Imaging av intracellulære ATP i Organotypic tissue skiver av Mouse Brain ved hjelp av bånd-basert sensor ATeam 1.03^YEMK

Her demonstrerer vi hvordan du bruker DEN ATP-sensitive FRET-sensoren ATeam 1.03 YEMK for dynamiske målinger av endringer i nevronale og astrocytiske ATP-nivåer i organotypisk kultiverte museflodcampale skiver. Den største fordelen med denne teknikken er at man kan studere energimetabolisme i levende hjernevev i en kontrollert setting, et miljø med høye sensoruttrykksnivåer. Denne teknikken kan bidra til å få innsikt i pathomechanisms, underliggende sykdommer, eller hjerneskade, for eksempel forårsaket av energimangel, som iskemisk hjerneslag.

Det kan i prinsippet brukes til å studere ATP-nivåer, ikke bare i hjernevev, men også i andre organer. For å kunne kjøre dette eksperimentet, er det viktig å utføre alle trinnene som er involvert i å kultere vevet ekstremt forsiktig og for å opprettholde sterilitet. Videre er det nødvendig med litt kunnskap om cellulær fluorescerende bildebehandling.

Vevshåndtering i mest sofistikert tilnærming og en visualisering er viktig for å forstå de riktige prosedyrene. Det samme gjelder for bildeeksperimenter. Demonstrere prosedyren vil være Rodrigo Lerchundi, en postdoc, og Na Huang, en Master student fra laboratoriet.

I en iskald petriskål fylt med ACSF, legg hjernen på en filtermembran. Skill halvkulene og utfør et parasagittalt kutt i en vinkel på 45 grader. Fest en halvkule på Vibratome vev stadium med superlim, og umiddelbart overføre vevsblokken til Vibratome bad som inneholder iskalde ACSF bobler med 5% karbondioksid og 95% oksygen.

Juster vevet i Vibratome-badet. Hold den andre halvkule i iskald ACSF til kutting. Juster Vibratomen for å kutte skiver på 250 til 400 mikrometer.

Etter å ha kuttet skiven, identifiser hippocampalformasjonen basert på det typiske morfologiske utseendet og isolere det ved hjelp av hypodermiske nåler, og hold den delen av hjernebarken ved siden av hippocampus. Legg skiven på et nett i ACSF, varmet opp til 34 grader Celsius og bobler med 5% karbondioksid og 95% oksygen til alle skivene samles inn. Overfør skivene til laminærstrømningskabinettet for å fortsette under sterile forhold.

Med en invertert, steril, glass Pasteur pipette, forsiktig overføre skiver fra ACSF til en av de forvarmede Petri retter fylt med sterile Hanks’salt løsning. Bytt pipetten og overfør skivene til den andre kulturretten. Gjenta prosessen fem ganger totalt.

Overfør så lite HBSS som mulig til følgende kulturplater. Bruk en pipette til å forsiktig plassere en skive om gangen på toppen av kulturinnsatsen. Unngå turbulenser i pipetten, og vent til skiven går ned til spissen av Pasteur pipetten.

Gjenta prosessen for hver sektor. Legg to skiver på en membran. Fjern forsiktig overflødig Hank-løsning fra toppen av innsatsen ved hjelp av en fin spiss.

Hold kulturene i en fuktet inkubator ved 5% karbondioksid og 37 grader Celsius til dagen for eksperimentet. Bytt medium hver to til tre dager. Uten å berøre vevet, bruk 0,5 mikroliter av den fortynnede vektoren direkte til toppen av hver skive.

Til slutt plasserer skivene tilbake i inkubatoren og vedlikeholder dem der i minst seks dager til. Like før du starter et eksperiment, overfør en innsats som inneholder kultiverte skiver i den sterile hetten, og legg den i en 30 millimeter tallerken som inneholder en milliliter organotypisk skivekulturmedium, eller minimalt viktig medium. Plasser parabolen under stereoskopet og fokuser på overflaten av skiven.

Bruk to sterile hypodermiske nåler for å lage en kort krysssnitt rett på de smale kantene av en valgt skive, og i det øvre laget uten å skade vevet under. For å fjerne den tilberedte skiven fra innsatsen, hold kantene på membranen med pinsett og bruk en steril skalpell for å lage rette, parallelle kutt til membranen, danner en firkant eller en trekant med skiven i midten. Hvis innsatsen er vert for flere skiver, overfører du den tilbake til den opprinnelige platen og inn i inkubatoren.

Overflatespenningen i mediet vil forhindre lekkasje på membranens overflate. Forbered eksperimentell ACSF og få en pH på 7,4 ved å boble den med 95% oksygen og 5% karbondioksid gjennom en innsatt slange koblet til karbagenforsyningen i minst tretti minutter. Hold saltvannet bobler under hele eksperimentet.

Slå deretter på den fluorescerende lyskilden til monokroometeret. Overfør den organotypiske skivekulturen inn i det eksperimentelle kammeret. Plasser et rutenett på toppen av den organotypiske skivekulturen med rammen ned, ikke berøre kulturen, og trådene opp, berøre membranen.

Plasser kammeret på mikroskopstadiet og koble det til perfusjonssystemet. Slå på den peristaltiske pumpen med en strømningshastighet på 1,5 til 2,5 milliliter per minutt. Kontroller at det ikke lekker opp perfusjonssystemet.

Bruk overføringslys, ta den kultiverte skiven i fokus og identifiser området der eksperimenter skal utføres. Før du starter bildeeksperimenter, må du vente i minst 15 minutter for å la skiver tilpasse seg saltvannsforholdene, og slå deretter på kameraet og bildeprogramvaren. Opphisse donor fluorescerende protein på 435 nanometer.

Sett eksponeringstiden til mellom 40 og 90 millisekunder. Sett deretter det diktomiske speilet og filtrene inn i strålesplitterenheten. Del fluorescensutslippet på 500 nanometer med en utslippsbildesplitter, og bruk båndpassfiltre på 482 pluss eller minus 16 og 542 pluss eller minus 13,5 nanometer for å isolere donor og akseptorfluorescens.

Velg en interesseregion tilsynelatende blottet for cellulær fluorescens for subtraksjon i bakgrunnen. Sirkel enkeltstrukturer av merket vev i bildet på skjermen for å lage ROIer. Angi frekvensen for bildeanskaffelse og den totale opptakstiden.

For eksperimenter som er lengre enn 30 minutter, anbefales en oppkjøpsfrekvens på 0,2 til 0,5 Hertz for å forhindre fototoksisitet. Deretter starter du opptaket. For å indusere endringer i intracellulær ATP, bytt perfusjonsrøret fra standard ACSF til en saltvannsholdig metabolske hemmere, for eksempel kjemisk iskemiløsning.

Alternativt kan du bruke en saltvann med forhøyet kaliumkonsentrasjon på åtte millimolar for å etterligne frigjøring av kaliumion fra aktive nevroner. Rett etter opptakene utveksler du den eksperimentelle ACSF med heaps-bufret ACSF. Deretter overfører du opptakskammeret som inneholder skivekulturen til det konokale laserskanningsmikroskopet.

Ta Z-stakkbilder med høyest mulig Z-oppløsning ved den angitte optiske konfigurasjonen. I denne protokollen, ti dager etter en transduksjon, ble nevroner som uttrykker ATeam 1,03 YEMK funnet ved høy tetthet i neocortex av kultiverte vevskiver på dybder på opptil 50 mikrometer under skiveoverflaten. Sammenlignbare resultater ble oppnådd i hippocampus.

For astrocytter ble ATeam 1.03 YEMK uttrykt under kontroll av den menneskelige glial fibrolary sure proteinarrangøren, og organotypiske skiver som uttrykker ATeam 1.03 YEMK i hippocampal nevroner utvalgte ROM representerer somata av pyramidale celler. Etter å ha eksponert skiven til 5 millimolar natriumazid i fravær av ekstracellulær glukose i ett minutt, ble motsatte endringer indusert i utslippsintensiteten til FRET-paret. Det ble også observert en reversibel reduksjon i ATeam FRET-forholdet.

Langsiktig ATeam FRET-forhold i 14 forskjellige celler under baselineforhold i nevroner og astrocytter viser at ATeam er en pålitelig og stabil sensor. Vær oppmerksom på at kjemisk iskemi resulterte i forventet sterk nedgang i ATeam-forholdet i begge celletyper på slutten av dette eksperimentet. En økning i den ekstracellulære kaliumkonsentrasjonen fra tre til åtte millimolar i tre minutter resulterte ikke i en påviselig endring i nevronene som uttrykte ATeam 1,03 YEMK.

Astrocytter reagerte derimot på økningen i ekstracellulær kalium med en reversibel økning i ATeam FRET-forholdet, noe som indikerer en økning i intracellulære ATP-nivåer. Igjen forårsaket kjemisk iskemi en umiddelbar reduksjon i ATeam-forholdet, noe som viste at sensoren kan oppdage endringer i ATP. Når du prøver FRET-basert cellulær bildebehandling som beskrevet her, er det viktig å huske på at produksjon av høykvalitets skiver i organotypiske kulturer er et viktig skritt.

Videre er nøye fjerning av glial arr og ekspertnivå bildebehandling nødvendig. Etter denne prosedyren bør man også kunne utføre eksperiment som omfatter forskjellige andre FRET-baserte nanosensor for cellulære metabolitter. For eksempel de for glukose eller laktat.

Sist, men ikke minst, må det understrekes at relevante handlinger for beskyttelse av dyr alltid må observeres. Dette gjelder også for de effektive lovene som styrer håndteringen av genmodifiserte organismer.