Ce protocole décrit une méthode pour suivre les trajectoires individuelles de vieillissement du cerveau à travers un programme de don de cerveau et une caractérisation appropriée des cerveaux. Les donneurs de cerveau sont impliqués dans une étude longitudinale à long terme comprenant des évaluations multidimensionnelles en série. Le protocole contient une description détaillée du traitement du cerveau et une méthodologie diagnostique précise.
Dans une population qui vieillit constamment, on s’attend à ce que la prévalence des troubles neurodégénératifs augmente. Comprendre les mécanismes de la maladie est la clé pour trouver des mesures préventives et curatives. La façon la plus efficace d’y parvenir est par l’examen direct des tissus cérébraux malades et sains. Les auteurs présentent un protocole pour obtenir, traiter, caractériser et stocker les tissus cérébraux de bonne qualité donnés par des personnes inscrites dans un programme de don de cerveaux antemortem. Le programme de dons comprend une approche empathique en personne à l’égard des personnes, une collection d’information clinique, biologique, sociale et de style de vie complémentaire et des évaluations multidimensionnelles en série au fil du temps pour suivre les trajectoires individuelles du vieillissement normal et du déclin cognitif. Étant donné que de nombreuses maladies neurologiques sont asymétriques, notre banque de cerveaux offre un protocole unique pour trancher des spécimens frais. Les sections cérébrales des deux hémisphères sont alternativement gelées (à -80 °C) ou fixées en formaline; une tranche fixe sur un hémisphère correspond à une tranche congelée sur l’autre hémisphère. Avec cette approche, une caractérisation histologique complète de tous les matériaux congelés peut être obtenue, et des études d’omics peuvent être effectuées sur des tissus histologiquement bien définis des deux hémisphères offrant ainsi une évaluation plus complète des mécanismes de la maladie neurodégénérative. Le diagnostic correct et défini de ces maladies ne peut être réalisé qu’en combinant le syndrome clinique avec l’évaluation neuropathologique, qui ajoute souvent des indices étiologiques importants nécessaires pour interpréter la pathogénie. Cette méthode peut prendre du temps, être coûteuse et limitée car elle ne couvre qu’une zone géographique limitée. Indépendamment de ses limites, le degré élevé de caractérisation qu’il fournit peut être gratifiant. Notre but ultime est d’établir la première Banque italienne du cerveau, tout en soulignant l’importance des études épidémiologiques vérifiées neuropathologiquement.
Selon l’OMS, environ 50 millions de personnes souffrent actuellement de démence, un chiffre qui devrait tripler d’ici 2050. La maladie d’Alzheimer est la principale cause de démence, suivie par la maladie cérébrovasculaire et d’autres troubles neurodégénératifs liés à l’âge. En 2017, l’OMS a mis au point l’Observatoire mondial de la démence pour sensibiliser la population à la démence et encourager un plan d’action mondial à son encontre1. Chaque individu a sa propre trajectoire de vieillissement cérébral, donc la recherche de la guérison peut être difficile en raison de la complexité de la pathogénie des maladies neurodégénératives. Peut-être, chaque personne possède sa propre pathogénie écrite dans le tissu cérébral nécessitant une approche personnalisée. Ainsi, l’étude des tissus cérébraux sera la clé pour comprendre les mécanismes de la neurodégénérescence.
En repensant à l’histoire des neurosciences, nous nous rendons compte que les découvertes les plus impressionnantes et révolutionnaires n’auraient jamais pu se produire sans l’examen direct du cerveau humain. Au fil du temps, la source de tissus cérébraux à étudier est passée de dissections grossières, de « rencontres fortuites » aléatoires et, dans certains cas, de commerce illégal, à des collectes de cerveaux organisées et à des banques stratégiques modernes de cerveaux. La prise en compte de nombreux aspects éthiques est l’un des principaux facteurs qui différencient les banques cérébrales modernes des collections cérébrales du passé. Les premières vraies banques de cerveau modernes (BB) ont été instituées dans la seconde moitié du20ème siècle. Nicholas Corsellis et Wallace Tourtelotte peuvent être considérés comme des pionniers de la banque moderne du cerveau. Au Royaume-Uni, Corsellis a rassemblé une collection contenant plus de 1000 cerveaux bien documentés affectés par divers troubles mentaux et neurologiques2. En outre, Corsellis a contribué à révéler la nécessité de préserver les tissus cérébraux frais dans la glace pour le bien des tests biochimiques3. Pendant ce temps aux États-Unis, Wallace Tourtelotte a introduit des programmes de don de cerveau antemortem pour faciliter la sollicitation de donneurs potentiels de cerveau et de s’assurer que les cerveaux recueillis sont accompagnés d’une histoire médicale et neurologique complète4,5. Pour un aperçu historique des collections de cerveaux et des BB modernes, voir Carlos et coll. 6.
Alors, pourquoi avons-nous encore besoin de cerveaux humains ? Les maladies du cerveau ne peuvent recevoir un diagnostic précis qu’après un examen neuropathologique. La neuropathologie conteste le diagnostic clinique, et est la clé d’une interprétation correcte des symptômes cliniques et de la découverte des bases histologiques de nouvelles variantes syndromiques. En effet, le diagnostic peut être redéfini en fonction de l’image pathologique. Néanmoins, le taux d’autopsie a diminué au cours des dernières décennies en raison du développement récent de techniques de neuroimagerie innovantes. Grâce à l’imagerie cérébrale, les altérations morphologiques, fonctionnelles et métaboliques du cerveau, ainsi que l’étendue de l’erreur de pliage des protéines, peuvent être évaluées in vivo. Cependant, la neuroimagerie in vivo et d’autres études de biomarqueurs ne peuvent donner qu’une « estimation » de l’image pathologique, car elles sont incapables de détecter des changements cellulaires et moléculaires subtils. Les progrès de l’imagerie moléculaire et la découverte de nouveaux biomarqueurs, molécules cibles et traceurs7 (ex. amyloïdes, TAU, traceurs microgliaux) rendent le cerveau humain encore plus indispensable à l’interprétation des données obtenues à partir d’évaluations cliniques et de tests de biomarqueurs. En outre, les technologies omiques (génomique, épigénomique, transcriptomique, métabolomique, protéomique, lipidomique, etc.), réalisée sur des tissus cérébraux frais et congelés, a ouvert de nouvelles possibilités de compréhension des mécanismes de la maladie et de découverte des gènes de risque, de nouveaux marqueurs diagnostiques et pronostiques, et des cibles médicamenteuses potentielles8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.
À ces fins, les BB modernes archivent des tissus cérébraux de haute qualité bien caractérisés qui les rendent disponibles pour la communauté scientifique3,24. Les cerveaux fournis par les BB devraient être accompagnés d’une histoire clinique complète. L’activité d’un BB comprend les éléments suivants : (1) Reconnaissance et recrutement de personnes malades et en bonne santé dans les programmes de don de cerveau; la condition idéale serait d’obtenir un suivi multidisciplinaire des donneurs tout au long de la vie afin d’obtenir un historique clinique, de style de vie et social complet, ainsi que des profils de biomarqueurs; en effet, la réserve cognitive et la structure du cerveau dépendent du mode de vie et des facteurs socio-éducatifs25,26, de sorte que ces informations enrichit les données totales à portée de main. (2) Acquisition du cerveau (composé de cerveaux, de cervelet et de troncs cérébraux) et des tissus connexes (p. ex., moelle épinière, nerfs crâniens et ganglions, etc.) à la suite de la disparition du donneur, tout en respectant des règlements juridiques et éthiques normalisés. (3) Traitement approprié (dissection, fixation, congélation) du cerveau, tel que défini dans un protocole opératoire normalisé, pour obtenir des tissus de haute qualité et pour permettre une utilisation future dans la recherche multidisciplinaire. (4) Caractérisation neuropathologique détaillée fournissant un diagnostic définitif défini. (5) Stockage et distribution de matériel tissulaire à la communauté de recherche27,28.
Tous les BB stockent les tissus incorporés congelés et la formaline-fixe-paraffine. Chaque BB a son propre protocole. À l’exception d’études particulières, comme le protocole de coupe bihémisphérique de l’Institut de recherche biomédicale (New Jersey)29 et l’étude de la pathologie cérébrovasculaire30du Deramecourt , les plus grands BB au monde ont simplement coupé le cerveau, le cervelet et le tronc cérébral le long de la ligne médiane (plan sagittal). Une moitié est disséquée fraîche puis congelée pour des études biochimiques, tandis que l’autre est fixée en formaline pour l’évaluation histopathologique. Ainsi, les analyses biochimiques et histopathologiques sont menées séparément sur chaque hémisphère. La décision quant à quel côté est fixé ou gelé (lateralité), dépend de la banque singulière31,32,33,34,35. Comme de nombreuses maladies neurologiques sont asymétriques, notre BB offre un protocole unique pour trancher les cerveaux frais : les sections adjacentes du tronc cérébral et chaque hémisphère sont alternativement fixes et congelées ; une tranche fixe sur un hémisphère correspond à une tranche congelée sur l’autre hémisphère. Grâce à cette méthode, l’utilisation du tissu cérébral est optimisée, et une caractérisation histologique complète de tous les matériaux congelés peut être réalisée avec la possibilité d’obtenir et de comparer des informations histologiques et biochimiques de toutes les zones des deux hémisphères.
Le cadre de notre projet de banque de cerveaux est la ville d’Abbiategrasso. Abbiategrasso est une petite ville située à environ 22 km au sud-ouest de la ville de Milan, dans le nord de l’Italie. Sa population est d’environ 32 600 habitants. Il abrite la Fondation Golgi-Cenci (GC). Gc Foundation fait partie d’un grand hôpital gériatrique de réadaptation (ASP Golgi-Redaelli), et est un institut axé sur la recherche sur le vieillissement et les soins aux personnes âgées. En particulier, il se concentre sur l’étude du vieillissement mental, les facteurs sociaux et comportementaux qui l’influencent, et la biologie et la pathologie sous-jacentes aux troubles neurocognitifs dépendants de l’âge (MNT). En 2009, la Fondation GC a lancé une nouvelle étude longitudinale auprès de 1 321 participants (sur 1644 sujets admissibles : taux de réponse initial de 80,3 %) né entre 1935 et 1939 (âgés de 70 à 75 ans), d’origine caucasienne, vivant dans la même petite zone géographique. L’étude a été appelée InveCe.Ab (Invecchiamento Cerebrale Abbiategrasso; en anglais: Brain Aging Abbiategrasso, ClinicalTrials.gov, NCT01345110) et est actuellement en cours. InveCe.Ab est prévu d’obtenir une cohorte avec une homogénéité maximale et la moindre variabilité afin d’évaluer l’incidence, la prévalence et l’histoire naturelle de la démence, ainsi que son risque possible ou des facteurs de protection, y compris les variables comportementales, psychosociales, cliniques et biologiques36. Les caractéristiques de la cohorte sont indiquées à la figure 1 et au tableau 1. Les données épidémiologiques sont compatibles avec la tendance de démence dans la population européenne37,,38 et les participants d’InveCe.Ab ont des caractéristiques génétiques et environnementales homogènes, représentant un bon modèle pour étudier la trajectoire du vieillissement normal aux désordres neurocognitifs. En effet, les populations homogènes ont besoin de moins de sujets pour atteindre une puissance statistique adéquate. La méthodologie InveCe.Ab a déjà été rapportée ailleurs36, mais il est important de souligner son approche multidimensionnelle par des contrôles périodiques (tous les 2 à 3 ans) en utilisant le même ensemble d’évaluations, y compris: l’échantillonnage sanguin (panneau métabolique, homocystéine et vitamines, extraction d’ADN au profil Apolipoprotéine E (APOE) et autres polymorphismes génétiques liés à la cognition et au vieillissement), mesures anthropométriques (poids, taille et taille), Test de marche (double test de tâche), entretien pour évaluer le mode de vie (observance du régime méditerranéen, niveaux d’activité physique et engagement cognitif) et les facteurs sociaux (implication sociale, solitude), une évaluation neuropsychologique et un examen général clinique. Comparer ces données longitudinales avec les données neuropathologiques postmortem serait crucial pour la recherche. Par conséquent, notre équipe et en particulier le Dr Michela Mangieri ont conçu l’approche neuropathologique mentionnée ci-dessus. Depuis 2014 et lors du second suivi, les participants d’InveCe.Ab ont été invités à donner leur cerveau, ce qui a entraîné la naissance de l’Abbiategrasso Brain Bank (ABB). Les principaux donateurs d’ABB sont les participants d’InveCe.Ab, mais ABB est maintenant ouvert à d’autres donateurs bénévoles. Il s’agit de patients de l’ASP Golgi-Redaelli, qui abrite plusieurs patients atteints de différentes maladies neurologiques ou de volontaires adultes qui apprennent le projet ABB et appartiennent à la même zone géographique (Abbiategrasso et environs). Tous les donateurs subissent le même protocole d’évaluation.
Les auteurs proposent une méthode pour suivre les trajectoires individuelles du vieillissement normal et la progression possible vers les MNT, et pour gérer, traiter et caractériser avec précision les cerveaux acquis auprès de ces donneurs suivis longitudinalement. En outre, notre objectif est de rencontrer et d’engager les individus dans des évaluations neurologiques périodiques, des séminaires et des activités éducatives concernant le bien-être du cerveau et de les sensibiliser au don du cerveau à des fins de recherche.
Étapes critiques du protocole
Notre objectif est d’obtenir, caractériser et stocker des tissus de bonne qualité provenant de sujets ayant une histoire détaillée dérivée de l’observation longitudinale. Afin d’atteindre cet objectif, il est nécessaire de traiter les aspects clés suivants. Comme décrit ci-dessus, le protocole commence par le recrutement des donateurs, qui est la première étape cruciale. Ensuite, il est nécessaire que les donateurs poursuivent le programme de suivi et maintiennent l’adhésion au projet au fil du temps jusqu’au don réel du cerveau. Au moment du décès, il est nécessaire que le personnel d’ABB soit rapidement avisé afin de convoquer l’équipe d’autopsie dans les 24 heures, ce qui est important pour une qualité adéquate des tissus. La coupe fraîche des hémisphères cérébraux nécessite une main stable et une formation spécifique. Pour éviter les dommages cellulaires causés par le gel lent et obtenir des tranches de bonne qualité pour le cryostat et omics, il est important qu’ils soient congelés rapidement. Compte tenu de la vitesse de pénétration de la solution de formaline (1 mm/heure), pour préserver l’antigénicité des tissus, le temps de trempage de la seule tranche est maintenu à son minimum.
Dépannage de la méthode
Afin de répondre aux étapes critiques mentionnées ci-dessus, nous offrons l’approche suivante. Recrutement des donneurs et adhésion aux suivis : Il existe plusieurs facteurs qui entravent le don du cerveau, y compris la crainte d’endommager la figure, la pureté et l’intégrité du corps, ou la possibilité de ressentir de la douleur après la mort. Certains craignent même que l’autopsie puisse être menée alors qu’ils sont encore en vie70,71. Des préoccupations concernant la perturbation des arrangements funéraires et le fardeau financier sont également présents72. En outre, le manque de connaissances du personnel médical sur les procédures post mortem et l’incapacité de répondre aux préoccupations des donneurs potentiels ou de leurs NOK peuvent décourager l’enregistrement. Tous ces facteurs peuvent produire un faible niveau de sensibilisation avec un faible nombre de participants inscrits et une forte possibilité de perte de donneurs au fil du temps. En effet, le programme de recrutement des donateurs devrait être efficace pour sensibiliser les gens, inspirer la confiance et convaincre les gens de s’inscrire et de maintenir des taux élevés de participation au suivi. D’après notre expérience, cela se fait par une sélection minutieuse des donateurs potentiels et une explication approfondie des objectifs du BB. Nous offrons des activités éducatives et une approche empathique répondant aux craintes et aux besoins des personnes en bonne santé et des personnes atteintes de maladies neurodégénératives et de leurs familles. Nous constatons que les donateurs potentiels sont plus susceptibles de donner leur consentement lorsqu’ils sont approchés en personne. Une approche en personne crée une relation fondée sur la confiance et le respect mutuels, qui est fondamentale pour atteindre un pourcentage élevé d’inscription au don de cerveau et aux évaluations de suivi. Un personnel hautement qualifié avec un fort sens de l’éthique aborde d’abord le donneur potentiel, discute de la possibilité de donner le cerveau après la mort, explique la valeur du tissu cérébral humain à la recherche neuroscientifique, et clarifie tout doute concernant les procédures post mortem. Le bouche-à-oreille favorable est tout aussi important. Après la récolte du cerveau, une attention et des soins appropriés sont accordés pour recomposer le cadavre. Il est important de montrer du respect et de la gratitude à la personne décédée en traitant le cadavre doucement. Quelques mois plus tard, une réunion est prévue pour communiquer les résultats de l’analyse neuropathologique chaque fois que les membres de la famille le demandent.
L’heure du décès et la récolte du cerveau: Lorsque la personne accepte, ils deviennent un donneur et sont donnés une carte d’identité avec un numéro à contacter 24 heures par jour, 7 jours/semaine (le numéro de réception de l’ASP Golgi-Redaelli Hôpital gériatrique qui est connecté à nous). En outre, une étiquette adhésive est donnée aux parents à utiliser en cas d’hospitalisation. Les agences funéraires de la région ont déjà été informées d’amener le corps dans les installations d’ABB, où l’équipe d’autopsie est convoquée. L’équipe d’autopsie est composée d’un pathologiste, d’un neurologue et/ou d’un neurobiologiste, et d’un technicien de salle anatomique, qui sont de garde tous les jours de 6 h à 23 h; certains étudiants stagiaires sont également fréquemment présents pour aider et prendre des photos.
La précision et la cohérence des nouvelles procédures de coupe sont assurées par la participation des deux mêmes opérateurs (un neurologue et un pathologiste) qui ont développé la méthode et ont plusieurs années d’expérience en neuropathologie. Lors de la congélation des tranches, elles sont mises sur un plateau en aluminium préfrouzen et recouvertes d’une plaque d’aluminium imbriquée pour les garder bien plates. Immédiatement après, ils sont mis dans l’azote liquide pendant 3 minutes, avant de les stocker à -80 °C. Les tranches à fixer sont emballées individuellement dans de la gaze et trempées dans une solution de formaline tamponnée de phosphate de 10 %, qui est remplacée après une journée. Par la suite, ils sont conservés en formaline pas plus de 5 jours supplémentaires; toutefois, étant donné que la solution formaline pénètre à 1 mm/jour, nous aimerions raccourcir davantage le temps de trempage.
Limitations de la méthode
La méthode de recherche décrite ici ne couvre qu’une zone géographique limitée, et les personnes impliquées dans le programme de don possèdent des caractéristiques qui ne représentent pas entièrement la population générale. Bien qu’il soit plus qu’acceptable, un intervalle post mortem pouvant aller jusqu’à 24 heures peut produire des altérations dans certaines structures protéiques, enzymes et ARN des tissus cérébraux. La détermination de l’AFS et du pH peut ne pas être entièrement suffisante pour déterminer la qualité des tissus73 et nous développons d’autres moyens d’authentifier la qualité des tissus en fonction de l’intégrité de l’ARN.
En ce qui concerne la procédure de coupe des microtomes, bien que très utile pour reconstruire les relations anatomiques, il convient de noter que l’utilisation de macrosections n’est pas simple et présente quelques difficultés techniques. Notre méthode est difficile et prend beaucoup de temps. Les coûts sont assez élevés et le financement n’est pas toujours facile. Le financement provient principalement de ressources publiques (ASP Golgi-Redaelli Geriatric Hospital) et privées (Fondation Golgi-Cenci), de dons privés, d’organismes à but non lucratif (p. ex. « Federazione Alzheimer Italia ») et de subventions de participation.
L’importance de la méthode ABB par rapport aux méthodes existantes/alternatives
Au début, notre programme de don de cerveau s’adressait aux personnes participant à l’étude longitudinale InveCe.Ab. En conséquence, les cerveaux donnés sont accompagnés d’informations cliniques, biologiques et sociales détaillées recueillies au fil des ans. La force d’ABB découle précisément de cette origine distinctive. En effet, l’étude d’un groupe de personnes socialement et génétiquement apparentées qui partagent des caractéristiques biologiques et des expositions environnementales améliore l’analyse statistique. En outre, l’étude comprend les avantages suivants : 1) S’occuper des besoins de la communauté (l’acte de « donner avant de demander ») : les personnes reçoivent un contrôle périodique gratuit dont le médecin généraliste est informé, un numéro de téléphone de notre secrétaire est fourni pour les consultations, et les personnes gravement handicapées sont visitées à la maison; 2) Engager les participants, les personnes ayant des rôles publics et les omnipraticiens dans des activités éducatives par l’organisation de séminaires périodiques (liés à la santé du cerveau, au don du cerveau et à la santé générale) et la planification de cours thématiques (p. ex. l’utilisation de dispositifs de technologie de l’information pour les personnes âgées); 3) Rencontrer des gens et adopter une approche en personne. Tous ces éléments constituent la force du projet ABB. De plus, le projet améliore les capacités cliniques du personnel médical impliqué, car il acquière de l’expérience dans les évaluations antemortem et les évaluations neuropathologiques postmortem. À cet égard, nous aimerions mentionner l’expérience très particulière de « l’étude de recherche sur le vieillissement des minorités ». Cette étude a porté sur un nombre limité et sélectionné d’Afro-Américains résidant dans la région de Chicago (784 sur 1 357 sujets admissibles : taux de réponse de 57 %). Les participants ont été visités chaque année à la maison et on leur a demandé de se joindre au programme de don de cerveaux. Cette étude est basée sur une approche inhabituelle avec certaines similitudes avec la nôtre obtenir des pourcentages élevés de réponse positive au programme de don de cerveau (352 donneurs sur 784 participants étaient inscrits: 44%), bien que le taux d’autopsie n’était pas tout à fait satisfaisant (53%)74. Tout comme dans « L’étude de recherche sur le vieillissement des minorités », nous offrons des activités éducatives et une approche empathique, obtenant d’excellents résultats. En particulier, notre taux de réponse est de 93%, le pourcentage d’inscription est de 28,7%, et le taux d’autopsie à l’heure actuelle est de 67%. Ces taux montrent que les projets qui engagent directement les gens ont un pourcentage plus important de dons. D’autres programmes de don de cerveau, avec moins d’attention dans l’établissement d’une relation avec les donateurs potentiels, ont généralement un faible pourcentage d’inscription, étant d’environ 10-15% ou moins73,75.
Il y a peu d’études de cohorte précédentes se terminant par une analyse neuropathologique. En outre, la majorité des banques de cerveaux et des dépôts sont centrés sur la maladie et il ya une pénurie de cerveaux « témoins » de donneurs en bonne santé par rapport au nombre de cerveaux « malades ». Seul un nombre limité de BB sont basés sur des études de population impliquant des sujets malades et normaux afin d’étudier les trajectoires de vieillissement73,74,76,77,78,79,80. Certaines études telles que « L’étude de recherche sur le vieillissement des minorités » aux États-Unis74 et « L’étude Vantaa 85 + » en Finlande76 sont semblables à la nôtre, mais elles ont tendance à s’épuiser avec la fin de la cohorte. Au lieu de cela, le programme de dons d’ABB devrait se poursuivre pendant une longue période à l’avenir, enrôlant les donateurs potentiels et en programmant des suivis même après la fin de l’étude longitudinale InveCe.Ab. Cette approche rend notre méthode de recrutement semblable à celle du programme de don de cerveau de l’Institut de recherche en santé solaire (IRS) qui vise une communauté de retraités73. Le protocole SHRI pour le don de cerveau est très efficace avec l’intervalle post mortem moyen le plus court dans le monde (3,92 heures). Semblable aux plus grands BB dans le monde, le protocole SHRI a simplement coupé le cerveau, le cervelet et le tronc cérébral dans la ligne médiane (plan sagittal), puis une moitié est disséquée fraîche et congelée pour des études biochimiques, tandis que l’autre est fixé en formaline pour l’évaluation histopathologique. Cependant, l’une des forces du protocole de dissection SHRI est la fixation de tranches individuelles au lieu de l’hémisphère entier. En effet, fixer un hémisphère dans son ensemble n’est pas optimal, en raison des différents gradients de fixation entre la surface et le noyau. En outre, les protéines corticales peuvent être affectées par une exposition prolongée à la solution de formaline. Ainsi, la raison pour laquelle nous avons décidé de fixer des tranches individuelles.
La décision quant à quel côté est fixé ou gelé, dépend de la banque singulière (toujours la même, aléatoirement assignée ou assignée selon que le jour de la dissection est impair ou même)31,32,33,34,35. Ainsi, l’analyse biochimique et histopathologique est menée séparément sur chaque hémisphère. Comme de nombreuses maladies neurologiques sont asymétriques, notre BB offre un protocole unique pour trancher des spécimens frais : des sections alternatives du tronc cérébral et de chaque hémisphère de cervelet et de cerveau sont conservées comme matière fixe ou congelée ; une tranche fixe sur un hémisphère correspond à une tranche congelée sur l’autre hémisphère. Notre méthode donne l’occasion d’obtenir une caractérisation histologique complète de tous les matériaux congelés et de comparer les résultats de toutes les zones des deux côtés. Comme dit dans l’introduction, la méthode décrite nous permet d’obtenir autant d’informations que possible à partir du tissu cérébral. En outre, la méthode d’ABB donne une caractérisation neuropathologique de base mais complète, y compris presque toutes les protéines cérébrales connues et la pathologie vasculaire. En raison du rôle controversé des lésions vasculaires dans la détermination des troubles cognitifs, nous avons décidé d’utiliser une double notation pour le fardeau vasculaire30,53.
Comme expliqué dans le protocole, nous utilisons une approche multidisciplinaire. Bien qu’il s’agisse d’une méthode longue et laborieuse, nous croyons qu’elle offre plusieurs avantages pour la recherche. Par exemple, dans un travail précédent, nous avons démontré que le tHcy élevé en soi, ou MTHFR C677T TT associé à l’allèle APOE-ε4, peut être lié à des dysfonctionnements exécutifs plutôt que la perte de mémoire81. Par conséquent, il peut être intéressant d’évaluer les sujets avec ce profil génétique particulier au niveau neuropathologique. Il s’agit d’un exemple de la façon dont un tel suivi approfondi est utile pour créer de nouvelles hypothèses de recherche vérifiables par l’étude des matériaux biologiques recueillis dans notre banque. Une autre démonstration de l’avantage de notre approche est l’inclusion du QEEG dans les évaluations que nous effectuons régulièrement, pour son originalité et la relative facilité d’utilisation. En effet, EEG détecte l’activité synaptique du cortex cérébral en enregistrant les potentiels électriques des dendrites appartenant aux neurones pyramidaux corticaux82. QEEG peut être considéré comme un biomarqueur pour l’estimation de l’activité synaptique corticale qui est liée à la cognition83. En particulier, une diminution des rythmes alpha dans la partie postérieure du cerveau avec une augmentation générale des fréquences inférieures (rythmes theta et delta) a été liée à la rupture de connexion corticale. Il convient de considérer que la plupart des études de corrélation diagnostique ont été basées sur un diagnostic clinique qui n’est qu’un diagnostic probable et non un diagnostic défini84,85,86,87. Seules très peu d’études ciblées ont comparé les données du QEEG à l’image neuropathologique pour étudier la corrélation entre les variantes QEEG et LTS88,89, et la distinction entre FTLD et AD83. En terminant notre étude par une définition du diagnostic neuropathologique, il est alors possible d’interpréter correctement les observations faites sur l’activité électrique cérébrale. En outre, l’exécution de QEEG série dans chaque sujet, nous pouvons suivre la trajectoire intra-individuelle des ondes EEG et leurs corrélations avec l’image neuropathologique. Suivre des modifications individuelles de l’activité électrique corticale au fil du temps peut conduire à une meilleure compréhension de sa signification en tant que biomarqueur pour la démence naissante.
Applications futures et orientation de la méthode
La mise en œuvre de la distribution des tissus est l’un de nos principaux objectifs potentiels. Pour ce faire, nous venons de mettre sur pied une commission scientifique comprenant le directeur de la Fondation GC (gériatre), un universitaire en neurologie de l’Université de Pavia, un neurologue et un pathologiste de la Fondation GC et de l’Hôpital gériatrique ASP Golgi-Redaelli. Lors de la distribution de tissus cérébraux, de diapositives histologiques et d’autres échantillons biologiques, il est important de se rappeler que les donateurs ont accepté le don pour des raisons de recherche. La distribution des documents devrait donc avoir lieu avec prudence, comme le décrit le Code de conduite BNE40. Toute partie qui présente une demande de documents doit indiquer le type et la quantité de l’échantillon nécessaire, fournir une description du projet de recherche et comment les échantillons seront utilisés et, dans la mesure du possible, fournir des preuves de publications antérieures (pour l’accord de transfert, voir la figure 9). La banque de cerveaux ne fonctionne pas pour un gain financier. Ainsi, les frais payés par les chercheurs ne devraient couvrir que les dépenses de l’approvisionnement, du traitement, de l’entreposage et de la distribution de tissus.
Les plans pour commencer à analyser les cas avec le séquençage d’exome et les techniques d’omics, telles que la protéomique et la transcriptomique, sont en mouvement. Notre méthodologie d’échantillonnage alternative permettra d’effectuer des études d’omics sur des tissus histologiquement bien définis des deux hémisphères. Grâce à cette approche, il sera possible de comparer le modèle d’activation des gènes dans différentes zones du cerveau d’un même hémisphère et dans les zones correspondantes de l’autre hémisphère, et d’être en mesure de corréler l’activation des gènes avec l’histopathologie. Dans ce domaine, les applications d’apprentissage profond seraient d’un grand intérêt, y compris l’analyse informatisée des diapositives histologiques et la corrélation de pointe des données cliniques, histologiques et omiques. D’autres corrélations entre de nombreuses variables différentes peuvent être identifiées ainsi que d’autres applications technologiques possibles. La disponibilité de matériaux congelés des deux hémisphères permettra une topographie précise de l’activation des gènes et de la distribution des protéines. Cela sera d’un intérêt particulier, même pour les sujets sains, étant donné que les fonctions cérébrales et certaines maladies sont asymétriques.
En outre, nous pouvons obtenir des cultures cellulaires de donneurs de cerveau bien caractérisés. En effet, les cultures cellulaires des leptomeninges des cerveaux récoltés fournissent des cellules vivantes qui peuvent être utilisées pour une étude plus approfondie de la maladie ou des mécanismes de vieillissement, au moyen de la technologie des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) qui consiste à reprogrammer les fibroblastes leptomeningés et à les différencier en cellules neuronales dans les modèles avancés90.
À mesure que le cerveau vieillit, différents profils de changement peuvent se produire au niveau moléculaire, cellulaire et tissulaire. Chaque cerveau est unique. Chacun a sa propre façon de répondre aux facteurs de stress internes et externes; certains résistent tandis que d’autres succombent et affichent des pathologies distinctes. Des écarts entre la présentation clinique et l’image neuropathologique existent souvent parce que la topographie des lésions, plutôt que leur nature moléculaire, détermine la présentation clinique. Le diagnostic correct et défini ne pouvait être réalisé qu’en combinant le syndrome clinique avec les résultats neuropathologiques qui ajoutent souvent des indices étiologiques importants nécessaires pour démêler la pathogénie des maladies. En Europe, il y a un effort pour créer une approche standard du diagnostic neuropathologique. Notre protocole de diagnostic suit presque complètement les lignes directrices récemment publiées sur le diagnostic neuropathologique pour les banques de cerveau91. Cela nous permettra de collecter et de partager des tissus cérébraux bien documentés, dans le but potentiel d’établir la première banque italienne de cerveaux. En effet, en Italie, il existe des dépôts cérébraux, mais pas des banques de cerveaux basées sur des études de cohorte. Notre objectif est de développer une méthode de récolte des tissus cérébraux qui peut être mise en œuvre dans toute l’Italie, afin d’établir un réseau qui utilise un protocole commun et partage des matériaux comparables. Pour ce faire, la participation d’autres centres de recherche et la création d’un site web spécifique sont parmi les principaux objectifs pour l’avenir.
Des technologies innovantes sont constamment utilisées pour l’analyse de la nature moléculaire des maladies neurodégénératives et pour l’identification des biomarqueurs. Dans ce contexte, il y aura un besoin croissant de cerveaux accompagné d’informations sur les trajectoires cognitives et de vieillissement obtenues par le biais d’études longitudinales, soulignant l’importance d’une approche épidémiologique vérifiée neuropathologiquement92.
The authors have nothing to disclose.
Nous souhaitons dédier ce travail au Dr.ssa Michela Mangieri. Avant de mourir prématurément, elle a conçu et lancé le projet Abbiategrasso Brain Bank.
Nous sommes reconnaissants à nos donneurs de cerveau, qui contribuent généreusement à la recherche en faisant don de l’organe le plus noble de leur corps; sans eux, cette recherche ne serait pas possible.
Nous sommes reconnaissants à Valeria Marzagalli pour son travail précieux dans le projet ABB.
Les auteurs remercient le Professeur Johannes Attems, le Dr Paolo Fociani et le Dr Giorgio Giaccone pour leurs précieux conseils et leurs sages conseils.
Nous tenons à remercier la Dre Alice Cirrincione et Mlle Giulia Bortone pour leur précieuse aide tout au long du projet.
Un grand merci à Mme Tere Cassani pour son soutien et à « Federazione Alzheimer Italia » pour sa collaboration.
Les auteurs sont reconnaissants au Dr Matteo Moretti et au Professeur Antonio Marco Maria Osculati, Département de santé publique, médecine expérimentale et médico-légale de l’Université de Pavia.
50ml polypropilene conical tube 30x115mm | BD | 405253 | |
Anti-GFAP | Dako | Z0334 | policlonal primary antibody (anti-rabbit); dilution = 1:1000 |
Anti-NeuN (A60) | Chemicon | MAB377 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000 |
Anti-phospho TAU (AT8) | ThermoScientific | MN1020 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:200 |
Anti-phospho TDP-43 (pS409/410-2) | CosmoBio | TIP-PTD-P02 | policlonal primary antibody (anti-rabbit) ; dilution = 1:4000; pretreatment : Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6 |
Anti-α-SYN (KM51) | Novocastra | NCL-L-ASYN | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:500; pretreatment: 1) Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6 ; 2) 70% formic acid in H2O for 10 min |
Anti-βamyloid (4G8) | BioLegend | 800703 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000; pretreatment : 70% formic acid in H2O for 10 min |
Cutting board | BD | 352070 | |
DMEM High Glucose | Carlo Erba | FA30WL0101500 | medium |
Electrical saw with 5d blade | CEA | 06.06.14/06.00.16 | |
Electrode pH measure surface 12mm | CEA | 70064.250 HHH | |
Electrode pH needle | Fisher Scientific | 11796338 | |
EnVision+System-HRP | Dako | K4001 | secondary antibody (anti-mouse); dilution 1:2 |
EnVision+System-HRP | Dako | K4003 | secondary antibody (anti-rabbit); dilution 1:2 |
Ethylether | SMI | 8401530 | |
Feather safety trimming knife blade 14cm | Fisher Scientific | 11749798 | |
Fetal Bovine Serum | Carlo Erba | FA30WS1810500 | medium supplement; dilution = 20% |
Forceps 15cm surgical or anatomical | Uvex | 500XG | |
Gloves | CEA | 01.28.14 | |
Glue | Arcobaleno | 2624000800002 | |
Head supporter | Lacor | 60456 | |
L-Glutamine (100X) | Carlo Erba | FA30WX0550100 | medium supplement; dilution = 1% |
Measuring tape | CEABIS | CEATA34 | |
Non adsorbable monofilament black polyamide | UHU Bostik | 8000053131470 | |
Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140050 | medium supplement; dilution = 1% |
Pen/Strept Solution (100X) | Carlo Erba | FA30WL0022100 | medium supplement; dilution = 1% |
Spinal needle quincke tipe point 20GA 3.50IN 0.9x90mm | CEA | 03.06.16 | |
Sterile scalpel with n°21 blade | |||
Surgical basin | Olcelli Farmaceutica | A930857255 | |
Surgical mallet and surgical cisel | CEA | 79.68.88 | |
Surgical scissor | CEA | 27.08.45/79.68.64 | |
Feather | M130RC |