeño, se necesitan 2 microplagas de vidrio y tubos de 1,7 ml.
  3. Homogeneización de un espécimen de vertebrados grandes(Tabla 4 y Tabla 5)
    1. Usando una pipeta de transferencia, transfiera el tejido picado a una trituradora de tejido de vidrio Potter-Elvehjem de 55 ml con un pestillo de PTFE y adjúntelo al agitador superior. Añadir la mitad del volumen recomendado de la solución MV-1, de acuerdo con la parte específica del SNC que se está homogeneiparando(Tabla 5).
    2. Encienda el agitador superior a muy baja velocidad (150 rpm) y mueva cuidadosamente el tubo de vidrio hacia arriba y hacia abajo durante unos 30 s.
    3. Apague el agitador superior, agregue más solución MV-1 y repita el paso 4.3.2 hasta obtener una suspensión homogénea.
    4. Traslado a un tubo cónico de 50 ml. Mantenga el tubo en el hielo.
    5. Lave la amoladora con agua desionizada entre cada homogeneización del tejido del SNC.
      NOTA: Para un vertebrado grande 5 o 4, con o sin materia blanca, respectivamente, se necesitan tubos cónicos de 50 ml. Del mismo modo, se necesitan dos (2) tubos cónicos de 15 ml para el hipotálamo y la hipófisis.

5. Purificación de microvasos

  1. El tejido centrífugo se homogeneiza resultante de los pasos 4.2.1, 4.2.2 o 4.3.4 a 2.000 x g durante 10 min a 4oC. Una gran interfaz blanca de mielina se formará en la parte superior de los pellets de los microvasos rojizos. Descarta los supernatantes.
    1. Espécimen de vertebrados pequeños(Tabla 2 y Tabla 3)
      1. Resuspenda la corteza, el cerebelo, el tronco encefálico, el lóbulo óptico y los gránulos de la médula espinal en 5 ml de solución MV-2 helada con una pipeta serológica de 5 ml (10 rubores). Añadir 5 ml de solución MV-2 helada a cada suspensión y mezclar cuidadosamente girando los tubos.
      2. Resuspender el hipotálamo y los pellets pituitaria con 1 ml de solución MV-2.
    2. Espécimen de vertebrados grandes(Tabla 4 y Tabla 5)
      1. Agregue 20 ml de solución MV-2 helada a la corteza, el cerebelo, el tronco encerefálico y los gránulos de microvasola de la médula espinal. Resuspende los pellets mezclando en un agitador de revólver de tubo, revolviendo a 40 rpm durante 5 minutos.
      2. Resuspenda el hipotálamo y los gránulos de microvasos pituitarioes en 5 ml de solución MV-2 con una pipeta serológica de 5 ml (10 rubores). Añadir 5 ml de solución MV-2 helada a las suspensiones y mezclar cuidadosamente girando el tubo.
  2. Centrífuga a 4.400 x g durante 15 min a 4oC.
  3. Separe cuidadosamente la gruesa y densa capa de mielina en la interfaz líquida de las paredes de cada tubo girando lentamente los tubos y permitiendo que el sobrenadante pase a lo largo de las paredes.
  4. Deseche la interfaz de mielina y líquido y borre la pared interior de cada tubo con una espátula envuelta con una toallita de papel de baja pelusa. Para muestras de vertebrados pequeños, retire la capa de mielina de cada hipotálamo y tubo pituitario succionando cuidadosamente con una pipeta de transferencia.
  5. Limpie el exceso de líquido con una toallita de papel retorcida con poca pelusa. Resuspenda cada pellet con 1 ml de solución MV-3 utilizando puntas de baja unión. Mantenga los tubos en el hielo.

6. Elución y filtración de microvesseles

  1. Vierta la solución MV-3 helada en vasos individuales para cada región del SNC. Manténgase a 4oC.
    1. Para muestras de vertebrados pequeños, utilice 10 ml de solución MV-3 por vaso de precipitados de 50 ml. Un total de 6-7 vasos es necesario dependiendo de si el lóbulo óptico está incluido o no.
    2. Para muestras de vertebrados grandes, utilice 30 ml de solución MV-3 por vaso de precipitados de 100 ml. Un total de 6-7 vasos es necesario dependiendo de si se incluye o no la materia blanca.
  2. Coloque un colador de células encima de un tubo cónico de 50 ml. Utilice uno por región cns. Utilice un colador de 100 m para la corteza, el tronco encefálico, el lóbulo óptico, la médula espinal y la hipófisis. Utilice un colador de células de 70 m para el cerebelo y el hipotálamo.
  3. Humedezca cada colador con 1 ml de solución MV-3 helada.
  4. Añadir más solución MV-3 a las suspensiones preparadas en el paso 5.5 con una pipeta serológica mientras se mezcla para evitar agregados. Cargue cuidadosamente los microvasos en la parte superior del colador. Enjuague con solución MV-3 helada.
    1. Para pequeños muestras de vertebrados(Tabla 2 y Tabla 3),añadir 10–15 ml de solución MV-3 con una pipeta serológica y enjuagar con 5 ml de solución MV-3.
    2. Para muestras de vertebrados grandes, agregue 20 ml de solución MV-3 con una pipeta serológica y enjuague con 10 ml de solución MV-3.
  5. Montar la unidad de filtración colocando un filtro de red de nylon de 20 m en un soporte de filtro modificado(Figura 2D),uno por región CNS.
    1. Para muestras de vertebrados pequeños(Tabla 2 y Tabla 3),utilice soportes de filtro modificados de 25 mm para la corteza, el cerebelo, el tronco encefálico, el lóbulo óptico y la médula espinal. Utilice soportes de filtro modificados de 13 mm para el hipotálamo y la hipófisis.
    2. Para muestras de vertebrados grandes(Tabla 4 y Tabla 5),utilice soportes de filtro modificados de 47 mm para la corteza, el cerebelo, el tronco encefálico y la médula espinal. Utilice 25 mm para el hipotálamo y la hipófisis.
  6. Coloque el filtro en la parte superior de un tubo cónico de 50 ml y un filtro húmedo con 5 ml de solución MV-3 helada, asegurándose de que el tampón vierta por el soporte del filtro hasta el tubo cónico.
  7. Transfiera los microvasos eludados (del paso 6.4) en la parte superior del filtro de red de nylon de 20 m y enjuague los microrecipientes con 5-10 ml de solución MV-3 helada.
  8. Recupere el filtro con fórceps limpios y sumerjalo en el vaso de precipitados que contiene la solución MV-3 helada preparada en el paso 6.1.
  9. Separe los microrecipientes del filtro sacudiéndolo suavemente durante unos 30 s. Para pequeños especímenes de vertebrados, vierta el contenido del vaso de precipitados en un tubo cónico de 15 ml. Para muestras de vertebrados grandes, vierta el contenido del vaso de precipitados en un tubo cónico de 50 ml.
  10. Centrifugar a 2.000 x g durante 5 min a 4 oC y resuspender el pellet en 1 ml de solución MV-3 helada con una punta de pipeta de baja unión.
    1. Para muestras de vertebrados pequeños, transfiera la suspensión (del paso 6.10) a un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml y centrífuga a 20.000 x g durante 5 min a 4 oC.
      NOTA: Este giro se realiza en una centrífuga de sobremesa a máxima velocidad (20.000 x g)para garantizar un rendimiento robusto.
    2. Para muestras de vertebrados grandes, transfiera la suspensión del paso 6.10 a un tubo de microcentrífuga de 5,0 ml, añada 4 ml de solución MV-3 y centrífuga a 2.000 x g durante 5 min a 4 oC.

7. Inmunomanchación

NOTA: La tinción de hematoxilina y eosina (H&E) se realizó en reptiles, anfibios y especímenes de peces como prueba de concepto de la viabilidad del protocolo. Por lo tanto, no hay ninguna recomendación para el inmunoetiquetado de estos especímenes.

  1. Retire el sobrenadante de los tubos de microcentrífuga.
  2. Resuspenda el pellet en 1 PBS estéril usando una punta de pipeta de baja unión(Tabla de Materiales). Evitar que los microvasos formen agregados pipeteando varias veces. Para muestras de vertebrados pequeños(Tabla 3),utilice de 100 a 2.000 ol de acuerdo con el tamaño del pellet. Para especímenes de vertebrados grandes(Tabla 5),utilice de 1.000 a 4.000 l de acuerdo con el tamaño del pellet.
  3. Usando una punta de pipeta de baja unión, transfiera los microvas a diapositivas de pozo, teniendo cuidado de agregarlos al centro de cada pocal, evitando las paredes laterales.
  4. Ajuste las diapositivas del pozo, descubiertas, dentro de un BSC-2, y deje secar durante 20 a 30 minutos en RT.
    NOTA: Se utiliza un volumen relativamente alto de 1x PBS para evitar la formación de agregados. Debido a esto, es necesario dejar que las diapositivas se sequen antes de la fijación para asegurarse de que los microrecipientes están siendo sostenidos por el recubrimiento de poli-D-lisina.
  5. Retire el PBS residual 1x pipeteando con una pipeta de transferencia, agregue 200 éL de 4% de paraformaldehído (PFA) e incubar durante 30 minutos en RT.
  6. Pipetear la solución fijativa y lavar 3x con 200 éL de 1x PBS durante 5 min a RT.
    NOTA: En este punto se realizaron manchas de H&E en microvas de sNC de pescado, anfibios y reptiles.
  7. Añadir 200 s de tampón de bloqueo a la diapositiva del pozo e incubar durante 60 min a 37 oC.
  8. Retire el tampón de bloqueo con una pipeta de transferencia y añada 200 ml del cóctel de anticuerpos primarios en diluyente de anticuerpos(Tabla de materiales). Incubar a 4oC durante la noche.
  9. Pipetear el cóctel primario de anticuerpos y lavar 3 veces con 200 éL de 1x PBS durante 5 min a RT.
  10. Cargar el cóctel secundario de anticuerpos(Tabla de Materiales)diluido en 1x PBS e incubar durante 2 h a RT, protegido de la luz.
  11. Pipetear el cóctel secundario de anticuerpos y lavar 3 veces con 200 éL de 1x PBS durante 5 min a RT, protegido de la luz. Después del último lavado, desenganche el marco del well-slide y seque cualquier exceso de 1x PBS con una toallita de papel de pelusa baja.
  12. Agregue un soporte de montaje antidescolora líquido y un medio de montaje antidescolora líquido de 4o,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) para la tinción nuclear. Dejar secar durante la noche en RT protegido de la luz.
  13. Una vez seco, manténgase protegido de la luz en una caja deslizante a 4 oC hasta que esté listo para la microscopía confocal y la adquisición de datos.

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Representative Results

Los microvasos aislados del SNC murino mostraron todos los componentes celulares intrínsecos de la unidad neurovascular2,3. Usando molécula de adhesión de células endoteliales plaquetarias-1 (PECAM, también conocida como CD31) o isolctina IB4 (una glicoproteína que une la célula endotelial glicocalyx) para células endoteliales, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR) o antígeno de la neurona-glial 2 (NG2) para pericitos y aquaporina-4 (AQP4) para los pies finales astrocíticos(Figura 3A,B)demuestra que estos componentes intrínsecos están presentes en microvasos aislados. Las regiones visibles del SNC incluyen los microvasos corticales(Figura 3B),el cerebelo(Figura 3C),la hipófisis(Figura 3D),el hipotálamo (Figura 3E),el tronco cerebral(Figura 3F)y la médula espinal(Figura 3G). Todos mostraban expresión de estos marcadores canónicos.

Del mismo modo, los microvasos mostraron expresión de proteína de unión adherencias VE-cadherina(Figura 4A,C),proteínas de unión estrecha claudin-5 y zonula occludens-1 (CLDN5 y ZO-1, Figura 4A,D), proteína de unión tricelular angulin-1(Figura 4A,E)y marcadores apicobasales C-X-C motivo quimiotronina ligada 12 y gamma-glutamilaltransferasa 1 (CXCL12 y GGT1, Figura 4A,F). Estos hallazgos son relevantes porque estas proteínas son indicadores de propiedades pivotales específicas de BBB9,12,13,14. Una presencia limitada de astrocitos, oligodendrocitos y neuronas que expresan proteína ácida fibrilar glial (GFAP, Figura 4B,C,G),proteína específica de oligodendrocitos (OSP, Figura 4B,G),y neurofilamento-medio (NFM, Figura 4B,H),respectivamente, demuestra que los microvasos aislados tenían rastros insignificantes de células unitarias no neurovasculares no deseadas. Por otra parte, la mayoría de los microvasculares carecían de la expresión de la acta muscular lisa (-SMA, Figura 5B,C). Esto es relevante porque el SMA es un marcador para las células musculares lisas asociadas con arteriolas y venules(Figura 5A),lo que indica que este protocolo de aislamiento se dirige selectivamente a microvas de pequeño calibre15.

Los microrecipientes obtenidos de otros pequeños vertebrados lissencéfalos comparten algunas características morfológicas, como se ve en peces (rana y lagarto no se muestran) y microvas aviares. Esto sugiere que este método es útil para una mayor caracterización de las diferencias en NVU entre especies(Figura 6). Además, los microvasos aviares del SNC(Figura 6H–N)mostraron reactividad cruzada con muchos de los anticuerpos desarrollados para humanos y ratones. Esto fomenta una mayor investigación de especímenes aviares para estudios biológicos y biomédicos de BBB. Observamos resultados similares cuando aislamos microvasculares de cerdos y macacos, dos especies gyrencéfalas(Figura 7). Solo se muestran los marcadores canónicos NVU en los microvasos porcinos. Además de las regiones del SNC antes mencionadas, pudimos aislar los microvasculares de la materia blanca periventricular(Figura 7B). Esto es relevante porque la materia blanca está implicada en condiciones neuroinflamatorias (por ejemplo, esclerosis múltiple16,17,18).

Queríamos averiguar si este método podría utilizarse como una herramienta confiable para determinar los cambios en la expresión de proteínas. Sabiendo que VCAM-1 y JAM-B han estado implicados en el proceso neuroinflamatorio en la médula espinal durante la EAE, decidimos cuantificar la expresión de estas proteínas en las etapas máximas y crónicas de EAE y ratones de control falso (ratones C57BL/6J de 10 semanas)9,10,11. Para ello, medimos la unidad arbitraria de intensidad (AUI) a lo largo del diámetro de los microvasculares. A continuación, utilizando un umbral de 20 AUI para DAPI, calculamos el área bajo la curva (AUC) para VE-cadherin, VCAM-1 y JAM-B para 50 microrridos por región de SNC(Figura 8A,B). Por último, realizamos ANOVA bidireccional seguido de la prueba post-hoc de Sidak para determinar la importancia estadística de los cambios en la expresión de proteínas.

Como se preveía, observamos un aumento de VCAM-1 y JAM-B a lo largo de los microvasos de la médula espinal durante el pico de EAE(Figura 8D,E). Sin embargo, observamos cambios en otras regiones del SNC no notificadas previamente para EAE. VCAM-1 aumentó significativamente en microvasculares pituitares y disminuyó en los microvasculares del hipotálamo y tronco encefálico. Hubo cambios durante la EAE crónica en todos los tejidos del SNC(Figura 8D). JAM-B aumentó significativamente en el hipotálamo y microvasos pituitares durante la EAE crónica(Figura 8E). Curiosamente, observamos cambios en la VE-cadherina a lo largo de microvasculares aislados del hipotálamo y tronco encefálico durante el pico de EAE, el cerebelo durante la EAE crónica(Figura 8C),y una disminución en el ancho de los microvasos pituitarios durante el pico y el EAE crónico. En general, estos datos sugieren que este método de aislamiento de microvasculares es una herramienta útil para caracterizar los cambios en los patrones regionales de expresión de proteínas durante la salud y la enfermedad.

Figure 1
Figura 1: Disección eficiente de la médula espinal sin laminectomía. La disección de la médula espinal de pequeños muestras de vertebrados (hasta 100 g) se realiza de forma más rápida y eficiente mediante el lavado del cordón en una dirección caudal a rostral a lo largo del foramen vertebral. Usando tijeras dislindantes la cabeza es removida por la articulación del atlas y la columna vertebral es cortada por la cadera (A). Se extraen todos los órganos restantes, dejando sólo la columna vertebral (B). La médula espinal dentro del foramen vertebral lumbar aparece como un círculo blanco muy pequeño (<1 mm de diámetro) en comparación con el ancho del cordón cervical(B,flechas amarillas). Mantener una abertura estrecha en el foramen vertebral lumbar facilita un gradiente de presión desde la columna lumbar hasta la columna cervical cuando se lava con una aguja de 18 G y una jeringa de 10 cc cargada con 1x PBS (C y D). Una vez enrojecida, la médula espinal(D, flecha amarilla) está casi totalmente desprovista del saco dural, y sólo la pia necesita ser removida bajo el alcance de la disección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Herramienta de disección de picking de doble punta y portafiltros modificado. Esta herramienta de disección de 11 cm de largo (A) tiene dos puntos muy afilados, casi horizontalmente opuestos, 2 mm de punta a punta (B). Aplicando una suave presión hacia abajo y torciendo ligeramente en el sentido de las agujas del reloj(C),los puntos se incrustan horizontalmente en las meninges para que puedan ser levantados hacia arriba. Esto es especialmente útil cuando se retiran las meninges del cerebelo, ya que permite el acceso a la profundidad de la folia cerebeli. También es muy útil cuando se extraen las meninges del tejido cortical, especialmente gyrencephalic. En este caso, la pia está altamente incrustada con vasculatura de alto calibre que comprometerá la pureza del aislamiento microseo. Del mismo modo, facilita la eliminación del plexo coroides, que es la fuente más probable de contaminación. Los soportes de filtro de 47 mm, 25 mm y 13 mm de diámetro se cortaron con láser para retirar el conector de entrada (D) del compartimiento superior (E), pero mantienen el componente de tamiz (G). Esta modificación permitió el montaje de una unidad de filtro (I,J) colocando la red de filtro de nylon de 20 m sobre el tamiz y la parte inferior (G,H), asegurando la red en su lugar al atornillar la parte superior (E). Solo se muestra el soporte del filtro de 25 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Los microvasculares aislados de múltiples regiones del SNC expresaron marcadores de unidades neurovasculares canónicas. (A) Utilizando inmunoetiquetado y microscopía confocal, los componentes celulares intrínsecos de la NVU se utilizan para identificar microvas CNS murinas de 8-14 semanas de edad. Como se ve en la imagen de fusión para microvasos corticales (B), por encima de las imágenes confocales individuales para el marcador de celda endotelial CD31 (blanco), el marcador de pericita PDGFR (rojo) y el marcador astrocítico de pies finales AQP4 (verde) se conservan todos estos componentes celulares. Observe que la relación íntima entre las células endoteliales y los pericitas hacen que aparezcan magenta en la imagen fusionada, mientras que los pies al final astrocíticos parecen tener un halo que las rodea (B). El mismo patrón de expresión se observa para el cerebelo (C), la hipófisis (D), el hipotálamo (E), el tronco cerebral (F), y la médula espinal (G, DAPI, mancha nuclear - azul; barra de escala a 10 m). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Los microrecipientes expresaron proteínas asociadas con propiedades específicas de BBB. Las células endoteliales dentro de la unidad neurovascular (NVU) también son descritas por las proteínas asociadas con sus propiedades de barrera intrínseca (A). Como se ve en la figura, las células endoteliales tienen uniones hechas de VE-cadherina, CLDN5, ZO-1(A, amarillo), y angulin-1 (A, azula). También exhiben polaridad apicobasal a múltiples proteínas incluyendo GGT-1 y CXCL12(A,verde y rojo). Las neuronas, los oligodendrocitos y los cuerpos de células astrocitos pueden incluirse en los microvasos aislados, aunque no son intrínsecos a la NVU (B). Estos son identificables por la expresión de NFM (rojo), OSP (cian) y GFAP (verde lima), respectivamente (B). De acuerdo con estos, nuestros microvasos aislados expresaron adherencias proteína VE-cadherina(C, rojo), proteínas de unión estrecha CLDN5 y ZO-1(D, rojo y verde, respectivamente, fusionarse a amarillo), proteína de unión tricelular LSR (E, verde), y marcadores apicobasal es CXCL12 y GGT1 (F, rojo y verde, respectivamente). También exhibieron cantidades limitadas de GFAP (A, verde, G, blanco), OSP (G, verde), y NFM (H, rojo), lo que sugiere la retención insignificante de las células de la unidad no neurovascular (DAPI, mancha nuclear - azul; barra de escala de 10 m). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: La mayoría de los microvasos aislados no expresan la ACM. La unidad neurovascular presenta una sofisticada transición de arteriole-capillary-venule (A). La expresión anular de la ACM identifica claramente la arteriola, y a medida que se convierte en la expresión capilar, la expresión de la ACM(B, rojo) disminuye, exponiendo el marcador mural NG2 (B, verde). Medimos el diámetro de los recipientes de samm+ y SMA (corchetes blancos, n a 20), para distinguirlos como arteriolas o capilares (DAPI, mancha nuclear, azul, barra de escala a 10 m). El análisis de prueba t no emparejado del diámetro de los recipientes de los recipientes de los recipientes de las islas SMA+ y SMA mostró una alta significación estadística (C, áSMA+ a rojo, AAMa- rojo/verde, ****p < 0.0001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Aislamiento exitoso de los microvasculares del SNC de otras especies lissencéfalas. El CNS fue cosechado de una rana capturada silvestre (8,2 cm), lagarto (12,7 cm), trucha arco iris criada en tanques (2 años, 35,6 cm) y paloma criada en aviario (9 meses de edad, 300 g). Los microrecipientes de la rana, los peces y el lagarto fueron teñidos por H&E (sólo se muestran los microvasculares de la trucha, la barra de la escala de 20 m). Los microvasos de palomas estaban inmunoetiquetados. Pudimos identificar microvas en todas las regiones como etiquetados en los contornos del SNC de peces y palomas: corteza (A y H), lóbulo óptico (B e I), cerebelo (C y J), hipófisis (D y L), hipotálamo (E y K), tronco cerebral (F y M), y médula espinal (G y N). Además, pudimos identificar células endoteliales con isolctina IB4 (blanco), pies astrocíticos con AQP4 (verde), y neuronas adyacentes con NFM (rojo) de los microvasos aislados de la paloma (DAPI, mancha nuclear, azul, barra de escala a 10 m). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Aislamiento de los microvasos del SNC de las especies gyrencéfalas. El cerebro y la médula espinal fueron diseccionados de un cerdo criado en granja (6 meses de edad, 120 kg) para el aislamiento de microvasos y la inmunoetiquetado. Pudimos identificar microvas etiquetadas positivamente para IB4 (blanco), PDGFR (rojo) y AQP4 (verde) en todas las regiones del SNC porcino: corteza (A), materia blanca periventricular (B), cerebelo(C),hipófisis (D), hipotálamo (E), tronco cerebral (F), y médula espinal (G, DAPI, mancha nuclear - azul, barra de escala de 10 m). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Ejemplo de otra aplicación del aislamiento de microvasos CNS. La expresión de JAB-B y VCAM-1 se cuantificó para microvas eAE murinas. Se midieron unidades arbitrarias de intensidad (AUI) para la corteza, el cerebelo, el hipotálamo, la hipófisis, el tronco encefálico y la médula espinal de los ratones en las etapas máximas y crónicas de la EAE, con la farsa como control (n.o 4). Para cada región del SNC, se evaluaron doce microbuques por ratón para determinar la AUI por fluorocromo y el diámetro del microrecipiente (A). Los soportes blancos muestran ejemplos de la herramienta de medición de software de microscopio confocal utilizada para determinar AUI para VCAM-1 (blanco), VE-cadherina (verde), JAM-B (rojo) y DAPI (azul, barra de escala a 10 m). A continuación, la AUI resultante se tracó contra el diámetro en micras (B) para calcular el área bajo la curva (AUC) para cada proteína inmunoetiquetada como una estimación de la expresión de proteína. El AUC medio por grupo fue analizado por ANOVA bidireccional, seguido de la prueba post hoc de Sidak, para un total de 48 microrridos por región del SNC. A excepción de los microvasculares pituitarioes, no observamos diferencias importantes entre el diámetro de los microvasos asociados con el estado de la enfermedad (C, insert), sino una disminución significativa de la expresión de VE-cadherina del hipotálamo y tronco encefálico en ratones EAE (C). Un análisis estadístico similar mostró un aumento significativo para VCAM-1 (D) y JAM-B (E) en la médula espinal, consistente con el estado neuroinflamatorio durante el pico de EAE. Curiosamente, también observamos cambios para VCAM-1 en el hipotálamo, hipófisis, y tronco encefálico. Estos resultados están bajo investigación (barras y puntos negros: sham, barras rojas y puntos, pico EAE, barras de salmón y puntos, EAE crónico, *p<0.05, @p<0.01, #p<0.001 y &p<0.0001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

MV-1 HEPES de 10 mM
en 1x solución salina equilibrada de Hank (HBSS) con calcio y magnesio
MV-2 18% 70 kDa peso molecular (MW) dextran
en 10 mM HEPES/HBSS (MV-1)
MV-2 20% 70 kDa MW dextran
en 10 mM HEPES/HBSS (MV-1)
MV-3 1% albúmina sérica bovina (BSA)
en 10 mM HEPES/HBSS (MV-1)
Fijador 4% paraformaldehyde (PFA)
en 1x solución salina con fosfato (PBS) pH 7,4
Tampón de lavado 1x PBS pH 7.4
Almacenamiento de información y bloqueo de permeabilización 10% BSA
0.25% tensioactivo no iónico
en 1x PBS pH 7.4
Diluente de anticuerpos 5% BSA
0.25% tensioactivo no iónico
en 1x PBS pH 7.4

Tabla 1: Soluciones utilizadas en el protocolo.

Paso(s) Acción
4.1 y 4.1.1 Mince en solución MV-1 con una hoja de un solo filo
4.2 a 4.2.2 Homogeneizar en solución MV-1 utilizando un PTFE Potter-ELVJ o un pestle de microtubo
5.1 Girar a 2.000 x g, 4 oC, 10 min
5.1.1 a 5.1.1.2 Resuspender el pellet en solución MV-2
5.2 Girar a 4.400 x g, 4 oC, 15 min
5.3 a 5.5 Resuspenda el pellet con 1 ml de solución MV-3
6.2 a 6.4.1 Elule sobre un tubo cónico de 50 ml a través de un colador de células y enjuague con solución MV-3
6.5, 6.5.1, 6.6 y 6.7 Filtro con una red de nylon de 20 m en el soporte de filtro modificado
6.8 Cargue la red de nylon en el vaso de precipitados de 50 ml con 10 ml de solución MV-3 y agite durante 30 s
6.9 a 6.10 Decantar en un tubo cónico de 15 ml y girar a 2.000 x g,4 oC, 5 min
6.10 Resuspender en 1 ml de solución MV-3
6.10.1 Pasar a un microtubo de 1,7 ml y girar a 20.000 x g,4 oC, 5 min
7.1 a 7.3 Resuspender en 1x PBS y cargar en diapositivas de pozo

Tabla 2: Disposición para el aislamiento de microvasos vertebrados pequeños. Este gráfico es una versión abreviada del protocolo cuando se utiliza una muestra lissencéfala.

Paso(s) Solución Acción Ctx Cbl Optar Bst Sc Hyp Hoyo
4.1 MV-1 Mince en el plato Plato Petri de 100 mm x 20 mm, 1 mL n/a
4.2.1 y 4.2.2 MV-1 Homogeneizar 5 mL, 10 mL Potter-Elvehjem con pestle 1 ml, micropsto
5.1.1.1 y 5.1.1.2 MV-2 Resuspender 5 mL + 5 mL, 18% Dextran 1 mL, 20% dextran
5.5 y 6.4.1 MV-3 Resuspender 1 mL + 10-15 mL 1 mL
6.2 y 6.4.1 MV-3 Tamaño del colador 100 m 70 m 100 m 70 m 100 m
Enjuague 5 mL
6.5, 6.5.1 y 6.7 MV-3 Tamaño del filtro, enjuague Filtro de 25 mm, 10 mL 13 mm, 5 mL
6.8 MV-3 Agitar en el vaso de precipitados 10 mL
6.10 MV-3 Resuspender 1 mL
7.2 1x PBS Resuspender 1,5 a 2,0 ml 0,5 a 1,0 ml 0,1 a 0,2 ml
7.3 1x PBS Carga por pozo 200 l 100 l 25 a 50 l
CTX - corteza, CBL - cerebelo, BST - tronco cerebral, OPT - lóbulo óptico (no presente en mamíferos), HYP - hipotálamo, PIT - hipófisis, SC - médula espinal. Los volúmenes recomendados son para el tejido entero de animales que varían en tamaño de 20 g (ratón joven) a 800 g (rata adulta).

Tabla 3: Volumen/tamaño recomendado. Este esquema tiene el volumen recomendado de soluciones para el uso de una pequeña muestra de vertebrados que van desde 20–800 g, o más específicamente, el ratón de 25 g que se muestra en el vídeo. El ajuste final de los volúmenes necesarios debe ser determinado por el investigador de acuerdo con la cantidad específica de tejido húmedo obtenido después de la disección. La práctica y la solución de problemas son muy recomendables. CTX - corteza, CBL - cerebelo, BST - tronco cerebral, OPT - lóbulo óptico (no presente en mamíferos), HYP - hipotálamo, PIT - hipófisis, SC - médula espinal.

Paso(s) Acción
4.1 y 4.1.2 Mince en MV-1 con una hoja de un solo borde
4.3 a 4.3.4 Homogeneizar en solución MV-1 utilizando una trituradora Potter-Elvehjem con un pestillo de PTFE
5.1 Girar a 2.000 x g, 4 oC, 10 min
5.1.2 a 5.1.2.2 Resuspender el pellet en solución MV-2
5.2 Girar a 4.400 x g, 4 oC, 15 min
5.3 a 5.5 Resuspenda el pellet con 1 ml de solución MV-3
6.2 a 6.4 y 6.4.2 Elule sobre un tubo cónico de 50 ml a través de un colador de células y enjuague con solución MV-3
6.5, 6.5.2, 6.6 y 6.7 Filtro con una red de nylon de 20 m en el soporte de filtro modificado
6.8 Cargue la red de nylon en un vaso de precipitados de 50 ml con 30 ml de solución MV-3 y agite durante 30 s
6.9 y 6.10 Decantar en un tubo cónico de 50 ml y girar a 2.000 x g,4 oC, 5 min
6.10 Resuspender en 1 ml de solución MV-3
6.10.2 Pasar a un microtubo de 5 ml y girar a 2.000 x g,4 oC, 5 min
7.1 a 7.3 Resuspender en 1x PBS y cargar en diapositivas de pozo

Tabla 4: Disposición para el aislamiento de microvasos vertebrados grandes. Este gráfico es una versión abreviada del protocolo cuando se utiliza una muestra gyrencéfala.

Paso(s) Soution Acción Ctx Cbl Wm Bst Sc Hyp Hoyo
4.1 MV-1 Mince en el plato 3 x 5 ml 1 mL
4.3 a 4.3.4 MV-1 Homogeneizar 20 x 30 mL, 55 mL Potter-Elvehjem con pestle y agitador superior 5 mL, 10 mL Potter-Elvehjem con pestle
5.1.2 a 5.1.2.2 MV-2 Resuspender >20 mL, 20% dextran 5 mL + 5 mL, 20% dextran
5.5, 6.4 y 6.4.2 MV-3 Resuspender 1 mL + 20 mL 1 mL + 10 mL
6.2 y 6.4.2 MV-3 Tamaño del colador 100 m 70 m 100 m 70 m 100 m
Enjuague 10 mL
6.5, 6.5.2 y 6.7 MV-3 Tamaño del filtro, enjuague Filtro de 47 mm, 10 mL 25 mm, 10 mL
6.8 MV-3 Agitar en el vaso de precipitados 30 mL
6.10 y 6.10.2 MV-3 Resuspender 1 mL + 4 mL
7.2 1x PBS Resuspender 2.0 a 4.0 mL 1,0 a 2,0 ml
7.3 1x PBS Carga por pozo 200 l 100 l
CTX - corteza, CBL - cerebelo, WM - materia blanca, BST - tronco encefálico, HYP - hipotálamo, PIT - hipófisis, SC - médula espinal. Los volúmenes recomendados son para muestras de 45 cm3 para CTX, CBL, BST y SC completo HYP y PIT.

Tabla 5: Volumen/tamaño recomendado. Este esquema tiene el volumen recomendado de soluciones para el uso de una muestra de vertebrado grande. Más específicamente, se aplica a las biopsias de tejido del SNC de 45 cm3 para la corteza, el cerebelo, la materia blanca, el tronco encerefálico, la médula espinal, y todo el hipotálamo y la hipófisis, como se muestra en el video. El ajuste final de los volúmenes necesarios debe ser determinado por el investigador de acuerdo con la cantidad específica de tejido húmedo obtenido después de la disección. La práctica y la solución de problemas son muy recomendables. CTX - corteza, CBL - cerebelo, WM - materia blanca, BST - tronco encefálico, HYP - hipotálamo, PIT - hipófisis, SC - médula espinal.

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Discussion

El BBB incluye las propiedades únicas de las células endoteliales de microvasculatura cerebral del cerebro acopladas por una sofisticada arquitectura de uniones estrechas, adheridas, "peg-socket", y placas de adhesión críticas para la homeostasisdelSNC2,3,19. Las propiedades de las células endoteliales son inducidas y mantenidas por pericitos y los procesos de pie final de la astroglia circundante2,3,19. La microvasculatura BBB muestra polaridad (es decir, el patrón de expresión asimétrica de proteínas localizadas en superficies celulares endoteliales luminales o abluminales)20. Si bien esto puede definir brevemente el BBB, en realidad sigue siendo una de las nociones más enigmáticas en neurociencia. Por ejemplo, las diferencias regionales, sexuales y de edad dentro de la NVU pueden explicar vulnerabilidades regionales del SNC a traumatismos, toxicidad, infección e inflamación, que pueden tener consecuencias clínicas importantes3,5,6. Otro obstáculo en la comprensión del BBB son las diferencias observadas entre los taxones múltiples7,8. Uno de los principales obstáculos de la comprensión e investigación del BBB es precisamente la dificultad relacionada con el aislamiento de la NVU que abarca el BBB, manteniendo sus propiedades específicas de barrera14.

En un intento de acelerar nuestra comprensión de las diferencias BBB, CNS-regionales, así como las diferencias de especies, adaptamos métodos publicados anteriormente. Adaptamos con éxito estos, en particular Boulay et al.21, para obtener microvas de simples corticales, cerebelosos, hipotalámicos, pituitario, tronco encefálico y tejidos espinales en una miríada de vertebrados pequeños lisencéfalos: peces, anfibios, reptiles, aves y mamíferos(Figura 3, Figura 4, Figura 5y Figura 6). Una ventaja de este método es que sus adaptaciones se basan en el tamaño total del tejido del SNC: el investigador elige la cantidad de solución, el tamaño de la trituradora de tejido, el tubo cónico, los portafiltros, etc. según el tejido húmedo, independientemente de la especie, el sexo y la edad. En nuestra experiencia con inmunoetiquetado, una muestra de 20 g produce suficientes microvas para un deslizamiento de 8 pozos por corteza, cerebelo, lóbulo óptico, tronco encefálico y médula espinal y medio tobogán de 8 pozos por hipotálamo y hipófisis. Sin embargo, el rendimiento del lóbulo cortical y óptico es mucho mayor en comparación con el cerebelo, el tronco encefálico y la médula espinal.

Como se muestra, realizamos las adaptaciones necesarias para el aislamiento e inmunoetiquetado de microvasculares del SNC de cerdos y macacos, mamíferos gyrencéfalos más grandes que son más relevantes para la investigación traslacional(Figura 7). En particular, pudimos incluir materia blanca periventricular solo en estas especies. Dado que el SNC en estos animales es más grande, recogimos suficiente materia blanca para permitirnos separar un pellet de microvasde la capa de mielina durante la segunda centrifugación (paso 5.3, MV-2 con 20% de dextran). Especulamos que se necesita una masa crítica para poder lograr esta separación y estamos buscando activamente cómo obtener un resultado similar con el tejido del SNC murino.

Aunque se omitió en aras de la simplicidad, realizamos inmunoetiquetado más allá de los marcadores canónicos de nVU en microrridos aviares, porcinos y macacos. En particular, todas las especies compartían marcadores celulares y moleculares previamente identificados en muestras murinas como relevantes para la función BBB (proteínas de unión VE-cadherina, CLDN5, ZO-1 y LSR y marcadores apicobasals CXCL12 y GGT1) o en proximidad a NVU (NFM, OSP y GFAP). Una vez más, estos hallazgos fomentan el uso de este método en otras especies para identificar aún más la ortología nVU y la divergencia entre las especies. También abre la oportunidad para una mayor investigación sobre las diferencias de cepa, sexo y edad de NVU dentro de la misma especie y la viabilidad de utilizar otros organismos para la investigación biomédica de BBB. También mostramos evidencia de un uso exitoso de este método de aislamiento de microvasos para cuantificar los cambios en los niveles de expresión de proteínas durante la neuroinflamación(Figura 8). A pesar de que realizamos este experimento como una prueba de concepto, el enfoque utilizado aquí es actualmente ampliamente explotado en nuestro laboratorio. Estamos a favor de este enfoque sobre otros métodos cuantitativos (por ejemplo, Western blot) porque queremos centrarnos no sólo en el nivel de expresión sino en la abundancia relativa de proteínas, la reubicación de CXCL12 y otras proteínas apicobasales, la vinculación de proteínas de unión, etc., dentro de la complicada apariencia de los microvasdelSNC9,13,22. Del mismo modo, actualmente estamos solucionando problemas de nuestro método para otras aplicaciones, como el aislamiento adicional de los componentes celulares NVU (células endoteliales y periríticos), ARN-seq, y proteómica23,24,25,26.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

El Dr. Cruz-Orengo contó con el apoyo de la Universidad de California, Davis, School of Veterinary Medicine Start Up Funds.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X PBS ThermoFisher BP39920 Used for blocking and antibody diluent.
20% PFA Electron Microscopy Sciences 15713-S Used as fixative (4% PFA)
70,000 MW Dextran Millipore Sigma 9004-54-0 Used for MV-2 solution
Adson Forceps Fine Science Tools (FST) 11006-12 Used for removal of muscle and skin
Adson Forceps, student quality FST 91106-12 Same as above but cheaper
Bovine serum albumin (BSA) Millipore Sigma A7906-100G Used for MV-3 solution, blocking and antibody diluent
Corning 100 μm Cell strainer Millipore Sigma CLS431752-50EA
Corning 70 μm Cell strainer Millipore Sigma CLS431751-50EA
Corning Deskwork low-binding tips Millipore Sigma CLS4151 Same as below but cheaper.
Cultrex Poly-D-Lysine R&D 3439-100-01 Used for slide coating
Donkey anti-Goat IgG-ALEXA 555 Thermo A21432 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Donkey anti-Mouse IgG-ALEXA 488 Thermo A21202 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 488 Thermo A21206 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 647 Thermo A31573 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Donkey anti-Rat IgG-DyLight 650 Thermo SA5-10029 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Double-Pronged Tissue Pick FST 18067-11 Used for removal of meninges and choroid plexus
Dumont #3c Forceps FST 11231-20 Used for more delicate and/or small CNS tissue handling (like pituitary)
Dumont #7 Forceps FST 11274-20 Used for CNS tisssue dissection and handling
Dumont #7 Forceps, student FST 91197-00 Same as above but cheaper
ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Tips Eppendorf 22493008 Better quality than the tips above (more expensive).
Extra Fine Graefe Forceps, serrated FST 11151-10 Used for bone removal
Fine Scissors, sharp FST 14060-09 Used for removal of pig and macaque dural sac
Glass Pestle 1.5 mL Microcentrifuge Tube Tissue Grinder Homogenizer, Pack of 10 Chang Bioscience Inc. (eBay) GP1.5_10 Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.
Goat anti-CXCL12, biotinylated PeproTech 500-P87BGBT Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution: 1:20.
Goat anti-JAM-B R&D AF1074 Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 488 Thermo A11001 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 555 Thermo A21424 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Goat anti-PDGFRβ R&D AF1042 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Goat anti-Rabbit IgG-ALEXA 555 Thermo A21249 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Goat anti-Rabbit IgG-DyLight 488 Thermo 35552 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Goat anti-Rat IgG-DyLight 650 Thermo SA5-10021 Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.
Graefe Forceps, curved tip, 1X2 teeth FST 11054-10 Use for nylon filter net holding and shaking
HBSS, 1X buffer with calcium and magnesium Corning 21-022-CM Used for MV-1 solution
HEPES, 1M liquid buffer Corning 25-060-CI Used for MV-1 solution
Isolectin GS-IB4-Biotin-XX ThermoFisher Scientific (Thermo) I21414 Glycoprotein isolated from legume Griffonia simplicifolia that binds D-galactosyl residues of endothelial cell glycocalysx. Used for avian and porcine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL.
LaGrange Scissors, serrated FST 14173-12 Used for skull dissection and laminectomy (except pig and macaque)
Millicell EZ slide 8-well unit Millipore Sigma PEZGS0816
Mouse anti-CLDN5 Thermo 35-2500 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Mouse anti-GGT1 Abcam ab55138 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Mouse anti-Human CD31 R&D BBA7 Used as primary antibody on primate CNS microvessels. Recommended concentration: 16.5 μg/mL.
Mouse anti-NFM Thermo RMO-270 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Mouse anti-αSMA Thermo MA5-11547 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.
Nylon Filter Net, roll Millipore Sigma NY6000010 Laser-cut to 13 mm diameter filter net discs. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.
Nylon Filter Nets, 25 mm Millipore Sigma NY2002500 Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.
Nylon Filter Nets, 47 mm Millipore Sigma NY2004700 Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.
ProLong Gold antifade reagent with DAPI ThermoFisher P36935 Used to coverslip slides.
Rabbit anti-AQP4 Millipore Sigma A5971 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.
Rabbit anti-LSR Millipore Sigma SAB2107967 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Rabbit anti-NG2 Millipore Sigma AB5320 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.
Rabbit anti-OSP Abcam ab53041 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 1 μg/mL.
Rabbit anti-VE-Cadherin Abcam ab33168 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Rabbit anti-ZO-1 Thermo 61-7300 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Rat anti-CD31 Becton Dickinson BD 550274 Used as primary antibody for murine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Rat anti-GFAP Thermo 13-0300 Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.
Rat anti-VCAM-1 Becton Dickinson BD 553329 Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL.
Sterile Ringer's Solution, Frog Aldon Corporation IS5066 Used for amfibian anesthesia
Streptavidin-ALEXA 555 Thermo S32355 Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500.
Streptavidin-ALEXA 647 Thermo S32357 Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500.
Surgical Scissors, sharp FST 14002-12 Used for removal of muscle and skin
Surgical Scissors, sharp-blunt FST 14001-16 Used for decapitation (except pig and macaque)
Swinnex Filter Holder, 13 mm Millipore Sigma SX0001300 Modified by laser-cut. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.
Swinnex Filter Holder, 25 mm Millipore Sigma SX0002500 Modified by laser-cut. Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.
Swinnex Filter Holder, 47 mm Millipore Sigma SX0004700 Modified by laser-cut. Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.
Triton X-100 ThermoFisher 50-165-7277 Used for blocking and antibody diluent.
Wheaton 120 Vac Overhead Stirrer VWR (Supplier DWK Life Sciences) 62400-904 (DWK #903475) Used for macaque and pig CNS tissues with 55 mL tissue grinder, except hypothalamus and pituitary.
Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 10 mL VWR (Supplier DWK Life Sciences) 14231-384 (DWK #357979) Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.
Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 55 mL VWR (Supplier DWK Life Sciences) 14231-372 (DWK #357994) Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.

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References

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Aislamiento confiable de microvasculares del sistema nervioso central en cinco grupos de vertebrados
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Yuan, Y., Dayton, J. R., Freese, M.… More

Yuan, Y., Dayton, J. R., Freese, M. L., Dorflinger, B. G., Cruz-Orengo, L. Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups. J. Vis. Exp. (155), e60291, doi:10.3791/60291 (2020).

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