Summary
该协议描述了一种通过大脑捐献计划和大脑的适当表征来跟踪个体大脑老化轨迹的方法。脑捐献者参与长期纵向研究,包括连续的多维评估。该协议包含大脑处理的详细描述和准确的诊断方法。
Abstract
在人口不断老龄化的人群中,神经退行性疾病的患病率预计将上升。了解疾病机制是找到预防和治疗措施的关键。实现这一点最有效的方法是通过直接检查患病和健康的脑组织。作者提出了一个方案,以获得,处理,特征和存储优质的脑组织捐赠的个人捐赠的产前脑捐赠计划。捐赠计划包括面对面的感同身受的方法,收集互补的临床、生物、社会和生活方式信息,以及一段时间的连续多维评估,以跟踪正常衰老和认知衰退的个人轨迹。由于许多神经系统疾病是不对称的,我们的脑库提供了一个独特的协议,切片新鲜标本。两个半球的大脑部分交替冻结(在-80°C)或固定在形式中;一个半球上的固定切片对应于另一个半球上的冻结切片。通过这种方法,可以获得所有冷冻材料的完整组织学特征,并且可以对来自两个半球的组织学定义明确的组织进行奥米学研究,从而提供神经退行性疾病机制的更完整的评估。只有将临床综合征与神经病理学评价相结合,才能正确、明确地诊断这些疾病,这往往增加了解释发病机制所需的重要病因线索。此方法可能非常耗时、昂贵且有限,因为它只覆盖有限的地理区域。无论其局限性如何,它提供高度的表征可能是有益的。我们的最终目标是建立第一个意大利脑库,同时强调神经病理学验证流行病学研究的重要性。
Introduction
据世卫组织说,目前约有5 000万人患有痴呆症,预计到2050年这一数字将增加两倍。阿尔茨海默病是痴呆症的主要病因,其次是脑血管疾病和其他与年龄相关的神经退行性疾病。2017年,世卫组织开发了全球痴呆症观察站,以提高对痴呆症的认识,并鼓励制定全球行动计划。每个人都有自己的大脑老化轨迹,因此,由于神经退行性疾病的发病机制的复杂性,寻找治疗方法可能具有挑战性。也许,每个人都拥有他或她自己的发病机制写在脑组织需要个性化的方法。因此,脑组织的研究将是理解神经退化机制的关键。
回顾神经科学的历史,我们意识到,如果没有人类大脑的直接检查,最令人印象深刻和突破性的发现是不可能发生的。一直,要研究的脑组织来源从粗糙的解剖、随机的"偶然相遇",在某些情况下,非法交易,到有组织的脑收集和战略性的现代脑库。许多伦理方面的考虑是现代脑库与过去大脑集合不同的主要因素之一。第一个真正的现代脑库(BBs)是在20世纪下半叶建立。尼古拉斯·科塞利斯和华莱士·图尔特洛特可以被认为是现代脑库的先驱。在英国,Corsellis收集了一个集合,收藏了1000多个有据可查的大脑,这些大脑受到各种精神和神经疾病的影响。此外,科塞利斯帮助揭示需要保存新鲜脑组织在冰,以生化测试3。与此同时,在美国,华莱士·图尔特洛特推出了前脑捐赠计划,以促进潜在的大脑捐赠者的征集,并确保收集的大脑伴随着完整的医学和神经史4,4,5。有关大脑集合和现代 BB 的历史概述,请参阅 Carlos等人。6.
那么,为什么我们仍然需要人类的大脑呢?脑病只有在神经病理学检查后才能得到明确的诊断。神经病理学挑战临床诊断,是正确解释临床症状和发现新合成变异的组理基础的关键。事实上,诊断可以根据病理图片重新定义。然而,由于最近创新的神经成像技术的发展,验尸率在最近几十年中有所下降。通过脑成像,可以评估大脑的形态、功能和代谢变化,以及蛋白质错折叠的程度。然而,体内神经成像和其他生物标志物研究只能给出病理图的"估计",因为它们无法检测到微妙的细胞和分子变化。分子成像和发现新的生物标志物、靶分子和示踪剂7(如淀粉样体、TAU、微胶痕示踪剂)的进步使得人脑对临床评估和生物标志物测试获得的数据的解释更加不可或缺。此外,基因组技术(基因组学,表观基因组学,转录组学,代谢组学,蛋白质组学, 唇部疾病等),在新鲜和冷冻脑组织上进行,为了解疾病机制和发现风险基因、新的诊断和预后标记以及潜在的药物靶点,,,,,8,8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23开辟了新的可能性。9,10,1112,13,14,15,16,17,20,21181922
为了这些目的,现代BB存档良好的特点,高质量的脑组织,使他们提供给科学界3,3,24。BB 提供的大脑应附有完整的临床史。BB的活动包括:(1) 确认和招募患病和健康的人参加脑捐赠计划;理想的条件是实现捐赠者一生多学科的随从,以获得完整的临床、生活方式和社会历史,以及生物标志物特征;事实上,认知储备和大脑结构取决于生活方式和社会教育因素25,26,所以这些信息丰富了手头的总数据。25,(2) 在捐赠者死亡后获得大脑(包括脑、小脑和脑干)和相关组织(如脊髓、颅神经和神经神经等),同时遵守标准化的法律和道德规范。(3) 适当的处理(解剖,固定,冻结)的大脑,如标准化的手术协议定义,以获得高质量的组织,并允许将来用于多学科研究。(4) 详细的神经病理表征提供最终的诊断。(5) 组织材料的储存和分发到研究界27,28。27,
所有 BB 都存储冷冻和形式固定石蜡嵌入组织。每个 BB 都有自己的协议。除了特定的研究,如生物医学研究所(新泽西州)29和德拉梅科特的脑血管病理学30的研究,世界上最大的BB只是削减脑,脑和脑干沿中线(盐面)。一半被解剖新鲜,然后冷冻进行生化研究,而另一半被固定在形式素组织病理学评估。因此,每个半球分别进行生化和组织病理学分析。决定哪一方是固定的或冻结的(横向),取决于单一银行31,32,33,34,35。31,32,33,34,35由于许多神经系统疾病是不对称的,我们的BB提供了一个独特的协议,切开新鲜的大脑:脑干和每个半球的相邻部分交替固定和冻结;一个半球上的固定切片对应于另一个半球上的冻结切片。通过这种方法,优化了脑组织的使用,并实现了所有冷冻物质的完整组织学特征,并有可能从两个半球的所有区域获取和比较组织学和生化信息。
我们脑库项目的框架是阿比亚特格拉索镇。Abbiategrasso 是意大利北部米兰市西南约 22 公里处的一个小镇。它的人口约为32,600人。它是戈尔吉-森奇(GC)基金会的家。GC基金会是大型康复老年医院(ASP Golgi-Redaelli)的一部分,是一个专注于老年人老龄化和护理研究的研究所。特别是研究精神老化、影响心理老化的社会和行为因素,以及影响年龄依赖性神经认知障碍(NCDs)的生物学和病理学。2009年,GC基金会对1321名参与者(在1644个合格科目中:初始答复率为80.3%)开展了一项新的纵向研究1935年至1939年(70-75岁)之间出生,白种人,居住在同一小地理区域。这项研究被称为InveCe.Ab (Invecchiamento Cerebrale Abbiategrasso;在英语中: 脑老化 Abbiategrasso, ClinicalTrials.gov, NCT01345110), 目前正在进行中。InveCe.Ab计划获得一个同质性最大、变异性最小的队列,以评估痴呆症的发病率、患病率和自然史,以及可能的风险或保护因素,包括行为、社会心理、临床和生物变量36。队列的特征如图1 和表 1 所示。流行病学数据符合欧洲37、38,38和 InveCe.Ab人群的痴呆症趋势,具有同质的遗传和环境特征,是研究从正常衰老到神经认知障碍的轨迹的一个很好的模型。事实上,同质种群需要较少的受试者才能达到足够的统计能力。InveCe.Ab 方法已经在其他地方报告过 36,但重要的是,使用同一组评估(包括:血液采样(代谢面板、同型半胱氨酸和维生素,DNA提取到配置文件Apolipo蛋白E(APOE)和其他与认知和衰老有关的遗传多态性,人体测量(体重,身高和腰部),边走边说话测试(双重任务测试),评估生活方式(地中海饮食坚持,身体活动和认知参与水平)和社会因素(社会参与,孤独),神经心理学评估和临床一般检查。将这种纵向数据与死后神经病理学数据进行比较对研究至关重要。因此,我们的团队,特别是米切拉·曼吉里博士设想了上述神经病理学方法。自2014年以来,在第二次随从中,InveCe.Ab参与者被要求捐献他们的大脑,从而诞生了Ab;avegrasso脑库(ABB)。ABB的核心捐赠者是 InveCe.Ab 的参与者,但 ABB 现在向其他志愿者捐赠者开放。他们是来自 ASP Golgi-Redaelli 的患者,那里是几个患有不同神经系统疾病的患者或成人志愿者的家,他们了解 ABB 项目,属于同一地理区域(Abbiategrasso 和环境)。所有捐助者都接受相同的评价协议。
作者提出了一种方法,跟踪正常衰老的个体轨迹和可能的进展到非传染性疾病,并准确地管理,处理和描述从这些捐赠者获得的大脑纵向跟随。此外,我们的目标是与个人会面,让他们参与有关大脑健康情况的定期神经评估、研讨会和教育活动,并提高他们对为研究目的捐赠大脑的认识。
Protocol
根据本机构的人类研究道德委员会和BNE行为准则,ABB按照道德标准39,40开展活动。大脑采集程序在 InveCe.Ab 研究 36 的背景下提交给了帕维亚大学伦理委员会并获得批准。研究程序符合1964年《赫尔辛基宣言》和以下修正案概述的原则。同意书完整且易于理解。加入捐赠计划是个人决定,需要完全的意识。如果某人被认为无权签署同意书,则需要获得法定监护人或近亲 (NOK) 的授权。 表2报告了 大脑捐赠的包含和排除标准。这项研究是意大利老年痴呆症协会的监督下 进行的。
1. 脑捐赠计划的招聘
- 召集那些对大脑捐赠表示有兴趣的受试者及其NOK和/或法定监护人,介绍项目(捐赠计划的范围;大脑清除、保护、使用和分配的过程)、在任何特定时间退出项目的权利、匿名保护以及后续策略。讨论进行其他生物标志物调查和基因测试的可能性。请注意潜在捐赠者或其 NOK 希望了解结果。
- 解释所有经济方面,包括基金会和捐赠者缺乏经济利益(大脑是捐赠和利他主义的)。告知他们,ABB支付遗体运输费用,而家属支付丧葬、丧葬或火葬费用。
- 在接受的情况下,获得同意的同意书,参加捐赠计划。给捐赠者一个单独的数字代码,以保证匿名。记下参与纵向研究的人的身份识别号,并为脑库提供另一个代码,以便轻松分离两个捐赠者子组(纵向研究的参与者或非参与者;见表3)。
- 向捐赠者出示一张证明其捐赠者身份的身份证,并显示电话号码(24/7 可用),通知脑库有关其死亡。
2. 捐助者评价和连续后续行动
注:对于以下提及的考试中,只能给予部分(而不是全部)同意。所有临床评估由同一团队执行,包括一名神经科医生、一名具有神经学专业知识的老年医学家和3名心理学家。如果出现新症状或认知衰退进展,后续活动之间的时间间隔可以缩短。
- 与 InveCe.Ab 研究一样,获得生活方式-社会问卷,包括自主程度(ADL、IADL)、个人习惯、社交和生活方式因素,这些影响心理功能。收集有关遗传、感染、毒性、代谢、自身免疫、心血管、创伤、退行性、肿瘤和神经系统疾病的信息,收集家庭、医学和神经史。收集以前的临床检查并列出药理学治疗。
- 进行广泛的神经运动评估,包括颅神经功能、腹膜、视觉场、肌肉力量和语气、情感、倾向反射、外向和原始反射、脑膜体体体体、姿势、步态、运动、协调、括约功能测试,以及任何焦点或巴宾斯基符号的存在。评估语言、精神状态和行为的任何变化。
- 进行广泛的神经认知评估,包括全球认知和特定认知领域的完整的神经心理学评估:语言和视觉记忆、注意力、精神运动速度、语言、语义记忆、执行功能和视觉空间能力(详见表4)。 考虑抑郁症的存在(CES-D 量表)。
- 获取用于血液化学分析(表5)和DNA、血浆和外周血单核细胞(PBMC)的分离和储存的血液样本。确定 APOE 基因分型 (rs429358 和 rs7412) (在 InveCe.Ab 参与者中已确定更广泛的基因分析;参见 表 6)。注册心电图(心脏改变、心房颤动)和静静状态脑电图进行定量分析(QEEG)。
- 考虑可选的生物标志物测试,包括脑脊液(CSF)TAU、磷-TAU和β-淀粉样体,以及脑成像(MRI检测体内退化、缺血或炎症;FDG-PET检测代谢失败;PIB-PET 检测与阿尔茨海默氏症病理生理学相关的脑淀粉样病)。
- 计划脑供者的后续检查计划。根据不同年龄组(64岁以下:每10岁,65~74岁:每3年,从75岁起:每2年)设置时间间隔。
- 根据 DSM-V 分配临床诊断和/或神经认知诊断。将临床痴呆症分期与临床痴呆评分(CDR)评分分类。在死亡前的最后一个时期更新 CDR。
- 以图形方式准备与纸质数据库类似的数据库。将所有收集的数据插入脑库数据库。计划由另一个职员进行修订,以检查是否有错误。
3. 死亡时间和脑部切除
注:意大利法律规定,阿西斯托勒必须持续超过20分钟才能确认死亡。扁平心电图(ECG)的登记至少为20分钟(姓名为比成像),允许在死亡后24小时内进行尸检(DPR 285/90第8条和1993年12月29日第578号法律)。<24 h 的验尸时间是保持整体组织质量的一个很好的目标。如果验尸时间为>30小时,验尸将被取消(见 表2)。验尸小组由病理学家、神经科医生和/或神经生物学家、护士、解剖室技术员和任何实习学生组成;前两名团队成员也进行神经病理学诊断。在尸体处理和解剖过程中,必须使用适当的衣物(外套、手套、眼镜和发网)。在本节中,我们将介绍实验室中常用的主要工具和设备。读者可以选择可自行决定使用的工具。有关此处使用的材料的详细说明,请参阅 材料表。
- 确保家属选择的葬礼机构将尸体带到ABB设施。执行必须缺席心脏活动进行检查。如果是,请签署死亡证明并开始验尸程序。
- 把尸体运到验尸室在头部最宽部分的水平上测量头骨的周长。从鼻孔到 inion 测量以获得前柱直径 (APD),而从一只耳朵到另一只耳朵的距离会产生横向直径 (TD)。使用公式计算头型指数 (CI:CI = TD/APD x 100)。
- 使用锋利的手术刀,在日冕平面上做一个头皮切口,从一侧的乳腺过程尖端到另一侧,通过顶点。切开头发、皮肤和皮下组织,小心地将头皮的两个褶皱从头骨下面分离出来。执行切口,直到黄色超轨道脂肪变得可见,并反映头皮前。将另一部分拉后拉。
- 使用手术刀和钳子,在两侧对时间肌肉进行一个小样本,将一个放入4%甲醛中,然后冻结另一侧(见第7节)。
- 在正面的 V 形切口后,使用电锯切割头骨。取下头骨盖并切开脑毛。样品的杜拉都固定在4%甲醛和冷冻(见第7节)。
- 通过插入一个20G 3.5 in. 针,通过语料库卡洛苏姆到达第三个心室,获得约10 mL的CSF。评估 CSF 的外观、颜色和浊度并测量 pH 值。然后,制作10个等分,每个约1mL,并储存在-80°C。
- 抬起大脑巧妙地拉扯两个前叶,并削减两个视神经在fundibulum,内部冠状动脉(ICA)和第三,第四,第五和第六颅神经。切开触角,到达后肢,切开椎动脉和下颅神经。插入手术刀尽可能深通过前人巨无霸,以削减最多的梅杜拉部分。此时,轻轻切除整个大脑。
- 用手术刀,刺穿梅克尔洞穴的骨头,从两侧获得加塞里亚帮带。将一个结节修复为4%甲醛并冻结另一个结节(见第7节)。用手术锤和凿子将骨性塞拉图西卡断裂,以去除脑垂体,然后用4%甲醛将其固定。
- 检查头骨和整个大脑的宏观变化和血管变化。用测量带测量大脑的横向和外侧直径。小心检索威利斯的圆圈,并宏观地评估它(图2E)是否存在解剖变异、病变或血管狭窄。
- 从凸度中拿1~2片2~4厘米2的麻风病,在4°C下将它们保存在完全高葡萄糖Dulbecco的改良鹰介质(DMEM)培养基中,含有20%的胎儿牛血清(FBS)、1%的笔/链球菌、1%的谷氨酰胺和1%的非必需氨基酸(如以前发表的,有一些修饰)41。
- 为了获得成纤维细胞培养,将钩端霉素放在10厘米的培养皿上,用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗两次,每次丢弃液体。
- 使用手术刀和移液器尖端,将钩端切成约 2 或 3 mm 的小片,在以前涂有明胶的 6 井板的每个井中播种 3~4 片,并在 0.5% 时用 2 mL 的完整介质填充,并辅以 1% 的安培霉素 B(在生物安全柜中进行加工,以保证培养的无菌性)。
- 将板放入37°C,5%CO2 培养箱至少一周,每3~4天更换一次。当井处于约70%的汇合点时,用无菌1x trypsin对细胞进行试穿。将钩端膜纤维细胞放入T75烧瓶中,用12 mL的完整介质填充。5 天后,在 900 μL 的 FBS 和 100 μL 的二甲基硫化物 (DMSO) 中对它们进行辛酸化和保存。
- 分离和检查大脑,小脑和脑干,并单独加权。脱掉松果腺,用4%甲醛固定。去除嗅觉灯泡和视神经,并固定或冻结每对,独立于侧面。将大脑、小脑和脑干在4°C下保持至少2~4小时,直到准备解剖,以尽量减少组织破坏,减少组织的柔软性。
- 收获后,适当注意和照顾尸体。使用超级粘合胶重新连接骨骼,并使用手术针和不可吸收的缝合线缝合回头皮。
- 温柔地对待尸体,表达对死者的尊敬和感激之情。清洁和剃光脸,洗和擦干头发,因为尸体将被放在一个开放的棺材可见的亲人。
注:尸体的重新组合由技术人员完成。可以在这里暂停协议。
4. ABB解剖协议
注:同一病理学家和/或神经科医生将脑干、小脑和脑膜切在烟罩下。神经生物学家在切片后排列切片。不处理大脑部分的受训者将整个过程与照片上传到数据库,以在随后的组织处理阶段作为指导。
- 使用解剖刀,轴 向 切割脑干,并通过优越的胶合,在左脑中脑水平进行第一次切割,获得两片暴露的亚斯坦蒂格拉(SN)。
- 使其余的切口获得8毫米脑干片,以获得约10个部分。小心包括通过第四心室优越边缘附近的轮状庞的切口,以观察耳塞 (LC) 的位点,并通过低于第四心室低劣顶点正上方的声学石室的切口,以切片,包括迷干(DMNV)的后体马达核。
- 将玫瑰色的所有切片名称为 BS(脑干),后跟阿拉伯数字来标识各部分。最后一个脑干部分后,使用名称 SC(脊髓),后跟数字 1\n。根据去除的脊柱元数,获得大约2~4个SC切片(图2H+I)。
- 标记要固定或要冻结的所有部分,并拍摄照片存档的照片(图 2)。然后,修复并冻结所有切片,如下所述(步骤 4.7 和 4.8)。
- 切 开下垂平面 上的小脑,以分离两个小半球在 vermis 的水平上。执行下垂剖切,从每个半球获得 5 个切片(图 2F+G)。
- 将 vermis 中的所有切片名称为 CBR 或 CBL(分别用于右小脑和左脑),并使用阿拉伯语数字标识部分。将所有要固定或冻结的部分标记为交替,并拍摄存档照片(图 2)。然后,修复并冻结所有切片,如下所述。
- 通过图库卡洛苏姆(图2A+B)分离大脑的两个半球,并在日冕平面上奇异地切分它们。在光学奇亚姆和马木体之间穿过前叶、时间极、前角、前侧切口、美纳特和基底神经核的平面上进行第一次切割。
- 执行第二个切口约1厘米后通过妈妈的身体,并暴露基底神经节,前丘脑,亚三核和杏仁核。继续切片以解剖前区域和后部区域,获取 1 厘米切片,以便每个半球获得 15 到 20 个切片。
- 在平面上设置切片。将它们按照其原始位置在前柱方向放置,从正面到腹杆,部分与上一个切片朝上。
- 通过比较两个半球的部分,从每个半球选择要保留为固定或冻结材料的备用部分。识别要固定和处理的主要部分为基础病理学,包括前叶和时间叶,青光,基底神经,梅纳特核基巴沙利,杏仁核,丘脑,海马和腹皮质,腹角层陀螺,腹水叶和腹叶。
- 将所有具有前向意义的切片命名为 L(左)或 R(右),后跟为阿拉伯数字,并放置一个标签,指示切片是固定的还是冻结的(图 2A+D)。要识别这些部分,请为照片存档拍照。然后,修复并冻结所有切片,如第 7 节和 8 节所述。
5. 大脑和血管检查和宏观病理评估(肉眼)
- 进行一般宏观检查,考虑脑膜改变,弥漫或局部皮质萎缩,海马萎缩,心室扩大,小脑萎缩,脑干萎缩,亚斯坦蒂格,白质改变(指定类型和位置)。
- 检查威利斯的圆圈考虑动脉硬化和闭塞。分配分数 = 1 在动脉瘤的情况下,没有狭窄超过 50%,得分 = 2 如果至少一条动脉是 50% 或更多遮挡,得分 = 3 如果两个或两个以上的动脉是 50% 或更多遮挡42。评估其他颅内血管中是否存在病理学。
- 要检测脑膜血管病变,检查脑半球、小脑和脑干。考虑裂变病变(直径< 10 mm)、缺血或出血梗塞和出血(直径 > 10 mm)。如果存在,请指定大小(以毫米、数量和位置为单位)。此外,考虑存在或不存在亚布拉奇内出血。
6. 组织质量控制
注:高因子分(AFS)范围为0和2,在组织质量评估中非常重要。要确定AFS,请考虑死亡时(特别是决定脑酸中毒的病症)和前状态(突然死亡或长期痛苦)的持续时间。如果AFS > 1,脑组织可能不是最佳质量43。还要考虑大脑和CSFpH;如果pH< 6,脑组织可能不是最佳质量43,44。43,
- 验证死亡是否由可损伤脑组织(包括缺氧、长期酸中毒、机械通气、多器官衰竭、高烧、严重颅外伤、神经毒性物质摄入、严重脱水、严重低血糖、癫痫状态和长期昏迷)等情况引起。如果存在这些条件之一,则分配 1 点。
- 验证前状态的持续时间(如果死亡发生在 1 小时内,则快速;如果死亡发生在 1 到 24 小时之间,则快速死亡;如果前状态持续超过 1 天,则速度慢)。 slow如果发生中间死亡或缓慢死亡,请分配 1 点。
- 计算 AFS 分数,通过电极 pH 针和组织 pH 值测量 CSF pH 值,通过每个叶和小脑部分脑片上的表面 pH 计测量 CSF pH 值。
7. 组织冻结
- 将所有组织在4°C下冻结在冰中。 然后,迅速冻结它们。将它们放在预冻结的铝托盘上。盖上联锁铝板,以保持其平整。在-120°C下放入液氮中3分钟。
- 将切片放在标有相应标识代码和切片编号的塑料袋内。将塑料袋分成三个低温盒(用于右半球、左半球和脑干),储存在-80°C。
8. 组织固定
- 将切片一个一个包裹在纱布中,将切片放入10%磷酸盐缓冲形式溶液中。1 天后,用新的解决方案替代正式解决方案。在4°C的冷室里,让他们在冷室里大约5天。
- 将所有切片作为一个整体,只将含有海马和杏仁核的切片分成两部分(图3)。两个切片的上部将包含前叶(图3中的R10a=L9a );下部部分将分别包含:(1)杏仁核、叶和基底节(图3B中的L9b)和(2)海马和部分叶(图3A中的R10b)。 Figure 3这是为了保持各种结构之间的关系。
- 将所有部分放入磷酸盐缓冲液中至少 2 天,以洗净并去除交叉链接产品。
注意: 协议可以在这里暂停。
9. 脱水、清除、石蜡嵌入和幻灯片准备
- 准备将乙醇浓度从70%提高至100%,二甲苯和两组熔融石蜡。将大脑部分放在自动处理器中,用于脱水、清除程序和石蜡渗透(使用两种不同的组织处理方案进行宏(脑和小脑切片)和微样本(脑干片和其他小样本); 表7。将组织嵌入金属或塑料模具上的石蜡中。
- 选择要切片的各部分,用于评估应用蒙丁神经病理学特征45 指数的所有感兴趣区域(表 8)。然后,对所选部分进行切片。
- 使用雪橇微切用于大截,使用旋转微切件用于小截面。切5 μm片用于海霉素和Eosin(H&E)染色,8μm切片用于其他染色和免疫基础化学。将切片放在三种不同类型的组织学幻灯片上:8.5 厘米 x 11 厘米用于最大切片,5 厘米 x 7.5 厘米用于中等切片,经典 2.5 厘米 x 7.5 厘米用于最小切片。
注意:可以在这里暂停协议。
10. 去皮化、组织学染色和免疫组织化学
- 执行去帕非化,使水性染料溶液发生反应。使用二甲苯和降低酒精浓度(每步5分钟)执行。用蒸馏水补充5分钟。
- 使用以下组织学染色来评估建筑和结构组织异常和细胞形态:H&E(用于血管显微病变和炎症)、克西勒紫罗兰(NISSL;用于神经元损失)、Luxol快速蓝(LFB;脱叶),Gallyas(用于神经斑块和神经皮线)。
- 使用免疫组织化学 (IHC) 来突出特定目标结构的存在。抗新微和抗G非用于识别神经元和胶质室;4G8、AT8、+-SYN和TDP-43用于识别聚合在神经退行性疾病中的蛋白质(材料表)。
- 用 3% H 2O 2预处理露轴部分 10 分钟,然后在 PBS 中冲洗。使用柠檬酸盐缓冲液 0.01 M pH 6(连续微波 2、1 和 2 分钟)对 4G8、+-SYN、TDP-43 和 NeuN 抗原进行检索处理;4G8 和 + - SYN 使用 70% 的甲酸。在5%的正常山羊血清中预孵化30分钟。
- 在4°C下用原抗体孵育过夜。后天,在二次抗体(Envision® 系统-HRP 标记聚合物)孵育前,在 PBS 中稀释 1:2,在室温下冲洗 1 小时。在 PBS 中,在 PBS 中冲洗部分。
- 在PBS中洗涤多次,用二甲苯胺(液体DAB+基底铬质系统)在铬原系统中孵育,观察显微镜下的反应发展(放大4~10倍)。最后洗涤 PBS 中的部分。使用 DPX 安装对血氧素、脱水和盖玻片中的部分进行反污。
注 :表8 总结了标准协议。在所有部分上执行 H&E 染色,而特殊/特异性污渍和反应用于选定部分。选定的病例需要额外的区域或反应。 材料表 显示用于 IHC 的抗体的详细信息。
11. 基本神经病理学特征
注:非特异性脑组织改变、血管病理学、阿尔茨海默病(AD)病理学、非AD TAUopath、突触、TAR DNA结合蛋白(TDP-43)病理学和海马病变。连接到相机的光学显微镜用于检测腹腔显微病变。组织学评估由同一训练有素的神经病理学人员团队进行,其中包括一名神经学教授、一名神经学家和一名病理学家。它基于修改的蒙廷方法45 (表 8) 还包括: (1) 异质非AD TAUopath构成与 TAU 矿床相关的前时态叶变性 (FTLD) 的病理标志: Pick 的疾病, 非流利的原发性失语症(TAU-nfPPA),进步超核麻痹(PSP)46,47和皮质-基础退化(CBD)48。4846,47此外,非AD TAU病变包括与衰老和没有明确临床意义的条件,如初级年龄相关TAU病变(PART)49,年龄相关的TAU天体-Glipath(ARTAG)50,嗜血谷物病48。50(2)与帕金森病 (PD)和 Lewy 身体痴呆症 (LBD) 相关的 Lewy 型三核素病 (LTS)。要搜索 LTS,请应用以下等级步骤:首先,嗅球、脑干、杏仁核/时间皮层;如果前面的区域是积极的,添加边缘结构(海马形成,腹皮层,前腹体),中前陀螺,下层腹皮和腹皮层45。如果皮质 LBD 的临床特征存在(即波动和/或幻觉),则考虑第一步的边缘结构和异皮质。(3) TDP-43矿床,与TDP-43矿床相关的FTLD病理特征:前时性痴呆症(bvFTD)、语义性痴呆(SD或svFTD)、TDP-nfPPA和FTD-运动神经元疾病(FTD-MND)的行为变异。TDP-43的 IHC 在以下部分执行:杏仁核、海马、内皮层和中前体陀螺;在怀疑有临床FTLD的情况下,考虑检查其他第51条。
- 使用 H&E、NISSL、LFB 和 IHC 评估特定部分的非特异性脑组织改变,用于 GFAP 和 NeuN。考虑神经元罕见,气球神经元,海绵状病,胶质病,脑膜丧失,是否存在炎症或肿瘤渗透。指定这些更改的流行位置。
- 要检测 微小的血管病变,检查H&E和LFB幻灯片,包括至少两个半球大截面(第一次通过带前叶和叶的乳腺体(查科特切口),带前叶和叶, 基础神经节,前丘脑,杏仁核,和第二个通过腹叶),海马形成的"基因"部分,一个小脑部分,和脑干的所有三个主要部分(通过基斯坦蒂格拉,心库和DDMNV)。
- 检测小血管疾病,包括动脉硬化、脂质核硬化、血管外空间分裂、白质损失、钩端膜和/或乳酸和/或毛细管脑淀粉样动物性病变。指定分级 (0+3) 和流行位置42,52。考虑是否存在血红素泄漏、微漂白和微梗塞。
- 使用等级德拉姆考特方案(血管壁改变-小血管疾病-宏观梗塞)评估血管损伤对认知障碍的贡献。对于这个评估考虑正面和时间叶部分,基底节和海马(得分0~20)30。此外,估计脑血管疾病导致认知障碍的概率使用VCING评分(低中高),通过考虑半球宏观梗塞和小血管疾病的腹腔叶,包括中度至重度动脉硬化和淀粉样血管病53。
- 使用 IHC (4G8) 评估淀粉样体传播的 AD 病理学。定义 Thal 的阶段 (1+5)54, 聚合淀粉样 色评分 (0+3)45,以及每个站点的形态(扩散、焦点、核心)。
- 使用 IHC (AT8) 评估 AD Tau 病理学,并描述每个站点的流行形态(神经纤维缠绕、神经皮线、神经斑块)。定义 布拉克的阶段 (I[VI]; 正标志表示存在额外的区域,高磷陶病理学不遵循布拉克的层次结构)55 和聚合评分 (0+3)45。
- 使用加利亚斯染色和CERAD评分(0~3)56评估神经斑块。56然后,使用 A 骨髓-B raak-CERAD分数(ABC分数B0~3):非中低高45,定义与 AD 临床综合征对应的神经病理特征的概率。
- 使用 AT8 IHC 注意到是否存在非AD TAU 病理学,指定流行位置和奇特的形态图。考虑神经元内含物,如火焰形状或球状纠结,球状球状内含物(即皮克的身体)57, 神经皮线, 营养不良的中性, 嗜血谷物;和胶质内含物,如刺状星形细胞,刺状星形细胞,星形斑块,盘绕体,球状内含物58,59。58,
- 使用 +-syn IHC 检测上述注释中的区域上的 LTS(Lewy 身体、苍白的身体和 Lewy 中性)。在积极的情况下,应用麦基思的评分(0~4)来评估病变的严重程度60;然后,使用海滩的阶段(I+IV)进行地形分布(嗅球、脑干为主、边缘主导、新皮质)61。比较海滩和布拉克的阶段,以定义LBD和,AD病理学60,61,62,61之间的关系。
- 考虑存在或不存在胶质细胞质内含物(GCI;非Lewy型胶质性胶质性细胞核素病),这是多系统萎缩(MSA)的病理特征,并指定其流行位置63。
- 使用 TDP-43 IHC 检测上述说明中区域的 TDP-43沉积物。确定每个站点的流行形态:神经元细胞质内含物 (NIs)、绝营养新核素内含物 (NNs)、核内含物 (NI)。定义模式:A(主要 NFI 和 DN:bvFTD 和 nfPPA);B(主要国家信息中心:FTD-MND);C (主要长DN:svPPA和bvFTD)51,64。使用纳尔逊的计划来定义TDP-43在AD案例65,66,的存在。
- 从 亚分区和 索默扇区 (CA1) 开始评估海马。使用Rauramaa的分数(0~4):1~2分别用于微梗塞和宏法克;3~4分别对应于中度和重度神经元损失和海马萎缩(海马性硬化症:HS)。指出存在或不存在病理蛋白沉积(以频率递减顺序:pTAU,TDP-43,+-syn)67。
- 定义神经病理学诊断并在数据库中输入所有病理数据。
注:储存捐赠者的生物材料和合理数据的房间始终是上锁的,只有经过授权的人员才能进入,以保证安全和隐私。冷冻生物材料储存在-80°C的上锁冷冻机中,而形式固定石蜡嵌入组织在室温下储存在上锁的壁橱中。使用双电机冰柜,还有一个备份冰柜。此外,为了确保冰柜始终工作,他们提供了一个24/7监控系统,可以触发警报。如果发生电源故障,也存在紧急发电机。参与者匿名化,并采用数字代码,以确保其隐私;未获授权人员不可能回到捐助者的身份及其明智的数据。所有信息均在受密码保护的数据库中收集;同样,这些数据的硬拷贝保存在锁定的档案中。
Representative Results
脑癌和大脑采集数据
2014年,在第二次 InveCe.Ab 后续行动期间开始招募捐助者,涉及 1061 个合格科目中的 1010 个(答复率:93%; 图1)。与 InveCe.Ab 纵向研究有关,1010 名参与者中的 290 人(28.7%)同意登记为捐赠者(160人已经登记,130人表示打算登记)。捐助者的教育水平高于非捐助者(66%的捐助者具有中等程度的教育水平:8年或8年以上的学校),这表明文化和教育的重要性。许多"健康"的人也对大脑捐赠计划表现出兴趣。我们的大多数"控制"承认,他们可以同情患病者及其亲属,并想以某种方式为研究做出贡献,从而更好地了解神经系统疾病。在生命中经常从事献血或骨髓捐献计划无私的人,对脑捐的想法更加开放,那些已经同意死后捐献器官的人也更加开放。他们知道,即使没有活的接受者,他们的捐赠对研究也非常重要。造成大脑捐赠的另一个因素是倾向于火化。目前,ABB的捐赠者包括427人(290名 InveCe.Ab 参与者 – 137 名志愿者或来自 ASP Golgi-Redaelli 老年病医院的患者),其中 75% 是 70 岁或以上的人。女性明显占优势(64%)和精神完好无损的老人(约85%)。到目前为止,在40名死亡捐赠者中,已经采集了27个大脑(67%的尸检率);13名受试者因各种原因未得到验尸,包括未向ABB报告死亡、严重伤害导致脑损伤、危险传染病和1例CJD病例;4名受试者已撤销其同意。到目前为止,在采集的27个大脑中,有24个经过了完整的神经病理特征,并进行了明确的临床病理诊断,而其余3个大脑仍在检查中(表3)。ABB的其他大脑采集数据包括:平均死亡年龄(81岁);平均验尸间隔(10.37小时);平均 CSF pH 值 (6.64);平均组织pH值(6.07);平均脑重(1012.86 gr);AFS 是 90% 的死者中的 1。
神经生理生物标志物(QEEG)
QEEG 是多维方法的一部分。这是一种简单明了、非侵入性且价格低廉的方法,有可能检测从轻度神经认知障碍(轻度-NCD或 MCI)到主要神经认知障碍(主要-NCD或痴呆症)的转化。通过我们的多维方法,进行了简单的QEEG检查,并测试了其作为痴呆症生物标志物的可能作用。我们关于36名脑体捐献者(18名正常老年人(NOLD)、11名轻度非传染性疾病和7名主要非传染性疾病患者;其中9名具有明确神经病理学诊断)的初步数据表明,与轻度非传染性疾病(p:0,002)和NOLD(第0,033个),主要非传染性疾病中平均α节律百分比明显较低。相反,在主要 NCD 中,较慢的 EEG 频率(theta/delta)明显高于 NOLD/轻度非传染性疾病(参见图 4中的示例案例)。在我们的系列中,EEG节律分布可以区分NOLD/轻度-NCD受试者与主要NDC患者,无论病因诊断如何,这表明大脑节律受退行性病变负担的影响,无论病变类型如何。事实上,9个被检查的大脑中,有7个因混合病理而出现痴呆症。病理学性质的特异性似乎很低,脑电节律似乎受病变负担和地形的影响大于其分子性质的影响(Poloni等人,公元2019年,里斯本,数据未发表)。
标志案例
ABB 协议在某些情况下和条件下可能有用且必要。例如,存在不对称病理学(图5)。我们的协议非常适合识别和正确描述这种类型的病理学。到目前为止,我们已经检查了4个大脑的不对称参与,其中一些如图5所示。宏观上,右侧萎缩(图5A)存在于右侧日冕部分严重心室分裂(图5C)与左侧(图5B)的一种情况下。另一个案例显示右半球的梗塞(图5D),另一个案例显示右千米体明显萎缩(图5E)。Figure 5在微观层面上,FTLD的一个案例显示了一个不对称的TDP-43正向,与左侧相比,右正面的正向更强烈(图5F,G)。
宏观剖切(图6A,C)用于获取整体视图。LFB染色有助于识别4G8和 AT8的脑林损失(图6D)和 IHC(图6B),用肉眼评估半球免疫反应的分布。在ABB系列中,相关个人的大脑是可以比较的。
在图7中,同源双胞胎大脑中各部分的微观图像并排放置,以便于比较(双胞胎1(BB137):图7A、C、E、G、I、K与双胞胎2(BB138:图Figure 77B、D、F、H、J、L)。 Figure 7与之前的类似研究68一样,通过临床和神经病理学评估对两对双胞胎进行了比较。这对双胞胎报告了由于多种病因而对主要非传染性疾病相同的诊断,但他们分别于83岁(72岁患痴呆症)和85岁(76岁痴呆症发作)相隔两年死亡。他们的大脑有非常相似的神经病理学图,高AD病理学与淀粉样动物性血管病有关。4G8免疫反应性扩散到整个皮层(图7A,B)和基底带(图7C,D),具有扩散、致密和核心斑块。在皮层和小脑的皮质和钩端膜血管中也明显检测到(图Figure 77A,B,G+J)。在较高的放大倍率下,capCAA 是显而易见的(图 7G,H)。AT8免疫正向斑块、纠结和线在两个大脑的皮质中弥漫(图7E,F,L)。关于淀粉样蛋白和NFT病理负担,双胞胎1被认为是塔尔阶段3(蒙丁A2)和布拉克阶段5(蒙丁B3),而双胞胎2被认为是塔尔阶段5(蒙太恩A3)和布拉克阶段6(蒙丁B3)。他们有着相同的教育和相似的生活方式;然而,一个(BB137)结婚不久就成为寡妇,而另一个是单身(BB138)。他们表现出不同程度的临床病理变异性,具有相同的开始和相同的病过程,但在不同的时间框架。这证实了一个事实,即虽然遗传成分在疾病的发展中起着关键作用,但表观遗传和环境成分在确定略有不同的表现方面至关重要。
在某些情况下,临床图与神经病理学特征不相符。在图8中,两个不同的病例被临床定义为AD病例;神经病理学分析表明,除了中间的AD病理学,+-syn的扩散积极。在第一种情况下,一个严重的LTS(海滩IV)图片显示Lewy身体均匀地发现整个陀螺cingoli(图Figure 88A)和SN作为细胞质内含物包围神经梅兰宁(图8B,C)。在第二种情况下,与Lewy神经相关的Lewy身体在杏仁核(图8D,E)和美纳特的核(图8F,G)中扩散分布,建议进行边缘LTS诊断。事实上,病变的地形,而不是其分子性质产生临床表现。
图1:Inve.Ce.Ab 研究的流程图。在基线上,痴呆症的总患病率为3%。在随组随到过程中,患病率为:4.4%(第1名rd)69,7.1%(第2),10.9%(第3位)。69nd八年发病率为15p/1000/年(95%CI:13-18 p/1000/年)。2014年(在第二次后续行动期间)开始征聘捐助者。请单击此处查看此图的较大版本。
图2:脑(A)、小脑(F)和脑干(H)的解剖方案。 威利斯和单半球的圆圈显示在 (E) 和 ( B )中。右侧 ( C ) 和左侧 (D) 的冠状切口编号,或者固定 ("F") 和冻结 ("C")。显示下垂小脑部分 (G) 和脑干轴向部分 (I) . 请单击此处查看此图的较大版本。
图3:显示固定右(A)和左(B)前叶的冠状切片。
河马和叶(A,R10b)从右片的前叶(A,R10a)分割。在对面的切片上,杏仁核和基底节节(B,L9b)从前叶(B,L9a)分割。比例线: 1.7 厘米。请点击这里查看这个数字的较大版本。
图4:NOLD和主要NCD主体的相对光谱功率分布。请单击此处查看此图的较大版本。
图5:不对称病理的代表性图像。(A) 第一个案例:右萎缩的大脑。冠状切片 (B) 和 (C) 显示右侧心室扩张,在第 10~12 节(C,箭头)中尤为明显。在 (B) 节和 (C) 中,"F"代表固定,"C"代表冻结(意大利语 :congelato)。(D) 第二例:右半球的严重梗塞。(E) 第三例:右妈妈身体的萎缩(箭头)。(F, G)第四例:微观图像显示,与前额痴呆症的左皮层(G)相比,右前皮层(G)的TDP-43免疫反应更强烈。比例线:183 μm(F,G)。 请单击此处查看此图的较大版本。
图 6:宏部分。(A , C)固定前叶(A)和新鲜面叶(C)的冠状切片。(B) 组织学前时节免疫标记与 AT8 抗体.免疫反应性明显分布在皮层,但在叶层中更为强烈。(D) 与LFB染的组织学部分。箭头表示白色物质的去叶化区域。比例线:1.55 厘米(B,D)。 请单击此处查看此图的较大版本。
图7:双胞胎。两个同源双胞胎的大脑比较:BB137(A、C、E、G、I、K)和BB138(B、D、F、H、J、L)。神经病理学的图片非常相似。(A) 和 (B) 显示弥漫 4G8 正向在腹膜叶与淀粉样斑块, 钩端素 (箭头) 和帕伦奇马尔 (箭头) 血管.毛细管淀粉样血管病变(星号)在较高的放大倍率(G)和(H)下被很好地识别。4G8分布于整个基底神经群(C,D)和小脑的钩端膜血管周围(I,J:箭头)。 JAT8免疫反应性识别皮层(E、F)中的纠结、螺纹和斑块(箭头)。加利亚斯染色 (K) 与 AT8 抗体 (L) 一样,揭示了神经斑块.比例线:470 μm(A+F;I=J);90 μm (G+H;K=L)。请单击此处查看此图的较大版本。
图8:临床与神经病理学诊断。在这个数字中,报告了两个不同的病例,其中神经病理学诊断不同于临床诊断。α-syn 的免疫反应是一个意想不到的结果。(A+C)第一个案例:陀螺丝青体 (A) 在 SN (B 箭头) 中显示 Lewy 实体的均匀分布。在SN的神经元中,显示由神经美兰宁包围的双Lewy身体(C)。(D=G)第二种情况下:在杏仁核(D、E)和美因特核(F、G)中可检测到α-syn的扩散正向。细胞体和Lewy中性(星号)标记良好。比例线:154 μm(A、D、F);37 μm (B, E, G);20 μm (C)。 请单击此处查看此图的较大版本。
图9:转移协议模板。请单击此处查看此图的较大版本。
n | % | ||
性别 | 男性 | 607 | 45.9 |
女性 | 714 | 54.1 | |
出生队列 | 1935 | 236 | 17.8 |
1936 | 219 | 16.6 | |
1937 | 264 | 20.0 | |
1938 | 305 | 23.1 | |
1939 | 297 | 22.5 | |
婚姻状况 | 结婚 | 872 | 66.1 |
同居 | 13 | 1.0 | |
分居/离婚 | 29 | 2.2 | |
丧偶 | 325 | 24.6 | |
单 | 80 | 6.1 | |
初级生活职业 | 蓝领工人 | 666 | 50.6 |
白领工人 | 459 | 34.9 | |
家庭 主妇 | 191 | 14.5 | |
教育年 | ±5 年 | 754 | 57.2 |
>5 年 | 565 | 42.8 |
表1:InveCe.Ab研究参与者的社会人口特征。
包含标准 | 排除标准 |
所有18岁及以上人士 | 公然拒绝捐赠的人 |
居住在阿比亚特格拉索境内的人 | 居住在伦巴第地区以外的人 |
自愿自愿自己同意 | 潜在捐赠者与 NOK 在脑捐赠方面的愿望差异 |
在 NOK 的许可下无法决定的主题 | 极大地破坏大脑一致性的情况 |
自然原因造成的死亡 | <2年的 临床过程 ,除非排除普里昂 病的可能性 |
因杀人或自杀而死亡,需要验尸官报告 | |
验尸间隔 >30 小时 |
表2:脑力捐赠标准。
N+ | 性 | 代码 Bb | 代码 Invece | 年龄 | 教育 (年) | 临床诊断 | Cdr | Afs | 下午(小时) | pH 组织 | pH 酒 | 神经病理学诊断 | ||||
1 | F | BB 37 | 87 | 5 | 由于AD(BPSD)导致的主要非传染性疾病 | 5 | 2 | 29 | nd | nd | 高AD病理学,中度SVD,TDP43+,ctx LTS,HS | |||||
2 | F | BB 105 | 94 | 5 | 由于 AD 导致的主要 NCD | 5 | 1 | 5 | 5.72 | 6.78 | 高AD病理学,轻度SVD,HS | |||||
3 | F | BB 137 | 83 | 3 | 由于多种病因(AD-VaD)导致的主要非传染性疾病 | 5 | 1 | 16 | nd | nd | 高AD病理学,中度SVD,腹皮梗塞,CAA-capCAA | |||||
4 | M | BB 181 | 71 | 13 | 由于AD(BPSD)导致的主要非传染性疾病 | 5 | 2 | 3 | nd | nd | 重度 LTS(海滩 IV),中间AD病理学,轻度SVD,mCAA | |||||
5 | M | BB 115 | I 636 | 78 | 18 | 由于 AD 导致的主要 NCD | 5 | 1 | 6 | nd | nd | 中级广告, 中度 SVD, 炎症, ILBD (海滩 IIa), HS | ||||
6 | F | BB 23 | I 65 | 79 | 3 | 血管疾病引起的主要非传染性疾病 | 5 | 1 | 14 | nd | nd | 严重和广泛的CAA,中间AD病理学 | ||||
7 | M | BB 102 | I 412 | 79 | 8 | 血管疾病引起的主要非传染性疾病 | 3 | 1 | 8 | nd | nd | 血管性痴呆,ILBD | ||||
8 | M | BB 224 | I 16 | 80 | 3 | 由于多种病因导致的主要非传染性疾病 | 5 | 1 | 11 | nd | 5.99 | 中度 SVD, 低广告病理学, ILBD (海滩 IIa), HS | ||||
9 | F | BB 47 | 78 | 5 | 多种病因的主要 NCD(LBD-VaD BPSD) | 5 | 0 | 8 | nd | nd | 高广告病理学, BG TAU 病理学, ARTAG, 轻度 SVD, HS | |||||
10 | F | BB 153 | I 965 | 79 | 5 | 轻度-NCD(因结肠癌死亡,广泛转移) | 0.5 | 1 | 8 | nd | 6.73 | 低AD病理学,中度BG-SVD | ||||
11 | M | BB 118 | I 1211 | 79 | 13 | NOLD(肝癌死亡) | 0 | 2 | 3 | nd | 6.51 | 中等 SVD | ||||
12 | M | BB 236 | I 521 | 80 | 3 | 由于AD(BPSD)导致的主要非传染性疾病 | 4 | 1 | 15 | nd | 6.15 | 高AD病理学,严重BG-SVD(几种微漂白),HS | ||||
13 | F | BB 138 | 85 | 3 | 由于多种病因(AD-VaD BPSD)导致的主要非传染性疾病 | 4 | 0 | 15 | nd | 6.75 | 高AD病理学,中度SVD,CAA,边缘TDP43 | |||||
14 | M | BB 109 | I 876 | 79 | 8 | NOLD (因脑肿瘤死亡 - GBL) | 0 | 1 | 16 | nd | 6.4 | 低广告病理学, ILBD (海滩 IIa), 轻度 SVD | ||||
15 | F | BB 271 | 84 | 8 | 由于AD(BPSD)导致的主要非传染性疾病 | 4 | 1 | 2 | nd | 6.7 | 中级广告, 边缘 LTS, 中度 BG-SVD, mCAA, TDP | |||||
16 | F | BB 71 | I 1080 | 79 | 8 | NOLD(因心力衰竭死亡) | 0 | 0 | 6 | nd | 6.26 | 中度 BG - svd, ILBD, amy Tdp, 低广告 | ||||
17 | F | BB 189 | I 858 | 80 | 5 | 由于AD(BPSD)导致的主要非传染性疾病 | 3 | 0 | 20 | nd | 6.42 | 中级广告, CAA-capCAA, TDP43, 中度BG-SVD, HS | ||||
18 | F | BB 278 | I 924 | 80 | 5 | LbD (BPSD) 导致的主要 NCD | 3 | 1 | 5 | 6.02 | 7.05 | 中级广告, 边缘 LTS (海滩 IV), 边缘 TDP, HS | ||||
19 | F | BB 247 | 104 | 8 | 由于多种病因(可能混合病理学)导致的主要非传染性疾病 | 3 | 0 | 6 | 6.48 | 7.22 | TAU 病理学 (部分 - ARTAG), HS | |||||
20 | M | BB 85 | I 19 | 83 | 10 | LbD (BPSD) 导致的主要 NCD | 3 | 1 | 9 | 6.26 | 7.3 | 重肢 LTS, 中间 AD, 中度 SVD, 重 CAA-capCAA, HS | ||||
21 | F | BB 14 | I 222 | 82 | 8 | 由于多种病因(AD-VaD)导致的主要非传染性疾病 | 2 | 1 | 11 | 5.59 | 6.4 | 中级AD病理学,中度SVD | ||||
22 | F | BB 282 | 76 | 8 | 主要前部 NCD (nfPPA BPSD) | 3 | 1 | 10 | 6.07 | 6.39 | TDP(A型),ILBD,中度SVD,低广告,HS | |||||
23 | F | BB 154 | I 1079 | 80 | 5 | NOLD(癌症死亡,广泛转移) | 0 | 1 | 5 | 6.49 | 6.9 | 中度SVD,CAA,低AD,边缘脑炎 | ||||
24 | F | BB 290 | 65 | 13 | 主要前空 NCD (bvFTD BPSD) | 5 | 1 | 12 | 5.73 | 6.42 | TDP(A 型) | |||||
25 | F | BB 210 | 89 | 8 | 由于AD(BPSD)导致的主要非传染性疾病 | 5 | 1 | 15 | 5.94 | 6.4 | 正在进行中 | |||||
26 | M | BB 293 | 75 | 18 | 主要前部非传染性疾病(bvFTD BPSD) | 5 | 1 | 8 | 6.14 | 6.83 | 正在进行中 | |||||
27 | F | BB 99 | I 1370 | 79 | 9 | NOLD(因化粪池休克死亡) | 0 | 2 | 14 | 6.3 | 7.12 | 正在进行中 | ||||
M/F | 意味 着 | 意味 着 | 意味 着 | 意味 着 | 意味 着 | 意味 着 | 意味 着 | |||||||||
0.5 | 81 | 7.7 | 3.2 | 1.0 | 10.4 | 6.1 | 6.6 |
表3:ABB系列的临床/神经病理学诊断。 BB:脑库;教育(年):教育年;CDR:临床痴呆评分(0 = 无痴呆症;0.5 = 轻度认知障碍;1 = 轻度痴呆症;2 = 中度痴呆症;3 = 严重痴呆症;4 = 非常严重的痴呆症;5 = 末期痴呆症);AFS:法纳因子得分;下午(小时):验尸后小时数;和: 未完成;M/F:男性/女性;BPSD:痴呆症的行为和心理症状;VaD:血管性痴呆;NOLD:正常老年人;GBL:胶质母细胞瘤;nfPPA: 非流利的初级渐进性失语症;bvFTD:前空性痴呆症的行为变异;SVD:小船病;LTS: Lewy 型三核素病;HS:河马硬化;CAA:脑淀粉样性血管病;CAPCAA:毛细管CAA;mCAA: 梅宁角CAA;ILBD: 偶然的Lewy身体疾病;BG: 巴萨尔·甘利亚;ARTAG:与年龄相关的TAU天体-格利病;部分:原发年龄相关TAU病变;艾米: 阿米加拉。
域 | 测试名称 |
抑郁症 | 流行病学研究中心抑郁症量表(CES-D) [2] |
全球认知 | 迷你精神状态考试 [1] |
口头和视觉记忆 | 免费和可爱的选择性提醒测试 [3] |
科西测试 [4] | |
雷-奥斯特里思复杂图 (ROCF) 召回 [5] | |
注意/精神运动速度 | 跟踪制作 A [6] |
注意矩阵 [4] | |
语言语义记忆 | 语义语言流利(颜色,动物,水果,城市) [4] |
执行职能 | 踪迹制作 B [6] |
雷文的彩色矩阵 [7] | |
视觉空间能力 | 时钟绘图测试 (CDT) [8] |
雷-奥斯特里思复杂图 (ROCF) 副本 [5] |
表4:脑供者的神经心理评估。
代谢 产物 |
完整的血液计数 |
胆固醇高密度脂蛋白和低密度脂蛋白 |
甘油 三 酯 |
葡萄糖 |
糖化血红蛋白 (HbA1c) |
同 型 半 胱氨酸 |
钴胺(维生素B12) |
叶酸 |
白 蛋白 |
尿素 |
肌 酐 |
转氨酶(ALT 和 AST) |
伽玛谷氨酰转移酶 |
甲状腺刺激激素 (TSH) |
维生素D(25-羟基维生素D) |
C-反应蛋白(CRP) |
电解 质 |
表5:脑供者代谢小组。
基因名称 | dbsnp |
阿波利波蛋白E (APOE) | rs429358 |
rs7412 | |
加泰罗尼亚酶 (CAT) | rs1001179 |
超氧化物不变性酶 2 (SOD2) | rs4880 |
血管紧张素(AGT) | rs699 |
西尔图因 2 (SIRT2) | rs10410544 |
外线粒体膜的外侧膜 40 (TOMM40) | rs2075650 |
桥接集成器 1 (BIN1) | rs7561528 |
儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT) | rs4680 |
甲基四氢酚酸还原酶(MTHFR) | rs1801133 |
rs1801131 | |
脑衍生神经营养因子(BDNF) | rs6265 |
溶质托架系列 6,成员 4(SLC6A4 或 5HTT) | 羟基三聚胺运输机基因链接多态性区域(5-HTTLPR) |
rs25531 |
表6:为 InveCe.ab 脑供者分析的 SNPs。
过程 | 解决 方案 | 时间 | |
宏样本 | 微样本 | ||
固定 | 10% 缓冲形式 | 4 °C下8天 | 4 °C下8天 |
洗 | 磷酸盐缓冲液 | 室温下2-15天 | 室温下2-15天 |
洗 | H2O 洗涤 | 2-3小时,自来水 | 2-3小时,自来水 |
脱水 | 乙酰酒精 70% | 24 小时 | 8 小时 |
脱水 | 乙酰酒精 80% | 24 小时 | 4 小时 |
脱水 | 乙酰酒精 90% | 60 小时(通常在周末) | 4 小时 |
脱水 | 乙酰酒精 95% | 12 小时 | 4 小时 |
脱水 | 乙酰酒精 95% | 12 小时 | 4 小时 |
脱水 | 乙酰酒精 100% | 6 小时 | 4 小时 |
脱水 | 乙酰酒精 100% | 6 小时 | 4 小时 |
结算 | 西琳一 | 12 小时 | 10 小时 |
结算 | 西琳二世 | 12 小时 | 10 小时 |
渗透 | 帕拉菲尼 I | 12 小时 | 11 小时 |
渗透 | 石蜡II | 12 小时 | 11 小时 |
嵌入 | 石蜡 |
表7:ABB组织处理协议。
地区 | 健康 | 克雷西尔紫罗兰 | Lfb | 加利亚斯 | 4G8 | AT8 | +-SYN | TDP-43 | 纽恩 | Gfap |
脑干 | ||||||||||
瓦格斯的梅杜拉- 多萨尔电机核 | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | |||||||
庞斯 - 洛库斯库鲁勒斯 | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | |||||||
中脑 - 乌兹别克斯坦尼格拉 | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | ||||||
小脑 | ||||||||||
小脑皮层和电核 | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | ||||||
大脑 | ||||||||||
中正面陀螺 | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | |||
巴萨尔 · 甘利亚 – 梅纳特的核心 | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | ||||
Cingulate, 前 | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | |||
杏仁 核 | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | ||||
塔拉穆斯和亚塔拉米奇核 | Ⅹ | Ⅹ | ||||||||
高级和中间时间陀螺仪 | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | |
希马坎图斯和恩托希纳尔皮层 | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ |
劣质帕里塔尔球 | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | |||
腹皮层 | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | Ⅹ | |||||
嗅觉灯泡 | Ⅹ | Ⅹ |
表8:评估区域、染色和免疫基础化学。
Discussion
协议中的关键步骤
我们的目标是获得,特征和存储优质组织来自从纵向观察获得的详细历史。为了实现这一目标,需要处理以下关键方面。如上所述,议定书从征聘捐助者开始,这是第一个关键步骤。然后,捐赠者必须继续执行后续计划,并随着时间的推移保持对项目的粘附,直到实际捐赠大脑。在死亡时,ABB工作人员必须及时得到通知,以便在24小时内召开验尸小组会议,这对于足够的组织质量非常重要。脑半球的新鲜切割需要稳定的手和特定的训练。为了避免缓慢冷冻造成的细胞损伤,并获得低温和Omics的优质切片,重要的是它们被快速冷冻。考虑到甲醛溶液的渗透速度(1毫米/小时),为了保持组织抗原性,单片的浸泡时间保持在最低水平。
方法的故障排除
为了解决上述关键步骤,我们提供以下方法。捐赠者招募和坚持随从:有几个因素阻碍大脑捐赠,包括担心损害身体的身体,纯洁和完整,或死后感到疼痛的可能性。有些人甚至担心验尸可能在他们还活着的时候进行,他们70,71。,71此外,亦有72个关注,即丧葬安排中断及财政负担。此外,医务人员对验尸程序缺乏了解,无法解决潜在捐赠者或其NOK的关切,可能会阻碍登记。所有这些因素都可能导致意识水平低,登记参加人数减少,而且随着时间的推移,捐助者损失的可能性很大。事实上,捐助者征聘方案应有效地传播认识,灌输信任,并说服人们登记并保持高后续参与率。根据我们的经验,这是通过仔细选择潜在的捐赠者和透彻解释BB的目的。我们提供教育活动和同情的方法,解决健康人和那些患有神经退行性疾病的人及其家庭的恐惧和需求。我们发现,当与人接触时,潜在捐助者更有可能表示同意。面对面的方法创造了一种基于相互信任和尊重的关系,这对实现对大脑捐赠和后续评估的高注册比例至关重要。训练有素的员工具有强烈的道德意识,首先接近潜在的捐赠者,讨论死后捐献大脑的可能性,解释人脑组织对神经科学研究的价值,并澄清任何有关验尸程序的疑问。有利的口碑同样重要。大脑采集后,适当注意和护理重新组合尸体。重要的是要通过温柔地对待尸体来表示对死者的尊重和感激。几个月后,只要家庭成员提出要求,就安排开会,传达神经病理学分析的结果。
死亡和大脑采集的时间:当患者接受时,他们成为捐赠者,并获得一个身份证,号码为24小时/天,每天7天/周联系(与我们相连的AP Golgi-Redaelli老年医院的接待号码)。此外,在住院时,还给亲属贴上胶粘剂标签。该地区的葬礼机构先前被告知将尸体带到ABB设施,在那里传唤了验尸小组。验尸小组由一名病理学家、一名神经科医生和/或神经生物学家以及解剖室技术员组成,他们每天从上午6时至晚上11时就应到;一些受训学生也经常来帮忙和拍照。
新的切割程序的精度和一致性由同一两个操作者(神经学家和病理学家)的参与得到保证,他们开发了这种方法,并在神经病理学方面拥有数年的经验。冷冻切片时,它们被放在预冻结的铝托盘上,并覆盖着一个联锁的铝板,以保持它们平整。紧接着,它们被放入液氮3分钟,然后将它们储存在-80°C。 要固定的切片单独包裹在纱布中,浸泡在10%磷酸盐缓冲的甲醛溶液中,一天后被替换。随后,他们被正式保留不超过5天;然而,考虑到形式溶液渗透在1毫米/天,我们想进一步缩短浸泡时间。
方法的限制
此处描述的研究方法仅涵盖有限的地理区域,参与捐赠计划的个人具有不完全代表一般人群的特征。虽然不能接受,验尸间隔长达24小时可能会产生改变的蛋白质结构,酶和RNA的脑组织。AFS 和 pH 的测定可能不完全足以确定组织质量73,我们正在开发基于 RNA 完整性的组织质量验证的其他方法。
关于微切切程序,虽然对重建解剖关系非常有用,但应该指出,使用大切量并不简单,并存在一些技术困难。我们的方法具有挑战性和耗时。成本相当高,资金筹措并不总是容易的。资金主要来自公共(ASP Golgi-Redaelli老年医院)和私人资源(Golgi-Cenci基金会)、私人捐款、非营利组织(如"意大利老年痴呆症")和赠款参与。
ABB方法对现有/替代方法的意义
一开始,我们的脑力捐赠计划针对参与 InveCe.Ab 纵向研究的个人。因此,捐赠的大脑伴随着多年来收集的详细的临床、生物和社会信息。ABB的实力正是源于这一独特的起源。事实上,研究一组具有共同生物特征和环境接触的社会和基因相关的人可以加强统计分析。此外,该研究还包括以下好处:1) 照顾和满足社区的需要("先问前给予"的行为):人们接受免费定期检查,并告知全科医生,提供我们秘书的电话号码进行咨询,并在家里看望严重残疾的人;2) 通过定期举办研讨会(与大脑健康、大脑捐赠和一般健康有关)和规划专题课程(例如为老年人使用信息技术设备),使参与者、具有公共角色的人和全科医生参与教育活动;3) 与人会面,采取面对面的方式。所有这些因素构成了ABB项目的优势。此外,该项目提高了相关人员的临床能力,因为他们在产前评估和死后神经病理学评估方面获得了经验。在这方面,我们要提及"少数民族老龄化研究"的非常特殊的经验。这项研究涉及居住在芝加哥地区的非洲裔美国人人数有限和选定的人数(在1,357个合格受试者中,有784人:回答率为57%)。参与者每年在家参观,并被要求参加大脑捐赠计划。这项研究是基于一个不寻常的方法,一些类似的,我们获得高比例的正面反应,大脑捐赠计划(352捐赠者在784名参与者中登记:44%),虽然验尸率不太令人满意(53%)74。就像《少数民族老龄研究》一样,我们提供教育活动和感同身受的方法,取得了优异的成绩。特别是我们的回复率为93%,注册率为28.7%,验尸率为67%。这些比率表明,直接吸引人们参与的项目在捐款中所占的比例较高。其他脑力捐赠计划,较少注意建立与潜在的捐赠者的关系,一般有一个较低的注册率,是大约10-15%或更少的73,75。,75
以前很少有队列研究以神经病理学分析结束。此外,大多数脑库和储存库都以疾病为中心,与"患病"大脑的数量相比,健康捐赠者的"控制"大脑稀缺。只有有限的BB是基于人口研究,涉及疾病和正常科目,以研究老化轨迹73,74,76,77,78,79,80。73,74,76,77,78,79,80一些研究,如"少数民族老龄化研究"在美国74和"Vantaa 85+研究"在芬兰76类似于我们的,但他们往往用完与队列的终止。相反,ABB的捐赠计划预计在未来很长一段时间内继续,争取潜在的捐赠者,甚至在 InveCe.Ab 纵向研究结束后也安排后续工作。这种方法使我们的招聘方法类似于"太阳健康研究所(SHRI)脑捐赠计划",该计划针对的是一个退休社区73。SHRI 脑捐赠协议非常有效,平均验尸间隔在世界上最短(3.92 小时)。与世界上最大的BB类似,SHRI协议只是将中线(下垂平面)的脑、小脑和脑干切开,然后一半被解剖新鲜并冷冻用于生化研究,而另一半则固定在形式中进行组织病理学评估。然而,SHRI 解剖协议的优点之一是固定单个切片而不是整个半球。事实上,固定一个半球作为一个整体并不是最佳的,因为表面和核心之间的固定梯度不同。此外,皮质蛋白可能受到长期接触甲蛋白溶液的影响。因此,我们决定修复单个切片的原因。
决定哪一方是固定的或冻结的,取决于单一银行(总是相同的,随机分配或分配取决于解剖日是奇数还是偶数)31,32,33,34,35。31,32,33,34,35因此,每个半球分别进行生化和组织病理学分析。由于许多神经系统疾病是不对称的,我们的BB提供了一个独特的协议,切片新鲜标本:从脑干和从小脑和大脑的每个半球的替代部分保留为固定或冷冻材料;一个半球上的固定切片对应于另一个半球上的冻结切片。我们的方法使有机会获得所有冷冻材料的完整组织学特征,并比较双方所有领域的结果。如导言所述,所述方法使我们能够从脑组织中获取尽可能多的信息。此外,ABB的方法产生了一个基本但完整的神经病理学特征,包括几乎所有已知的脑蛋白病和血管病理学。由于血管损伤在确定认知障碍方面的争议作用,我们决定使用双分的血管负担30,53。30,
如协议所述,我们使用多学科方法。虽然这是一个耗时和费力的方法,我们相信它为研究提供了几个优势。例如,在之前的一些工作中,我们证明了与APOE-+4等位基因相关的高thFR C677T TT本身可能与执行功能障碍有关,而不是与记忆丧失81有关。因此,在神经病理学层面上评估具有此特定遗传特征的受试者可能很有趣。这是一个例子,说明这种深入的后续行动如何有助于创造新的研究假设,通过调查我们银行收集的生物材料来验证。我们方法的另一个优点是将 QEEG 纳入我们例行执行的评估中,因为它的独创性和相对易用性。事实上,EEG通过记录属于皮质金字塔神经元82的树突的电位来检测大脑皮层的突触活动。QEEG可被视为估计皮质突触活动的生物标志物,这与认知83有关。特别是,大脑后部的α节律减少,频率普遍增加(泰塔和三角洲节律)与皮质连接分解有关。应当考虑的是,大多数诊断相关性研究都是基于临床诊断,而临床诊断只是一种可能而不是明确的诊断84、85、86、87。84,85,86,87只有很少的针对性研究将QEG数据与神经病理学图进行比较,以研究QEG和LTS变种88、89之间的相关性,以及FTLD和AD83之间的区别。88,通过以神经病理学诊断的定义结束我们的研究,可以正确地解释对脑电活动的观察。此外,在每个学科中执行串行QEG,我们可以跟踪个体脑电图波内轨迹及其与神经病理学图的相关性。随着时间的推移,皮质电活动经过个别修改后,可以更好地了解其作为初期痴呆症的生物标志物的含义。
方法的未来应用和方向
实施组织分布是我们的主要目标之一。为此,我们成立了一个科学委员会,其中包括GC基金会(老年病学家)的主任,帕维亚大学神经学的学者,神经学家和病理学家,都来自GC基金会和老年医院ASP Golgi-Redaelli。在分发脑组织、组织学幻灯片和其他生物样本时,重要的是要记住,捐赠者为了研究而同意捐赠。因此,材料的分配应谨慎进行,正如 BNE 行为准则40 中所述。提交材料请求的任何一方都应指明所需样品的类型和数量,提供研究项目的描述以及如何使用样品,并尽可能提供以前出版物的证据(关于转让协议, 见图9)。脑库不为经济利益而工作。因此,研究人员支付的费用应只支付组织采购、加工、储存和分配的费用。
开始使用外显组测序和Omics技术(如蛋白质组学和转录组学)开始分析案例的计划正在启动中。我们的替代采样方法将允许对来自两个半球的组织学定义明确的组织进行奥米学研究。通过这种方法,可以比较同一半球的不同大脑区域和其他半球相应区域的基因活化模式,并能够将基因激活与组织病理学关联。在这个领域,深度学习应用将具有极大的兴趣,包括组织学幻灯片的计算机化分析以及临床、组织学和奥米学数据的前沿相关性。可以识别许多不同的变量之间的其他相关性以及其他可能的技术应用。两个半球的冷冻材料的可得性将允许对基因活化和蛋白质分布进行准确的地形。考虑到大脑功能和某些疾病都是不对称的,这甚至对健康受试者也特别感兴趣。
此外,我们可以从具有良好特征的脑捐赠者获得细胞培养。事实上,收获大脑的细胞培养物提供活细胞,可用于进一步研究疾病或衰老机制,通过诱导多能干细胞(iPSCs)技术,包括重新编程钩端细胞细胞,并在高级模型90中将它们分化成神经细胞。
随着大脑老化,在分子、细胞和组织水平上可能会发生不同的变化轮廓。每个大脑都是独一无二的。每个国家都有自己的应对内部和外部压力的方式;有些人抵抗, 而其他人屈服, 并显示不同的病理。临床表现和神经病理学图之间的差异通常存在,因为病变的地形,而不是其分子性质,决定了临床表现。只有将临床综合征与神经病理学发现相结合,才能正确和明确的诊断,而神经病理学的发现往往为解开疾病的发病机制而增加重要的病因线索。在欧洲,人们努力创建一种神经病理学诊断的标准方法。我们的诊断方案几乎完全遵循最近发布的关于脑科91神经病理学诊断的指南。这将使我们能够收集和分享有据可查的脑组织,并有望建立第一个意大利脑库。事实上,在意大利有大脑储存库,但没有基于队列研究的脑库。我们的目标是开发一种脑组织采集方法,可以在意大利广泛实施,建立一个使用共同协议并共享可比材料的网络。为此,其他研究中心的参与和建立一个具体的网站是今后的主要目标之一。
创新技术不断用于神经退行性疾病的分子性质分析和生物标志物识别。在此背景下,对大脑的需求将日益增加,同时需要通过纵向研究获得的认知和衰老轨迹信息,强调神经病理学验证流行病学方法92的重要性。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们愿把这项工作献给莎·米切拉·曼吉里博士。在她过早去世之前,她构思并开始了阿比亚特格拉索脑库项目。
我们感谢我们的脑力捐赠者,他们慷慨地为捐赠他们身体最崇高的器官的研究作出贡献;没有他们,这种研究是不可能的。
我们感谢瓦莱里亚·马尔扎加利在ABB项目中的宝贵工作。
作者感谢约翰内斯·阿滕斯教授、保罗·福西亚尼博士和乔治·贾科内博士的宝贵指导和明智的忠告。
我们要感谢萨·爱丽丝·西林乔内博士和朱利亚·博尔通小姐在整个项目中提供的宝贵帮助。
非常感谢特雷·卡萨尼夫人的支持,感谢"意大利老年痴呆症"的合作。
作者感谢帕维亚大学公共卫生、实验和法医学系的马特奥·莫雷蒂博士和安东尼奥·马可·玛丽亚·奥斯库拉蒂教授。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
50ml polypropilene conical tube 30x115mm | BD | 405253 | |
Anti-GFAP | Dako | Z0334 | policlonal primary antibody (anti-rabbit); dilution = 1:1000 |
Anti-NeuN (A60) | Chemicon | MAB377 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000 |
Anti-phospho TAU (AT8) | ThermoScientific | MN1020 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:200 |
Anti-phospho TDP-43 (pS409/410-2) | CosmoBio | TIP-PTD-P02 | policlonal primary antibody (anti-rabbit) ; dilution = 1:4000; pretreatment : Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6 |
Anti-α-SYN (KM51) | Novocastra | NCL-L-ASYN | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:500; pretreatment: 1) Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6 ; 2) 70% formic acid in H2O for 10 min |
Anti-βamyloid (4G8) | BioLegend | 800703 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000; pretreatment : 70% formic acid in H2O for 10 min |
Cutting board | BD | 352070 | |
DMEM High Glucose | Carlo Erba | FA30WL0101500 | medium |
Electrical saw with 5d blade | CEA | 06.06.14/06.00.16 | |
Electrode pH measure surface 12mm | CEA | 70064.250 HHH | |
Electrode pH needle | Fisher Scientific | 11796338 | |
EnVision+System-HRP | Dako | K4001 | secondary antibody (anti-mouse); dilution 1:2 |
EnVision+System-HRP | Dako | K4003 | secondary antibody (anti-rabbit); dilution 1:2 |
Ethylether | SMI | 8401530 | |
Feather safety trimming knife blade 14cm | Fisher Scientific | 11749798 | |
Fetal Bovine Serum | Carlo Erba | FA30WS1810500 | medium supplement; dilution = 20% |
Forceps 15cm surgical or anatomical | Uvex | 500XG | |
Gloves | CEA | 01.28.14 | |
Glue | Arcobaleno | 2624000800002 | |
Head supporter | Lacor | 60456 | |
L-Glutamine (100X) | Carlo Erba | FA30WX0550100 | medium supplement; dilution = 1% |
Measuring tape | CEABIS | CEATA34 | |
Non adsorbable monofilament black polyamide | UHU Bostik | 8000053131470 | |
Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140050 | medium supplement; dilution = 1% |
Pen/Strept Solution (100X) | Carlo Erba | FA30WL0022100 | medium supplement; dilution = 1% |
Spinal needle quincke tipe point 20GA 3.50IN 0.9x90mm | CEA | 03.06.16 | |
Sterile scalpel with n°21 blade | |||
Surgical basin | Olcelli Farmaceutica | A930857255 | |
Surgical mallet and surgical cisel | CEA | 79.68.88 | |
Surgical scissor | CEA | 27.08.45/79.68.64 | |
Feather | M130RC |
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