이 프로토콜은 뇌 기증 프로그램과 뇌의 적절한 특성을 통해 개별 뇌 노화 궤적을 추적하는 방법을 설명합니다. 두뇌 기증자는 연쇄 다차원 평가를 포함하여 장기 종방향 연구 결과에 관여합니다. 이 프로토콜에는 뇌 처리에 대한 자세한 설명과 정확한 진단 방법론이 포함되어 있습니다.
지속적으로 고령화 인구에서, 신경 퇴행성 질환의 보급은 상승 할 것으로 예상된다. 질병 메커니즘을 이해하는 것은 예방 및 치료 조치를 찾는 열쇠입니다. 이를 달성하는 가장 효과적인 방법은 병과 건강한 뇌 조직의 직접 검사를 통해서입니다. 저자는 선행 두뇌 기증 프로그램에 등록된 개별에 의해 기증된 좋은 질 두뇌 조직을 얻고, 가공하고, 특성화하고 저장하는 프로토콜을 제시합니다. 기부 프로그램에는 사람들에게 대면 공감접근법, 보완적인 임상, 생물학적, 사회적, 라이프스타일 정보, 시간이 지남에 따라 연쇄 다차원 평가가 포함되어 정상적인 노화와 인지 기능 저하의 개별 궤적을 추적합니다. 많은 신경 질환은 비대칭이기 때문에, 우리의 두뇌 은행은 신선한 표본을 슬라이스하기위한 독특한 프로토콜을 제공합니다. 두 반구의 뇌 섹션은 교대로 얼어 붙거나 (-80 °C에서) 또는 포르말린에 고정; 한 반구의 고정 된 슬라이스는 다른 반구의 고정 된 조각에 해당합니다. 이 접근법으로, 모든 냉동 물질의 완전한 조직학적 특성을 얻을 수 있고, 오믹스 연구는 두 반구에서 조직학적으로 잘 정의된 조직에 수행될 수 있으므로 신경 퇴행성 질환 메커니즘에 대한 보다 완전한 평가를 제공할 수 있다. 이러한 질병의 정확하고 명확한 진단은 종종 병인을 해석하는 데 필요한 중요한 병인 단서를 추가하는 신경 병리학 평가와 임상 증후군을 결합하여 달성 될 수 있습니다. 이 방법은 제한된 지리적 영역만 을 커버하기 때문에 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들며 제한될 수 있습니다. 그 한계에 관계없이, 그것이 제공하는 특성의 높은 정도는 보람이 될 수 있습니다. 우리의 궁극적 인 목표는 최초의 이탈리아 뇌 은행을 설립하는 것입니다, 신경 병리학적으로 검증 된 역학 연구의 중요성을 강조하면서.
WHO에 따르면 현재 약 5천만 명이 치매를 앓고 있으며, 이는 2050년까지 3배로 증가할 것으로 예상됩니다. 알츠하이머 병은 치매의 주요 원인이며 뇌혈관 질환 및 기타 노화 관련 신경 퇴행성 질환이 뒤따릅니다. 2017년 WHO는 치매에 대한 인식을 제고하고 글로벌 실천 계획을 장려하기 위해 글로벌 치매 천문대를개발했다. 각 개인은 자신의 뇌 노화 궤적을 가지고, 따라서 치료에 대한 검색은 신경 퇴행성 질환의 발병의 복잡성으로 인해 도전 적 수 있습니다. 아마도, 각 사람은 개인화 된 접근 방식을 필요로 하는 뇌 조직에 기록 된 그녀 또는 자신의 병인을 소유. 따라서, 뇌 조직의 연구는 신경 변성의 메커니즘을 이해하는 열쇠가 될 것입니다.
신경 과학의 역사를 돌이켜 보면, 우리는 인간의 뇌를 직접 검사하지 않고는 가장 인상적이고 획기적인 발견이 결코 일어나지 않았을 것이라는 것을 깨닫습니다. 시간이 지남에 걸쳐, 연구 할 뇌 조직의 소스는 원유 해부에서 변경되었습니다, 임의의 ‘기회 만남’, 어떤 경우에는 불법 거래, 조직 뇌 수집 및 전략적 현대 뇌 은행에. 많은 윤리적 측면의 고려는 과거의 뇌 컬렉션에서 현대 뇌 은행을 차별화 주요 요인 중 하나입니다. 최초의 실제 현대 브레인 뱅크 (BBs)는 20세기 후반에 제정되었다. 니콜라스 코셀리스와 월리스 투르텔로트는 현대 브레인 뱅킹의 선구자로 간주될 수 있습니다. 영국에서 Corsellis는 다양한 정신 및 신경 장애2에영향을 받은 1000개 이상의 잘 문서화된 뇌를 보유한 컬렉션을 조립했습니다. 또한, Corsellis는 생화학 적 테스트를 위해 얼음에 신선한 뇌 조직을 보존 할 필요성을 밝히는 데 도움이3. 한편, 미국에서 월리스 Tourtelotte는 잠재적 인 뇌 기증자의 권유를 용이하게하고 수집 된 뇌가 완전한 의료 및 신경 역사를 동반할 수 있도록 선행 뇌 기증 프로그램을도입4,,5. 뇌 수집과 현대 BB의 역사적인 개요를 보려면 Carlos 외를 참조하십시오. 6.
그렇다면 왜 우리는 여전히 인간의 뇌가 필요한가? 뇌 질환은 신경 병리학 검사 후 명확한 진단을 받을 수 있습니다. 신경 병리학은 임상 진단에 도전하고, 임상 현상의 정확한 해석및 새로운 syndromic 변이체의 조직학 기지의 발견에 열쇠입니다. 실제로, 진단은 병리학적인 그림에 근거하여 재정의될 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 부검 속도 혁신적인 신경 이미징 기술의 최근 개발으로 인해 지난 수십 년 동안 감소 했다. 뇌 이미징을 통해 뇌의 형태학적, 기능적 및 대사 적 변화뿐만 아니라 단백질 오접기 정도는 생체 내에서평가될 수 있습니다. 그러나, 생체 내 신경 이미징 및 기타 바이오마커 연구에서는 미묘한 세포 및 분자 변화를 감지할 수 없기 때문에 병리학적 그림의 “추정”만 줄 수 있습니다. 분자 이미징의 발전과 새로운 바이오마커, 표적 분자 및7 추적자 7(예: 아밀로이드, TAU, microglial 추적자)은 임상 평가 및 바이오마커 테스트에서 얻은 데이터의 해석에 인간의 뇌를 더욱 필수 불가결하게 만듭니다. 또한, 오믹스 기술 (유전체학, 에피소드학, 전사학, 메타볼로믹스, 프로테오믹스, 리피도믹스 등 신선하고 냉동된 뇌 조직에서 수행되며, 질병 메커니즘을 이해하고 위험 유전자, 새로운 진단 및 예후 마커, 잠재적 약물 표적22,,,,21,,20,,,,,8,,,9,10,,11,12,13,14,15,16, 16, 18, 18,18, 29, 18, 201, 201, 291, 18, 18, 18,201,201, 201, 201,18,201, 201, 201, 20.,23
이러한 목적을 위해, 현대 BBs 는 과학 공동체3,,24에사용할 수 있도록 잘 특징, 고품질의 뇌 조직을 보관합니다. BB에 의해 공급되는 두뇌는 완전한 임상 역사를 동반해야 합니다. BB의 활동은 다음과 같습니다 : (1) 뇌 기증 프로그램에 병과 건강한 개인의 인식 및 모집; 이상적인 조건은 완전한 임상, 생활양식 및 사회 역사, 및 biomarker 단면도를 얻기 위하여 일생 내내 기증자의 다분야 후속을 달성하는 것입니다; 실제로, 인지 예비 및 두뇌 구조는 생활 양식과 사회 교육 요인에 따라 달라 집니다25,,26,그래서 이러한 정보는 손에 총 데이터를 풍부하. (2) 기증자의 죽음 에 따라 뇌 (뇌, 소뇌 및 뇌 줄기로 구성) 및 관련 조직 (예를 들어, 척수, 두개골 신경 및 신경망 등)의 취득, 모든 표준화 된 법적 및 윤리적 규정을 관찰하면서. (3) 표준화된 수술 프로토콜에 정의된 바와 같이 뇌의 적절한 처리(해부, 고정, 동결)는 고품질 조직을 확보하고 다분야 연구에서 향후 사용할 수 있도록 한다. (4) 최종 명확한 진단을 제공하는 상세한 신경 병리학 특성. (5)연구커뮤니티(27,,28)에조직물질의 저장 및 유통.
모든 BB는 냉동 및 포르말린 고정 파라핀 임베디드 조직을 모두 저장합니다. 각 BB에는 자체 프로토콜이 있습니다. 생물 의학 연구소 (뉴저지)29및 뇌혈관병리학의Deramecourt의 연구 와 같은 특정 연구를 제외하고, 세계에서 가장 큰 BB는 단순히 뇌관, 소뇌 및 중위 (처상 평면)를 따라 뇌간을 잘라. 절반은 생화학 연구를 위해 신선하게 해부되고 냉동되고, 다른 절반은 조직 병리학 적 평가를 위해 포르말린에 고정되어 있습니다. 따라서 생화학 및 조직 병리학 분석은 각 반구에서 별도로 수행됩니다. 어느 쪽이 고정또는 동결(측면)에 대한 결정은 단수 은행31,,32,,33,,34,,35에따라 달라집니다. 많은 신경 질환이 비대칭적이기 때문에 BB는 신선한 뇌를 자르기위한 독특한 프로토콜을 제공합니다 : 뇌간과 각 반구의 인접 한 섹션은 교대로 고정되고 얼어 붙습니다. 한 반구의 고정 된 슬라이스는 다른 반구의 고정 된 조각에 해당합니다. 이 방법을 통해 뇌 조직의 사용이 최적화되고, 모든 냉동 물질의 완전한 조직학적 특성화는 두 반구의 모든 영역에서 조직학적 및 생화학 적 정보를 얻고 비교할 수 있는 가능성으로 달성될 수 있다.
우리의 두뇌 은행 프로젝트의 프레임은 아비아테그라소의 마을입니다. 아비아테그라소는 이탈리아 북부 밀라노시에서 남서쪽으로 약 22km 떨어진 작은 마을입니다. 인구는 약 32,600명입니다. 골기-첸치(GC) 재단의본고장입니다. GC재단은 대형 재활 노인병원(ASP 골기-레다엘리)의 일원이며, 노인의 노화와 관리에 관한 연구에 중점을 둔 연구소입니다. 특히, 그것은 정신 노화, 그것에 영향을 미치는 사회적, 행동 요인, 그리고 생물학 및 병리학 기본 연령 의존 신경 인지 장애 (NCDs)를 공부에 초점을 맞추고 있습니다. 2009년 GC재단은 1,321명의 참가자(1644명의 적격 과목 중 80.3%)와 함께 새로운 종로 연구를 시작했습니다. 1935년에서 1939년 사이에 태어난 백인 민족은 같은 작은 지역에 살고 있습니다. 연구 결과는 InveCe.Ab에게 불렸습니다(Invecchiamento Cerebrale Abbiategrasso;영어로: 두뇌 노화 Abbiategrasso, ClinicalTrials.gov, NCT01345110) 현재 진행 중입니다. InveCe.Ab는 치매의 발생률, 유병률 및 자연사를 평가하기 위해 최대 균질성 및 최소한의 가변성을 가진 코호트를 획득할 계획이며, 행동, 심리사회적, 임상 및 생물학적변수(36)를포함한 가능한 위험 또는 보호 요인과 함께. 코호트의 특성은 도 1 및 표 1에표시됩니다. 역학 데이터는 유럽 인구37,,38 및 InveCe.Ab 참가자의 치매 추세와 일치하며, 정상적인 노화에서 신경 인지 장애까지의 궤적을 연구하는 좋은 모델을 나타내는 균질한 유전 적 및 환경적 특성을 가지고 있습니다. 실제로, 동질적인 인구는 적당한 통계적인 힘에 도달하기 위하여 더 적은 과목을 요구합니다. InveCe.Ab 방법론은 이미 다른 곳에서 보고되었습니다36 하지만 혈액 샘플링 (신진 대사 패널, 포함 하 여 평가의 동일한 세트를 사용 하 여 정기적인 검사를 통해 다차원 접근 (매 2-3 년) 밑줄하는 것이 중요 하다 호모시스테인과 비타민, DNA 추출을 프로파일화하여 아폴리포프로틴 E(APOE) 및 인식과 노화와 관련된 기타 유전다형성, 인류측정(체중, 신장 및 허리), 걷기 테스트(이중 작업 테스트), 라이프스타일 평가 인터뷰(지중해 식단 준수, 신체 활동 및 인지 참여 수준) 및 사회적 요인(사회적 참여, 외로움, 일반 심리학 평가) 및 사회적 요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회 요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회 요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회적 요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회적 요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회적 요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회적 요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회적 요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회적 요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회요인(사회적 참여, 외로움) 및 사회적 이러한 종방향 데이터를 사후 신경 병리학 데이터와 비교하는 것은 연구에 매우 중요합니다. 따라서 우리 팀과 특히 미켈라 만지리 박사는 위에서 언급한 신경 병리학적 접근법을 구상했습니다. 이후 2014 그리고 두 번째 후속 기간 동안, InveCe.Ab 참가자는 그들의 두뇌를 기증 하도록 요청 했다, 따라서 Abbiategrasso 뇌 은행 (ABB)의탄생에 대 한 가져. ABB의 핵심 기부자는 InveCe.Ab 참가자이지만 ABB는 이제 다른 자원 봉사 기부자에게 열려 있습니다. 그(것)들은 ASP 골기-Redaelli에서 환자입니다, ABB 프로젝트에 관하여 배우고 같은 지리적 지역 (Abbiategrasso 및 주변)에 속하는 다른 신경학상 질병 또는 성인 자원봉사자로 고통받는 몇몇 환자에 가정합니다. 모든 기부자는 동일한 평가 프로토콜을 받습니다.
저자는 정상적인 노화의 개별 궤적과 NCD에 가능한 진행을 추적하고, 정확하게 관리, 처리 및 이러한 기증자에서 획득 된 뇌를 특성화하는 방법을 제안한다 세로로 따랐다. 또한, 우리의 목표는 뇌의 복지에 관한 정기적인 신경 학적 평가, 세미나 및 교육 활동에 개인을 만나고 참여시키고 연구 목적으로 뇌 기증에 대한 인식을 높이는 것입니다.
프로토콜의 중요한 단계
우리의 목표는 세로 관찰에서 파생 된 상세한 역사를 가진 과목에서 나오는 양질의 조직을 획득, 특성화 및 저장하는 것입니다. 이 목표를 달성하기 위해서는 다음과 같은 주요 측면을 처리해야합니다. 위에서 설명한 바와 같이, 프로토콜은 첫 번째 중요한 단계인 기증자모집에서 시작됩니다. 그런 다음, 기증자는 후속 프로그램을 계속하고 뇌의 실제 기부까지 시간이 지남에 따라 프로젝트에 대한 접착을 유지할 필요가있다. 사망 시, ABB 직원은 적절한 조직 품질에 중요한 24 시간 이내에 부검 팀을 소집하기 위해 신속하게 통보해야합니다. 대뇌 반구의 신선한 절단은 꾸준한 손과 특정 훈련을 필요로한다. 느린 동결로 인한 세포 손상을 방지하고 냉동 고장및 Omics에 대한 좋은 품질의 조각을 얻기 위해, 그들은 신속하게 냉동하는 것이 중요합니다. 포르말린 용액(1mm/hour)의 침투 속도를 고려하여, 조직 항원성을 보존하기 위해 단일 슬라이스의 담그기 시간은 최소한으로 유지된다.
메서드의 문제 해결
위에서 언급한 중요한 단계를 해결하기 위해 다음과 같은 방법을 제공합니다. 기증자 모집 및 후속 준수: 신체의 그림 손상의 두려움을 포함 하 여 뇌 기부를 방해 하는 몇 가지 요인이 있다, 순도와 무결성, 또는 죽음 후 통증을 느낄 의 가능성. 일부는 심지어 부검이 여전히 살아있는 동안 수행 될 수 있다고 걱정70,,71. 장례준비중단과 재정적 부담에 대한 우려도72현이다. 또한, 의료 인력의 사후 절차에 대한 지식의 부족과 잠재적 인 기증자 또는 그들의 NOK의 우려를 해결하는 무능력은 등록을 억제 할 수 있습니다. 이러한 모든 요인은 등록 된 참가자의 낮은 수와 시간이 지남에 따라 기증자 손실의 높은 가능성과 인식의 낮은 수준을 생성 할 수 있습니다. 실제로, 기부자 모집 프로그램은 인식을 확산, 신뢰를 심어 및 사람들이 등록하고 후속 참여의 높은 비율을 유지하도록 설득하는 데 효율적이어야한다. 우리의 경험에서, 이것은 잠재적 인 기증자의 신중한 선택과 BB의 목적에 대한 철저한 설명을 통해 이루어집니다. 우리는 건강한 사람들과 신경 퇴행성 질환과 그 가족에 영향을 받는 사람들의 두려움과 필요를 해결하는 교육 활동과 공감 접근법을 제공합니다. 우리는 잠재적 인 기증자가 직접 접근 할 때 자신의 동의를 줄 가능성이 더 높다는 것을 발견. 대면 접근 방식은 상호 신뢰와 존중에 기초한 관계를 만들어 뇌 기증 및 후속 평가에 대한 높은 비율의 등록을 달성하는 데 기본입니다. 윤리의 강한 감각을 가진 고도로 훈련된 직원은 먼저 잠재적인 기증자에 접근하고, 죽음 후에 두뇌를 기증의 가능성을 토론하고, 신경 과학적인 연구에 인간 두뇌 조직의 가치를 설명하고, 사후 절차에 관하여 어떤 의심든지 명확히 합니다. 입의 유리한 단어는 똑같이 중요합니다. 뇌 수확 후, 적절한 관심과 주의는 시신을 재구성하기 위해 주어진다. 시신을 부드럽게 치료함으로써 고인에게 존경과 감사를 표하는 것이 중요합니다. 몇 달 후, 회의는 가족이 요청할 때마다 신경 병리학 분석의 결과를 전달할 예정입니다.
사망 및 뇌 수확 시간: 사람이 수락하면 기증자가되어 24 시간 / 일, 7 일 / 주 (우리와 연결된 ASP 골기 – 레다엘리 노인 병원의 수신 수)에 연락 할 수있는 번호가있는 신분증을 받습니다. 더욱이, 입원시 사용할 친척에게 접착제 태그가 주어집니다. 이 지역의 장례 기관은 이전에 부검 팀이 소환된 ABB 시설에 시체를 데려오라는 통보를 받았습니다. 부검 팀은 병리학자, 신경학자 및/ 또는 신경생물학자, 그리고 매일 오전 6시부터 오후 11시까지 전화하는 해부학실 기술자로 구성됩니다. 일부 연수생 학생들은 종종 도움을 주고 사진을 찍을 수 있습니다.
새로운 절단 절차의 정밀도와 일관성은 방법을 개발하고 신경 병리학에서 경험의 몇 년을 가지고 동일한 두 연산자 (신경학자와 병리학자)의 참여에 의해 보장된다. 슬라이스를 얼릴 때, 그들은 냉동 알루미늄 트레이에 넣어 잘 평평하게 유지하기 위해 연동 알루미늄 접시로 덮여있다. 즉시 3 분 동안 액체 질소에 넣고 -80 °C로 저장합니다. 고정할 슬라이스는 개별적으로 거즈로 감싸고 10% 인산염 버퍼링 포르말린 용액에 담그며 하루 후에 대체됩니다. 그 후, 그들은 5 일 이상 포르말린에 보관됩니다; 그러나 포르말린 용액이 1mm/day로 침투한다는 점을 고려할 때, 우리는 담그기 시간을 더 단축하고 싶습니다.
메서드의 제한 사항
여기에 설명된 연구 방법은 제한된 지리적 영역만을 커버하며 기부 프로그램에 참여한 개인은 일반 인구를 완전히 나타내지 않는 특성을 가지고 있습니다. 비록 허용 보다 더, 사후 간격 최대 24 시간 일부 단백질 구조에 변화를 생산할 수 있습니다., 효소와 뇌 조직의 RNA. AFS와 pH의 결정은 조직 품질73을 결정하기에 완전히 적합하지 않을 수 있으며 RNA 무결성에 따라 조직 품질을 인증하는 다른 방법을 개발하고 있습니다.
미세 절삭 절차에 관해서는 해부학 적 관계를 재구성하는 데 매우 유용하지만 매크로 섹션의 사용은 간단하지 않으며 기술적 인 어려움을 제시한다는 점에 유의해야합니다. 우리의 방법은 도전적이고 시간이 많이 걸립니다. 비용은 매우 높고 자금 조달이 항상 쉬운 것은 아닙니다. 기금은 주로 공공 (ASP 골기 – 레다엘리 노인 병원) 및 민간 자원 (골기 – 첸치 재단), 개인 기부, 비영리 단체 (예 : “페데라지오네 알츠하이머 이탈리아”)에서 온다 참여.
기존/대체 방법에 대한 ABB 방법의 중요성
처음에, 우리의 두뇌 기증 프로그램은 InveCe.Ab 세로 연구에 참여하는 개별을 표적으로 했습니다. 결과적으로 기증된 뇌에는 수년에 걸쳐 수집된 상세한 임상, 생물학적 및 사회적 정보가 동반됩니다. ABB의 강도는 이 독특한 기원에서 정확하게 파생됩니다. 실제로 생물학적 특성과 환경 노출을 공유하는 사회적 및 유전 적 관련 사람들의 그룹을 연구하면 통계 분석이 향상됩니다. 또한, 연구에는 다음과 같은 이점이 포함됩니다: 1) 지역 사회의 필요를 돌보고 제공하십시오 (“요청하기 전에 주는 행위”) : 사람들은 일반 개업에게 통보되는 무료 정기 검진을 받고, 우리의 비서의 전화 번호가 상담을 위해 제공되며 중증 장애인은 집에서 방문합니다. 2) 참가자 참여자, 정기적인 세미나 조직(뇌 건강, 뇌 기증 및 일반 건강 관련)을 통해 교육 활동에 대한 공공 역할 및 일반 실무자 참여, 주제 과정의 계획(예: 노인을 위한 정보 기술 장치 사용) 3) 사람들을 만나고 대면 접근 방식을 채택합니다. 이러한 모든 요소는 ABB 프로젝트의 강도를 구성합니다. 또한, 이 프로젝트는 관련 의료진의 임상 능력을 향상시켰으며, 이 에대한 평가와 사후 신경 병리학 평가 모두에서 경험을 쌓습니다. 이와 관련하여 우리는 “소수 민족 노화 연구 연구”의 매우 독특한 경험을 언급하고 싶습니다. 이 연구는 시카고 지역에 거주하는 제한된 선택된 아프리카계 미국인 수(1,357명의 적격 과목 중 784명: 응답률 57%)를 포함시켰습니다. 참가자들은 매년 집에서 방문하여 뇌 기증 프로그램에 참여하라는 요청을 받았습니다. 이 연구는 뇌 기증 프로그램에 대한 긍정적 인 반응의 높은 비율을 얻는 우리의 몇 가지 유사성을 가진 특이한 접근 방식을 기반으로 (784 참가자 중 352 기증자가 등록되었다 : 44%), 부검 비율은 매우 만족스럽지 않았지만 (53%)74. “소수 노화 연구 연구”와 마찬가지로, 우리는 우수한 결과를 달성, 교육 활동과 공감 접근 방식을 제공합니다. 특히 응답률은 93%, 등록률은 28.7%, 현재 부검률은 67%입니다. 이러한 요금은 사람들을 직접 참여시키는 프로젝트가 기부금의 더 상당한 비율을 가지고 있음을 보여줍니다. 잠재적 인 기증자와의 관계를 구축하는 데 덜 주의를 기울이는 다른 뇌 기증 프로그램은 일반적으로 등록률이 약 10-15 % 이하73,75입니다.
신경 병리학 적 분석으로 끝나는 몇 가지 이전 코호트 연구가 있습니다. 또한, 뇌 은행과 저장소의 대부분은 질병 중심이며 “병에 걸린”뇌의 수에 비해 건강한 기증자에서 “제어”뇌의 부족이있다. 제한된 수의 BB는 노화 궤적73,74,,76,,77,,78,,79,,,80을연구하기 위해 병과 정상 과목을 모두 포함하는 인구 연구를 기반으로합니다. 미국74의 “소수 노화 연구 연구”와 핀란드76의 “Vantaa 85+ 연구”와 같은 일부 연구는 우리 와 유사하지만 코호트의 종료와 함께 실행되는 경향이 있습니다. 대신, ABB의 기부 프로그램은 InveCe.Ab 세로 연구가 끝난 후에도 잠재적 인 기부자를 모집하고 후속 조치를 예약하여 미래에 오랫동안 계속될 것으로 계획됩니다. 이 접근법은 은퇴 지역 사회를 대상으로하는 “태양 건강 연구소 (SHRI) 뇌 기증 프로그램”과 유사한 채용 방법을 만듭니다73. 뇌 기증을 위한 SHRI 프로토콜은 세계에서 가장 짧은 평균 사후 간격으로 매우 효율적입니다 (3.92 시간). 세계에서 가장 큰 BB와 마찬가지로 SHRI 프로토콜은 단순히 중음(처진 평면)에서 뇌원, 소뇌 및 뇌간을 잘라낸 다음, 절반은 생화학 연구를 위해 신선하고 냉동되는 반면, 다른 하나는 조직 병리학 평가를 위한 포르말린에 고정됩니다. 그러나 SHRI 해부 프로토콜의 강점 중 하나는 전체 반구 대신 개별 슬라이스를 고정하는 것입니다. 실제로, 표면과 코어 사이의 다른 고정 그라데이션 때문에 반구 전체를 고정하는 것이 최적이 지 않습니다. 더욱이, 피질 단백질은 포르말린 용액에 장기간 노출에 의해 영향을 받을 수 있다. 따라서 개별 조각을 수정하기로 결정한 이유입니다.
어느 쪽이 고정되거나 동결되는지에 대한 결정은 단수 은행(항상 동일하거나 무작위로 할당되거나 해부일이 홀수인지 에 따라 할당되거나 할당됨)에 따라 달라집니다31,,32,,33,,34,,35. 따라서 생화학적 및 조직 병리학 적 분석은 각 반구에서 별도로 수행됩니다. 많은 신경 질환이 비대칭이기 때문에 BB는 신선한 표본을 자르기위한 독특한 프로토콜을 제공합니다 : 뇌간과 소뇌및 뇌의 각 반구에서 의 대체 섹션은 고정 또는 냉동 물질로 유지됩니다. 한 반구의 고정 된 슬라이스는 다른 반구의 고정 된 조각에 해당합니다. 우리의 방법은 모든 냉동 재료의 완전한 조직 특성을 얻고 양측의 모든 영역에서 결과를 비교할 수있는 기회를 제공합니다. 소개에서 말했듯이, 설명 된 방법은 우리가 뇌 조직에서 가능한 한 많은 정보를 얻을 수 있습니다. 또한, ABB의 방법은 거의 모든 알려진 뇌 단백병증과 혈관 병리를 포함하여 기본적이지만 완전한 신경 병리학 적 특성을 산출합니다. 인지 장애를 결정하는 혈관 손상의 논란이 되는 역할로 인해 혈관부담(30,,53)에이중 점수를 사용하기로 결정했습니다.
프로토콜에 설명된 바와 같이, 우리는 다분야 접근 방식을 사용합니다. 이것은 시간이 많이 걸리고 노동된 방법이지만, 우리는 그것이 연구를 위한 몇몇 이점을 제공한다는 것을 믿습니다. 예를 들어, 이전 작업에서, 우리는 APOE-θ4 알렐과 관련된 Se 당 높은 tHcy, 또는 MTHFR C677T TT가 기억 상실(81)이아닌 임원 기능 장애와 관련이있을 수 있음을 입증했다. 따라서, 신경 병리학 수준에서이 특정 유전 프로필과 과목을 평가하는 것이 재미있을 수 있습니다. 이것은 우리 은행에서 수집 된 생물학적 물질의 조사를 통해 검증 가능한 새로운 연구 가설을 만드는 데 이러한 심층적 인 후속 조치가 어떻게 유용한지의 예입니다. 우리의 접근 방식의 장점의 또 다른 데모는 우리가 일상적으로 수행하는 평가 중 QEEG를 포함, 독창성과 사용의 상대적 용이성을 위해. 실제로, EEG는 피질 피라미드뉴런(82)에속하는 원달의 전기적 전위를 기록하여 대뇌 피질의 시냅스 활성을 검출한다. QEEG는 인식83과관련된 피질 시냅스 활성의 추정을 위한 바이오마커로 간주될 수 있다. 특히, 낮은 주파수 (theta 및 델타 리듬)의 일반적인 증가와 뇌의 후방 부분에서 알파 리듬의 감소는 피질 연결 고장과 관련이있다. 진단 상관 연구의 대부분은 단지 가능성만이고 명확한 진단이 아닌 임상 진단에 근거한 것으로 간주되어야 한다84,,85,,86,,87. 오직 극소수의 표적 연구만이 QEEG 데이터를 신경병리학적 영상과 비교하여 QEEG와 LTS 변이체88,,89,FTLD와 AD83사이의 구별을 조사한다. 신경 병리학 적 진단의 정의와 함께 우리의 연구를 종료하 여, 그것은 정확 하 게 대뇌 전기 활동에 만든 관찰을 해석 하는 것이 가능. 또한, 각 과목에서 연속 QEEG를 수행하면 개별 EEG 파궤적 궤적 및 신경 병리학 적 그림과의 상관 관계를 추적 할 수 있습니다. 시간이 지남에 따라 피질 전기 활동의 개별 적인 수정에 따라 부성 치 매에 대 한 바이오 마커로 그것의 의미의 더 나은 이해로 이어질 수 있습니다.
향후 응용 프로그램 및 방법의 방향
조직 분포를 구현하는 것은 우리의 주요 미래 목표 중 하나입니다. 이를 위해 우리는 파비아 대학의 신경학 학자인 GC 재단(노인학)의 이사, GC 재단 및 노인 병원 ASP 골기-레다엘리의 병리학자 등 과학 위원회를 설립했습니다. 뇌 조직, 조직 학적 슬라이드 및 기타 생물학적 샘플을 배포 할 때 기증자가 연구를 위해 기부에 동의했다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 BNE 행동 강령40에설명된 것처럼 자료의 분포는 신중하게 수행되어야 합니다. 자료에 대한 요청을 제출하는 당사자는 필요한 샘플의 종류와 수량을 나타내고, 연구 프로젝트에 대한 설명과 샘플이 어떻게 사용되는지, 그리고 가능하면 이전 출판물의 증거를 제공해야 합니다(이전 계약의 경우 그림 9참조). 뇌 은행은 재정적 이익을 위해 작동하지 않습니다. 따라서 연구원이 지불하는 수수료는 조직 조달, 처리, 저장 및 유통 비용을 충당해야 합니다.
외극체 염기서열 분석 및 프로테오믹스 및 전사학과 같은 Omics 기술로 사례를 분석할 계획이 추진되고 있습니다. 우리의 대체 샘플링 방법론은 오믹스 연구가 두 반구에서 조직학적으로 잘 정의된 조직에 수행 될 수 있습니다. 이러한 접근법을 통해, 동일한 반구의 다른 뇌 영역과 다른 반구의 해당 영역에서 유전자 활성화 패턴을 비교하고, 조직 병리학과 유전자 활성화를 상호 연관시킬 수 있을 것이다. 이 분야에서 딥 러닝 응용 분야는 조직 학적 슬라이드의 전산화 된 분석과 임상, 조직학 및 omics 데이터의 최첨단 상관 관계를 포함하여 큰 관심을 가질 것입니다. 다른 많은 변수 와 다른 가능한 기술 응용 프로그램 사이의 다른 상관 관계를 식별할 수 있습니다. 두 반구에서 냉동 물질의 가용성유전자 활성화 및 단백질 분포의 정확한 지형을 허용합니다. 이것은 건강한 과목에서도 특히 관심이 있을 것입니다, 뇌 기능과 일부 질병은 비대칭것을 고려.
더욱이, 우리는 잘 특징적인 두뇌 기증자에게서 세포 배양을 얻을 수 있습니다. 실제로, 수확된 뇌의 렙토멘딩으로부터의 세포 배양은 질병 또는 노화 메커니즘의 추가 조사에 사용될 수 있는 살아있는 세포를 공급하며, 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC) 기술을 통해 렙토뇌형 섬유아세포를 재프로그래밍하고 첨단 모델90에서신경세포로 분화하는 기술을 포함한다.
두뇌 나이로, 변화의 다른 단면도분자, 세포 및 조직 수준에서 생길 수 있습니다. 모든 뇌는 독특합니다. 각각은 내부 및 외부 스트레스 요인에 대응하는 자신의 방법이 있습니다. 어떤 사람들은 굴복하고 뚜렷한 병리를 표시하는 동안 저항합니다. 임상 프리젠 테이션과 신경 병리학 적 그림 사이의 불일치는 종종 병변의 지형이 분자 특성보다는 임상 프리젠 테이션을 결정하기 때문에 종종 존재합니다. 정확하고 명확한 진단은 종종 질병의 병인을 해명하는 데 필요한 중요한 병인 단서를 추가하는 신경 병리학 적 사실 인정과 임상 증후군을 결합하여 달성 될 수 있었습니다. 유럽에서는 신경 병리학 적 진단에 대한 표준 접근 법을 만들기위한 노력이 있습니다. 우리의 진단 프로토콜은 거의 완전히 뇌 뱅킹91에대한 신경 병리학 진단에 최근에 발표 된 지침을 다음과 같습니다. 이것은 우리가 수집하고 첫 번째 이탈리아 뇌 은행을 설립의 미래의 목표와 함께, 잘 문서화 된 뇌 조직을 공유 할 수 있습니다. 실제로, 이탈리아에서는 뇌 저장소하지만 코호트 연구에 기초한 뇌 은행이 없습니다. 우리의 목표는 이탈리아 전역에서 광범위하게 구현될 수 있는 뇌 조직 수확 방법을 개발하고, 일반적인 프로토콜을 사용하고 유사한 물질을 공유하는 네트워크를 구축하는 것입니다. 이를 위해 다른 연구 센터의 참여와 특정 웹 사이트의 생성은 미래의 주요 목표 중 하나입니다.
혁신적인 기술은 신경 퇴행성 질환의 분자 특성 분석 및 바이오 마커 식별을 위해 지속적으로 사용되고 있습니다. 이러한 맥락에서, 경도 연구를 통해 얻은 인지 및 노화 궤적에 대한 정보와 함께 뇌에 대한 필요성이 증가하고, 신경병리학적으로 검증된 역학 접근법92의중요성을 강조할 것이다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 이 작품을 닥터 사 미켈라 만지리에게 헌납하고자 합니다. 그녀는 조기에 죽기 전에, 그녀는 임신하고 Abbiategrasso 브레인 뱅크 프로젝트를 시작했다.
우리는 그들의 신체의 가장 고귀한 기관을 기증 하는 연구에 관대 하 게 기여 하는 우리의 두뇌 기증자에 게 감사; 그들없이이 연구는 가능하지 않을 것입니다.
우리는 ABB 프로젝트에서 그녀의 소중한 작품에 대한 발레리아 마르자갈리에 감사드립니다.
저자들은 요하네스 아템스 교수, 파올로 포시아니 박사, 조르지오 지아코네 박사의 소중한 지도와 현명한 조언에 감사드립니다.
프로젝트 전반에 걸쳐 귀중한 도움을 주신 닥터 사 앨리스 시린시오네와 줄리아 보톤 양에게 감사드립니다.
테레 카사니 여사의 지원과 “페데라지오네 알츠하이머 이탈리아”의 협력에 대한 많은 감사.
저자는 마테오 모레티 박사와 안토니오 마르코 마리아 오큘라티 교수, 공중 보건학과, 실험 및 법의학 의학, 파비아 대학에 감사드립니다.
50ml polypropilene conical tube 30x115mm | BD | 405253 | |
Anti-GFAP | Dako | Z0334 | policlonal primary antibody (anti-rabbit); dilution = 1:1000 |
Anti-NeuN (A60) | Chemicon | MAB377 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000 |
Anti-phospho TAU (AT8) | ThermoScientific | MN1020 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:200 |
Anti-phospho TDP-43 (pS409/410-2) | CosmoBio | TIP-PTD-P02 | policlonal primary antibody (anti-rabbit) ; dilution = 1:4000; pretreatment : Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6 |
Anti-α-SYN (KM51) | Novocastra | NCL-L-ASYN | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:500; pretreatment: 1) Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6 ; 2) 70% formic acid in H2O for 10 min |
Anti-βamyloid (4G8) | BioLegend | 800703 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000; pretreatment : 70% formic acid in H2O for 10 min |
Cutting board | BD | 352070 | |
DMEM High Glucose | Carlo Erba | FA30WL0101500 | medium |
Electrical saw with 5d blade | CEA | 06.06.14/06.00.16 | |
Electrode pH measure surface 12mm | CEA | 70064.250 HHH | |
Electrode pH needle | Fisher Scientific | 11796338 | |
EnVision+System-HRP | Dako | K4001 | secondary antibody (anti-mouse); dilution 1:2 |
EnVision+System-HRP | Dako | K4003 | secondary antibody (anti-rabbit); dilution 1:2 |
Ethylether | SMI | 8401530 | |
Feather safety trimming knife blade 14cm | Fisher Scientific | 11749798 | |
Fetal Bovine Serum | Carlo Erba | FA30WS1810500 | medium supplement; dilution = 20% |
Forceps 15cm surgical or anatomical | Uvex | 500XG | |
Gloves | CEA | 01.28.14 | |
Glue | Arcobaleno | 2624000800002 | |
Head supporter | Lacor | 60456 | |
L-Glutamine (100X) | Carlo Erba | FA30WX0550100 | medium supplement; dilution = 1% |
Measuring tape | CEABIS | CEATA34 | |
Non adsorbable monofilament black polyamide | UHU Bostik | 8000053131470 | |
Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140050 | medium supplement; dilution = 1% |
Pen/Strept Solution (100X) | Carlo Erba | FA30WL0022100 | medium supplement; dilution = 1% |
Spinal needle quincke tipe point 20GA 3.50IN 0.9x90mm | CEA | 03.06.16 | |
Sterile scalpel with n°21 blade | |||
Surgical basin | Olcelli Farmaceutica | A930857255 | |
Surgical mallet and surgical cisel | CEA | 79.68.88 | |
Surgical scissor | CEA | 27.08.45/79.68.64 | |
Feather | M130RC |