يصف هذا البروتوكول طريقة لتتبع مسارات شيخوخة الدماغ الفردية من خلال برنامج التبرع بالدماغ والتوصيف السليم للأدمغة. ويشارك المتبرعون الدماغ في دراسة طولية طويلة الأجل بما في ذلك التقييمات المتسلسلة متعددة الأبعاد. ويتضمن البروتوكول وصفا مفصلا لمعالجة الدماغ ومنهجية تشخيصية دقيقة.
في السكان المسنين باستمرار، من المتوقع أن يرتفع انتشار الاضطرابات العصبية. فهم آليات المرض هو المفتاح لإيجاد تدابير وقائية وعلاجية. الطريقة الأكثر فعالية لتحقيق ذلك هو من خلال الفحص المباشر للأنسجة المخ المريضة والسليمة. يقدم المؤلفون بروتوكولًا للحصول على أنسجة الدماغ ذات الجودة الجيدة التي تبرع بها الأفراد المسجلون في برنامج التبرع بالدماغ قبل الوفاة ومعالجتها وتوصيفها وتخزينها. يتضمن برنامج التبرع نهجًا متعاطفًا وجهًا لوجه مع الأشخاص ، ومجموعة من المعلومات السريرية والبيولوجية والاجتماعية ونمط الحياة التكميلية والتقييمات المتسلسلة متعددة الأبعاد مع مرور الوقت لتتبع المسارات الفردية للشيخوخة الطبيعية والتدهور المعرفي. منذ العديد من الأمراض العصبية غير متناظرة، لدينا بنك الدماغ يقدم بروتوكول فريد من نوعه لشرائح العينات الطازجة. يتم تجميد أجزاء الدماغ من كلا نصفي الكرة الأرضية بالتناوب (في -80 درجة مئوية) أو ثابتة في formalin; شريحة ثابتة على نصف الكرة الأرضية واحد يقابل واحد المجمدة على نصف الكرة الآخر. مع هذا النهج، يمكن الحصول على توصيف الأنسجة الكلدة من جميع المواد المجمدة، ويمكن إجراء دراسات omics على الأنسجة محددة جيدا من الناحية النسيجية من كلا نصفي الكرة الأرضية وبالتالي تقديم تقييم أكثر اكتمالا لآليات الأمراض العصبية. لا يمكن تحقيق التشخيص الصحيح والمُحَدَّد لهذه الأمراض إلا من خلال الجمع بين المتلازمة السريرية والتقييم العصبي، والذي غالباً ما يضيف أدلة etiological مهمة ضرورية لتفسير التسبب. ويمكن أن تستغرق هذه الطريقة وقتا طويلا، ومكلفة ومحدودة لأنها لا تغطي سوى منطقة جغرافية محدودة. وبصرف النظر عن القيود التي تفرضها، فإن الدرجة العالية من التوصيف الذي توفره يمكن أن تكون مجزية. هدفنا النهائي هو إنشاء أول بنك الدماغ الإيطالية، مع التأكيد على أهمية الدراسات الوبائية التحقق من الأمراض العصبية.
ووفقاً لمنظمة الصحة العالمية، يعاني حالياً نحو 50 مليون شخص من الخرف، وهو رقم من المتوقع أن يتضاعف ثلاث مرات بحلول عام 2050. مرض الزهايمر هو السبب الرئيسي للخرف، يليه المرض الدماغي الوعائي وغيره من الاضطرابات العصبية المرتبطة بالعمر. وفي عام 2017، أنشأت منظمة الصحة العالمية المرصد العالمي للخرف لزيادة الوعي بالخرف وتشجيع خطة عمل عالمية لمكافحة هذا الالخرف1. كل فرد لديه مسار الشيخوخة الدماغ الخاصة بهم، وبالتالي فإن البحث عن علاج يمكن أن يكون تحديا نظرا لتعقيد من الأمراض المسببة للأمراض العصبية. ربما، كل شخص يمتلك لها أو له pathogenesis مكتوبة في أنسجة الدماغ تتطلب نهجا شخصية. وهكذا، فإن دراسة أنسجة المخ تكون المفتاح لفهم آليات التنكس العصبي.
إذا نظرنا إلى تاريخ علم الأعصاب، ندرك أن الاكتشافات الأكثر إثارة للإعجاب ورائدة لم يكن من الممكن أن تحدث دون الفحص المباشر للدماغ البشري. على مر الزمن، تغير مصدر أنسجة الدماغ التي سيتم دراستها من تشريحات الخام، و “لقاءات الصدفة” العشوائية، وفي بعض الحالات، التداول غير القانوني، إلى مجموعات الدماغ المنظمة وبنوك الدماغ الحديثة الاستراتيجية. إن النظر في العديد من الجوانب الأخلاقية هو أحد العوامل الرئيسية التي تميز بنوك الدماغ الحديثة عن مجموعات الدماغ في الماضي. تم تأسيس أول بنوك الدماغ الحديثة الحقيقية (BBs) في النصف الثاني منالقرن العشرين. يمكن اعتبار نيكولاس كورسيليس ووالاس تورتيلوت رائدين في الخدمات المصرفية الحديثة للدماغ. في المملكة المتحدة، جمعت Corsellis مجموعة عقد أكثر من 1000 الأدمغة موثقة جيدا المتضررين من مختلف الاضطرابات العقلية والعصبية2. وعلاوة على ذلك، ساعدت Corsellis الكشف عن الحاجة إلى الحفاظ على أنسجة الدماغ الطازجة في الجليد من أجل الاختبارات الكيميائية الحيوية3. وفي الوقت نفسه في الولايات المتحدة الأمريكية، قدم والاس تورتيلوت برامج التبرع بالدماغ قبل الوفاة لتسهيل التماس المتبرعين المحتملين للدماغ وضمان أن الأدمغة التي تم جمعها مصحوبة بتاريخ طبي وعصبية كامل4،5. للحصول على لمحة تاريخية عن مجموعات الدماغ و BBs الحديثة، انظر كارلوس وآخرون. 6–
إذاً، لماذا ما زلنا بحاجة إلى أدمغة بشرية؟ لا يمكن إعطاء أمراض الدماغ سوى تشخيص محدد بعد الفحص العصبي. تتحدى الأمراض العصبية التشخيص السريري، وهو المفتاح لتفسير صحيح للعوارض السريرية واكتشاف الأسس النسيجية للمتغيرات المتلازمية الجديدة. في الواقع ، يمكن إعادة تعريف التشخيص استنادًا إلى الصورة المرضية. ومع ذلك، انخفض معدل التشريح في العقود الأخيرة بسبب التطور الأخير لتقنيات التصوير العصبي المبتكرة. من خلال تصوير الدماغ، يمكن تقييم التعديلات المورفولوجية والوظيفية والتمثيلية في الدماغ، وكذلك مدى اختلاء البروتين، في الجسم الحي. ومع ذلك ، في التصوير العصبي الجسمي وغيرها من الدراسات المؤشرات الحيوية يمكن أن تعطي فقط “تقدير” للصورة المرضية لأنها غير قادرة على الكشف عن التغيرات الخلوية والجزيئية الدقيقة. إن التقدم في التصوير الجزيئي واكتشاف المؤشرات الحيوية الجديدة والجزيئات المستهدفة والتتبع7 (مثل الأميلويد و TAU والمتتبعات الصغيرة) يجعل الدماغ البشري أكثر غنى عنه لتفسير البيانات التي تم الحصول عليها من التقييمات السريرية واختبار العلامات الحيوية. وعلاوة على ذلك ، فإن التكنولوجيات omics (الجينوم ، الجينوم ، الجينوم ، transcriptomics ، المستقلبومات ، البروتينات ، الدهونوميات، الخ)، التي أجريت على أنسجة المخ الطازجة والمجمدة، فتحت إمكانيات جديدة لفهم آليات المرض واكتشاف الجينات خطر، وعلامات التشخيص والتكهن رواية، والأهداف المخدرات المحتملة8،,9،,10،,11،,12،,13،,14، 14،,,16،,17،,18،,19،,1621،,,21،,23.22
لهذه الأغراض، و BBs الحديثة الأرشيف تتميز بشكل جيد، عالية الجودة أنسجة المخ جعلها متاحة للمجتمع العلمي3،24. وينبغي أن تكون مصحوبة الأدمغة المقدمة من BBs من قبل التاريخ السريري الكامل. ويشمل نشاط BB ما يلي: (1) الاعتراف وتجنيد الأفراد المرضى والأصحاء في برامج التبرع بالدماغ؛ (2) و”1″ تدريب الأفراد المصابين بأمراض صحية. الشرط المثالي هو تحقيق متابعة متعددة التخصصات من المتبرعين طوال الحياة للحصول على كامل السريرية، ونمط الحياة والتاريخ الاجتماعي، وملامح العلامات الحيوية؛ في الواقع، الاحتياطي المعرفي وهيكل الدماغ تعتمد على نمط الحياة والعوامل الاجتماعية التعليمية25،26، وبالتالي فإن هذه المعلومات تثري البيانات الإجمالية في متناول اليد. (2) اكتساب الدماغ (الذي يتكون من المخ، المخيخ وسيقان الدماغ) والأنسجة ذات الصلة (مثل الحبل الشوكي، الأعصاب القحفية و ganglia، الخ) بعد زوال المتبرع، في حين أن جميع مراعاة اللوائح القانونية والأخلاقية الموحدة. (3) المعالجة المناسبة (تشريح، تثبيت، تجميد) من الدماغ، على النحو المحدد في بروتوكول المنطوق موحدة، للحصول على أنسجة عالية الجودة والسماح للاستخدام في المستقبل في البحوث متعددة التخصصات. (4) توصيف الأمراض العصبية مفصلة توفير التشخيص النهائي المحدد. (5) تخزين وتوزيع مواد الأنسجة إلى مجتمع البحوث27،28.
جميع BBs تخزين كل من المجمدة وsinsin-ثابت- البارافين الأنسجة جزءا لا يتجزأ. كل BB له بروتوكول الخاصة به. باستثناء دراسات معينة، مثل بروتوكول قطع نصفين من معهد البحوث الطبية الحيوية (نيو جيرسي)29 ودراسة Deramecourt لعلم الأمراض الدماغية30، أكبر BBs في العالم ببساطة قطع المخ والاخين و الدماغ على طول خط الوسط (طائرة القوس). يتم تشريح نصف واحد الطازجة ثم جمدت للدراسات الكيميائية الحيوية، في حين يتم إصلاح الآخر في formalin لتقييم الهدولوجي. لذا، يتم إجراء التحليلات الكيميائية الحيوية والهوسولوجية بشكل منفصل في كل نصف الكرة الأرضية. يعتمد القرار فيما يتعلق بالجانب الثابت أو المجمد (الجانبي) على بنك المفرد31،32،33،34،35. كما العديد من الأمراض العصبية غير متناظرة, BB لدينا يقدم بروتوكول فريد من نوعه لشرائح العقول الطازجة: الأجزاء المجاورة من جذع الدماغ وكل نصف الكرة الأرضية هي بالتناوب ثابتة ومجمدة; شريحة ثابتة على نصف الكرة الأرضية واحد يقابل واحد المجمدة على نصف الكرة الآخر. من خلال هذه الطريقة ، يتم تحسين استخدام أنسجة الدماغ ، ويمكن تحقيق توصيف الأنسجة الكاملة لجميع المواد المجمدة مع إمكانية الحصول على ومقارنة المعلومات النسيجية والبيوكيميائية من جميع المناطق في نصفي الكرة الأرضية.
إطار مشروع بنك الدماغ لدينا هو بلدة آبياتيغراسو. Abbiategrasso هي بلدة صغيرة على بعد حوالي 22 كيلومترا جنوب غرب مدينة ميلانو، في شمال إيطاليا. يبلغ عدد سكانها حوالي 32,600 شخص. وهي موطن لمؤسسة غولجي-سينسي (GC). مؤسسة GC هي جزء من مستشفى كبير لإعادة تأهيل المسنين (ASP Golgi-Redaelli)، وهي معهد يركز على البحوث حول الشيخوخة ورعاية المسنين. ويركز بشكل خاص على دراسة الشيخوخة العقلية، والعوامل الاجتماعية والسلوكية التي تؤثر عليه، وعلم الأحياء وعلم الأمراض الكامنة وراء الاضطرابات العصبية المعرفية المعتمدة على العمر(1). وفي عام 2009، أطلقت مؤسسة GC دراسة طولية جديدة شارك فيها 1321 مشاركاً (من أصل 1644 موضوعاً مؤهلاً: معدل استجابة أولي قدره 80.3 في المائة) ولد بين عامي 1935 و 1939 (تتراوح أعمارهم بين 70-75 سنة)، من العرق القوقازي، ويعيش في نفس المنطقة الجغرافية الصغيرة. كانت الدراسة تسمى InveCe.Ab (Invecchiamento Cerebrale Abbiategrasso؛ باللغة الإنجليزية: Brain Aging Abbiategrasso , ClinicalTrials.gov , NCT01345110) وهي جارية حاليًا. InveCe.Ab ومن المقرر الحصول على الفوج مع أقصى قدر من التجانس والأقل تقلبا من أجل تقييم وقوع, انتشار والتاريخ الطبيعي للخرف, جنبا إلى جنب مع عوامل الخطر المحتملة أو الحماية, بما في ذلك السلوكية, النفسية والاجتماعية, المتغيرات السريرية والبيولوجية36. وتوجد خصائص الفوج في الشكل 1 والجدول 1. البيانات الوبائية تتفق مع اتجاه الخرف في السكان الأوروبيين37,38 و InveCe.Ab المشاركين لديهم خصائص وراثية وبيئية متجانسة, تمثل نموذجا جيدا لدراسة مسار من الشيخوخة الطبيعية إلى الاضطرابات العصبية المعرفية. والواقع أن السكان المتجانسين يحتاجون إلى عدد أقل من الأشخاص للوصول إلى قوة إحصائية كافية. وقد تم بالفعل الإبلاغ عن منهجية InveCe.Ab في مكان آخر36 ولكن من المهم التأكيد على نهجها متعدد الأبعاد من خلال الشيكات الدورية (كل 2-3 سنوات) باستخدام نفس المجموعة من التقييمات بما في ذلك: أخذ عينات الدم (لوحة التمثيل الغذائي، الحمض الهوموسيستين والفيتامينات، واستخراج الحمض النووي لملف Apolipoprotein E (APOE) وغيرها من الأشكال الجينية المتعلقة بالإدراك والشيخوخة)، والقياسات الأنثروبومترية (الوزن والطول والخصر)، والحديث أثناء اختبار المشي (اختبار المهمة المزدوجة)، مقابلة لتقييم نمط الحياة (الالتزام بالنظام الغذائي المتوسطي، ومستويات النشاط البدني والمشاركة المعرفية) والعوامل الاجتماعية (المشاركة الاجتماعية، والوحدة)، والتقييم العصبي العصبي إن مقارنة مثل هذه البيانات الطولية مع البيانات العصبية بعد الوفاة سيكون أمرًا حاسمًا للبحث. لذلك، فإن فريقنا وخاصة الدكتورة ميشيلا مانجيري تصور النهج العصبي المذكور أعلاه. منذ عام 2014 وخلال المتابعة الثانية ، طُلب من المشاركين InveCe.Ab التبرع بأدمغتهم ، وبالتالي تحقيق ولادة بنك الدماغ Abbiategrasso (ABB). الجهات المانحة الأساسية من ABB هي InveCe.Ab المشاركين ولكن ABB مفتوحة الآن للجهات المانحة المتطوعين الآخرين. هم مرضى من ASP Golgi-Redaelli، موطن للعديد من المرضى المصابين بأمراض عصبية مختلفة أو المتطوعين البالغين الذين يتعلمون عن مشروع ABB وينتمون إلى نفس المنطقة الجغرافية (Abbiategrasso والمناطق المحيطة). ويخضع جميع المانحين لنفس بروتوكول التقييم.
يقترح المؤلفون طريقة لتتبع المسارات الفردية للشيخوخة العادية والتقدم المحتمل إلى الأمراض غير السارية ، وإدارة ومعالجة وتوصيف الأدمغة المكتسبة من هؤلاء المانحين بعد طولية. وعلاوة على ذلك، فإن هدفنا هو الالتقاء وإشراك الأفراد في التقييمات العصبية الدورية، والحلقات الدراسية والأنشطة التعليمية المتعلقة برفاهية الدماغ، وزيادة وعيهم بالتبرع بالدماغ لأغراض البحث.
الخطوات الهامة في البروتوكول
هدفنا هو الحصول على، وتوصيف وتخزين أنسجة ذات نوعية جيدة قادمة من مواضيع ذات تاريخ مفصل مستمد من الملاحظة الطولية. ومن أجل بلوغ هذا الهدف، يلزم معالجة الجوانب الرئيسية التالية. وكما ورد أعلاه، يبدأ البروتوكول بتعيين المانحين، وهي الخطوة الحاسمة الأولى. ثم، فمن الضروري أن الجهات المانحة مواصلة برنامج المتابعة والحفاظ على الالتصاق إلى المشروع مع مرور الوقت حتى التبرع الفعلي للدماغ. وعند الوفاة، من الضروري أن يتم إخطار موظفي أي بي بي بسرعة من أجل عقد اجتماع لفريق التشريح في غضون 24 ساعة، مع ما إذا كان ذلك مهماً لجودة الأنسجة. قطع جديدة من نصفي الكرة الدماغية يتطلب يد ثابتة وتدريب محدد. لتجنب تلف الخلوية الناجمة عن تجميد بطيء والحصول على شرائح ذات نوعية جيدة للتبريد و Omics، من المهم أن يتم تجميدها بسرعة. النظر في سرعة اختراق حل formalin (1 مم / ساعة)، للحفاظ على antigenicity الأنسجة يتم الاحتفاظ الوقت نقع من شريحة واحدة في الحد الأدنى.
استكشاف أخطاء الأسلوب وإصلاحها
12 – ومن أجل التصدي للخطوات الحاسمة المذكورة أعلاه، نقدم النهج التالي. توظيف الجهات المانحة والالتزام بالمتابعة: هناك عدة عوامل تعوق التبرع بالدماغ بما في ذلك المخاوف من الإضرار بشخصية الجسم ونقاوته ونزاهته، أو إمكانية الشعور بالألم بعد الوفاة. حتى أن البعض قلقون من أن تشريح الجثة قد يتم بينما هم لا يزالون على قيد الحياة70,71. المخاوف من تعطيل ترتيبات الجنازة والعبء المالي هي أيضا الحاضر72. وعلاوة على ذلك، فإن عدم معرفة الموظفين الطبيين بإجراءات ما بعد الوفاة وعدم القدرة على معالجة شواغل المتبرعين المحتملين أو كرونة الـ 100 قد لا يشجعون على التسجيل. وقد تؤدي جميع هذه العوامل إلى انخفاض مستوى الوعي مع انخفاض عدد المشاركين المسجلين وارتفاع احتمال خسارة المانحين بمرور الوقت. وبالفعل، ينبغي أن يكون برنامج توظيف المانحين فعالا في نشر الوعي، وغرس الثقة، وإقناع الناس بالتسجيل والحفاظ على معدلات عالية من المشاركة في المتابعة. ومن واقع تجربتنا، يتم ذلك من خلال الاختيار الدقيق للمانحين المحتملين وشرحاً شاملاً لمقاصد BB. نحن نقدم أنشطة تعليمية ونهج التعاطفي لمعالجة مخاوف واحتياجات كل من الأشخاص الأصحاء والمتضررين من الأمراض العصبية وأسرهم. نجد أن المانحين المحتملين هم أكثر عرضة لإعطاء موافقتهم عند الاتصال بهم شخصيا. إن النهج المباشر يخلق علاقة قائمة على الثقة والاحترام المتبادلين وهو أمر أساسي لتحقيق نسبة عالية من التسجيل للتبرع الدماغي وتقييمات المتابعة. فريق عمل مدرب على درجة عالية من الحس الأخلاقي يقترب أولا من المتبرع المحتمل، ويناقش إمكانية التبرع بالدماغ بعد الوفاة، ويشرح قيمة أنسجة الدماغ البشري للبحوث العصبية العلمية، ويوضح أي شك فيما يتعلق بإجراءات ما بعد الوفاة. كلمة مواتية من الفم هو على نفس القدر من الأهمية. بعد حصاد الدماغ، يتم إيلاء الاهتمام المناسب والرعاية لإعادة تركيب الجثث. من المهم إظهار الاحترام والامتنان للشخص المتوفى من خلال علاج الجذافير بلطف. وبعد بضعة أشهر، من المقرر عقد اجتماع لإبلاغ نتائج التحليل العصبي عند الطلب من قبل أفراد الأسرة.
وقت الوفاة وحصاد الدماغ: عندما يقبل الشخص، يصبحون متبرعين ويُمنحون بطاقة هوية مع رقم للاتصال بـ 24 ساعة في اليوم، 7 أيام/أسبوع (رقم الاستقبال لمستشفى آسيا والمحيط الهادئ غولجي- ريدالي للشيخوخة الذي يرتبط بنا). وعلاوة على ذلك ، يتم إعطاء علامة لاصقة للأقارب لاستخدامها في حالة دخول المستشفى. وقد أُبلغت وكالات الجنازة في المنطقة في وقت سابق بإحضار الجثة إلى مرافق مصرف البحرين المركزي، حيث تم استدعاء فريق التشريح. يتكون فريق التشريح من أخصائي علم الأمراض، طبيب أعصاب و/أو أخصائي الأعصاب، وفني غرفة تشريحية، وهي قيد الاستدعاء من الساعة 6 صباحًا حتى الساعة 11 مساءً كل يوم. كما أن بعض الطلاب المتدربين موجودون بشكل متكرر للمساعدة في التقاط الصور.
يتم ضمان دقة واتساق إجراءات القطع الجديدة من خلال مشاركة نفس المشغلين (طبيب أعصاب وأخصائي أمراض) الذين طوروا الطريقة ولديهم عدة سنوات من الخبرة في علم الأمراض العصبية. عند تجميد الشرائح، يتم وضعها على صينية الألومنيوم prefrozen ومغطاة مع لوحة الألومنيوم المتشابكة للحفاظ عليها مسطحة بشكل جيد. بعد ذلك مباشرة، يتم وضعها في النيتروجين السائل لمدة 3 دقائق، قبل تخزينها في -80 درجة مئوية. يتم تغليف الشرائح التي سيتم إصلاحها بشكل فردي في الشاش ، وغارقة في محلول الفوريني المخزن بالفوسفات بنسبة 10٪، والذي يتم استبداله بعد يوم واحد. وبعد ذلك، يتم الاحتفاظ بها في شكليات في ما لا يزيد عن 5 أيام إضافية. ومع ذلك، بالنظر إلى أن حل formalin يخترق في 1 مم/يوم، نود أن تقصير مزيد من الوقت النقع.
قيود الطريقة
ولا تغطي طريقة البحث الموصوفة هنا سوى منطقة جغرافية محدودة، والأفراد المشاركين في برنامج التبرع لديهم خصائص لا تمثل بشكل كامل عامة السكان. على الرغم من أن أكثر من مقبول, فاصل ما بعد الوفاة تصل إلى 24 ساعة قد تنتج تغييرات في بعض هياكل البروتين, الإنزيمات والرنا من أنسجة الدماغ. قد لا يكون تحديد AFS وhh كافيًا تمامًا لتحديد جودة الأنسجة73 ، ونحن نعمل على تطوير طرق أخرى لتوثيق جودة الأنسجة استنادًا إلى سلامة الحمض النووي الريبي.
وفيما يتعلق بإجراء قطع الجزيئات الدقيقة، على الرغم من أنه مفيد جدا لإعادة بناء العلاقات التشريحية، تجدر الإشارة إلى أن استخدام التشظيات الصغيرة ليس بسيطاً، وهو يمثل بعض الصعوبات التقنية. طريقتنا صعبة وتستغرق وقتا طويلا. فالتكاليف مرتفعة جداً والتمويل ليس سهلاً دائماً. ويأتي التمويل في المقام الأول من القطاع العام (ASP Golgi-Redaelli Geriatric Hospital) والموارد الخاصة (مؤسسة غولجي – سينسي)، والتبرعات الخاصة، والمنظمات غير الربحية (مثل “Federazione Alzheimer Italia”) ومنح المشاركة.
أهمية طريقة ABB فيما يتعلق بالأساليب القائمة/البديلة
في البداية، استهدف برنامج التبرع الدماغي الأفراد المشاركين في الدراسة الطولية InveCe.Ab. ونتيجة لذلك، فإن الأدمغة المتبرع بها مصحوبة بمعلومات سريرية وبيولوجية واجتماعية مفصلة تم جمعها على مر السنين. تستمد قوة ABB على وجه التحديد من هذا الأصل المميز. والواقع أن دراسة مجموعة من الأشخاص ذوي الصلة اجتماعياً وجينياً الذين يشتركون في الخصائص البيولوجية والتعرض البيئي تعزز التحليل الإحصائي. وعلاوة على ذلك، تشمل الدراسة الفوائد التالية: 1) العناية باحتياجات المجتمع المحلي وتوفيرها (فعل “العطاء قبل السؤال”): يتلقى الناس فحصا دوريا مجانيا يتم إبلاغ الممارس العام به، ويقدم رقم هاتف سكرتيرنا للاستشارات، ويزور الأشخاص ذوي الإعاقة الشديدة في المنزل؛ (2) توفير خدمات الاستشارة في مجال الاستشارات. 2) إشراك المشاركين، والأشخاص الذين لهم أدوار عامة، والممارسون العامون في الأنشطة التعليمية من خلال تنظيم حلقات دراسية دورية (تتعلق بصحة الدماغ، والتبرع بالدماغ والصحة العامة)، وتخطيط دورات مواضيعية (مثل استخدام أجهزة تكنولوجيا المعلومات للمسنين)؛ 3) لقاء الناس واعتماد نهج وجها لوجه. وتشكل جميع هذه العناصر قوة مشروع ABB. وعلاوة على ذلك، يحسن المشروع القدرات السريرية للعاملين الطبيين المشاركين، حيث يكتسبون الخبرة في كل من تقييمات ما قبل الوفاة وتقييمات الأمراض العصبية بعد الوفاة. وفي هذا الصدد، نود أن نذكر التجربة الخاصة جداً “للدراسة البحثية المتعلقة بشيخوخة الأقليات”. وشملت هذه الدراسة عددا محدودا ومنتقى من الأميركيين الأفارقة المقيمين في منطقة شيكاغو (784 من أصل 1357 موضوعا مؤهلا: معدل استجابة قدره 57 في المائة). وقد تمت زيارة المشاركين سنويا فى منازلهم وطلب منهم الانضمام الى برنامج التبرع بال المخ . وتستند هذه الدراسة على نهج غير عادي مع بعض أوجه التشابه مع لنا الحصول على نسب عالية من الاستجابة الإيجابية لبرنامج التبرع بالدماغ (352 من أصل 784 مشاركا كانوا مسجلين: 44٪)، على الرغم من أن معدل تشريح الجثة لم يكن مرضيا تماما (53٪)74. تماما كما هو الحال في “دراسة أبحاث الشيخوخة الأقلية”، ونحن نقدم أنشطة تعليمية ونهج التعاطف، وتحقيق نتائج ممتازة. وعلى وجه الخصوص، فإن معدل استجابتنا هو 93%، ونسبة التسجيل هي 28.7%، ومعدل التشريح في الوقت الحالي هو 67%. وتبين هذه المعدلات أن المشاريع التي تشرك الناس بشكل مباشر لديها نسبة مئوية أكبر من التبرعات. برامج التبرع بالدماغ الأخرى ، مع اهتمام أقل في بناء علاقة مع المتبرعين المحتملين ، لديها عادة نسبة تسجيل منخفضة ، حيث تبلغ حوالي 10-15٪ أو أقل73،75.
هناك عدد قليل من الدراسات الفوج السابقة التي تنتهي بتحليل الأمراض العصبية. وعلاوة على ذلك، فإن غالبية بنوك الدماغ ومستودعاته تتركز على الأمراض، وهناك ندرة في أدمغة “السيطرة” من متبرعين أصحاء مقارنة بعدد الأدمغة “المريضة”. ويستند عدد محدود فقط من BBs على الدراسات السكانية التي تنطوي على كل من المواد المرضية والطبيعية من أجل دراسة مسارات الشيخوخة73،74،76،77،78،79،80. بعض الدراسات مثل “دراسة أبحاث الشيخوخة الأقلية” في الولايات المتحدةالأمريكية 74 و “دراسة Vantaa 85+ ” في فنلندا76 مشابهة لدراستنا ولكنها تميل إلى نفاد مع إنهاء الفوج. بدلا من ذلك، من المتصور أن يستمر برنامج التبرع في ABB لفترة طويلة في المستقبل، وتجنيد المتبرعين المحتملين وجدولة المتابعات حتى بعد انتهاء الدراسة الطولية InveCe.Ab. هذا النهج يجعل أسلوب التوظيف لدينا مشابهاً لأسلوب “معهد أبحاث الشمس الصحية (SHRI) برنامج التبرع بالدماغ” الذي يهدف إلى مجتمع التقاعد73. بروتوكول SHRI للتبرع الدماغي فعال جدا مع أقصر متوسط الفترة بعد الوفاة في العالم (3.92 ساعة). على غرار أكبر BBs في العالم ، فإن بروتوكول SHRI ببساطة قطع المخ المخيخ والمخيخ و الدماغ في خط الوسط (طائرة القوس) ، ثم يتم تشريح نصف جديد ومجمد للدراسات الكيميائية الحيوية ، في حين يتم إصلاح الآخر في الشكلين للتقييم الهستواثي. ومع ذلك، فإن أحد نقاط القوة في بروتوكول تشريح مبادرة المؤسسات الخاصة في مجال حقوق الإنسان هو تثبيت الشرائح الفردية بدلاً من نصف الكرة الأرضية بأكمله. في الواقع، تثبيت نصف الكرة الأرضية ككل ليس الأمثل، بسبب التدرجات التثبيت مختلفة بين السطح واللب. وعلاوة على ذلك، قد تتأثر البروتينات القشرية من التعرض لفترات طويلة لمحلول formalin. وهكذا، فإن السبب الذي قررناه لإصلاح شرائح فردية.
قرار أي جانب هو ثابت أو مجمد، يعتمد على بنك المفرد (دائما نفس، تعيين عشوائي أو تعيين اعتمادا على ما إذا كان يوم تشريح هو غريب أو حتى)31،32،33،34،35. لذلك، يتم إجراء التحليل الكيميائي الحيوي والهوسولوجي بشكل منفصل في كل نصف الكرة الأرضية. كما العديد من الأمراض العصبية غير متناظرة, لدينا BB يقدم بروتوكول فريد من نوعه لشرائح العينات الطازجة: يتم الاحتفاظ أقسام بديلة من جذع الدماغ ومن كل نصف الكرة الأرضية من المخيخ و المخيخ والمواد الثابتة أو المجمدة; شريحة ثابتة على نصف الكرة الأرضية واحد يقابل واحد المجمدة على نصف الكرة الآخر. طريقة لدينا يعطي الفرصة للحصول على توصيف كامل النسيجية لجميع المواد المجمدة ومقارنة النتائج من جميع المناطق من كلا الجانبين. كما قال في المقدمة، الطريقة الموصوفة تسمح لنا بالحصول على أكبر قدر ممكن من المعلومات من أنسجة الدماغ. وعلاوة على ذلك، فإن طريقة ABB تسفر عن توصيف أساسي ولكن كامل للأمراض العصبية، بما في ذلك تقريبا جميع أمراض البروتينات المعروفة في الدماغ وأمراض الأوعية الدموية. نظرا للدور المثير للجدل من إصابات الأوعية الدموية في تحديد ضعف الإدراك، قررنا استخدام تسجيل مزدوج لعبء الأوعية الدموية30،53.
وكما هو موضح في البروتوكول، فإننا نستخدم نهجا متعدد التخصصات. على الرغم من أن هذه طريقة تستغرق وقتا طويلا وشاقة، ونحن نعتقد أنه يوفر العديد من المزايا للبحوث. على سبيل المثال ، في عمل سابق ، أظهرنا أن tHcy عالية في حد ذاتها ، أو MTHFR C677T TT المرتبطة بأليل APOE-ε4 ، قد تكون ذات صلة باختلالات وظيفية تنفيذية بدلاً من فقدان الذاكرة81. لذلك، قد يكون من المثير للاهتمام لتقييم الموضوعات مع هذا الملف الوراثي خاصة على المستوى العصبي. وهذا مثال على مدى فائدة هذه المتابعة المتعمقة في إيجاد فرضيات بحثية جديدة يمكن التحقق منها من خلال التحقيق في المواد البيولوجية التي يتم جمعها في مصرفنا. ومن البرهان الآخر على ميزة نهجنا إدراج فريق قطر المعني بEG ضمن التقييمات التي نقوم بها بشكل روتيني، لإصالته وسهولة استخدامه النسبية. في الواقع، يكشف تخطيط الدماغ النشاط متشابك من قشرة الدماغ عن طريق تسجيل الإمكانيات الكهربائية من dendrites التي تنتمي إلى الخلايا العصبية الهرمية القشرية82. يمكن اعتبار QEEG علامة حيوية لتقدير النشاط المشبك القشري الذي يرتبط بالإدراك83. على وجه الخصوص، كان الانخفاض في إيقاعات ألفا في الجزء الخلفي من الدماغ مع زيادة عامة من الترددات المنخفضة (ثيتا وإيقاعات دلتا) مرتبطة بتعطل الاتصال القشري. وينبغي أن تعتبر أن معظم الدراسات الارتباط التشخيصي قد استندت إلى التشخيص السريري الذي هو فقط من المحتمل وليس تشخيص مؤكد84,85,86,87. فقط عدد قليل جدا من الدراسات المستهدفة قد قارنت بيانات QEEG مع الصورة العصبية للتحقيق في العلاقة بين QEEG وLTS المتغيرات88,89, والتمييز بين FTLD وD83. من خلال إنهاء دراستنا مع تعريف التشخيص العصبي ، ومن الممكن بعد ذلك لتفسير الملاحظات التي أجريت بشكل صحيح على النشاط الكهربائي الدماغي. وعلاوة على ذلك، أداء QEEG المسلسل في كل موضوع يمكننا تتبع مسار موجات EEG داخل الفردية وارتباطها مع الصورة العصبية. يمكن أن يؤدي اتباع التعديلات الفردية للنشاط الكهربائي القشري بمرور الوقت إلى فهم أفضل لمعانيه كعلامة حيوية للخرف المُبدا.
التطبيقات المستقبلية واتجاه الأسلوب
تنفيذ توزيع الأنسجة هو واحد من الأهداف الرئيسية المتوقعة. من أجل القيام بذلك، أنشأنا للتو لجنة علمية بما في ذلك مدير مؤسسة GC (طب الشيخوخة)، وهو أكاديمي من علم الأعصاب من جامعة بافيا، وطبيب أعصاب وأخصائي أمراض على حد سواء من مؤسسة GC ومستشفى الشيخوخة ASP Golgi-Redaelli. عند توزيع أنسجة المخ والشرائح النسيجية والعينات البيولوجية الأخرى، من المهم أن نتذكر أن المتبرعين وافقوا على التبرع من أجل البحث. ولذلك ينبغي أن يتم توزيع المواد بحكمة، تماما كما هو موضح في مدونة قواعد السلوك40لـ BNE . وينبغي لأي طرف يقدم طلباً للحصول على المواد أن يبين نوع العينة المطلوبة وكمية تلك العينات، وأن يقدم وصفاً لمشروع البحث، وكيف ستستخدم العينات، وأن يقدم، كلما أمكن، أدلة على المنشورات السابقة (للاطلاع على اتفاق النقل، انظر الشكل 9). بنك الدماغ لا يعمل لتحقيق مكاسب مالية. لذا، فإن الرسوم التي يدفعها الباحثون يجب أن تغطي فقط نفقات شراء الأنسجة ومعالجتها وتخزينها وتوزيعها.
خطط لبدء تحليل الحالات مع تسلسل exome وتقنيات Omics، مثل البروتيوميكس وعلم النسخ، هي في الحركة. وسوف تسمح منهجية أخذ العينات البديلة لدينا بإجراء دراسات أوميتش على أنسجة محددة جيداً من الناحية النسيجية من كلا نصفي الكرة الأرضية. ومن خلال هذا النهج، سيكون من الممكن مقارنة نمط تنشيط الجينات في مناطق مختلفة من الدماغ في نفس نصف الكرة الأرضية وفي المناطق المقابلة من نصف الكرة الغربي الآخر، وتكون قادرة على ربط تنشيط الجينات بعلم الأنسجة. وفي هذا المجال، ستكون تطبيقات التعلم العميق ذات أهمية كبيرة، بما في ذلك التحليل المحوسب للشرائح النسيجية والارتباط المتطور للبيانات السريرية والثنائية والبيانات العُمائية. ويمكن تحديد الارتباطات الأخرى بين العديد من المتغيرات المختلفة، فضلا عن التطبيقات التكنولوجية الأخرى الممكنة. وسيتيح توافر المواد المجمدة من نصفي الكرة الأرضية إمكانية وجود تضاريس دقيقة لتنشيط الجينات وتوزيع البروتين. وهذا سيكون من الأهمية الخاصة حتى في المواضيع الصحية، معتبرا أن كلا من وظائف الدماغ وبعض الأمراض غير متناظرة.
وعلاوة على ذلك، يمكننا الحصول على الثقافات الخلية من المتبرعين الدماغ تتميز بشكل جيد. في الواقع، الثقافات الخلية من leptomeninges من الأدمغة المقطوعة توريد الخلايا الحية التي يمكن استخدامها لمزيد من التحقيق في آليات المرض أو الشيخوخة، عن طريق الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) التكنولوجيا التي تنطوي على إعادة برمجة الخلايا الليفية leptomeningeal والتمييز بينها في الخلايا العصبية في النماذج المتقدمة90.
مع تقدم الأدمغة في العمر، يمكن أن تحدث ملامح مختلفة من التغيير على المستوى الجزيئي والخلوي والأنسجة. كل دماغ فريد من نوعه. كل لديه طريقته الخاصة في الاستجابة للضغوط الداخلية والخارجية. يقاوم البعض بينما يستسلم البعض الآخر ويعرض أمراضًا متميزة. التناقضات بين العرض السريري والصورة العصبية غالبا ما تكون موجودة لأن تضاريس الآفات، بدلا من طبيعتها الجزيئية، يحدد العرض السريري. لا يمكن تحقيق التشخيص الصحيح والمُحَدَد إلا من خلال الجمع بين المتلازمة السريرية والنتائج العصبية التي غالباً ما تضيف أدلة مسببة مهمة ضرورية لكشف التسبب في الأمراض. في أوروبا، هناك محاولة لخلق نهج قياسي لتشخيص الأمراض العصبية. يتبع بروتوكولنا التشخيصي بشكل كامل تقريبًا الإرشادات المنشورة مؤخرًا حول التشخيص العصبي للدماغالمصرفي 91. وهذا سيسمح لنا بجمع ومشاركة أنسجة الدماغ الموثقة جيدا، مع الهدف المحتمل المتمثل في إنشاء أول بنك الدماغ الإيطالي. في الواقع، في إيطاليا هناك مستودعات الدماغ ولكن ليس بنوك الدماغ على أساس الدراسات الأترابية. هدفنا هو تطوير طريقة لحصاد أنسجة الدماغ التي يمكن تنفيذها على نطاق واسع في جميع أنحاء إيطاليا، لإنشاء شبكة تستخدم بروتوكول مشترك وتشارك المواد المماثلة. ومن أجل القيام بذلك، فإن مشاركة مراكز البحوث الأخرى وإنشاء موقع شبكي محدد هما من بين الأهداف الرئيسية للمستقبل.
وتستخدم التكنولوجيات المبتكرة باستمرار لتحليل الطبيعة الجزيئية للأمراض العصبية و لتحديد العلامات البيولوجية. وفي هذا السياق، ستكون هناك حاجة متزايدة للأدمغة مصحوبة بمعلومات عن المسارات المعرفية والشيخوخة التي تم الحصول عليها من خلال الدراسات الطولية، مع التأكيد على أهمية النهج الوبائي الذي تم التحقق منه من الناحية العصبية92.
The authors have nothing to disclose.
ونود أن نكرس هذا العمل للدكتورة ميشيلا منجيري. قبل أن تموت قبل الأوان، حملت وبدأت مشروع بنك الدماغ آبياتغراسو.
ونحن ممتنون للمتبرعين لدينا الدماغ, الذين يساهم بسخاء في البحوث التبرع أنبل عضو من الجسم; بدونهم هذا البحث لن يكون ممكنا.
ونحن ممتنون لفاليريا مرزجالي على عملها الثمين في مشروع ABB.
يشكر المؤلفون البروفيسور يوهانس أتيمس، والدكتور باولو فوجياني، والدكتور جورجيو جياكون على توجيهاتهم الثمينة ومشورتهم الحكيمة.
نود أن نشكر الدكتورة أليس سيرينسيون والآنسة جوليا بورتون على مساعدتهما الثمينة طوال المشروع.
شكرا جزيلا للسيدة تيري كاساني على دعمها و “فيديرازيوني ألزهايمر إيطاليا” لتعاونها.
ويعرب المؤلفان عن امتنانهما للدكتور ماتيو موريتي والبروفيسور أنطونيو ماركو ماريا أوسكولاتي، من قسم الصحة العامة والطب التجريبي والطب الشرعي، جامعة بافيا.
50ml polypropilene conical tube 30x115mm | BD | 405253 | |
Anti-GFAP | Dako | Z0334 | policlonal primary antibody (anti-rabbit); dilution = 1:1000 |
Anti-NeuN (A60) | Chemicon | MAB377 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000 |
Anti-phospho TAU (AT8) | ThermoScientific | MN1020 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:200 |
Anti-phospho TDP-43 (pS409/410-2) | CosmoBio | TIP-PTD-P02 | policlonal primary antibody (anti-rabbit) ; dilution = 1:4000; pretreatment : Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6 |
Anti-α-SYN (KM51) | Novocastra | NCL-L-ASYN | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:500; pretreatment: 1) Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6 ; 2) 70% formic acid in H2O for 10 min |
Anti-βamyloid (4G8) | BioLegend | 800703 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000; pretreatment : 70% formic acid in H2O for 10 min |
Cutting board | BD | 352070 | |
DMEM High Glucose | Carlo Erba | FA30WL0101500 | medium |
Electrical saw with 5d blade | CEA | 06.06.14/06.00.16 | |
Electrode pH measure surface 12mm | CEA | 70064.250 HHH | |
Electrode pH needle | Fisher Scientific | 11796338 | |
EnVision+System-HRP | Dako | K4001 | secondary antibody (anti-mouse); dilution 1:2 |
EnVision+System-HRP | Dako | K4003 | secondary antibody (anti-rabbit); dilution 1:2 |
Ethylether | SMI | 8401530 | |
Feather safety trimming knife blade 14cm | Fisher Scientific | 11749798 | |
Fetal Bovine Serum | Carlo Erba | FA30WS1810500 | medium supplement; dilution = 20% |
Forceps 15cm surgical or anatomical | Uvex | 500XG | |
Gloves | CEA | 01.28.14 | |
Glue | Arcobaleno | 2624000800002 | |
Head supporter | Lacor | 60456 | |
L-Glutamine (100X) | Carlo Erba | FA30WX0550100 | medium supplement; dilution = 1% |
Measuring tape | CEABIS | CEATA34 | |
Non adsorbable monofilament black polyamide | UHU Bostik | 8000053131470 | |
Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140050 | medium supplement; dilution = 1% |
Pen/Strept Solution (100X) | Carlo Erba | FA30WL0022100 | medium supplement; dilution = 1% |
Spinal needle quincke tipe point 20GA 3.50IN 0.9x90mm | CEA | 03.06.16 | |
Sterile scalpel with n°21 blade | |||
Surgical basin | Olcelli Farmaceutica | A930857255 | |
Surgical mallet and surgical cisel | CEA | 79.68.88 | |
Surgical scissor | CEA | 27.08.45/79.68.64 | |
Feather | M130RC |