Summary
이 프로토콜은 뇌 기증 프로그램과 뇌의 적절한 특성을 통해 개별 뇌 노화 궤적을 추적하는 방법을 설명합니다. 두뇌 기증자는 연쇄 다차원 평가를 포함하여 장기 종방향 연구 결과에 관여합니다. 이 프로토콜에는 뇌 처리에 대한 자세한 설명과 정확한 진단 방법론이 포함되어 있습니다.
Abstract
지속적으로 고령화 인구에서, 신경 퇴행성 질환의 보급은 상승 할 것으로 예상된다. 질병 메커니즘을 이해하는 것은 예방 및 치료 조치를 찾는 열쇠입니다. 이를 달성하는 가장 효과적인 방법은 병과 건강한 뇌 조직의 직접 검사를 통해서입니다. 저자는 선행 두뇌 기증 프로그램에 등록된 개별에 의해 기증된 좋은 질 두뇌 조직을 얻고, 가공하고, 특성화하고 저장하는 프로토콜을 제시합니다. 기부 프로그램에는 사람들에게 대면 공감접근법, 보완적인 임상, 생물학적, 사회적, 라이프스타일 정보, 시간이 지남에 따라 연쇄 다차원 평가가 포함되어 정상적인 노화와 인지 기능 저하의 개별 궤적을 추적합니다. 많은 신경 질환은 비대칭이기 때문에, 우리의 두뇌 은행은 신선한 표본을 슬라이스하기위한 독특한 프로토콜을 제공합니다. 두 반구의 뇌 섹션은 교대로 얼어 붙거나 (-80 °C에서) 또는 포르말린에 고정; 한 반구의 고정 된 슬라이스는 다른 반구의 고정 된 조각에 해당합니다. 이 접근법으로, 모든 냉동 물질의 완전한 조직학적 특성을 얻을 수 있고, 오믹스 연구는 두 반구에서 조직학적으로 잘 정의된 조직에 수행될 수 있으므로 신경 퇴행성 질환 메커니즘에 대한 보다 완전한 평가를 제공할 수 있다. 이러한 질병의 정확하고 명확한 진단은 종종 병인을 해석하는 데 필요한 중요한 병인 단서를 추가하는 신경 병리학 평가와 임상 증후군을 결합하여 달성 될 수 있습니다. 이 방법은 제한된 지리적 영역만 을 커버하기 때문에 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들며 제한될 수 있습니다. 그 한계에 관계없이, 그것이 제공하는 특성의 높은 정도는 보람이 될 수 있습니다. 우리의 궁극적 인 목표는 최초의 이탈리아 뇌 은행을 설립하는 것입니다, 신경 병리학적으로 검증 된 역학 연구의 중요성을 강조하면서.
Introduction
WHO에 따르면 현재 약 5천만 명이 치매를 앓고 있으며, 이는 2050년까지 3배로 증가할 것으로 예상됩니다. 알츠하이머 병은 치매의 주요 원인이며 뇌혈관 질환 및 기타 노화 관련 신경 퇴행성 질환이 뒤따릅니다. 2017년 WHO는 치매에 대한 인식을 제고하고 글로벌 실천 계획을 장려하기 위해 글로벌 치매 천문대를개발했다. 각 개인은 자신의 뇌 노화 궤적을 가지고, 따라서 치료에 대한 검색은 신경 퇴행성 질환의 발병의 복잡성으로 인해 도전 적 수 있습니다. 아마도, 각 사람은 개인화 된 접근 방식을 필요로 하는 뇌 조직에 기록 된 그녀 또는 자신의 병인을 소유. 따라서, 뇌 조직의 연구는 신경 변성의 메커니즘을 이해하는 열쇠가 될 것입니다.
신경 과학의 역사를 돌이켜 보면, 우리는 인간의 뇌를 직접 검사하지 않고는 가장 인상적이고 획기적인 발견이 결코 일어나지 않았을 것이라는 것을 깨닫습니다. 시간이 지남에 걸쳐, 연구 할 뇌 조직의 소스는 원유 해부에서 변경되었습니다, 임의의 '기회 만남', 어떤 경우에는 불법 거래, 조직 뇌 수집 및 전략적 현대 뇌 은행에. 많은 윤리적 측면의 고려는 과거의 뇌 컬렉션에서 현대 뇌 은행을 차별화 주요 요인 중 하나입니다. 최초의 실제 현대 브레인 뱅크 (BBs)는 20세기 후반에 제정되었다. 니콜라스 코셀리스와 월리스 투르텔로트는 현대 브레인 뱅킹의 선구자로 간주될 수 있습니다. 영국에서 Corsellis는 다양한 정신 및 신경 장애2에영향을 받은 1000개 이상의 잘 문서화된 뇌를 보유한 컬렉션을 조립했습니다. 또한, Corsellis는 생화학 적 테스트를 위해 얼음에 신선한 뇌 조직을 보존 할 필요성을 밝히는 데 도움이3. 한편, 미국에서 월리스 Tourtelotte는 잠재적 인 뇌 기증자의 권유를 용이하게하고 수집 된 뇌가 완전한 의료 및 신경 역사를 동반할 수 있도록 선행 뇌 기증 프로그램을도입4,,5. 뇌 수집과 현대 BB의 역사적인 개요를 보려면 Carlos 외를 참조하십시오. 6.
그렇다면 왜 우리는 여전히 인간의 뇌가 필요한가? 뇌 질환은 신경 병리학 검사 후 명확한 진단을 받을 수 있습니다. 신경 병리학은 임상 진단에 도전하고, 임상 현상의 정확한 해석및 새로운 syndromic 변이체의 조직학 기지의 발견에 열쇠입니다. 실제로, 진단은 병리학적인 그림에 근거하여 재정의될 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 부검 속도 혁신적인 신경 이미징 기술의 최근 개발으로 인해 지난 수십 년 동안 감소 했다. 뇌 이미징을 통해 뇌의 형태학적, 기능적 및 대사 적 변화뿐만 아니라 단백질 오접기 정도는 생체 내에서평가될 수 있습니다. 그러나, 생체 내 신경 이미징 및 기타 바이오마커 연구에서는 미묘한 세포 및 분자 변화를 감지할 수 없기 때문에 병리학적 그림의 "추정"만 줄 수 있습니다. 분자 이미징의 발전과 새로운 바이오마커, 표적 분자 및7 추적자 7(예: 아밀로이드, TAU, microglial 추적자)은 임상 평가 및 바이오마커 테스트에서 얻은 데이터의 해석에 인간의 뇌를 더욱 필수 불가결하게 만듭니다. 또한, 오믹스 기술 (유전체학, 에피소드학, 전사학, 메타볼로믹스, 프로테오믹스, 리피도믹스 등 신선하고 냉동된 뇌 조직에서 수행되며, 질병 메커니즘을 이해하고 위험 유전자, 새로운 진단 및 예후 마커, 잠재적 약물 표적22,,,,21,,20,,,,,8,,,9,10,,11,12,13,14,15,16, 16, 18, 18,18, 29, 18, 201, 201, 291, 18, 18, 18,201,201, 201, 201,18,201, 201, 201, 20.,23
이러한 목적을 위해, 현대 BBs 는 과학 공동체3,,24에사용할 수 있도록 잘 특징, 고품질의 뇌 조직을 보관합니다. BB에 의해 공급되는 두뇌는 완전한 임상 역사를 동반해야 합니다. BB의 활동은 다음과 같습니다 : (1) 뇌 기증 프로그램에 병과 건강한 개인의 인식 및 모집; 이상적인 조건은 완전한 임상, 생활양식 및 사회 역사, 및 biomarker 단면도를 얻기 위하여 일생 내내 기증자의 다분야 후속을 달성하는 것입니다; 실제로, 인지 예비 및 두뇌 구조는 생활 양식과 사회 교육 요인에 따라 달라 집니다25,,26,그래서 이러한 정보는 손에 총 데이터를 풍부하. (2) 기증자의 죽음 에 따라 뇌 (뇌, 소뇌 및 뇌 줄기로 구성) 및 관련 조직 (예를 들어, 척수, 두개골 신경 및 신경망 등)의 취득, 모든 표준화 된 법적 및 윤리적 규정을 관찰하면서. (3) 표준화된 수술 프로토콜에 정의된 바와 같이 뇌의 적절한 처리(해부, 고정, 동결)는 고품질 조직을 확보하고 다분야 연구에서 향후 사용할 수 있도록 한다. (4) 최종 명확한 진단을 제공하는 상세한 신경 병리학 특성. (5)연구커뮤니티(27,,28)에조직물질의 저장 및 유통.
모든 BB는 냉동 및 포르말린 고정 파라핀 임베디드 조직을 모두 저장합니다. 각 BB에는 자체 프로토콜이 있습니다. 생물 의학 연구소 (뉴저지)29및 뇌혈관병리학의Deramecourt의 연구 와 같은 특정 연구를 제외하고, 세계에서 가장 큰 BB는 단순히 뇌관, 소뇌 및 중위 (처상 평면)를 따라 뇌간을 잘라. 절반은 생화학 연구를 위해 신선하게 해부되고 냉동되고, 다른 절반은 조직 병리학 적 평가를 위해 포르말린에 고정되어 있습니다. 따라서 생화학 및 조직 병리학 분석은 각 반구에서 별도로 수행됩니다. 어느 쪽이 고정또는 동결(측면)에 대한 결정은 단수 은행31,,32,,33,,34,,35에따라 달라집니다. 많은 신경 질환이 비대칭적이기 때문에 BB는 신선한 뇌를 자르기위한 독특한 프로토콜을 제공합니다 : 뇌간과 각 반구의 인접 한 섹션은 교대로 고정되고 얼어 붙습니다. 한 반구의 고정 된 슬라이스는 다른 반구의 고정 된 조각에 해당합니다. 이 방법을 통해 뇌 조직의 사용이 최적화되고, 모든 냉동 물질의 완전한 조직학적 특성화는 두 반구의 모든 영역에서 조직학적 및 생화학 적 정보를 얻고 비교할 수 있는 가능성으로 달성될 수 있다.
우리의 두뇌 은행 프로젝트의 프레임은 아비아테그라소의 마을입니다. 아비아테그라소는 이탈리아 북부 밀라노시에서 남서쪽으로 약 22km 떨어진 작은 마을입니다. 인구는 약 32,600명입니다. 골기-첸치(GC) 재단의본고장입니다. GC재단은 대형 재활 노인병원(ASP 골기-레다엘리)의 일원이며, 노인의 노화와 관리에 관한 연구에 중점을 둔 연구소입니다. 특히, 그것은 정신 노화, 그것에 영향을 미치는 사회적, 행동 요인, 그리고 생물학 및 병리학 기본 연령 의존 신경 인지 장애 (NCDs)를 공부에 초점을 맞추고 있습니다. 2009년 GC재단은 1,321명의 참가자(1644명의 적격 과목 중 80.3%)와 함께 새로운 종로 연구를 시작했습니다. 1935년에서 1939년 사이에 태어난 백인 민족은 같은 작은 지역에 살고 있습니다. 연구 결과는 InveCe.Ab에게 불렸습니다(Invecchiamento Cerebrale Abbiategrasso;영어로: 두뇌 노화 Abbiategrasso, ClinicalTrials.gov, NCT01345110) 현재 진행 중입니다. InveCe.Ab는 치매의 발생률, 유병률 및 자연사를 평가하기 위해 최대 균질성 및 최소한의 가변성을 가진 코호트를 획득할 계획이며, 행동, 심리사회적, 임상 및 생물학적변수(36)를포함한 가능한 위험 또는 보호 요인과 함께. 코호트의 특성은 도 1 및 표 1에표시됩니다. 역학 데이터는 유럽 인구37,,38 및 InveCe.Ab 참가자의 치매 추세와 일치하며, 정상적인 노화에서 신경 인지 장애까지의 궤적을 연구하는 좋은 모델을 나타내는 균질한 유전 적 및 환경적 특성을 가지고 있습니다. 실제로, 동질적인 인구는 적당한 통계적인 힘에 도달하기 위하여 더 적은 과목을 요구합니다. InveCe.Ab 방법론은 이미 다른 곳에서 보고되었습니다36 하지만 혈액 샘플링 (신진 대사 패널, 포함 하 여 평가의 동일한 세트를 사용 하 여 정기적인 검사를 통해 다차원 접근 (매 2-3 년) 밑줄하는 것이 중요 하다 호모시스테인과 비타민, DNA 추출을 프로파일화하여 아폴리포프로틴 E(APOE) 및 인식과 노화와 관련된 기타 유전다형성, 인류측정(체중, 신장 및 허리), 걷기 테스트(이중 작업 테스트), 라이프스타일 평가 인터뷰(지중해 식단 준수, 신체 활동 및 인지 참여 수준) 및 사회적 요인(사회적 참여, 외로움, 일반 심리학 평가) 및 사회적 요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회 요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회 요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회적 요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회적 요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회적 요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회적 요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회적 요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회적 요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회적 이러한 종방향 데이터를 사후 신경 병리학 데이터와 비교하는 것은 연구에 매우 중요합니다. 따라서 우리 팀과 특히 미켈라 만지리 박사는 위에서 언급한 신경 병리학적 접근법을 구상했습니다. 이후 2014 그리고 두 번째 후속 기간 동안, InveCe.Ab 참가자는 그들의 두뇌를 기증 하도록 요청 했다, 따라서 Abbiategrasso 뇌 은행 (ABB)의탄생에 대 한 가져. ABB의 핵심 기부자는 InveCe.Ab 참가자이지만 ABB는 이제 다른 자원 봉사 기부자에게 열려 있습니다. 그(것)들은 ASP 골기-Redaelli에서 환자입니다, ABB 프로젝트에 관하여 배우고 같은 지리적 지역 (Abbiategrasso 및 주변)에 속하는 다른 신경학상 질병 또는 성인 자원봉사자로 고통받는 몇몇 환자에 가정합니다. 모든 기부자는 동일한 평가 프로토콜을 받습니다.
저자는 정상적인 노화의 개별 궤적과 NCD에 가능한 진행을 추적하고, 정확하게 관리, 처리 및 이러한 기증자에서 획득 된 뇌를 특성화하는 방법을 제안한다 세로로 따랐다. 또한, 우리의 목표는 뇌의 복지에 관한 정기적인 신경 학적 평가, 세미나 및 교육 활동에 개인을 만나고 참여시키고 연구 목적으로 뇌 기증에 대한 인식을 높이는 것입니다.
Protocol
ABB는 우리 기관의 인간 연구 윤리위원회와 BNE 행동 강령에 따라 윤리 기준39,,40에따라 활동을 수행합니다. 뇌 수확 절차는 InveCe.Ab 연구36의맥락에서 파비아 대학의 윤리위원회에 제출되고 승인되었다. 연구 절차는 1964년 헬싱키 선언과 다음 개정에 명시된 원칙에 따라 처리되었습니다. 동의서가 완전하고 쉽게 이해할 수 있습니다. 기부 프로그램에 참여하는 것은 개인적인 결정이며 완전한 인식이 필요합니다. 동의서에 서명할 능력이 없다고 판단되는 경우, 법적 보호자 또는 차기 친족(NOK)의 승인이 보장됩니다. 표 2는 뇌 기증에 대한 포함 및 배제 기준을 보고합니다. 연구는 페데라지오네 알츠하이머 이탈리아의 감독하에 수행되었다.
1. 뇌 기증 프로그램 모집
- 뇌 기증및/또는 법적 보호자에 관심을 표명한 과목을 소집하여 프로젝트(기부 프로그램의 범위, 뇌 제거, 보존, 사용 및 배포 과정), 주어진 시간에 프로그램에서 탈퇴할 권리, 익명의 보호 및 후속 전략을 제시합니다. 추가 바이오마커 조사 및 유전자 검사의 가능성에 대해 논의한다. 잠재적 인 기증자 또는 그의 NOK의 소원은 결과에 대해 통보할 수 있습니다.
- 재단과 기증자 모두에 대한 재정적 이득의 부족을 포함하여 모든 경제적 측면을 설명 (뇌는 기부하고 이타적으로 배포). ABB는 신체 운송 비용을 충당하고, 가족은 장례식, 매장 또는 화장 비용을 커버한다는 사실을 알려줍니다.
- 수락시 기부 프로그램에 참여하는 동의서의 서명을 받으라. 기부자에게 익명을 보장하기 위해 개별 수치 코드를 제공합니다. 세로 연구에 참여하는 사람들의 식별 수를 적어 내고 뇌 은행이 기증자의 두 하위 그룹을 쉽게 분리할 수 있는 또 다른 코드를 제공합니다(종방향 연구의 참가자 또는 비참여자; 표 3참조).
- 기증자에게 기증자로서의 신분을 선언하고 전화번호(사용 가능한 24/7)를 표시하여 브레인 뱅크에게 그의 사망사실을 알리는 신분증을 제시하십시오.
2. 기부자 평가 및 직렬 후속 조치
참고: 아래에 언급된 시험중 일부만 동의할 수 있습니다. 모든 임상 평가는 신경과 전문의, 신경학 및 3 심리학자에 있는 전문 지식을 가진 노인학자를 포함하여 동일 팀에 의해 수행됩니다. 새로운 증상이 나타나거나 인지 감소가 진행되면 후속 조치 사이의 시간 간격이 단축 될 수 있습니다.
- InveCe.Ab 연구의 경우와 마찬가지로, 정신 기능에 영향을 미칠 수있는 자율성 (ADL, IADL), 개인 습관, 사회 및 라이프 스타일 요인을 포함한 라이프 스타일 사회적 설문지를 얻습니다. 유전적, 감염성, 독성, 대사, 자가면역, 심혈관, 외상, 퇴행성, 신가성 및 신경질환에 관한 정보로 가족, 의료 및 신경학적 역사를 수집합니다. 이전 임상 시험을 수집하고 약리학적 치료를 나열합니다.
- 두개골 신경 기능, fundus oculi, 시각 필드, 근육 강도 및 톤, 감수성, 힘줄 반사, 세포 및 원시 반사, 뇌막 징후, 자세, 걸음걸이, 움직임, 조정, 괄약근 기능 및 초점 또는 바빈 키의 존재에 대한 테스트를 포함하여 광범위한 신경 모터 평가를 수행하십시오. 언어, 정신 상태 및 행동의 변화를 평가합니다.
- 구두 및 시각 기억, 주의, 정신 운동 속도, 언어, 의미 체계 기억, 집행 기능 및 visuospatial 능력 (자세한 내용은표 4)와 같은 글로벌 인식 및 특정 인지 영역의 완전한 신경 심리적 평가를 포함한 광범위한 신경 인지 평가를 수행하십시오. 우울증의 존재를 고려 (CES-D 규모).
- 혈액 화학분석(표 5)과DNA, 혈장 및 말초 혈액 단핵세포(PBMC)의 격리 및 저장모두에 사용되는 혈액 샘플을 가져옵니다. APOE 유전(rs429358 및 rs7412) 결정(InveCe.Ab 참가자에서 보다 광범위한 유전자 프로파일링이 결정되었습니다; 표 6참조). 정량 적 분석을 위한 심전도(심전도 세동) 및 휴식 상태 뇌전도(QEEG)를 등록하십시오.
- 뇌척수액(CSF) TAU, 인-타우 및 β-아밀로이드, 및 뇌 이미징(MRI에서 생체 변성, 허혈 또는 염증에서 검출하는 MRI)을 포함하는 선택적 바이오마커 테스트를 고려하십시오. 신진 대사 실패를 감지 하는 FDG-PET; PIB-PET는 알츠하이머 병리생리학과 관련된 뇌 아밀로이드증을 검출합니다.
- 뇌 기증자의 후속 검진 프로그램을 계획합니다. 다른 연령 집단에 따라 시간 간격을 설정 (최대 64 세: 매 10 세, 65-74 세: 매 3 년, 이후 75 년 에서: 마다 2 년).
- DSM-V에 따라 임상 진단 및/또는 신경인지 진단을 할당합니다. 임상 치매 등급 (CDR) 점수로 임상 치매 준비를 분류합니다. 사망 전 마지막 기간에 CDR을 업데이트합니다.
- 용지와 그래픽으로 데이터베이스를 준비합니다. 수집된 모든 데이터를 브레인 뱅크 데이터베이스에 삽입합니다. 실수를 확인하기 위해 다른 서기의 개정을 계획합니다.
3. 죽음의 시간 및 뇌 제거
참고 : 이탈리아 법은 asystole가 죽음을 확인하기 위해 20 분 이상 지속해야한다는 것을 규정합니다. 최소 20분(명명된 발태그래피)에 대한 평정심도(ECG)를 등록하면 24시간 이내에 부검이 수행될 수 있습니다(DPR 285/90 art. 8 및 법률 n. 578, 1993년 12월 29일). <24h의 사후 평가 시간은 전반적인 조직 품질을 보존하는 좋은 목표입니다. 사후 평가 시간 >30h의 경우 부검이 취소됩니다(표 2참조). 부검 팀은 병리학자, 신경과 및 / 또는 신경 생물학자, 간호사, 해부학 실 기술자 및 연수생 학생으로 구성됩니다. 처음 두 팀 구성원은 또한 신경 병리학 진단을 수행. 시체 취급 및 해부 동안 적절한 의류 (코트, 장갑, 안경 및 헤어 넷)의 사용은 필수입니다. 이 섹션에서는 실험실에서 일반적으로 사용되는 주요 도구와 장비를 설명합니다. 독자는 재량에 따라 사용할 악기를 선택할 수 있습니다. 본 명세서에 활용된 자료에 대한 자세한 설명은 재료표를참조하십시오.
- 가족이 선택한 장례 기관이 시체를 ABB 시설로 데려오는지 확인하십시오. 심장 활동이 없어야하는 단층 촬영을 수행합니다. 그렇다면 사망 증명서에 서명하고 부검 절차를 시작합니다.
- 시신을 부검실로 이송합니다. 머리의 가장 넓은 부분의 수준에서 두개골의 둘레를 측정합니다. 나침절에서 난온으로 측정하여 전방 지름(APD)을 얻고, 한쪽 귀에서 다른 귀로의 거리는 횡방향 직경(TD)을 산출한다. 수식: CI = TD/APD x 100을 사용하여 세팔릭 인덱스(CI)를 계산합니다.
- 날카로운 메스를 사용하여, 정관상 평면에 두피 절개를, 한쪽에 있는 마스토이드 공정의 끝에서 다른 쪽으로, 정점을 통과합니다. 모발, 피부 및 피하 조직을 잘라 내고 두피의 두 주름을 아래 두개골과 조심스럽게 분리합니다. 노란 주부절 지방이 눈에 띄게되고 두피를 앞쪽으로 반사할 때까지 절개를 수행합니다. 다른 부분을 뒤쪽으로 당깁니다.
- 메스와 집게를 사용하여 각 면에 있는 측두근의 작은 샘플을 채취하고, 4% 포름알데히드에 하나를 넣고 다른 쪽을 동결하십시오(섹션 7 참조).
- 정면면의 V컷을 따라 전기 톱으로 두개골을 잘라냅니다. 두개골 캡을 제거하고 수막을 잘라. 두라의 샘플 조각은 모두 4 % 포름알데히드 및 냉동 (섹션 7 참조)에 고정되어 있습니다.
- 코퍼스 캘로섬을 통해 20 G 3.5in. 바늘을 삽입하여 CSF의 약 10mL를 획득하여 제3심실에 도달한다. CSF의 모양, 색상 및 탁도를 평가하고 pH를 측정합니다. 그런 다음, 각각 약 1mL의 10 개의 알리쿼트를 만들고 -80 °C에 저장하십시오.
- 뇌를 섬세하게 당기고 두 개의 전두엽을 섬세하게 당기고 시신경 인fundibulum, 내부 경동맥 (ICA) 및 세 번째, 네 번째, 다섯 번째 및 여섯 번째 두개골 신경을 모두 잘라. 분주한 포사에 도달하기 위해 텐토리엄을 자르고 척추 동맥과 낮은 두개골 신경을 잘라냅니다. 메스를 가능한 한 깊게 삽입하여 메둘라의 가장 많은 소들 부분을 자른다. 이 시점에서, 부드럽게 전체 뇌를 제거.
- 메스를 통해 메켈의 동굴 위로 뼈를 관통하고 양쪽에서 가스세리아 신경절을 얻습니다. 포름알데히드에 하나의 신경절을 수정하고 다른 하나를 동결 (섹션 7 참조). 뼈 셀라 키카를 골절 하는 수술 망치와 끌을 사용 하 여 뇌 하 수 체를 제거 하 고 4% 포름알데히드에 고정.
- 두개골과 전체 뇌를 검사하여 거시적인 변화와 혈관 변화를 검사합니다. 측정 테이프를 사용하여 횡방향 및 전방 직경을 얻는 뇌를 측정합니다. 윌리스의 원을 조심스럽게 검색하고 해부학 적 변이체, 병변 또는 혈관 협착증의 존재를 위해 거시적으로 (그림 2E)를 평가합니다.
- 대공에서 2-4cm 2의 렙토멘닝1-2개를 복용하고 4°C에서 완전한 고혈당 덜벡코의 수정된 이글 미디어(DMEM) 배양 배지에서 20% 펜/스트렙, 1% 글루타민, 1% 비필수 아미노산(이전에 발표된 바와같이)1%를 보존한다.
- 섬유아세포 배양을 얻기 위해 렙토멘딩을 10cm 페트리 접시에 놓고 액체를 버릴 때마다 인산염 완충식식염(PBS)으로 두 번 씻는다.
- 메스와 파이펫 팁을 사용하여 렙토멘딩을 약 2mm 또는 3mm의 작은 조각으로 자르고, 이전에 는 젤라틴으로 코팅된 6웰 플레이트의 각 웰에 3-4개 씩 잘라 내고, 앰포테린 B의 1%로 보충된 완전한 중간 크기의 2mL로 각각 의충을 채웁니다(생체안전 캐비닛에서 처리를 수행하여 멸균균을 보장한다).
- 플레이트를 37°C, 5% CO2 인큐베이터에 적어도 1주일 동안 넣고 3-4일마다 매미를 변경합니다. 잘 합류의 약 70 %에있을 때 살균 1x 트립신으로 세포를 트립시니징합니다. 렙토멘닝섬유아세포를 T75 플라스크에 넣고 12mL의 완전한 배지로 채웁니다. 5 일 후 시험 및 FBS의 900 μL과 디메틸 황산화물 (DMSO)의 100 μL에서 보존.
- 자궁 경, 소뇌 및 뇌간을 분리하고 검사하고 개별적으로 체중을 줄입니다. 송과선에서 벗고 4% 포름알데히드로 고정하십시오. 후각 전구와 시신경을 제거하고 측면과 독립적으로 각 쌍 중 하나를 수정하거나 동결합니다. 뇌경, 소뇌 및 뇌간을 4°C에서 4°C에서 최소 2-4h의 얼음체로 유지하여 조직 중단을 최소화하고 조직의 부드러움을 줄입니다.
- 수확 후, 시체에 대한 적절한 주의와 주의를 기울이라. 슈퍼 접착 접착제를 사용하여 뼈를 다시 부착하고 수술 바늘과 흡수할 수 없는 봉합사를 사용하여 두피를 다시 바느질합니다.
- 시신을 부드럽게 대함으로써 고인에게 존경과 감사를 표한다. 시신이 사랑하는 사람에게 보이는 열린 관에 넣어것이기 때문에 얼굴을 깨끗하고 면도하고 머리를 씻고 말리십시오.
참고: 시체의 재구성은 기술자에 의해 수행됩니다. 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
4. ABB 해부 프로토콜
참고: 동일한 병리학자 및/또는 신경과 전문의가 연기 후드 아래에서 뇌간, 소뇌 및 뇌막을 슬라이스합니다. 신경 생물학자는 단면 후 슬라이스를 준비합니다. 뇌 섹션을 다루지 않는 연수생은 후속 조직 처리 단계에서 가이드 역할을 하기 위해 데이터베이스에 업로드할 사진과 함께 전체 절차를 문서화합니다.
- 해부 칼을 사용하여 뇌간을 축시 자르고 우수한 콜리큘러스를 통해 장밋랄 중뇌 수준에서 첫 번째 컷을 만들어 실질적인 니그라(SN)를 노출시키는 두 조각을 얻습니다.
- 나머지 컷을 사용하여 8mm 브레인스STEM 슬라이스를 획득하여 약 10개의 섹션을 얻습니다. 제4심실의 우수한 마진 근처의 로스트랄 폰을 통과하는 컷을 포함하여 궤적 coeruleus(LC)를 관찰하고, 4심실의 열등한 정점 바로 위에 있는 음향 조각에 열등한 메둘라 외반다를 통해 DM의 등류 모터 핵을 포함하는 슬라이스를 갖는 것을 포함하도록 주의하십시오.
- BS (브레인스스STEM)로 로 로스트로코골 감각의 모든 조각을 이름을 다음 섹션을 식별하는 아랍어 번호로 이름을 지정합니다. 마지막 뇌간 섹션 후, SC (척수)를 다음 숫자 1-n을 사용합니다. 약 2~4개의 SC 슬라이스가 제거된 척추 메타미어의 수에 따라 얻어진다(그림2H-I).
- 모든 섹션을 고정하거나 번갈아 고정할 라벨을 지정하고 사진아카이브(그림 2)에대한 사진을 찍습니다. 그런 다음 아래에 설명된 대로 모든 슬라이스를 수정하고 고정합니다(4.7 단계 및 4.8).
- 두 소뇌 반구를 vermis 의 수준에서 분리하기 위해 처상 평면의 소뇌를 잘라냅니다. 각 반구(그림2F-G)에서5개의 슬라이스를 얻기 위해 처진 단면을 수행합니다.
- Vermis의 모든 조각을 CBR 또는 CBL(각각 오른쪽 및 왼쪽 소뇌의 경우)으로 지정하고 아랍어 번호를 사용하여 섹션을 식별합니다. 모든 섹션을 번갈아 고정하거나 동결하도록 레이블을 지정하고 아카이브에 대한 사진을 찍습니다(그림2). 그런 다음 아래에 설명된 대로 모든 슬라이스를 수정하고 고정합니다.
- 코퍼스 캘로섬(그림2A-B)을통해 뇌의 두 반구를 분리하고 관상 평면에서 단독으로 슬라이스합니다. 전두엽, 측두엽, 전방 cingulate, 전방 쉼표, 메이너트와 기저 신경교의 핵을 통해, 광학 치아즘과 매밀러 몸 사이를 통과하는 비행기에서 첫 번째 절단을 합니다.
- 두 번째 절단을 약 1cm 정도 후배로 유방병의 몸을 통과하고 기저 신경질, 전방 상하, 해상 및 편도체를 노출시하십시오. 각 반구에 대해 15~20개의 섹션을 얻기 위해 전방 및 후방 영역을 해부하여 1cm 슬라이스를 획득합니다.
- 평평한 표면에 슬라이스를 설정합니다. 전두엽에서 후수극까지, 이전 슬라이스가 위쪽으로 향하는 부분과 함께, 전방 방향에서 원래의 위치를 따라 놓습니다.
- 두 반구의 섹션을 비교하여 고정 또는 냉동 재질로 유지하도록 각 반구의 대체 섹션을 선택합니다. 전두엽 및 측두엽, cingulate, 기저 신경리아, 메이너트의 핵 기저, 편도선, 시상, 해마 및 내경 피질, occipito 측두엽, parietal 및 문어 를 포함한 조직 병리학을 위해 고정 및 처리될 주요 부분을 인식하십시오.
- 모든 슬라이스를 L(왼쪽) 또는 R(오른쪽)으로 이름을 지정하고 아랍어 번호로 표시하고 슬라이스가 고정또는 동결되는지 여부를 나타내는 라벨을 넣습니다(그림2A-D). 섹션을 식별하려면 사진 아카이브에 대한 사진을 찍습니다. 그런 다음 섹션 7과 8에 설명된 대로 모든 슬라이스를 수정하고 고정합니다.
5. 뇌 및 선박 검사 및 거시적 병리학 적 평가 (육안으로)
- 수막 변경, 확산 또는 국소화된 피질 위축, 해마 위축, 심실 확대, 소뇌 부비, 뇌간 위축, 실질적인 니그라 창백서, 백색 물질 변경(유형 및 위치 지정)을 고려하여 일반적인 거시적 검사를 수행하십시오.
- 죽상 동맥 경화증과 폐색을 고려 윌리스의 원을 검사. 할당 점수 = 50% 이상의 협착증이 없는 무도의 존재에서 1개, 적어도 하나의 동맥이 50% 이상이면 점수 = 3 개 이상의 동맥이 50% 이상 폐색된경우=3. 다른 두개 내 혈관에서 병리학의 존재 또는 부재를 평가합니다.
- 부추기혈관 병변을 감지하려면 뇌반구, 소뇌 및 뇌간을 검사합니다. 라부나 병변(직경 및 10mm), 허혈성 또는 출혈성 경색 및 출혈(직경 및 10mm)을 고려하십시오. 있는 경우 밀리미터, 수 및 위치로 크기를 지정합니다. 또한, 지주 막 증 의 존재 또는 부재를 고려 하십시오.
6. 조직 품질 관리
참고: 대뇌 인자 점수(AFS)는 0에서 2 사이이며 조직 품질 평가에서 중요합니다. AFS를 결정하려면 사망 시점(특히 뇌 산도증을 결정하는 조건) 및 고뇌 상태의 지속 시간(갑작스런 사망 또는 장기간 고뇌)에 따라 발생하는 임상 조건을 고려하십시오. AFS > 1, 뇌 조직은 최적의 품질이 아닐 수도 있습니다43. 또한 뇌와 CSF pH를고려; pH & 6, 뇌 조직은 최적의 품질43,,44되지않을 수 있습니다.
- 저산소증, 장기간산산증, 기계적 환기, 다기관 부전, 고열, 심한 두개골 외상, 신경독성 물질 섭취, 심한 탈수, 심한 저혈당증, 간질 상태 및 장기간 혼수 상태를 포함한 뇌 조직을 손상시킬 수 있는 조건으로 인해 사망이 발생했는지 확인하십시오. 이러한 조건 중 하나가 있는 경우 1점을 할당합니다.
- 고뇌 상태의 지속 시간을 확인 (죽음이 1 시간 이내에 발생하는 경우급속한, 죽음이 1 과 24 시간 사이에 발생하는 경우 중간, 고뇌 상태가 1 일 이상 지속되는 경우 느립니다). 중간 또는 느린 죽음이 발생하면 1점을 할당합니다.
- AFS 점수를 계산하고, 전극 pH 바늘 및 조직 pH에 의해 각 로브와 소뇌 섹션에서 뇌 슬라이스에 표면 pH 미터에 의해 CSF pH를 측정한다.
7. 조직 동결
- 모든 조직을 4°C에서 얼음으로 얼도록 유지합니다. 그런 다음 신속하게 얼리게하십시오. 냉동 알루미늄 트레이에 놓습니다. 연동 알루미늄 플레이트로 덮어 평평하게 유지합니다. 액체 질소에 넣어 -120 °C 3 분.
- 해당 식별 코드와 슬라이스 번호가 표시된 비닐 봉지 안에 슬라이스를 놓습니다. 비닐 봉지를 3개의 극저온 상자(오른쪽 반구, 왼쪽 반구 및 뇌간용)로 나누고 -80°C에 보관합니다.
8. 조직 고정
- 슬라이스를 하나씩 거즈로 감싸고 10% 인산염 버퍼링 포멀린 용액에 슬라이스를 넣습니다. 1 일 후, 신선한 솔루션으로 포르말린 솔루션을 대체합니다. 4 °C의 차가운 방에 약 5 일 동안 둡니다.
- 모든 슬라이스를 전체적으로 유지하고 해마와 편도체가 포함된 슬라이스만 두 부분으로 나눕니다(그림3). 두 조각의 상부에는 전두엽(그림 3의R10a-L9a);이 포함됩니다. 하부는 각각 포함됩니다: (1) 편도체, 측두엽 및 기저 신경질리아 (도 3B에서L9b), 및 (2) 해마 및 측두엽의 일부 (도 3A에서R10b). 이는 다양한 구조물 간의 관계를 유지하기 위해 이루어진다.
- 모든 섹션을 인산염 버퍼에 2일 이상 넣어 교차 연결 제품을 세척하고 제거합니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
9. 탈수, 클리어링, 파라핀 포함 및 슬라이드 준비
- 에틸 알코올 농도를 70%에서 100%로 늘리고 자일렌과 용융 파라핀 왁스 2세트를 준비합니다. 탈수, 클리어링 절차 및 파라핀 침투를 위한 자동 프로세서에 뇌 섹션을 배치합니다(매크로(뇌및 소뇌 슬라이스)와 마이크로 샘플(브레인스STEM 슬라이스 및 기타 작은 샘플)에 대한 두 가지 조직 처리 프로토콜을 사용하십시오. 표 7). 금속 또는 플라스틱 금형에 파라핀 왁스에 조직을 포함.
- 신경병리학적특성화(45)에 대한 몬틴지수를 적용한 관심 영역을 평가하기 위해 슬라이스할 섹션을 선택한다(표8). 그런 다음 선택한 섹션을 슬라이스합니다.
- 작은 섹션에 대 한 대문자 섹션에 대 한 썰매 마이크로 토메와 회전 마이크로 토메를 사용 합니다. 다른 염색 및 면역 히스토케작용을 위해 해마톡시린과 에오신(H&E) 염색 및 8μm 슬라이스를 위해 5μm 슬라이스를 잘라냅니다. 가장 큰 슬라이스의 경우 8.5cm x 11cm, 중간 슬라이스의 경우 5cm x 7.5cm, 가장 작은 슬라이드의 경우 클래식 2.5cm x 7.5cm의 세 가지 다른 종류의 조직슬라이드에 슬라이스를 놓습니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
10. 분리, 조직학적 염색 및 면역 조직화학 (IHC)
- 수성 염료 솔루션으로 반응을 가능하게 하기 위해 비파라시화를 수행합니다. 자일렌을 사용하여 알코올 농도를 감소 (모든 단계에 대한 5 분)를 수행합니다. 증류수로 5분 동안 재수화합니다.
- 다음과 같은 조직학적 얼룩을 사용하여 건축 및 구조 조직 이상을 평가하고 세포 형태: H&E(혈관 미세병변및 염증용), 크레실 바이올렛(NISSL; 신경 상실), 룩솔 패스트 블루(LFB; 탈명), 글리아스(신분증 플라크 및 신경필실용).
- 특정 표적 구조의 존재를 강조하기 위해 면역 히스토케미크(IHC)를 사용합니다. 안티-NeuN 및 안티-GFAP 신경 및 신경 교 구획을 식별 하는 데 사용 됩니다.; 4G8, AT8, α-SYN 및 TDP-43은 신경 퇴행성질환(재료표)에서골재되는 단백질을 식별하는 데 사용된다.
- Pretreat 는 3% H2O2로 10분 동안 섹션을 탈피한 다음 PBS에서 헹구십시오. 4G8, α-SYN, TDP-43 및 NeuN 항원용 구연산 버퍼 0.01 M pH 6(2, 1 및 2분 동안 전자레인지로 전자레인지)로 검색 처리를 수행합니다. 4G8 및 α-SYN에 70% 포믹산을 사용하십시오. 5% 일반 염소 세럼에서 30분 동안 프리인큐어를 준비합니다.
- 1차 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 동안 배양한다. 다음 날, 실온에서 1 시간 동안 PBS에서 1:2의 희석에서 이차 항체 (Envision + System-HRP 표지 폴리머)와 인큐베이션 전에 PBS의 섹션을 헹구십시오.
- PBS에서 여러 번 세척하고 다아미노 벤지딘 (액체 DAB + 기질 염색체 시스템)과 염색체 시스템에서 배양하여 현미경 (배율 4-10x)에서 반응 개발을 보고하십시오. 마지막으로 PBS에서 섹션을 씻어. DPX 장착으로 헤마톡시린, 탈수 및 커버슬립의 섹션을 카운터스테인합니다.
참고: 표 8은 표준 프로토콜을 요약합니다. 모든 섹션에서 H&E 염색을 수행하고 특수/특정 얼룩 및 반응은 선택한 섹션에서 사용됩니다. 선택한 경우 추가 영역 이나 반응이 필요합니다. 재료의 표는 IHC에 사용되는 항체의 세부 사항을 보여줍니다.
11. 기본적인 신경 병리학 적 특성화
참고: 비특이적 뇌 조직 변경, 혈관 병리학, 알츠하이머 병 (AD) 병리학, 비 AD TAUopathies, synucleinopathies, TAR DNA 결합 단백질 (TDP-43) 병리학 및 해마 병변이 연구된다. 카메라에 연결된 광학 현미경은 부추기엽 미세 병변을 검출하는 데 사용됩니다. 조직학적 평가는 신경병리학 교수, 신경과 및 병리학자를 포함하여 신경병리학에서 훈련된 인력의 동일한 팀에 의해 수행됩니다. 또한 변형된 몬틴의접근법(45)(표 8)을기반으로 합니다: (1) 타우 예금과 관련된 프론토-측두엽 변성(FTLD)의 병리학적 특징을 구성하는 이질적인 비AUopathies: 픽병, 유창하지 않은 1차 프로그레시브 실어증(TAU-nfPPA), 프로그레시브 수프라핵마비(PSP)46,,47, 코르티코-바살 변성(CBD)48. 또한, 비-AD TAUopathies는 노화와 관련된 조건을 포함하고 1차 연령 관련 TAUopathy (PART)49,연령 관련 타우 천체-글리오병증(ARTAG)50,아가이로필성 곡물질환(48)과같은 명확한 임상적 중요성을 가진 질환을 포함한다. (2) 파킨슨병(PD) 및 루이 바디 치매(LBD)와 관련된 루이 타입 Synucleinopathy (LTS). LTS를 검색하려면 먼저 후각 전구, 뇌간, 편도선/측두피질을 적용하십시오. 이전 영역이 양성인 경우, 변연 구조(해마 형성, 내측 피질, 전방 cingulate), 중간 전두엽 자이러스, 열등한 정수리 엽 및 난수피질(45)을추가한다. 피질 LBD의 임상 적 특징이 존재하는 경우 (즉, 변동 및 / 또는 환각), 첫 번째 단계에 대한 변연 구조와 이소 코르질을 고려하십시오. (3) TDP-43 예금,TDP-43 예금과 관련된 FTLD의 병리학적 특징: 프론토-측두치매(bvFTD), 세포치매(SD 또는 svFTD), TDP-nfPPA 및 FTD-운동 신경 질환(FTD-MND)의 행동 변이체. TDP-43에 대한 IHC는 다음과 같은 섹션에서 수행됩니다: 편도체, 해마, 내측 피질 및 중간 전두엽 자이루스; 의심되는 임상 FTLD를 가진 경우에, 다른 단면51를검토하는 것을 고려하십시오.
- GFAP 및 NeuN을 위한 H&E, NISSL, LFB 및 IHC를 사용하여 선택된 섹션에서 비특이적 뇌 조직 변경을 평가합니다. 신경 희귀 성, 풍선 뉴런, 해면절, 글리오증, 골린 손실, 염증 성 또는 종양 침투의 존재 또는 부재를 고려하십시오. 이러한 변경의 널리 퍼진 위치를 지정합니다.
- 현미경 혈관 병변을검출하기 위하여는, 적어도 2개의 반구체 매크로 단면도를 포함하여 H&E 및 LFB 슬라이드를 검사합니다 (유방 병체를 통과하는 첫번째 (Charcot cut) 전두엽 및 측두엽으로, 기저 신경리아, 전방 시상, 편도체 및 두 번째 후두엽을 통과하고, 해마 형성의 "geniculate" 섹션, 1개의 소뇌 부, 그리고 뇌줄기의 모든 3개의 주요 부분(실질적인 니그라, 궤엽 및 DMNV를 통해).
- 동맥 경화증, 리포히알리노증, 혈관 공간 팽창, 백색 물질 손실, 렙토멘징 및/또는 모세혈관 뇌아밀로이드 혈관증을 포함한 작은 혈관 질환을 감지합니다. 채점(0-3) 및 널리 사용되는 위치42,,52를지정합니다. 혈안데린 누설, 미세피 및 미세 한 파종의 존재 또는 부재를 고려하십시오.
- 계층 구조 Deramecourt의 계획 (선박 벽 변경 - 작은 혈관 질환 - 거시적 인 경색 경색)을 사용하여 인지 손상에 대한 혈관 손상의 기여를 평가합니다. 이 평가를 위해 정면 및 측두엽 섹션, 기저 신경질 및 해마 (점수 0-20)30을고려한다. 또한, 뇌혈관질환이 VCING 점수(저중간고)를 이용하여 인지장애에 기여할 확률을 추정하고, 중등도에서 중증 동맥경화증 및 아밀로이드혈관병증(53)을포함하는 후현엽의 반구성 대식극및 작은 혈관 질환을 고려하여 수득된다.
- 아밀로이드 확산을 위해 IHC(4G8)를 사용하여 AD 병리학을 평가합니다. 탈의 스테이지(1-5)54,집계 아밀로이드 득점(0-3)45,및 사이트별 형태학(분산, 초점, 코어)을 정의한다.
- IHC (AT8)를 사용하여 AD 타우 병리학을 평가하고 사이트 당 널리 사용되는 형태를 설명합니다 (신경 섬유 성 엉킴, 신경 필 스레드, 신생아 플라크). Braak의 스테이지 정의(I-VI +; 양수 기호는 브라악의 계층 구조를 따르지 않는 Hyperphosphorylated 타우 병리학의 추가 영역의 존재를 나타냅니다)55 및 집계 점수 (0-3)45.
- 글리아스 염색 및 CERAD 점수(0-3)56을사용하여 신생아 플라크를 평가한다. 이어서, A-마일로이드-B 라크-C ERAD 점수(ABC 점수 0-3)를C이용한 AD 임상 증후군에 대응하는 신경병리학적 특징의 확률을 정의한다: 저중간-고가 A45.B
- AT8 IHC를 사용하여 널리 퍼진 위치와 독특한 형태학적 그림을 지정하는 비AD TAU 병리학의 존재 또는 부재를 확인합니다. 불꽃 모양 또는 글로보스 엉킴, 구형 구형 포함 (즉, 픽의 몸)57,신경 필 실, 영양실, 영양신경성 곡물과 같은 뉴런 포함을 고려하십시오. 및 과 같은 신경교 포함 과 같은 tufted 성상 세포, 가시 성상 세포, 성상 세포 플라크, 코일 몸, 구형 포함58,59.
- α-syn IHC를 사용하여 위의 노트 의 영역에서 LTS (루이 바디, 창백한 몸 및 루이 중성염)를 감지하십시오. 양성의 경우, 병변60의심각도를 평가하기 위해 McKeith의 등급 (0-4)을 적용하십시오. 그런 다음, 지형 분포 (후각 전구, 뇌간 우세, 변연 우세, 신코르티컬)61에대한 해변의 단계 (I-IV)를 사용합니다. 해변과 Braak의 단계를 비교하여 LBD와 AD 병리학60,,61,,62사이의 관계를 정의합니다.
- 다중 시스템 위축(MSA)의 병리학적 특징인 글리아 세포질 포함(GCI; 비 루이형 신경교 시뉴클레오피나병증)의 존재 또는 부재를 고려하고 그들의 널리 퍼진위치(63)를지정한다.
- TDP-43 IHC를 사용하여 위의 메모 영역에 대한 TDP-43 예금을 감지합니다. 사이트당 널리 퍼진 형태 식별: 신경 세포질 포함 (NCI), 디스트로픽 Neurites 포함 (DNs), 핵 포함 (NII). 패턴 정의: A(주요 NCI 및 DNs: bvFTD 및 nfPPA); B (지배적 인 NCIs : FTD-MND); C (우세 긴 DN: svPPA 및 bvFTD)51,64. 넬슨의 계획을 사용하여 AD 사례65,,66에서TDP-43의 존재를 정의하십시오.
- 수분 및 Sommer 섹터(CA1)에서 시작하여 해마를 평가합니다. 라우라마의 점수(0-4): 마이크로파크트와 매크로인파르트의 경우 각각 1-2를 사용하십시오. 3-4 중등도 및 심한 신경 손실에 해당, 각각, 해마 위축 (해마 경화증: HS). 병리학적 단백질 침전물의 존재 또는 부재(주파수 의 감소 순서: pTAU, TDP-43, α-syn)67을지적한다.
- 신경 병리학 적 진단을 정의하고 데이터베이스에있는 모든 병리학 적 데이터를 입력합니다.
참고: 기증자의 생물학적 자료와 합리적인 데이터가 저장되는 객실은 항상 잠겨 있으며 보안및 개인 정보를 보장하기 위해 공인 된 직원만 입장 할 수 있습니다. 냉동 생물학적 물질은 -80°C의 잠긴 냉동고에 저장되며, 포르말린 고정 파라핀 임베디드 조직은 실온에서 잠긴 옷장에 보관됩니다. 듀얼 모터 냉동고가 사용되며 백업 냉동고도 존재합니다. 또한 냉동고가 항상 작동하는지 확인하기 위해 경보를 설정하는 24/7 모니터링 시스템이 제공됩니다. 정전 시 비상 발전기도 존재합니다. 참가자는 개인 정보를 보장하기 위해 숫자 코드로 익명화됩니다. 승인되지 않은 직원이 기부자의 신원과 합리적인 데이터로 돌아가는 것은 불가능합니다. 모든 정보는 암호로 보호된 데이터베이스에서 수집됩니다. 마찬가지로 이러한 데이터의 하드 복사본은 잠긴 아카이브에 보관됩니다.
Representative Results
뇌 기증자 및 뇌 수확 데이터
2014년, 기부자 모집은 두 번째 InveCe.Ab 후속 기간 동안 시작되어 1061명의 적격 과목 중 1010명(응답률: 93%)을 포함했습니다. 그림 1). InveCe.Ab 세로 연구와 관련하여 1010명 중 290명(28.7%) 기부자(이미 등록한 160명, 등록 의사를 밝힌 130명)로 등록하기로 합의했습니다. 교육 수준은 비 기부자보다 기부자에서 더 높습니다 (기부자의 66 %는 중간 수준의 교육을 가지고 있습니다 : 8 년 이상의 학교), 문화와 교육의 중요성을 나타냅니다. 많은 "건강한"개인은 또한 뇌 기증 프로그램에 관심을 보였다. 우리의 "통제"의 대부분은 병든 및 그들의 친척과 동정할 수 있다는 것을 고백하고, 신경 질환의 더 나은 이해로 이끌어 내는 연구에 어떻게 든 기여하고 싶습니다. 평생 동안 정기적으로 혈액이나 골수 기증 프로그램에 참여하는 이타적인 사람들은 이미 사망 후 장기를 기증하기로 합의한 사람들처럼 뇌 기증에 대한 아이디어에 더 개방적입니다. 그들은 살아있는 수령인이 없을지라도 그들의 기부금이 연구에 매우 중요하다는 사실을 알고 있습니다. 뇌 기증에 기여하는 또 다른 요인은 화장하는 것을 선호합니다. 현재, ABB 기증자 인구는 총 427명의 개별 (290 InveCe.Ab 참가자 + 137명의 자원봉사자 또는 ASP 골기-Redaelli 노인 병원에서 환자) 포함됩니다, 그 중 75%는 70 세 이상입니다. 여성의 명확한 우세 (64%)가 있습니다. 그리고 정신적으로 온전한 노인 (약 85 %). 지금까지, 27 두뇌는 40명의 죽은 기증자 (67% 부검 비율) 에서 수확되었습니다; 13 명의 과목은 ABB에 죽음을보고하지 실패, 뇌 파괴로 이어지는 심각한 부상, 위험한 감염 질환 및 1 CJD 사건을 포함하여 여러 가지 이유로 부검되지 않았습니다. 4 명의 과목이 동의를 취소했습니다. 지금까지 수확된 27개의 뇌 중 24개는 명확한 임상병리학적 진단으로 완전한 신경병리학적 특성을 받았으며, 나머지 3개의 뇌는 여전히 검사 중이다(표3). ABB에서 추가 두뇌 수확 데이터는 다음을 포함합니다: 죽음에 평균 나이 (81 년); 평균 사후 간격 (10.37 h); 평균 CSF pH (6.64); 평균 조직 pH (6.07); 평균 뇌 중량 (1012.86 gr); AFS는 고인의 90%에서 1이었다.
신경생리학적 바이오마커(QEEG)
QEEG는 다차원 접근 방식의 일부입니다. 그것은 간단 하 고, 비 침습 적이 고 저렴 한 방법, 가벼운 신경 인지 장애에서 변환을 감지 하는 가능성이 가능성 (가벼운 NCD 또는 MCI) 주요 신경 인지 장애 (주요 NCD 또는 치 매). 다차원적인 접근법을 통해 일반 QEEG 검사가 수행되고 치매바이오마커로서의 역할이 테스트됩니다. 36명의 뇌 기증자(일반 노인 18명), 경도 NCD 7개, 주요 NCD 7개, 경증-NCD 7개(9개)의 예비 시리즈에 대한 당사의 데이터는 평균 알파 리듬 비율이 경증 NCD(p: 0,002)와 NOLD(p: 0,033)에 비해 주요 NCD에서 현저히 낮았음을 나타냅니다. 반대로, 느린 EEG 주파수(테타/델타)는 NOLD/mild-NCD보다 주요 NCD에서 상당히 높았다(그림 4의예 사례 참조). 우리의 시리즈에서, EEG 리듬 분포는 병변 유형에 관계없이 퇴행성 병변의 부담에 의해 뇌 리듬이 영향을 받는다는 것을 건의하는 병변 진단에 관계없이 주요 NDC 환자에서 NOLD/온화한 NCD 과목을 구별할 수 있습니다. 실제로, 검사된 9개의 두뇌 중 7개는 혼합병으로 인해 치매를 보여줍니다. 병리학의 본질에 관하여 특이성은 낮고 두뇌 전기적인 리듬은 그들의 분자 본질에 의하여 보다는 병변의 부담 그리고 지형에 의해 더 많은 영향을 받는 것처럼 보입니다 (Poloni, 등. AD/PD 2019, 리스본, 데이터는 미공개).
상징적인 케이스
ABB 프로토콜은 경우에 따라 유용하고 필요할 수 있습니다. 예를 들어 비대칭 병리학의존재(도 5). 우리의 프로토콜은 이러한 유형의 병리학을 식별하고 적절한 특성화에 매우 적합합니다. 지금까지, 우리는 비대칭 관여와 4 두뇌를 검사했습니다, 그 중 일부는 그림 5에표시됩니다. 매크로,B오른쪽 위축(도5A)은좌측에Figure 5비해 오른쪽 관상 부(도 5C)에서Figure 5C심실 팽창이 심한 경우 1경우에 존재한다.Figure 5 또 다른 케이스는 오른쪽 반구의 경색을 표시(그림 5D)다른 하나는 오른쪽 유방 병체의 명확한 위축을 보여줍니다(그림 5E). 현미경 수준에서, FTLD의 경우 왼쪽에 비해 오른쪽 정면 측에서 더 강렬한 비대칭 TDP-43 양성을나타낸다(도 5F,G).
매크로섹션(그림 6A, C)은전체 보기를 얻는 데 사용됩니다. LFB 염색은 4G8 및 AT8(도 6B)에대해 골린 손실(도Figure 66D)과IHC를 식별하는 데 도움을 주며 육안으로 반구에서 면역반응성의 분포를 평가할 수 있다.Figure 6 ABB 시리즈에서, 관련 개인의 두뇌를 비교 할 수 있습니다.
도 7에서,동형 쌍둥이의 뇌에서 섹션의 현미경 이미지는 쉽게 비교 (쌍둥이 1 (BB137) : 그림 7A, C, E, G, K 대 트윈 2 (BB138: 그림 7B, D, F, H, J, L)를쉽게 비교하기 위해 나란히 배치됩니다. 유사한 이전 연구68에서와같이, 두 쌍둥이는 임상 및 신경 병리학 평가에 의해 비교되었다. 쌍둥이는 다중 병학으로 인해 주요 NCD의 동일한 진단을 보고했지만, 각각 83 세 (72 세에 치매 발병) 및 85 (치매 발병 76 년)에서 2 년 떨어져 사망했습니다. 그들의 두뇌는 아밀로이드 혈관병증과 관련되었던 높은 AD 병리를 가진 아주 유사한 신경 병리학 그림을 가지고 있습니다. 4G8 면역 반응성은 확산, 조밀한 및 코로플라크를 사용하여 피질(그림7A, B)및 기저 간질(도7C,D)을통해 확산된다. 또한 피질과 소뇌의 빈맥 및 렙토멘닝혈관 모두에서 명확하게 검출된다(그림7A, B, G-J). 높은 배율에서 capCAA는 분명히 분명합니다(그림 7G, H). AT8 면역 양성 플라크, 엉킴 및 실은 두 뇌의 정수리 코르티코에서 확산된다(그림 7E, F, L). 아밀로이드와 NFT 병리학 부담에 관해서는, 트윈 1은 탈 스테이지 3 (몬틴 A2)와 브라크 스테이지 5 (몬틴 B3)로 간주되며, 트윈 2는 탈 스테이지 5 (몬틴 A3)와 브라크 스테이지 6 (몬틴 B3)로 간주됩니다. 그들은 같은 년의 교육과 비슷한 생활 방식을 가지고 있었다. 그러나 한 명(BB137)은 결혼하여 곧 미망인이 되었고, 다른 하나는 독신(BB138)이었다. 그(것)들은 질병의 동일 시작 및 동일 과정 그러나 다른 시간 프레임에서 임상 병리학 가변성의 다른 정도를 보여주었습니다. 이것은 유전 성분이 질병의 발달에 있는 중요한 역할을 하더라도, 후성 유전학 및 환경 분대가 약간 다른 표현을 결정하는 근본적이다는 사실을 확인합니다.
경우에 따라, 임상 사진은 신경 병리학 적 특징에 해당하지 않습니다. 도 8에서,두 개의 상이한 케이스는 AD 케이스로 임상적으로 정의되었다; 신경 병리학 분석은, 중간 AD 병리학 이외에, α-syn를 위한 분산 양성을 보여줍니다. 첫 번째 경우, 심한 LTS (비치 IV) 사진은 gyrus cingoli(그림 8A)및 SN에서 neuromelanin(그림 8B, C)에둘러싸인 세포질 포함으로 균질적으로 발견되는 루이 시체를 보여줍니다. 두 번째 경우, 루이 중성염과 관련된 Lewy 바디는 편도체(도8D, E)와Meynert의 핵(도8F, G)에서변연 LTS 진단을 제안합니다. 실제로, 병변의 지형은 그들의 분자 자연 보다는 오히려 임상 표현을 생성합니다.
그림 1: Inve.Ce.Ab 연구의 흐름 차트. 기준선에서는 치매의 전반적인 보급률이 3%였습니다. 후속 조치 과정에서 보급률은 4.4%(1st)69,7.1%(2위), 10.9%(3위)였다.stndrd 8년 부각율은 15 p/1000/year(95% CI: 13-18 p/1000/year)였습니다. 기부자 모집은 2014년에 시작되었습니다(두 번째 후속 조치 중). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 뇌의 해부 프로토콜 (A), 소뇌 (F) 및 뇌간 (H). 윌리스와 한 반구의 원은(E)및(B)에표시됩니다. 오른쪽(C)과왼쪽(D)의코로날 컷은 번호가 매겨지고 대안적으로 고정("F") 및 냉동("C")입니다. 간경소부(G) 및G뇌간 축단(I)이I도시되어 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 고정 된 오른쪽 (A)와 왼쪽 (B) 정면 측두엽의 코로날 슬라이스가 표시됩니다.
해마와 측두엽(A, R10b)은 오른쪽 슬라이스의 전두엽(A, R10a)에서 나뉩니다. 반대 쪽 슬라이스에서 편도체및 기저 간질(B, L9b)은 전두엽(B, L9a)에서 나뉜다. 규모 표시줄: 1.7cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: NOLD 및 주요 NCD 과목의 상대 스펙트럼 배전. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 비대칭 병리학의 대표적인 이미지입니다. (A)첫 번째 경우 : 오른쪽 위축과 뇌. 관상 슬라이스(B)및(C)섹션 10-12 (C, 화살표)에서 특히 분명 오른쪽 심실 팽창을 보여줍니다. 섹션(B)과 (C)에서 "F"는 고정 및 "C"를 고정(이탈리아어: congelato)에의미합니다. (D)두 번째 경우 : 오른쪽 반구의 심각한 경색. (E)세 번째 경우: 오른쪽 유방 밀레 몸의 위축 (화살표). (F, G) 네 번째 경우: 현미경 이미지는 전두엽 치매의 경우 왼쪽 피질(G)에 비해 전두엽 우측 피질(G)에서 보다 강렬한 TDP-43 면역 반응성을 보여준다. 스케일 바: 183 μm (F, G). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 매크로 섹션입니다. (A, C) 고정 된 정면 측두엽 (A) 및 신선한 정수리 엽 (C)의 코로날 조각. (B)AT8 항체로 표기된 조직학적 전두엽-측두엽 부. 면역 반응성은 피질 전체에 명확하게 분포되지만 측두엽에서 더 강렬합니다. (D)LFB로 염색된 조직학적 정수리 섹션. 화살표는 백색 물질의 탈근 영역을 나타냅니다. 스케일 바: 1.55cm(B, D). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 쌍둥이. 두 개의 동종 쌍둥이의 뇌 비교 : BB137 (A, C, E, G, I, K) 및 BB138 (B, D, F, H, J, L). 신경 병리학 적 사진은 매우 유사합니다. (A)및(B)아밀로이드 플라크, 렙토멘닝게일(arrow) 및 당면(화살촉) 혈관을 가진 후두 엽에서 확산 4G8 양성을 보여준다. 모세관 아밀로이드 혈관병증 (별표)은 더 높은 배율(G)및(H)에서잘 인식된다. 4G8은 기저신경질(C,D)을통해 확산되고 소뇌의 렙토멘딩혈관주위(I, J: 화살표)를 분산한다. AT8 면역 반응성은 정수리피질(E, F)에서 엉킴,실 및 플라크(arrows)를 식별합니다. 글리아스 염색(K)AT8 항체로 신생아 플라크를 밝혀(L)않습니다. 스케일 바: 470 μm(A-F; I-J); 90 μm (G-H; K-L). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 임상 대 신경 병리학 진단. 이 그림에서, 신경 병리학 진단이 임상 진단과 다른 2개의 다른 케이스는 보고됩니다. α-syn에 대한 면역 반응성은 예기치 않은 결과입니다. (A–C) 첫 번째 경우: 자이루스 싱골리(A)는 SN(B-arrows)에서 루이 바디의 균일한 분포를 나타낸다. SN의 뉴런에서, 신경멜라닌에 둘러싸인 이중 Lewy 바디가 표시됩니다 (C). (D–G) 두 번째 경우: α-syn에 대한 분산 양성은 편도체(D, E) 및 미이너트 핵(F, G)에서 검출된다. 세포 체와 루이 중성염 (별표) 잘 표시 되어 있습니다. 스케일 바: 154 μm(A, D, F); 37 μm (B, E, G); 20 μm (C). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 계약 서식 을 이전합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| N | % | ||
| 성별 | 남성 | 607 | 45.9 |
| 여성 | 714 | 54.1 | |
| 출생 코호트 | 1935 | 236 | 17.8 |
| 1936 | 219 | 16.6 | |
| 1937 | 264 | 20.0 | |
| 1938 | 305 | 23.1 | |
| 1939 | 297 | 22.5 | |
| 결혼 상태 | 결혼 | 872 | 66.1 |
| Cohabiting | 13 | 1.0 | |
| 분리/이혼 | 29 | 2.2 | |
| 사별 | 325 | 24.6 | |
| 단일 | 80 | 6.1 | |
| 1차 생활 직업 | 블루 칼라 작업자 | 666 | 50.6 |
| 화이트 칼라 작업자 | 459 | 34.9 | |
| 주부 | 191 | 14.5 | |
| 수년간의 교육 | ≤5년 | 754 | 57.2 |
| >5년 | 565 | 42.8 |
표 1: InveCe.Ab 연구 참가자의 사회 인구 통계학적 특징.
| 포함 기준 | 제외 기준 |
| 18세 이상 모든 개인 | 노골적으로 기부를 거부하는 사람들 |
| 아비아테그라소 영토 내에 거주하는 사람들 | 롬바르디아 지역 외부에 거주하는 사람들 |
| 스스로 동의를 제공하는 자원봉사자 | 잠재적 인 기증자와 NOKs 사이의 불일치는 뇌 기증에 관한 소원 |
| NOK의 허가로 결정할 수 없는 과목 | 크게 뇌의 일관성을 파괴 상황 |
| 자연적인 원인에 의한 죽음 | 프리온 질병의 가능성이 배제되지 않는 한 & 2 년의 임상 과정 |
| 살인 이나 자살에 의한 죽음, 검시관의 보고서에 대 한 필요성 | |
| 사후 모템 간격 >30 시간 |
표 2: 뇌 기증 기준.
| N° | 섹스 | 코드 BB | 코드 인베스 | 연령 | 에듀 (세) | 임상 진단 | Cdr | Afs | 오후 (시간) | pH 조직 | pH 주류 | 신경 병리학 적 진단 | ||||
| 1 | F | BB 37 | 87 | 5 | AD(BPSD)로 인한 주요 NCD | 5 | 2 | 29 | Nd | Nd | 높은 AD 병리학, 적당한 SVD, TDP43+, ctx LTS, HS | |||||
| 2 | F | BB 105 | 94 | 5 | AD로 인한 메이저 NCD | 5 | 1 | 5 | 5.72 | 6.78 | 높은 AD 병리학, 온화한 SVD, HS | |||||
| 3 | F | BB 137 | 83 | 3 | 다중 병들로 인한 주요 NCD(AD-VaD) | 5 | 1 | 16 | Nd | Nd | 높은 AD 병리학, 적당한 SVD, 목막 경색, CAA-capCAA | |||||
| 4 | M | BB 181 | 71 | 13 | AD(BPSD)로 인한 주요 NCD | 5 | 2 | 3 | Nd | Nd | 중증 LTS (비치 IV), 중간 AD 병리학, mildSVD, mCAA | |||||
| 5 | M | BB 115 | I 636 | 78 | 18 | AD로 인한 메이저 NCD | 5 | 1 | 6 | Nd | Nd | 중간 AD, 중간 SVD, 염증, ILBD (비치 IIa), HS | ||||
| 6 | F | BB 23 | I 65 | 79 | 3 | 혈관 질환으로 인한 주요 NCD | 5 | 1 | 14 | Nd | Nd | 심각하고 광범위한 CAA, 중간 AD 병리학 | ||||
| 7 | M | BB 102 | I 412 | 79 | 8 | 혈관 질환으로 인한 주요 NCD | 3 | 1 | 8 | Nd | Nd | 혈관 성 치매, ILBD | ||||
| 8 | M | BB 224 | I 16 | 80 | 3 | 여러 가지 에디오로 인한 주요 NCD | 5 | 1 | 11 | Nd | 5.99 | 적당한 SVD, 낮은 AD 병리학, ILBD (비치 IIa), HS | ||||
| 9 | F | BB 47 | 78 | 5 | 주요 NCD에서 다중 에디오로지(LBD-VaD BPSD) | 5 | 0 | 8 | Nd | Nd | 높은 AD 병리학, BG TAU 병리학, ARTAG, 온화한 SVD, HS | |||||
| 10 | F | BB 153 | I 965 | 79 | 5 | 온화한 NCD (광범위한 전이를 가진 결장암으로 인한 죽음) | 0.5 | 1 | 8 | Nd | 6.73 | 낮은 AD 병리학, 적당한 BG-SVD | ||||
| 11 | M | BB 118 | I 1211 | 79 | 13 | NOLD (간암으로 인한 사망) | 0 | 2 | 3 | Nd | 6.51 | 적당한 SVD | ||||
| 12 | M | BB 236 | I 521 | 80 | 3 | AD(BPSD)로 인한 주요 NCD | 4 | 1 | 15 | Nd | 6.15 | 높은 AD 병리학, 심한 BG-SVD (여러 미세 피), HS | ||||
| 13 | F | BB 138 | 85 | 3 | 다중 병들로 인한 주요 NCD(AD-VaD BPSD) | 4 | 0 | 15 | Nd | 6.75 | 높은 AD 병리학, 적당한 SVD, CAA, 변연 TDP43 | |||||
| 14 | M | BB 109 | I 876 | 79 | 8 | NOLD (뇌종양으로 인한 사망 - GBL) | 0 | 1 | 16 | Nd | 6.4 | 낮은 AD 병리학, ILBD (비치 IIa), 온화한 SVD | ||||
| 15 | F | BB 271 | 84 | 8 | AD(BPSD)로 인한 주요 NCD | 4 | 1 | 2 | Nd | 6.7 | 중간 AD, 변연 LTS, 적당한 BG-SVD, mCAA, TDP | |||||
| 16 | F | BB 71 | I 1080 | 79 | 8 | NOLD (심부전으로 인한 사망) | 0 | 0 | 6 | Nd | 6.26 | 적당한 BG-SVD, ILBD, 에이미 TDP, 낮은 AD | ||||
| 17 | F | BB 189 | I 858 | 80 | 5 | AD(BPSD)로 인한 주요 NCD | 3 | 0 | 20 | Nd | 6.42 | 중간 AD, CAA-capCAA, TDP43, 적당한 BG-SVD, HS | ||||
| 18 | F | BB 278 | I 924 | 80 | 5 | LBD(BPSD)로 인한 주요 NCD | 3 | 1 | 5 | 6.02 | 7.05 | 중간 AD, 변연 LTS (비치 IV), 변연 TDP, HS | ||||
| 19 | F | BB 247 | 104 | 8 | 다중 병학으로 인한 주요 NCD (아마도 혼합 병리학) | 3 | 0 | 6 | 6.48 | 7.22 | 타우 병리학 (파트-ARTAG), HS | |||||
| 20 | M | BB 85 | I 19 | 83 | 10 | LBD(BPSD)로 인한 주요 NCD | 3 | 1 | 9 | 6.26 | 7.3 | 심한 변연계 LTS, 중간 AD, 중간 SVD, 심한 CAA-capCAA, HS | ||||
| 21 | F | BB 14 | I 222 | 82 | 8 | 다중 병들로 인한 주요 NCD(AD-VaD) | 2 | 1 | 11 | 5.59 | 6.4 | 중간 AD 병리학, 중간 SVD | ||||
| 22 | F | BB 282 | 76 | 8 | 주요 프론토패럴 NCD (nfPPA BPSD) | 3 | 1 | 10 | 6.07 | 6.39 | TDP (유형 A), ILBD, 중간 SVD, 낮은 AD, HS | |||||
| 23 | F | BB 154 | I 1079 | 80 | 5 | NOLD (광범위한 전이암으로 인한 사망) | 0 | 1 | 5 | 6.49 | 6.9 | 적당한 SVD, CAA, 낮은 AD, 변종 뇌염 | ||||
| 24 | F | BB 290 | 65 | 13 | 주요 프론토측성 NCD (bvFTD BPSD) | 5 | 1 | 12 | 5.73 | 6.42 | TDP(A형) | |||||
| 25 | F | BB 210 | 89 | 8 | AD(BPSD)로 인한 주요 NCD | 5 | 1 | 15 | 5.94 | 6.4 | 진행 중인 상황 | |||||
| 26 | M | BB 293 | 75 | 18 | 주요 프런트로측도 NCD (bvFTD BPSD) | 5 | 1 | 8 | 6.14 | 6.83 | 진행 중인 상황 | |||||
| 27 | F | BB 99 | I 1370 | 79 | 9 | NOLD (패혈증 쇼크로 인한 사망) | 0 | 2 | 14 | 6.3 | 7.12 | 진행 중인 상황 | ||||
| M/F | 의미 | 의미 | 의미 | 의미 | 의미 | 의미 | 의미 | |||||||||
| 0.5 | 81 | 7.7 | 3.2 | 1.0 | 10.4 | 6.1 | 6.6 | |||||||||
표 3: ABB 시리즈의 임상/신경 병리학 진단. BB: 브레인 뱅크; 에듀 (연): 교육 년; CDR: 임상 치매 등급 (0 = 치매 없음; 0.5 = 경미한 인지 장애; 1 = 경증 치매; 2 = 중간 치매; 3 = 중증 치매; 4 = 매우 심한 치매; 5 = 말기 치매); AFS: 아뇌 인자 점수; 오후 (hrs): 사후 평가 시간; nd: 완료되지 않음; M/F: 남성/여성; BPSD: 치매의 행동 및 심리적 증상; VaD: 혈관 성 치매; 놀드: 일반 노인; GBL: 교모세포종; nfPPA: 비 유창한 기본 진보적 실어증; bvFTD: 전두엽 치매의 행동 변이체; SVD: 작은 혈관 질병; LTS: 루이 타입 Synucleinopathy; HS: 해마 경화증; CAA: 대뇌 아밀로이드 혈관병증; 캡카아: 모세관 CAA; mCAA: 수막 CAA; ILBD: 부수적인 루이 바디 병; BG: 기저 간리아; ARTAG: 연령 관련 타우 천체-글리오병증; PART: 1 차 연령 관련 TAUopathy; 에이미: 아미그달라.
| 도메인 | 테스트 이름 |
| 우울증 | 역학 연구 우울증 규모 센터 (CES-D) [2] |
| 글로벌 인식 | 미니 정신 상태 검사 (MMSE) [1] |
| 구두 및 시각적 기억 | 무료 및 cued 선택적 알림 테스트 [3] |
| 코르시 테스트 [4] | |
| 레이 오스터리스 복합 피규어 (ROCF) 리콜 [5] | |
| 주의/정신 운동 속도 | 트레일 만들기 A [6] |
| 주의 행렬 [4] | |
| 언어 의미 메모리 | 의미론적 언어유창성(색상, 동물, 과일, 도시) [4] |
| 집행 기능 | 트레일 메이킹 B [6] |
| 까마귀의 색깔의 매트릭스 [7] | |
| 비수공간 능력 | 시계 그리기 테스트(CDT) [8] |
| 레이 오스터리스 복합 피규어(ROCF) 복사 [5] |
표 4: 뇌 기증자에 대한 신경 심리학 평가.
| 대사 산물 |
| 완전한 혈액 수 |
| 콜레스테롤 HDL 및 LDL |
| 트리 글 리세 리드 |
| 포도 당 |
| 글리세이트 헤모글로빈 (HbA1c) |
| 호모 시스테인 |
| 코발라민 (비타민 B12) |
| Folate |
| 알부민 |
| 우 레 아 |
| 크레아티닌 |
| 트랜스아미나제 (ALT 및 AST) |
| 감마 글루타밀 트랜스퍼라제 |
| 갑상선 자극 호르몬 (TSH) |
| 비타민 D (25-하이드록시 비타민 D) |
| C-반응성 단백질 (CRP) |
| 전해질 |
표 5: 뇌 기증자를 위한 대사 패널.
| 유전자 이름 | dbSNP |
| 아폴리포프로틴 E (APOE) | rs429358 |
| rs7412 | |
| 카탈라제 (CAT) | rs1001179 |
| 슈퍼옥사이드 디스무타제 2 (SOD2) | rs4880 |
| 안지오텐시노겐 (AGT) | rs699 |
| 시르투인 2 (SIRT2) | rs10410544 |
| 외부 미토콘드리아 멤브레인 40 (TOMM40)의 트랜스로케이스 | rs2075650 |
| 브리징 통합자 1 (BIN1) | rs7561528 |
| 카테콜-오 메틸트랜스퍼라제 (COMT) | rs4680 |
| 메틸레네트슈트라하이드로폴레이트 환원효소 (MTHFR) | rs1801133 |
| rs1801131 | |
| 뇌 유래 신경 영양인자 (BDNF) | rs6265 |
| 솔루트 캐리어 패밀리 6, 회원 4 (SLC6A4 또는 5HTT) | 하이드록시트립타민 수송기 유전자 연결 다형성 영역 (5-HTTLPR) |
| rs25531 |
표 6: InveCe.Ab 뇌 기증자를 위해 분석된 SNPs.
| 프로세스 | 솔루션 | 기간 | |
| 매크로 샘플 | 마이크로 샘플 | ||
| 고정 | 10% 버퍼링 된 포르말린 | 4 °C에서 8 일 | 4 °C에서 8 일 |
| 세척 | 포스페이트 버퍼 | 실온에서 2-15 일 | 실온에서 2-15 일 |
| 세척 | H2O 워시 | 2-3h, 수돗물 | 2-3h, 수돗물 |
| 탈수 | 에틸 알코올 70% | 24 h | 8 h |
| 탈수 | 에틸 알코올 80% | 24 h | 4 h |
| 탈수 | 에틸 알코올 90% | 60 시간 (일반적으로 주말 동안) | 4 h |
| 탈수 | 에틸 알코올 95% | 12 h | 4 h |
| 탈수 | 에틸 알코올 95% | 12 h | 4 h |
| 탈수 | 에틸 알코올 100% | 6 h | 4 h |
| 탈수 | 에틸 알코올 100% | 6 h | 4 h |
| 지우기 | 자일린 I | 12 h | 10 시간 |
| 지우기 | 자일린 II | 12 h | 10 시간 |
| 침투 | 파라핀 I | 12 h | 11 h |
| 침투 | 파라핀 II | 12 h | 11 h |
| 포함 | 파라핀 왁스 | ||
표 7: ABB 조직 처리 프로토콜.
| 지역 | H&E | 크레실 바이올렛 | LFB | 갈리아스 | 4G8 | AT8 | α-SYN | TDP-43 | 노이엔 | GFAP |
| Brainstem | ||||||||||
| 메둘라- 도살 모터 핵 의 vagus | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | |||||||
| 폰스 - 로커스 코룰러스 | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | |||||||
| 미드브레인 - 실질적인 니그라 | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | ||||||
| 소뇌 | ||||||||||
| 소뇌피질 및 덴테이트 핵 | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | ||||||
| 뇌 | ||||||||||
| 중간 정면 자이루스 | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | |||
| 기저 간리아 + 메이너트핵 | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | ||||
| Cingulate, 전방 | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | |||
| 편도 | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | ||||
| 탈하하 및 수해 핵 | Ⅹ | Ⅹ | ||||||||
| 우수 및 중간 측두구 자리 | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | |
| 해마와 내피질 | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ |
| 열등한 정수리 나귀 | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | |||
| 후두 피질 | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | |||||
| 후각 전구 | Ⅹ | Ⅹ | ||||||||
표 8: 평가된 영역, 염색 및 면역히스토케.
Discussion
프로토콜의 중요한 단계
우리의 목표는 세로 관찰에서 파생 된 상세한 역사를 가진 과목에서 나오는 양질의 조직을 획득, 특성화 및 저장하는 것입니다. 이 목표를 달성하기 위해서는 다음과 같은 주요 측면을 처리해야합니다. 위에서 설명한 바와 같이, 프로토콜은 첫 번째 중요한 단계인 기증자모집에서 시작됩니다. 그런 다음, 기증자는 후속 프로그램을 계속하고 뇌의 실제 기부까지 시간이 지남에 따라 프로젝트에 대한 접착을 유지할 필요가있다. 사망 시, ABB 직원은 적절한 조직 품질에 중요한 24 시간 이내에 부검 팀을 소집하기 위해 신속하게 통보해야합니다. 대뇌 반구의 신선한 절단은 꾸준한 손과 특정 훈련을 필요로한다. 느린 동결로 인한 세포 손상을 방지하고 냉동 고장및 Omics에 대한 좋은 품질의 조각을 얻기 위해, 그들은 신속하게 냉동하는 것이 중요합니다. 포르말린 용액(1mm/hour)의 침투 속도를 고려하여, 조직 항원성을 보존하기 위해 단일 슬라이스의 담그기 시간은 최소한으로 유지된다.
메서드의 문제 해결
위에서 언급한 중요한 단계를 해결하기 위해 다음과 같은 방법을 제공합니다. 기증자 모집 및 후속 준수: 신체의 그림 손상의 두려움을 포함 하 여 뇌 기부를 방해 하는 몇 가지 요인이 있다, 순도와 무결성, 또는 죽음 후 통증을 느낄 의 가능성. 일부는 심지어 부검이 여전히 살아있는 동안 수행 될 수 있다고 걱정70,,71. 장례준비중단과 재정적 부담에 대한 우려도72현이다. 또한, 의료 인력의 사후 절차에 대한 지식의 부족과 잠재적 인 기증자 또는 그들의 NOK의 우려를 해결하는 무능력은 등록을 억제 할 수 있습니다. 이러한 모든 요인은 등록 된 참가자의 낮은 수와 시간이 지남에 따라 기증자 손실의 높은 가능성과 인식의 낮은 수준을 생성 할 수 있습니다. 실제로, 기부자 모집 프로그램은 인식을 확산, 신뢰를 심어 및 사람들이 등록하고 후속 참여의 높은 비율을 유지하도록 설득하는 데 효율적이어야한다. 우리의 경험에서, 이것은 잠재적 인 기증자의 신중한 선택과 BB의 목적에 대한 철저한 설명을 통해 이루어집니다. 우리는 건강한 사람들과 신경 퇴행성 질환과 그 가족에 영향을 받는 사람들의 두려움과 필요를 해결하는 교육 활동과 공감 접근법을 제공합니다. 우리는 잠재적 인 기증자가 직접 접근 할 때 자신의 동의를 줄 가능성이 더 높다는 것을 발견. 대면 접근 방식은 상호 신뢰와 존중에 기초한 관계를 만들어 뇌 기증 및 후속 평가에 대한 높은 비율의 등록을 달성하는 데 기본입니다. 윤리의 강한 감각을 가진 고도로 훈련된 직원은 먼저 잠재적인 기증자에 접근하고, 죽음 후에 두뇌를 기증의 가능성을 토론하고, 신경 과학적인 연구에 인간 두뇌 조직의 가치를 설명하고, 사후 절차에 관하여 어떤 의심든지 명확히 합니다. 입의 유리한 단어는 똑같이 중요합니다. 뇌 수확 후, 적절한 관심과 주의는 시신을 재구성하기 위해 주어진다. 시신을 부드럽게 치료함으로써 고인에게 존경과 감사를 표하는 것이 중요합니다. 몇 달 후, 회의는 가족이 요청할 때마다 신경 병리학 분석의 결과를 전달할 예정입니다.
사망 및 뇌 수확 시간: 사람이 수락하면 기증자가되어 24 시간 / 일, 7 일 / 주 (우리와 연결된 ASP 골기 - 레다엘리 노인 병원의 수신 수)에 연락 할 수있는 번호가있는 신분증을 받습니다. 더욱이, 입원시 사용할 친척에게 접착제 태그가 주어집니다. 이 지역의 장례 기관은 이전에 부검 팀이 소환된 ABB 시설에 시체를 데려오라는 통보를 받았습니다. 부검 팀은 병리학자, 신경학자 및/ 또는 신경생물학자, 그리고 매일 오전 6시부터 오후 11시까지 전화하는 해부학실 기술자로 구성됩니다. 일부 연수생 학생들은 종종 도움을 주고 사진을 찍을 수 있습니다.
새로운 절단 절차의 정밀도와 일관성은 방법을 개발하고 신경 병리학에서 경험의 몇 년을 가지고 동일한 두 연산자 (신경학자와 병리학자)의 참여에 의해 보장된다. 슬라이스를 얼릴 때, 그들은 냉동 알루미늄 트레이에 넣어 잘 평평하게 유지하기 위해 연동 알루미늄 접시로 덮여있다. 즉시 3 분 동안 액체 질소에 넣고 -80 °C로 저장합니다. 고정할 슬라이스는 개별적으로 거즈로 감싸고 10% 인산염 버퍼링 포르말린 용액에 담그며 하루 후에 대체됩니다. 그 후, 그들은 5 일 이상 포르말린에 보관됩니다; 그러나 포르말린 용액이 1mm/day로 침투한다는 점을 고려할 때, 우리는 담그기 시간을 더 단축하고 싶습니다.
메서드의 제한 사항
여기에 설명된 연구 방법은 제한된 지리적 영역만을 커버하며 기부 프로그램에 참여한 개인은 일반 인구를 완전히 나타내지 않는 특성을 가지고 있습니다. 비록 허용 보다 더, 사후 간격 최대 24 시간 일부 단백질 구조에 변화를 생산할 수 있습니다., 효소와 뇌 조직의 RNA. AFS와 pH의 결정은 조직 품질73을 결정하기에 완전히 적합하지 않을 수 있으며 RNA 무결성에 따라 조직 품질을 인증하는 다른 방법을 개발하고 있습니다.
미세 절삭 절차에 관해서는 해부학 적 관계를 재구성하는 데 매우 유용하지만 매크로 섹션의 사용은 간단하지 않으며 기술적 인 어려움을 제시한다는 점에 유의해야합니다. 우리의 방법은 도전적이고 시간이 많이 걸립니다. 비용은 매우 높고 자금 조달이 항상 쉬운 것은 아닙니다. 기금은 주로 공공 (ASP 골기 - 레다엘리 노인 병원) 및 민간 자원 (골기 - 첸치 재단), 개인 기부, 비영리 단체 (예 : "페데라지오네 알츠하이머 이탈리아")에서 온다 참여.
기존/대체 방법에 대한 ABB 방법의 중요성
처음에, 우리의 두뇌 기증 프로그램은 InveCe.Ab 세로 연구에 참여하는 개별을 표적으로 했습니다. 결과적으로 기증된 뇌에는 수년에 걸쳐 수집된 상세한 임상, 생물학적 및 사회적 정보가 동반됩니다. ABB의 강도는 이 독특한 기원에서 정확하게 파생됩니다. 실제로 생물학적 특성과 환경 노출을 공유하는 사회적 및 유전 적 관련 사람들의 그룹을 연구하면 통계 분석이 향상됩니다. 또한, 연구에는 다음과 같은 이점이 포함됩니다: 1) 지역 사회의 필요를 돌보고 제공하십시오 ("요청하기 전에 주는 행위") : 사람들은 일반 개업에게 통보되는 무료 정기 검진을 받고, 우리의 비서의 전화 번호가 상담을 위해 제공되며 중증 장애인은 집에서 방문합니다. 2) 참가자 참여자, 정기적인 세미나 조직(뇌 건강, 뇌 기증 및 일반 건강 관련)을 통해 교육 활동에 대한 공공 역할 및 일반 실무자 참여, 주제 과정의 계획(예: 노인을 위한 정보 기술 장치 사용) 3) 사람들을 만나고 대면 접근 방식을 채택합니다. 이러한 모든 요소는 ABB 프로젝트의 강도를 구성합니다. 또한, 이 프로젝트는 관련 의료진의 임상 능력을 향상시켰으며, 이 에대한 평가와 사후 신경 병리학 평가 모두에서 경험을 쌓습니다. 이와 관련하여 우리는 "소수 민족 노화 연구 연구"의 매우 독특한 경험을 언급하고 싶습니다. 이 연구는 시카고 지역에 거주하는 제한된 선택된 아프리카계 미국인 수(1,357명의 적격 과목 중 784명: 응답률 57%)를 포함시켰습니다. 참가자들은 매년 집에서 방문하여 뇌 기증 프로그램에 참여하라는 요청을 받았습니다. 이 연구는 뇌 기증 프로그램에 대한 긍정적 인 반응의 높은 비율을 얻는 우리의 몇 가지 유사성을 가진 특이한 접근 방식을 기반으로 (784 참가자 중 352 기증자가 등록되었다 : 44%), 부검 비율은 매우 만족스럽지 않았지만 (53%)74. "소수 노화 연구 연구"와 마찬가지로, 우리는 우수한 결과를 달성, 교육 활동과 공감 접근 방식을 제공합니다. 특히 응답률은 93%, 등록률은 28.7%, 현재 부검률은 67%입니다. 이러한 요금은 사람들을 직접 참여시키는 프로젝트가 기부금의 더 상당한 비율을 가지고 있음을 보여줍니다. 잠재적 인 기증자와의 관계를 구축하는 데 덜 주의를 기울이는 다른 뇌 기증 프로그램은 일반적으로 등록률이 약 10-15 % 이하73,75입니다.
신경 병리학 적 분석으로 끝나는 몇 가지 이전 코호트 연구가 있습니다. 또한, 뇌 은행과 저장소의 대부분은 질병 중심이며 "병에 걸린"뇌의 수에 비해 건강한 기증자에서 "제어"뇌의 부족이있다. 제한된 수의 BB는 노화 궤적73,74,,76,,77,,78,,79,,,80을연구하기 위해 병과 정상 과목을 모두 포함하는 인구 연구를 기반으로합니다. 미국74의 "소수 노화 연구 연구"와 핀란드76의 "Vantaa 85+ 연구"와 같은 일부 연구는 우리 와 유사하지만 코호트의 종료와 함께 실행되는 경향이 있습니다. 대신, ABB의 기부 프로그램은 InveCe.Ab 세로 연구가 끝난 후에도 잠재적 인 기부자를 모집하고 후속 조치를 예약하여 미래에 오랫동안 계속될 것으로 계획됩니다. 이 접근법은 은퇴 지역 사회를 대상으로하는 "태양 건강 연구소 (SHRI) 뇌 기증 프로그램"과 유사한 채용 방법을 만듭니다73. 뇌 기증을 위한 SHRI 프로토콜은 세계에서 가장 짧은 평균 사후 간격으로 매우 효율적입니다 (3.92 시간). 세계에서 가장 큰 BB와 마찬가지로 SHRI 프로토콜은 단순히 중음(처진 평면)에서 뇌원, 소뇌 및 뇌간을 잘라낸 다음, 절반은 생화학 연구를 위해 신선하고 냉동되는 반면, 다른 하나는 조직 병리학 평가를 위한 포르말린에 고정됩니다. 그러나 SHRI 해부 프로토콜의 강점 중 하나는 전체 반구 대신 개별 슬라이스를 고정하는 것입니다. 실제로, 표면과 코어 사이의 다른 고정 그라데이션 때문에 반구 전체를 고정하는 것이 최적이 지 않습니다. 더욱이, 피질 단백질은 포르말린 용액에 장기간 노출에 의해 영향을 받을 수 있다. 따라서 개별 조각을 수정하기로 결정한 이유입니다.
어느 쪽이 고정되거나 동결되는지에 대한 결정은 단수 은행(항상 동일하거나 무작위로 할당되거나 해부일이 홀수인지 에 따라 할당되거나 할당됨)에 따라 달라집니다31,,32,,33,,34,,35. 따라서 생화학적 및 조직 병리학 적 분석은 각 반구에서 별도로 수행됩니다. 많은 신경 질환이 비대칭이기 때문에 BB는 신선한 표본을 자르기위한 독특한 프로토콜을 제공합니다 : 뇌간과 소뇌및 뇌의 각 반구에서 의 대체 섹션은 고정 또는 냉동 물질로 유지됩니다. 한 반구의 고정 된 슬라이스는 다른 반구의 고정 된 조각에 해당합니다. 우리의 방법은 모든 냉동 재료의 완전한 조직 특성을 얻고 양측의 모든 영역에서 결과를 비교할 수있는 기회를 제공합니다. 소개에서 말했듯이, 설명 된 방법은 우리가 뇌 조직에서 가능한 한 많은 정보를 얻을 수 있습니다. 또한, ABB의 방법은 거의 모든 알려진 뇌 단백병증과 혈관 병리를 포함하여 기본적이지만 완전한 신경 병리학 적 특성을 산출합니다. 인지 장애를 결정하는 혈관 손상의 논란이 되는 역할로 인해 혈관부담(30,,53)에이중 점수를 사용하기로 결정했습니다.
프로토콜에 설명된 바와 같이, 우리는 다분야 접근 방식을 사용합니다. 이것은 시간이 많이 걸리고 노동된 방법이지만, 우리는 그것이 연구를 위한 몇몇 이점을 제공한다는 것을 믿습니다. 예를 들어, 이전 작업에서, 우리는 APOE-θ4 알렐과 관련된 Se 당 높은 tHcy, 또는 MTHFR C677T TT가 기억 상실(81)이아닌 임원 기능 장애와 관련이있을 수 있음을 입증했다. 따라서, 신경 병리학 수준에서이 특정 유전 프로필과 과목을 평가하는 것이 재미있을 수 있습니다. 이것은 우리 은행에서 수집 된 생물학적 물질의 조사를 통해 검증 가능한 새로운 연구 가설을 만드는 데 이러한 심층적 인 후속 조치가 어떻게 유용한지의 예입니다. 우리의 접근 방식의 장점의 또 다른 데모는 우리가 일상적으로 수행하는 평가 중 QEEG를 포함, 독창성과 사용의 상대적 용이성을 위해. 실제로, EEG는 피질 피라미드뉴런(82)에속하는 원달의 전기적 전위를 기록하여 대뇌 피질의 시냅스 활성을 검출한다. QEEG는 인식83과관련된 피질 시냅스 활성의 추정을 위한 바이오마커로 간주될 수 있다. 특히, 낮은 주파수 (theta 및 델타 리듬)의 일반적인 증가와 뇌의 후방 부분에서 알파 리듬의 감소는 피질 연결 고장과 관련이있다. 진단 상관 연구의 대부분은 단지 가능성만이고 명확한 진단이 아닌 임상 진단에 근거한 것으로 간주되어야 한다84,,85,,86,,87. 오직 극소수의 표적 연구만이 QEEG 데이터를 신경병리학적 영상과 비교하여 QEEG와 LTS 변이체88,,89,FTLD와 AD83사이의 구별을 조사한다. 신경 병리학 적 진단의 정의와 함께 우리의 연구를 종료하 여, 그것은 정확 하 게 대뇌 전기 활동에 만든 관찰을 해석 하는 것이 가능. 또한, 각 과목에서 연속 QEEG를 수행하면 개별 EEG 파궤적 궤적 및 신경 병리학 적 그림과의 상관 관계를 추적 할 수 있습니다. 시간이 지남에 따라 피질 전기 활동의 개별 적인 수정에 따라 부성 치 매에 대 한 바이오 마커로 그것의 의미의 더 나은 이해로 이어질 수 있습니다.
향후 응용 프로그램 및 방법의 방향
조직 분포를 구현하는 것은 우리의 주요 미래 목표 중 하나입니다. 이를 위해 우리는 파비아 대학의 신경학 학자인 GC 재단(노인학)의 이사, GC 재단 및 노인 병원 ASP 골기-레다엘리의 병리학자 등 과학 위원회를 설립했습니다. 뇌 조직, 조직 학적 슬라이드 및 기타 생물학적 샘플을 배포 할 때 기증자가 연구를 위해 기부에 동의했다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 BNE 행동 강령40에설명된 것처럼 자료의 분포는 신중하게 수행되어야 합니다. 자료에 대한 요청을 제출하는 당사자는 필요한 샘플의 종류와 수량을 나타내고, 연구 프로젝트에 대한 설명과 샘플이 어떻게 사용되는지, 그리고 가능하면 이전 출판물의 증거를 제공해야 합니다(이전 계약의 경우 그림 9참조). 뇌 은행은 재정적 이익을 위해 작동하지 않습니다. 따라서 연구원이 지불하는 수수료는 조직 조달, 처리, 저장 및 유통 비용을 충당해야 합니다.
외극체 염기서열 분석 및 프로테오믹스 및 전사학과 같은 Omics 기술로 사례를 분석할 계획이 추진되고 있습니다. 우리의 대체 샘플링 방법론은 오믹스 연구가 두 반구에서 조직학적으로 잘 정의된 조직에 수행 될 수 있습니다. 이러한 접근법을 통해, 동일한 반구의 다른 뇌 영역과 다른 반구의 해당 영역에서 유전자 활성화 패턴을 비교하고, 조직 병리학과 유전자 활성화를 상호 연관시킬 수 있을 것이다. 이 분야에서 딥 러닝 응용 분야는 조직 학적 슬라이드의 전산화 된 분석과 임상, 조직학 및 omics 데이터의 최첨단 상관 관계를 포함하여 큰 관심을 가질 것입니다. 다른 많은 변수 와 다른 가능한 기술 응용 프로그램 사이의 다른 상관 관계를 식별할 수 있습니다. 두 반구에서 냉동 물질의 가용성유전자 활성화 및 단백질 분포의 정확한 지형을 허용합니다. 이것은 건강한 과목에서도 특히 관심이 있을 것입니다, 뇌 기능과 일부 질병은 비대칭것을 고려.
더욱이, 우리는 잘 특징적인 두뇌 기증자에게서 세포 배양을 얻을 수 있습니다. 실제로, 수확된 뇌의 렙토멘딩으로부터의 세포 배양은 질병 또는 노화 메커니즘의 추가 조사에 사용될 수 있는 살아있는 세포를 공급하며, 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC) 기술을 통해 렙토뇌형 섬유아세포를 재프로그래밍하고 첨단 모델90에서신경세포로 분화하는 기술을 포함한다.
두뇌 나이로, 변화의 다른 단면도분자, 세포 및 조직 수준에서 생길 수 있습니다. 모든 뇌는 독특합니다. 각각은 내부 및 외부 스트레스 요인에 대응하는 자신의 방법이 있습니다. 어떤 사람들은 굴복하고 뚜렷한 병리를 표시하는 동안 저항합니다. 임상 프리젠 테이션과 신경 병리학 적 그림 사이의 불일치는 종종 병변의 지형이 분자 특성보다는 임상 프리젠 테이션을 결정하기 때문에 종종 존재합니다. 정확하고 명확한 진단은 종종 질병의 병인을 해명하는 데 필요한 중요한 병인 단서를 추가하는 신경 병리학 적 사실 인정과 임상 증후군을 결합하여 달성 될 수 있었습니다. 유럽에서는 신경 병리학 적 진단에 대한 표준 접근 법을 만들기위한 노력이 있습니다. 우리의 진단 프로토콜은 거의 완전히 뇌 뱅킹91에대한 신경 병리학 진단에 최근에 발표 된 지침을 다음과 같습니다. 이것은 우리가 수집하고 첫 번째 이탈리아 뇌 은행을 설립의 미래의 목표와 함께, 잘 문서화 된 뇌 조직을 공유 할 수 있습니다. 실제로, 이탈리아에서는 뇌 저장소하지만 코호트 연구에 기초한 뇌 은행이 없습니다. 우리의 목표는 이탈리아 전역에서 광범위하게 구현될 수 있는 뇌 조직 수확 방법을 개발하고, 일반적인 프로토콜을 사용하고 유사한 물질을 공유하는 네트워크를 구축하는 것입니다. 이를 위해 다른 연구 센터의 참여와 특정 웹 사이트의 생성은 미래의 주요 목표 중 하나입니다.
혁신적인 기술은 신경 퇴행성 질환의 분자 특성 분석 및 바이오 마커 식별을 위해 지속적으로 사용되고 있습니다. 이러한 맥락에서, 경도 연구를 통해 얻은 인지 및 노화 궤적에 대한 정보와 함께 뇌에 대한 필요성이 증가하고, 신경병리학적으로 검증된 역학 접근법92의중요성을 강조할 것이다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 이 작품을 닥터 사 미켈라 만지리에게 헌납하고자 합니다. 그녀는 조기에 죽기 전에, 그녀는 임신하고 Abbiategrasso 브레인 뱅크 프로젝트를 시작했다.
우리는 그들의 신체의 가장 고귀한 기관을 기증 하는 연구에 관대 하 게 기여 하는 우리의 두뇌 기증자에 게 감사; 그들없이이 연구는 가능하지 않을 것입니다.
우리는 ABB 프로젝트에서 그녀의 소중한 작품에 대한 발레리아 마르자갈리에 감사드립니다.
저자들은 요하네스 아템스 교수, 파올로 포시아니 박사, 조르지오 지아코네 박사의 소중한 지도와 현명한 조언에 감사드립니다.
프로젝트 전반에 걸쳐 귀중한 도움을 주신 닥터 사 앨리스 시린시오네와 줄리아 보톤 양에게 감사드립니다.
테레 카사니 여사의 지원과 "페데라지오네 알츠하이머 이탈리아"의 협력에 대한 많은 감사.
저자는 마테오 모레티 박사와 안토니오 마르코 마리아 오큘라티 교수, 공중 보건학과, 실험 및 법의학 의학, 파비아 대학에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50ml polypropilene conical tube 30x115mm | BD | 405253 | |
| Anti-GFAP | Dako | Z0334 | policlonal primary antibody (anti-rabbit); dilution = 1:1000 |
| Anti-NeuN (A60) | Chemicon | MAB377 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000 |
| Anti-phospho TAU (AT8) | ThermoScientific | MN1020 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:200 |
| Anti-phospho TDP-43 (pS409/410-2) | CosmoBio | TIP-PTD-P02 | policlonal primary antibody (anti-rabbit) ; dilution = 1:4000; pretreatment : Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6 |
| Anti-α-SYN (KM51) | Novocastra | NCL-L-ASYN | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:500; pretreatment: 1) Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6 ; 2) 70% formic acid in H2O for 10 min |
| Anti-βamyloid (4G8) | BioLegend | 800703 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000; pretreatment : 70% formic acid in H2O for 10 min |
| Cutting board | BD | 352070 | |
| DMEM High Glucose | Carlo Erba | FA30WL0101500 | medium |
| Electrical saw with 5d blade | CEA | 06.06.14/06.00.16 | |
| Electrode pH measure surface 12mm | CEA | 70064.250 HHH | |
| Electrode pH needle | Fisher Scientific | 11796338 | |
| EnVision+System-HRP | Dako | K4001 | secondary antibody (anti-mouse); dilution 1:2 |
| EnVision+System-HRP | Dako | K4003 | secondary antibody (anti-rabbit); dilution 1:2 |
| Ethylether | SMI | 8401530 | |
| Feather safety trimming knife blade 14cm | Fisher Scientific | 11749798 | |
| Fetal Bovine Serum | Carlo Erba | FA30WS1810500 | medium supplement; dilution = 20% |
| Forceps 15cm surgical or anatomical | Uvex | 500XG | |
| Gloves | CEA | 01.28.14 | |
| Glue | Arcobaleno | 2624000800002 | |
| Head supporter | Lacor | 60456 | |
| L-Glutamine (100X) | Carlo Erba | FA30WX0550100 | medium supplement; dilution = 1% |
| Measuring tape | CEABIS | CEATA34 | |
| Non adsorbable monofilament black polyamide | UHU Bostik | 8000053131470 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140050 | medium supplement; dilution = 1% |
| Pen/Strept Solution (100X) | Carlo Erba | FA30WL0022100 | medium supplement; dilution = 1% |
| Spinal needle quincke tipe point 20GA 3.50IN 0.9x90mm | CEA | 03.06.16 | |
| Sterile scalpel with n°21 blade | |||
| Surgical basin | Olcelli Farmaceutica | A930857255 | |
| Surgical mallet and surgical cisel | CEA | 79.68.88 | |
| Surgical scissor | CEA | 27.08.45/79.68.64 | |
| Feather | M130RC |
References
- The Global Dementia Observatory Reference Guide World Health Organization. , at http://apps.who.int/bookorders (2018).
- Kasper, B. S., et al. Neuropathology of epilepsy and psychosis: the contributions of J.A.N. Corsellis. Brain: a journal of neurology. 133, Pt 12 3795-3805 (2010).
- Overy, C., Tansey, E. M. The development of brain banks in the UK. c.1970-c.2010. , Available from: www.histmodbiomed.org (2013).
- Tourtellotte, W. W., Itabashi, H. H., Rosario, I., Berman, K. The National Neurological Research Bank. A collection of cryopreserved human neurological specimens for neuroscientists. Annals of the New York Academy of Sciences. 436, 513-516 (1984).
- Tourtellotte, W. W., Rosario, I. P., Conrad, A., Syndulko, K. Human neuro-specimen banking 1961-1992. The National Neurological Research Specimen Bank (a donor program of pre- and post-mortem tissues and cerebrospinal fluid/blood; and a collection of cryopreserved human neurological specimens for neuroscientists). Journal of neural transmission. 39, Supplementum 5-15 (1993).
- Carlos, A. F., Poloni, T. E., Medici, V., Chikhladze, M., Guaita, A., Ceroni, M. From brain collections to modern brain banks: A historical perspective. Alzheimer's & dementia. 5, New York, N.Y. 52-60 (2019).
- Szymański, P., Markowicz, M., Janik, A., Ciesielski, M., Mikiciuk-Olasik, E.
- Nowak, D., Hofmann, W. K., Koeffler, H. P. Genome-Wide Mapping Of Copy Number Variations using SNP Arrays. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 36 (4), 246-251 (2009).
- Bush, W. S., Moore, J. H. Chapter 11: Genome-wide association studies. PLoS computational biology. 8 (12), 1002822 (2012).
- Dirks, R. A. M., Stunnenberg, H. G., Marks, H. Genome-wide epigenomic profiling for biomarker discovery. Clinical epigenetics. 8 (1), 122 (2016).
- Felsenfeld, G.
- Cogswell, J. P., et al. Identification of miRNA Changes in Alzheimer's Disease Brain and CSF Yields Putative Biomarkers and Insights into Disease Pathways. Journal of Alzheimer's Disease. 14 (1), 27-41 (2008).
- Lau, P., et al. Alteration of the microRNA network during the progression of Alzheimer's disease. EMBO molecular medicine. 5 (10), 1613-1634 (2013).
- Lowe, R., Shirley, N., Bleackley, M., Dolan, S., Shafee, T.
- Simpson, J. E., et al. Microarray analysis of the astrocyte transcriptome in the aging brain: relationship to Alzheimer’s pathology and APOE genotype. Neurobiology of aging. 32 (10), 1795-1807 (2011).
- Shevchenko, G., Konzer, A., Musunuri, S., Bergquist, J.
- Patterson, S. D.
- Paraizo Leite, R. E., Tenenholz Grinberg, L. Closing the gap between brain banks and proteomics to advance the study of neurodegenerative diseases. Proteomics. Clinical applications. 9 (9-10), 832-837 (2015).
- Giacomelli, C., Daniele, S., Martini, C. Potential biomarkers and novel pharmacological targets in protein aggregation-related neurodegenerative diseases. Biochemical Pharmacology. 131, 1-15 (2017).
- Faghihi, M. A., Mottagui-Tabar, S., Wahlestedt, C.
- Toft, M. Advances in genetic diagnosis of neurological disorders. Acta Neurologica Scandinavica. 129, 20-25 (2014).
- Kumar, D., Weatherall, D. J. Genomics and clinical medicine. , 651 (2008).
- Han, G., Sun, J., Wang, J., Bai, Z., Song, F., Lei, H.
- Gere, C.
- Fratiglioni, L., Paillard-Borg, S., Winblad, B. An active and socially integrated lifestyle in late life might protect against dementia. Lancet neurology. 3 (6), 343-353 (2004).
- Spartano, N. L., et al. Association of Accelerometer-Measured Light-Intensity Physical Activity With Brain Volume. JAMA Network Open. 2 (4), 192745 (2019).
- Bell, J. E., et al. Management of a twenty-first century brain bank: experience in the BrainNet Europe consortium. Acta neuropathologica. 115 (5), 497-507 (2008).
- Ravid, R., Park, Y. mok Brain banking in the twenty-first century: creative solutions and ongoing challenges. Journal of Biorepository Science for Applied Medicine. 2, 17 (2014).
- Iacono, D., Geraci-Erck, M., Peng, H., Bouffard, J. P. Symmetric Bihemispheric Postmortem Brain Cutting to Study Healthy and Pathological Brain Conditions in Humans. Journal of visualized experiments: JoVE. (118), (2016).
- Deramecourt, V., et al. Staging and natural history of cerebrovascular pathology in dementia. Neurology. 78 (14), 1043-1050 (2012).
- Netherlands Brain Bank Information for tissue applicants. , Available from: https://www.brainbank.nl/media/uploads/file/Information for tissue applicants_2019.pdf (2019).
- UK Brain Bank Network Process used by the banks for tissue processing and storage. The UK Brain Bank Network protocol. , Available from: https://mrc.ukri.org/documents/pdf/process-used-by-the-banks-for-tissue-processing-and-storage/ (2019).
- Vonsattel, J. P. G., Del Amaya, M. P., Keller, C. E. Twenty-first century brain banking. Processing brains for research: the Columbia University methods. Acta neuropathologica. 115 (5), 509-532 (2008).
- A Tour Of The Brain Bank. Brain Bank. , Available from: https://hbtrc.mclean.harvard.edu/pdf/about/HBTRC-Tour-2013.2.pdf (2019).
- Sheedy, D., et al. An Australian Brain Bank: a critical investment with a high return! Cell and tissue banking. 9 (3), 205-216 (2008).
- Guaita, A., et al. Brain aging and dementia during the transition from late adulthood to old age: design and methodology of the "Invece.Ab" population-based study. BMC Geriatr. 13, 98 (2013).
- Lobo, A., et al. Prevalence of dementia and major subtypes in Europe: A collaborative study of population-based cohorts. Neurologic Diseases in the Elderly Research Group. Neurology. 54, 4-9 (2000).
- Hofman, A., et al. The prevalence of dementia in Europe: a collaborative study of 1980-1990 findings. Eurodem Prevalence Research Group. Int J Epidemiol. 20 (3), 736-748 (1991).
- BrainNet Europe - Code of Conduct. , Available from: https://www.brainnet-europe.org/indexe151.html?_option=com_content_view=article_id=89_Itemid=89 (2008).
- Klioueva, N. M., Rademaker, M. C., Huitinga, I. Design of a European code of conduct for brain banking. Handbook of Clinical Neurology. 150, Elsevier B.V. (2018).
- Lee, K., Saetern, O. C., Nguyen, A., Rodriguez, L., Schüle, B. Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors. Journal of visualized experiments: JoVE. (119), (2017).
- Esiri, M. M., Wilcock, G. K., Morris, J. H. Neuropathological assessment of the lesions of significance in vascular dementia. Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry. 63 (6), 749-753 (1997).
- Tomita, H., et al. Effect of agonal and postmortem factors on gene expression profile: quality control in microarray analyses of postmortem human brain. Biological psychiatry. 55 (4), 346-352 (2004).
- Stan, A. D., et al. Human postmortem tissue: what quality markers matter. Brain research. 1123 (1), 1-11 (2006).
- Montine, T. J., et al. National Institute on Aging-Alzheimer's Association guidelines for the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease: a practical approach. Acta Neuropathologica. 123 (1), 1-11 (2012).
- Boxer, A. L., Yu, J. T., Golbe, L. I., Litvan, I., Lang, A. E., Höglinger, G. U. Advances in progressive supranuclear palsy: new diagnostic criteria, biomarkers, and therapeutic approaches. The Lancet Neurology. 16 (7), 552-563 (2017).
- Dickson, D. W., Ahmed, Z., Algom, A. A., Tsuboi, Y., Josephs, K. A. Neuropathology of variants of progressive supranuclear palsy. Current opinion in neurology. 23 (4), 394-400 (2010).
- Dickson, D. Neurodegeneration: the molecular pathology of dementia and movement disorders. , Wiley-Blackwell. (2011).
- Crary, J. F., et al. Primary age-related tauopathy (PART): a common pathology associated with human aging. Acta neuropathologica. 128 (6), 755-766 (2014).
- Kovacs, G. G., et al. Aging-related tau astrogliopathy (ARTAG): harmonized evaluation strategy. Acta neuropathologica. 131 (1), 87-102 (2016).
- Alafuzoff, I., et al. Neuropathological assessments of the pathology in frontotemporal lobar degeneration with TDP43-positive inclusions: an inter-laboratory study by the BrainNet Europe consortium. Journal of neural transmission. 122 (7), Vienna, Austria. 957-972 (2015).
- Love, S., et al. Development, appraisal, validation and implementation of a consensus protocol for the assessment of cerebral amyloid angiopathy in post-mortem brain tissue. American journal of neurodegenerative disease. 3 (1), 19-32 (2014).
- Skrobot, O. A., et al. Vascular cognitive impairment neuropathology guidelines (VCING): the contribution of cerebrovascular pathology to cognitive impairment. Brain. 139 (11), 2957-2969 (2016).
- Thal, D. R., Rüb, U., Orantes, M., Braak, H. Phases of A beta-deposition in the human brain and its relevance for the development of AD. Neurology. 58 (12), 1791-1800 (2002).
- Braak, H., Alafuzoff, I., Arzberger, T., Kretzschmar, H., Del Tredici, K. Staging of Alzheimer disease-associated neurofibrillary pathology using paraffin sections and immunocytochemistry. Acta Neuropathologica. 112 (4), 389-404 (2006).
- Mirra, S. S., et al. The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (CERAD): Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease. Neurology. 41 (4), 479-479 (1991).
- Finger, E. C.
- Kovacs, G. G. Neuropathology of Neurodegenerative Diseases. , Cambridge University Press. Cambridge. (2014).
- Kovacs, G. G., et al. Neuropathology of the hippocampus in FTLD-Tau with Pick bodies: a study of the BrainNet Europe Consortium. Neuropathology and applied neurobiology. 39 (2), 166-178 (2013).
- McKeith, I. G., et al. Diagnosis and management of dementia with Lewy bodies: third report of the DLB Consortium. Neurology. 65, 1863-1872 (2005).
- Beach, T. G., et al. Unified staging system for Lewy body disorders: correlation with nigrostriatal degeneration, cognitive impairment and motor dysfunction. Acta neuropathologica. 117 (6), 613-634 (2009).
- McKeith, I. G., et al. Diagnosis and management of dementia with Lewy bodies. Neurology. 89 (1), 88-100 (2017).
- Trojanowski, J. Q., Revesz, T. Neuropathology Working Group on MSA Proposed neuropathological criteria for the post mortem diagnosis of multiple system atrophy. Neuropathology and applied neurobiology. 33 (6), 615-620 (2007).
- Mackenzie, I. R. A., et al. A harmonized classification system for FTLD-TDP pathology. Acta neuropathologica. 122 (1), 111-113 (2011).
- Nelson, P. T., et al. Limbic-predominant age-related TDP-43 encephalopathy (LATE): consensus working group report. Brain. 142 (6), 1503-1527 (2019).
- Josephs, K. A., et al. Staging TDP-43 pathology in Alzheimer's disease. Acta neuropathologica. 127 (3), 441-450 (2014).
- Rauramaa, T., et al. Consensus recommendations on pathologic changes in the hippocampus: a postmortem multicenter inter-rater study. Journal of neuropathology and experimental neurology. 72 (6), 452-461 (2013).
- Iacono, D., et al. Same Ages, Same Genes: Same Brains, Same Pathologies?: Dementia Timings, Co-Occurring Brain Pathologies, ApoE Genotypes in Identical and Fraternal Age-matched Twins at Autopsy. Alzheimer Disease & Associated Disorders. 30 (2), 178-182 (2016).
- Guaita, A., et al. Influence of socio-demographic features and apolipoprotein E epsilon 4 expression on the prevalence of dementia and cognitive impairment in a population of 70-74-year olds: The InveCe.Ab study. Archives of Gerontology and Geriatrics. 60 (2), 334-343 (2015).
- Stevens, M. Factors influencing decisions about donation of the brain for research purposes. Age and ageing. 27 (5), 623-629 (1998).
- Le Bouc, R., et al. Limiting Factors of Brain Donation in Neurodegenerative Diseases: The Example of French Memory Clinics. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 49 (4), 1075-1083 (2016).
- Samarasekera, N., et al.
- Beach, T. G., et al. The Sun Health Research Institute Brain Donation Program: description and experience, 1987-2007. Cell and tissue banking. 9 (3), 229-245 (2008).
- Barnes, L. L., Shah, R. C., Aggarwal, N. T., Bennett, D. A., Schneider, J. A. The Minority Aging Research Study: ongoing efforts to obtain brain donation in African Americans without dementia. Current Alzheimer research. 9 (6), 734-745 (2012).
- de Lange, G. M., Rademaker, M., Boks, M. P., Palmen, S. J. M. C. Brain donation in psychiatry: results of a Dutch prospective donor program among psychiatric cohort participants. BMC psychiatry. 17 (1), 347 (2017).
- Peuralinna, T., et al. APOE and AβPP Gene Variation in Cortical and Cerebrovascular Amyloid-β Pathology and Alzheimer's Disease: A Population-Based Analysis. Journal of Alzheimer's Disease. 26 (2), 377-385 (2011).
- Kawas, C. H. The oldest old and the 90+ Study. Alzheimer's & dementia: the journal of the Alzheimer's Association. 4, Suppl 1 56-59 (2008).
- Bennett, D. A., Schneider, J. A., Arvanitakis, Z., Wilson, R. S. Overview and findings from the religious orders study. Current Alzheimer research. 9 (6), 628-645 (2012).
- O'Brien, R. J., et al. Neuropathologic studies of the Baltimore Longitudinal Study of Aging (BLSA). Journal of Alzheimer's disease: JAD. 18 (3), 665-675 (2009).
- Jonkman, L. E., et al. Normal Aging Brain Collection Amsterdam (NABCA): A comprehensive collection of postmortem high-field imaging, neuropathological and morphometric datasets of non-neurological controls. NeuroImage: Clinical. 22, 101698 (2019).
- Polito, L., et al. High homocysteine and epistasis between MTHFR and APOE: association with cognitive performance in the elderly. Experimental gerontology. 76, 9-16 (2016).
- Amzica, F., Lopes Silva, F. Cellular substrates of brain rhythms. Niedermeyer's Electroencephalography is now in its thoroughly updated sixth edition. , 33-63 (2009).
- Vecchio, F., et al. Resting state cortical EEG rhythms in Alzheimer's disease: toward EEG markers for clinical applications: a review. Supplements to Clinical neurophysiology. 62, 223-236 (2013).
- Gouw, A. A., et al. EEG spectral analysis as a putative early prognostic biomarker in nondemented, amyloid positive subjects. Neurobiology of Aging. 57, 133-142 (2017).
- Babiloni, C., et al. Abnormalities of cortical neural synchronization mechanisms in patients with dementia due to Alzheimer's and Lewy body diseases: an EEG study. Neurobiology of Aging. 55, 143-158 (2017).
- Bonanni, L., et al. Quantitative electroencephalogram utility in predicting conversion of mild cognitive impairment to dementia with Lewy bodies. Neurobiology of Aging. 36 (1), 434-445 (2015).
- Engedal, K., et al. Quantitative EEG Applying the Statistical Recognition Pattern Method: A Useful Tool in Dementia Diagnostic Workup. Dementia and Geriatric Cognitive Disorders. 40 (1-2), 1-12 (2015).
- Caviness, J. N., Beach, T. G., Hentz, J. G., Shill, H. A., Driver-Dunckley, E. D., Adler, C. H. Association Between Pathology and Electroencephalographic Activity in Parkinson's Disease. Clinical EEG and Neuroscience. 49 (5), 321-327 (2018).
- Goossens, J., et al. EEG Dominant Frequency Peak Differentiates Between Alzheimer's Disease and Frontotemporal Lobar Degeneration. Journal of Alzheimer's Disease. 55 (1), 53-58 (2016).
- Bordoni, M., et al. From Neuronal Differentiation of iPSCs to 3D Neuro-Organoids: Modelling and Therapy of Neurodegenerative Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 3972 (2018).
- Alafuzoff, I. Minimal neuropathologic diagnosis for brain banking in the normal middle-aged and aged brain and in neurodegenerative disorders. Handbook of clinical neurology. 150, 131-141 (2018).
- Wharton, S. B., et al. Epidemiological Neuropathology: The MRC Cognitive Function and Aging Study Experience. Journal of Alzheimer's Disease. 25 (2), 359-372 (2011).
