Denne protokol beskriver en metode til at spore individuelle hjerne-aldring baner gennem en hjernedonation program og korrekt karakterisering af hjerner. Hjernedonorer er involveret i en langsigtet langtidsundersøgelse, herunder serielle flerdimensionale vurderinger. Protokollen indeholder en detaljeret beskrivelse af hjernens behandling og en nøjagtig diagnostisk metode.
I en konstant aldrende befolkning, forekomsten af neurodegenerative lidelser forventes at stige. Forståelse af sygdomsmekanismer er nøglen til at finde forebyggende og helbredende foranstaltninger. Den mest effektive måde at opnå dette på er gennem direkte undersøgelse af syge og sunde hjernevæv. Forfatterne præsentere en protokol for at opnå, behandle, karakterisere og gemme god kvalitet hjernevæv doneret af personer, der er registreret i en antemortem hjernedonation program. Donationen programmet omfatter en ansigt-til-ansigt empatisk tilgang til mennesker, en samling af komplementære kliniske, biologiske, sociale og livsstil oplysninger og serielle multi-dimensionelle vurderinger over tid til at spore individuelle baner af normal aldring og kognitiv tilbagegang. Da mange neurologiske sygdomme er asymmetriske, tilbyder vores hjernebank en unik protokol til udskæring af friske prøver. Hjernesektioner af begge halvkugler er skiftevis frosset (ved -80 °C) eller fastgjort i formalin; en fast skive på den ene halvkugle svarer til en frossen på den anden halvkugle. Med denne fremgangsmåde kan der opnås en fuldstændig histologisk karakterisering af alt frosset materiale, og omics-undersøgelser kan udføres på histologisk veldefinerede væv fra begge halvkugler, hvilket giver en mere fuldstændig vurdering af neurodegenerative sygdomsmekanismer. Korrekt og klar diagnose af disse sygdomme kan kun opnås ved at kombinere det kliniske syndrom med den neuropatologiske vurdering, som ofte tilføjer vigtige æologiske spor, der er nødvendige for at fortolke patogenesen. Denne metode kan være tidskrævende, dyr og begrænset, da den kun dækker et begrænset geografisk område. Uanset dens begrænsninger, den høje grad af karakterisering det giver kan være givende. Vores ultimative mål er at etablere den første italienske Brain Bank, alt imens understreger betydningen af neuropatologisk verificerede epidemiologiske undersøgelser.
Ifølge WHO lider ca. 50 millioner mennesker i øjeblikket af demens, et tal, der forventes at blive tredoblet i 2050. Alzheimers sygdom er den vigtigste årsag til demens, efterfulgt af cerebrovaskulær sygdom og andre aldersrelaterede neurodegenerative lidelser. I 2017 udviklede WHO Det Globale Observatorium for Demens for at øge bevidstheden om demens og fremme en global handlingsplan mod det1. Hver enkelt har deres egen hjerne aldring bane, derfor søgen efter kuren kan være udfordrende på grund af kompleksiteten af patogenesen af neurodegenerative sygdomme. Måske, hver person besidder hende eller hans egen patogenese skrevet i hjernevævet kræver en personlig tilgang. Således, studiet af hjernevæv vil være nøglen til at forstå mekanismerne i neurodegeneration.
Ser man tilbage på historien om neurovidenskab, indser vi, at de mest imponerende og banebrydende opdagelser aldrig kunne have fundet sted uden direkte undersøgelse af den menneskelige hjerne. Gennem tiden har kilden til hjernevæv, der skal undersøges, ændret sig fra rå dissektioner, tilfældige “tilfældige møder” og i nogle tilfælde ulovlig handel til organiserede hjernesamlinger og strategiske moderne hjernebanker. Behandlingen af mange etiske aspekter er en af de vigtigste faktorer, der adskiller moderne hjernebanker fra fortidens hjernesamlinger. De første ægte moderne Brain Banks (BBs) blev indført i anden halvdel af det20. Nicholas Corsellis og Wallace Tourtelotte kan betragtes som pionerer inden for moderne hjernebank. I Storbritannien, Corsellis samlet en samling bedrift over 1000 veldokumenterede hjerner ramt med forskellige psykiske og neurologiske lidelser2. Desuden, Corsellis hjalp afsløre behovet for at bevare frisk hjernevæv i is af hensyn til biokemiske test3. I mellemtiden i USA, Wallace Tourtelotte indført antemortem hjernedonation programmer til at lette opfordring af potentielle hjernedonorer og sikre, at hjerner indsamlet er ledsaget af en komplet medicinsk og neurologiskhistorie 4,5. For et historisk overblik over hjernesamlinger og moderne BBs, se Carlos et al. 6.
Hvorfor har vi stadig brug for menneskelige hjerner? Hjernesygdomme kan kun gives en klar diagnose efter neuropatologisk undersøgelse. Neuropatologi udfordrer den kliniske diagnose og er nøglen til en korrekt fortolkning af de kliniske symptomer og til opdagelsen af de histologiske grundlag for nye syndromiske varianter. Diagnosen kan faktisk omdefineres på baggrund af det patologiske billede. Ikke desto mindre, obduktionsraten er faldet i de sidste årtier på grund af den seneste udvikling af innovative neuroimaging teknikker. Gennem hjernebilleddannelse kan de morfologiske, funktionelle og metaboliske ændringer i hjernen samt omfanget af proteins misfolding vurderes in vivo. Men in vivo neuroimaging og andre biomarkør undersøgelser kan kun give et “skøn” af det patologiske billede, da de ikke er i stand til at opdage subtile cellulære og molekylære ændringer. Fremskridt inden for molekylær billeddannelse og opdagelsen af nye biomarkører, målmolekyler og sporstoffer7 (f.eks. amyloid, TAU, mikrogliale sporstoffer) gør den menneskelige hjerne endnu mere uundværlig for fortolkningen af data fra kliniske evalueringer og biomarkørtest. Endvidere er omics-teknologierne (genomik, epigenomics, transskriptomik, metabolomik, proteomik, lipidomics, osv.), udført på friskogfrossen hjernevæv, åbnet nye muligheder for at forstå sygdomsmekanismer og opdage risikogener, nye diagnostiske og prognostiske markører, og potentiellelægemiddelmål 8,9,,10,11,12,13,14,15,16,17,18 , 19,,9,20,21,22,23.19
Til disse formål, moderne BBs arkiv vel karakteriseret, høj kvalitet hjernevæv gør dem tilgængelige for det videnskabelige samfund3,24. Hjerner, der leveres af BBs, skal ledsages af en komplet klinisk historie. Aktiviteten af en BB omfatter følgende: (1) Anerkendelse og rekruttering af syge og raske personer til hjernedonation programmer; den ideelle betingelse ville være at opnå en tværfaglig opfølgning af donorer gennem hele livet for at opnå en komplet klinisk, livsstil og social historie, og biomarkør profiler; faktisk, kognitive reserve og hjernestruktur afhænger af livsstil og socio-uddannelsesmæssige faktorer25,26, så disse oplysninger beriger de samlede data ved hånden. (2) Erhvervelse af hjernen (bestående af cerebrum, lillehjernen og hjernestammen) og relaterede væv (f.eks rygmarv, kranienerver og ganglier osv.) efter donorens død, alt imens standardiserede juridiske og etiske regler. (3) Passende behandling (dissektion, fiksering, frysning) af hjernen, som defineret i en standardiseret operativ protokol, for at opnå væv af høj kvalitet og for at give mulighed for fremtidig brug i tværfaglig forskning. (4) Detaljeret neuropatologisk karakterisering giver en endelig bestemt diagnose. (5) Opbevaring og distribution af vævsmateriale tilforskningsfællesskabet 27,28.
Alle BBs gemme både frosne og formalin-fast-paraffin indlejret væv. Hver BB har sin egen protokol. Bortset fra særlige undersøgelser, såsom den bihemisfæriske skæring protokol af Biomedical Research Institute (New Jersey)29 og Deramecourt’s undersøgelse af cerebrovaskulær patologi30, de største BBs i verden blot skære cerebrum, cerebellum og hjernestammen langs midterlinjen (sagittal plan). Den ene halvdel dissekeres frisk og derefter frosset til biokemiske undersøgelser, mens den anden er fastsat i formalin til histopatologisk vurdering. Så biokemiske og histopatologiske analyser udføres separat på hver halvkugle. Beslutningen om , hvilken side der er fast eller frosset (lateralitet), afhænger af entalsbanken31,32,33,34,35. Da mange neurologiske sygdomme er asymmetriske, tilbyder vores BB en unik protokol til udskæring af friske hjerner: tilstødende dele af hjernestammen og hver halvkugle er skiftevis faste og frosne; en fast skive på den ene halvkugle svarer til en frossen på den anden halvkugle. Gennem denne metode er brugen af hjernevæv optimeret, og en komplet histologisk karakterisering af alt frosset materiale kan opnås med mulighed for at opnå og sammenligne histologiske og biokemiske oplysninger fra alle områder af begge halvkugler.
Rammen for vores hjernebankprojekt er byen Abbiategrasso. Abbiategrasso er en lille by omkring 22 km sydvest for byen Milano, i det nordlige Italien. Det har en befolkning på omkring 32.600 mennesker. Det er hjemsted for Golgi-Cenci (GC) Foundation. GC Foundation er en del af et stort Rehabilitering Geriatric Hospital (ASP Golgi-Redaelli), og er et institut med fokus på forskning om aldring og pleje af ældre. Især fokuserer det på at studere mental aldring, de sociale og adfærdsmæssige faktorer, der påvirker det, og biologi og patologi underliggende aldersafhængige neurokognitive lidelser (NCDs). I 2009 lancerede GC Foundation en ny langsgående undersøgelse med 1321 deltagere (ud af 1644 støtteberettigede forsøgspersoner: indledende responsrate på 80,3 %) født mellem 1935 og 1939 (i alderen 70-75 år), af kaukasisk etnicitet, der bor i samme lille geografiske område. Undersøgelsen blev kaldt InveCe.Ab (Invecchiamento Cerebrale Abbiategrasso; på engelsk: Brain Aging Abbiategrasso, ClinicalTrials.gov, NCT01345110) og er i øjeblikket i gang. InveCe.Ab er planlagt til at opnå en kohorte med maksimal homogenitet og mindst variabilitet med henblik på at vurdere forekomsten, prævalens og naturlige historie af demens, sammen med dens mulige risiko eller beskyttende faktorer, herunder adfærdsmæssige, psykosociale, kliniske og biologiske variabler36. Kohortens karakteristika er vist i figur 1 og tabel 1. De epidemiologiske data er i overensstemmelse med demenstendensen iden europæiske befolkning 37,,38 og InveCe.Ab-deltagerne har homogene genetiske og miljømæssige egenskaber, der repræsenterer en god model til at studere forløbet fra normal aldring til neurokognitive lidelser. Homogene populationer kræver faktisk færre forsøgspersoner for at opnå tilstrækkelig statistisk effekt. InveCe.Ab-metoden er allerede blevet rapporteret andetsteds36, men det er vigtigt at understrege dens flerdimensionale tilgang gennem periodisk kontrol (hvert 2.-3. år) ved hjælp af det samme sæt evalueringer, herunder: blodprøvetagning (metabolisk panel, homocystein og vitaminer, DNA-ekstraktion til profil Apolipoprotein E (APOE) og andre genetiske polymorfier relateret til kognition og aldring), antropometriske målinger (vægt, højde og talje), Talking Mens Walking Test (dobbelt opgave test), et interview for at vurdere livsstil (Middelhavet kost overholdelse, niveauer af fysisk aktivitet og kognitive engagement) og sociale faktorer (social involvering, ensomhed), en neuropsychological evaluering og en klinisk generel undersøgelse. At sammenligne sådanne langsgående data med postmortem neuropatologiske data ville være afgørende for forskning. Derfor har vores team og især Dr. Michela Mangieri udtænkt den neuropatologiske tilgang, der er nævnt ovenfor. Siden 2014 og under den anden opfølgning, inveCe.Ab deltagerne blev bedt om at donere deres hjerner, og dermed skabe fødslen af Abbiategrasso Brain Bank (ABB). De centrale donorer af ABB er InveCe.Ab deltagere, men ABB er nu åben for andre frivillige donorer. De er patienter fra ASP Golgi-Redaelli, hjemsted for flere patienter ramt af forskellige neurologiske sygdomme eller voksne frivillige, der lærer om ABB-projektet og hører til det samme geografiske område (Abbiategrasso og omgivelser). Alle donorer gennemgår den samme evalueringsprotokol.
Forfatterne foreslår en metode til at spore individuelle baner af normal aldring og den mulige progression til NCDs, og præcist at styre, behandle og karakterisere hjerner erhvervet fra sådanne donorer fulgte langsgående. Desuden er vores mål at møde og engagere enkeltpersoner i periodiske neurologiske vurderinger, seminarer og uddannelsesmæssige aktiviteter vedrørende hjernens trivsel og at øge deres bevidsthed om hjernedonation til forskningsformål.
Kritiske trin i protokollen
Vores mål er at opnå, karakterisere og gemme væv af god kvalitet, der kommer fra emner med detaljeret historie stammer fra langsgående observation. For at nå dette mål er det nødvendigt at behandle følgende centrale aspekter. Som beskrevet ovenfor begynder protokollen med rekruttering af donorer, som er det første afgørende skridt. Derefter er det nødvendigt, at donorerne fortsætte opfølgningsprogrammet og opretholde vedhæftning til projektet over tid, indtil den faktiske donation af hjernen. På dødstidspunktet er det nødvendigt, at ABB-personalet straks underrettes for at indkalde obduktionsholdet inden for 24 timer, da det er vigtigt for tilstrækkelig vævskvalitet. Frisk skæring af hjernehalvdel kræver en rolig hånd og en specifik uddannelse. For at undgå cellulære skader forårsaget af langsom frysning og opnå god kvalitet skiver til kryostat og Omics, er det vigtigt, at de er frosset hurtigt. I betragtning af hastigheden af indtrængning af formalin opløsning (1 mm / time), for at bevare væv antigenicitet iblødsætningen tid af den enkelte skive holdes på sit minimum.
Fejlfinding af metoden
For at løse de kritiske trin, der er nævnt ovenfor, tilbyder vi følgende tilgang. Donor rekruttering og overholdelse af opfølgninger: Der er flere faktorer, der hindrer hjernedonation, herunder frygt for at beskadige kroppens figur, renhed og integritet, eller muligheden for at føle smerte efter døden. Nogle endda bange for, at obduktionen kan udføres, mens de stadig er ilive 70,71. Der er også72bekymring over afbrydelsen af begravelsesordninger og den finansielle byrde . Desuden kan et medicinsk personales manglende viden om postmortem-procedurer og den manglende evne til at løse potentielle donorers eller deres NOK’s problemer afskrække fra registrering. Alle disse faktorer kan give et lavt niveau af bevidsthed med et lavt antal tilmeldte deltagere og en stor mulighed for donortab over tid. Faktisk bør donor rekrutteringsprogrammet være effektiv til at sprede bevidsthed, indgyde tillid og overbevise folk til at registrere og opretholde en høj grad af opfølgning deltagelse. Det er vores erfaring, at dette sker gennem omhyggelig udvælgelse af potentielle donorer og grundig forklaring af BB’s formål. Vi tilbyder uddannelsesaktiviteter og en empatisk tilgang, der imødekommer frygt og behov hos både raske mennesker og dem, der rammes af neurodegenerative sygdomme og deres familier. Vi finder, at potentielle donorer er mere tilbøjelige til at give deres samtykke, når kontaktet personligt. En ansigt-til-ansigt tilgang skaber et forhold baseret på gensidig tillid og respekt, som er afgørende for at opnå en høj procentdel af registrering til hjernedonation og opfølgende vurderinger. Et højtuddannet personale med en stærk sans for etik nærmer sig først den potentielle donor, diskuterer muligheden for at donere hjernen efter døden, forklarer værdien af humant hjernevæv til neurovidenskabelig forskning og tydeliggør enhver tvivl om postmortem-procedurer. Gunstige ord i munden er lige så vigtigt. Efter hjernen høst, passende opmærksomhed og pleje gives til at komponere kadaver. Det er vigtigt at vise respekt og taknemmelighed over for den afdøde person ved at behandle kadaveren forsigtigt. Et par måneder efter, et møde er planlagt til at kommunikere resultaterne af den neuropatologiske analyse, når anmodet af familiemedlemmer.
Døds- og hjernehøsttid: Når personen accepterer, bliver de donor og får et id-kort med et nummer, der kan kontaktes 24 timer i døgnet, 7 dage om ugen (modtagelsesnummeret på ASP Golgi-Redaelli Geriatric Hospital, som er forbundet med os). Desuden gives en selvklæbende mærke til de pårørende, der skal anvendes i tilfælde af hospitalsindlæggelse. Begravelsen agenturer i området blev tidligere informeret til at bringe liget til ABB faciliteter, hvor obduktionen holdet er indkaldt. Obduktionsholdet består af en patolog, en neurolog og/eller en neurolog og en anatomisk rumtekniker, som er på vagt fra 06:00 til 11:00 hver dag; nogle praktikantstuderende er også ofte til stede for at hjælpe og tage billeder.
Præcisionen og konsistensen af de friske skæreprocedurer sikres ved inddragelse af de samme to operatører (en neurolog og en patolog), som har udviklet metoden og har flere års erfaring med neuropatologi. Når frysning skiverne, er de sat på en prefrozen aluminium bakke og dækket med en sikringsanlæg aluminiumsplade for at holde dem godt fladt. Umiddelbart efter sættes de i flydende nitrogen i 3 minutter, før de opbevares ved -80 °C. De skiver, der skal fastsættes, er individuelt pakket ind i gaze, og dyppet i en 10% fosfat buffered formalin opløsning, som erstattes efter en dag. Derefter holdes de i formali højst 5 ekstra dage; i betragtning af, at formalinopløsningen trænger ind ved 1 mm/dag, vil vi dog gerne forkorte iblødsætningstiden yderligere.
Begrænsninger af metoden
Den forskningsmetode, der er beskrevet her, dækker kun et begrænset geografisk område, og de personer, der er involveret i donationsprogrammet, har karakteristika, der ikke helt repræsenterer den almindelige befolkning. Selv om mere end acceptabelt, en postmortem interval op til 24 timer kan producere ændringer i nogle proteinstrukturer, enzymer og RNA af hjernevæv. Bestemmelsen af AFS og pH er muligvis ikke helt tilstrækkelig til at bestemmevævskvalitet 73, og vi udvikler andre måder at autentificere vævskvaliteten på baseret på RNA’s integritet.
Med hensyn til mikrotomskæringsproceduren, selv om det er meget nyttigt til rekonstruere anatomiske relationer, skal det bemærkes, at brugen af makrosektioner ikke er enkel og giver nogle tekniske vanskeligheder. Vores metode er udfordrende og tidskrævende. Omkostningerne er ret høje, og finansieringen er ikke altid let. Finansieringen kommer primært fra offentlige (ASP Golgi-Redaelli Geriatric Hospital) og private ressourcer (Golgi-Cenci Foundation), private donationer, non-profit organisationer (f.eks.”Federazione Alzheimer Italia”) og giver deltagelse.
ABB-metodens betydning for eksisterende/alternative metoder
I begyndelsen, vores hjernedonation program målrettet personer, der deltager i InveCe.Ab langsgående undersøgelse. Som følge heraf ledsages de donerede hjerner af detaljerede kliniske, biologiske og sociale oplysninger, der er indsamlet gennem årene. ABB’s styrke stammer netop fra denne karakteristiske oprindelse. Faktisk, studere en gruppe af socialt og genetisk relaterede mennesker, der deler biologiske karakteristika og miljømæssige eksponeringer øger statistisk analyse. Desuden omfatter undersøgelsen følgende fordele: 1) At tage sig af og sørge for samfundets behov (den handling at “give før du spørger”): folk modtager en gratis periodisk kontrol, som den praktiserende læge er informeret om, et telefonnummer på vores sekretær er fastsat for konsultationer, og alvorligt handicappede mennesker besøges i hjemmet; 2) Inddragelse af deltagere, personer med offentlige roller og alment praktiserende læger i uddannelsesaktiviteter gennem afholdelse af regelmæssige seminarer (relateret til hjernesundhed, hjernedonation og generel sundhed) og planlægning af tematiske kurser (f.eks. anvendelse af informationsteknologisk udstyr til ældre); 3) Møde mennesker og vedtage en ansigt-til-ansigt tilgang. Alle disse elementer udgør ABB-projektets styrke. Desuden forbedrer projektet de involverede medicinske medarbejderes kliniske evner, da de får erfaring med både antemortem-vurderinger og postmortem-neuropatologiske evalueringer. I den forbindelse vil vi gerne nævne den meget ejendommelige oplevelse af “Minoritets aldrende forskningsundersøgelse”. Denne undersøgelse omfattede et begrænset og udvalgt antal afroamerikanere, der bor i Chicago-området (784 ud af 1.357 støtteberettigede forsøgspersoner: svarprocent på 57 %). Deltagerne blev besøgt årligt hjemme og blev bedt om at deltage i hjernen donation program. Denne undersøgelse er baseret på en usædvanlig tilgang med nogle ligheder med vores opnå høje procentdele af positiv respons på hjernen donation program (352 donorer ud af 784 deltagere var tilmeldt: 44%), selv om obduktionen var ikke helt tilfredsstillende (53%)74. Ligesom i “The Minority aging research study”, tilbyder vi uddannelsesmæssige aktiviteter og en empatisk tilgang, der opnår fremragende resultater. Især er vores svarprocent 93%, tilmeldingsprocenten er 28,7%, og obduktionsprocenten i øjeblikket er 67%. Disse satser viser, at projekter, der direkte engagerer folk, har en større procentdel af donationer. Andre hjernedonation programmer, med mindre opmærksomhed i opbygningen af et forhold til potentielle donorer, generelt har en lav tilmelding procent, er omkring 10-15%eller mindre 73,75.
Der er få tidligere kohorte undersøgelser slutter med en neuropatologisk analyse. Desuden er de fleste af hjernen banker og depoter er sygdom-centreret, og der er en mangel på “kontrol” hjerner fra raske donorer i forhold til antallet af “syge” hjerner. Kun et begrænset antal BBs er baseret på befolkningsundersøgelser, der involverer både syge og normale forsøgspersoner med henblik på at studerealdrende forløb 73,74,76 , 77,,78,79,80.77 Nogle undersøgelser såsom “The Minority aging research study” i USA74 og “The Vantaa 85+ study” i Finland76 ligner vores, men de har tendens til at løbe tør med afslutningen af kohorten. I stedet er ABB’s donation program forestillet sig at fortsætte i lang tid i fremtiden, hverve potentielle donorer og planlægning opfølgninger selv efter afslutningen af InveCe.Ab langsgående undersøgelse. Denne fremgangsmåde gør vores rekrutteringsmetode svarer til “Sun Health Research Institute (SHRI) hjernedonation program”, som er rettet mod en pensionering samfund73. SHRI-protokollen for hjernedonation er meget effektiv med det korteste middeltidsinterval i verden (3,92 timer). I lighed med de største BBs i verden, SHRI protokollen simpelthen skære cerebrum, cerebellum og hjernestammen i midterlinjen (sagittal plan), så den ene halvdel er dissekeret frisk og frosset til biokemiske undersøgelser, mens den anden er fastsat i formalin for histopatologisk vurdering. Men en af styrkerne ved SHRI dissektion protokol er fiksering af de enkelte skiver i stedet for hele halvkugle. Faktisk er fiksering af en halvkugle som helhed ikke optimal, på grund af de forskellige fikseringsgradienter mellem overfladen og kernen. Desuden kan de kortikale proteiner blive påvirket af langvarig eksponering for formalinopløsningen. Således grunden til, at vi besluttede at fastsætte individuelle skiver.
Beslutningen om, hvilken side der er fastgjort eller frosset, afhænger af entalsbanken (altid den samme , tilfældigt tildelte eller tildelte, afhængigt af om dissektionsdagen er ulige eller lige)31,32,33,34,35. Så, biokemiske og histopatologiske analyse udføres separat på hver halvkugle. Da mange neurologiske sygdomme er asymmetriske, tilbyder vores BB en unik protokol til udskæring af friske prøver: alternative sektioner fra hjernestammen og fra hver halvkugle af lillehjernen og cerebrum bevares som fast eller frosset materiale; en fast skive på den ene halvkugle svarer til en frossen på den anden halvkugle. Vores metode giver mulighed for at opnå en komplet histologisk karakterisering af alt frosset materiale og til at sammenligne resultaterne fra alle områder af begge sider. Som sagt i indledningen, den beskrevne metode giver os mulighed for at få så mange oplysninger som muligt fra hjernevæv. Desuden giver ABB’s metode en grundlæggende, men komplet neuropatologisk karakterisering, herunder næsten alle kendte hjerneproteinopatier og vaskulær patologi. På grund af den kontroversielle rolle vaskulære skader i fastsættelsen af kognitiv svækkelse, besluttede vi at bruge en dobbelt scoring for denvaskulære byrde 30,,53.
Som forklaret i protokollen anvender vi en tværfaglig tilgang. Selv om dette er en tidskrævende og bearbejdede metode, mener vi, at det giver flere fordele for forskning. For eksempel, i et tidligere arbejde, viste vi, at høj tHcy i sig selv, eller MTHFR C677T TT forbundet med APOE-ε4 allel, kan være relateret til udøvende dysfunktioner snarere end hukommelsestab81. Derfor kan det være interessant at evaluere emner med denne særlige genetiske profil på et neuropatologisk niveau. Dette er et eksempel på, hvordan en sådan dybdegående opfølgning er nyttig til at skabe nye forskningshypoteser verificerbare gennem undersøgelse af biologisk materiale indsamlet i vores bank. En anden demonstration af fordelen ved vores tilgang er inddragelsen af QEEG blandt de vurderinger, vi rutinemæssigt udfører, for dens originalitet og den relative brugervenlighed. Faktisk, EEG registrerer den synaptiske aktivitet af hjernebarken ved at registrere de elektriske potentialer af dendritter, der tilhører kortikale pyramideformede neuroner82. QEEG kan betragtes som en biomarkør til estimering af kortikale synaptisk aktivitet , som er relateret til kognition83. Især har et fald i alfarytmer i den bageste del af hjernen med en generel stigning i lavere frekvenser (theta og delta rytmer) været relateret til kortikal forbindelse opdeling. Det bør overvejes, at de fleste diagnostiske korrelationsundersøgelser har været baseret på en kliniskdiagnose,der kun er en sandsynlig og ikke en bestemtdiagnose 84,85,86,87. Kun meget få målrettede undersøgelser har sammenlignet QEEG-data med det neuropatologiske billede for at undersøge sammenhængen mellem QEEG- og LTS-varianterne88,89og sondringen mellem FTLD og AD83. Ved at afslutte vores undersøgelse med en definition af den neuropatologiske diagnose, er det derefter muligt at fortolke observationerne på den cerebrale elektriske aktivitet korrekt. Desuden udfører seriel QEEG i hvert emne kan vi spore intra-individuelle EEG bølger bane og deres korrelationer med det neuropatologiske billede. Efter individuelle ændringer af kortikale elektriske aktivitet over tid kan føre til en bedre forståelse af dens betydning som en biomarkør for begyndende demens.
Fremtidige anvendelser og retning af metoden
Implementering af vævsfordelingen er et af vores vigtigste fremtidige mål. For at gøre dette, har vi netop etableret en videnskabelig kommission, herunder direktøren for GC Foundation (geriatrician), en akademisk af neurologi fra University of Pavia, en neurolog og en patolog både fra GC Foundation & geriatric Hospital ASP Golgi-Redaelli. Når du distribuerer hjernevæv, histologiske dias og andre biologiske prøver, er det vigtigt at huske, at donorer enige om at donation af hensyn til forskning. Distributionen af materiale bør derfor ske med forsigtighed, ligesom beskrevet i BNE’s adfærdskodeks40. Enhver part, der indgiver en begæring om materiale, skal angive typen og mængden af den nødvendige stikprøve, give en beskrivelse af forskningsprojektet, og hvordan prøverne vil blive anvendt, og så vidt muligt fremlægge dokumentation for tidligere publikationer (for overførselsaftalen, se figur 9). Hjernen banken virker ikke for økonomisk vinding. Så de gebyrer, der betales af forskerne bør kun dække udgifterne til væv udtagning, forarbejdning, opbevaring og distribution.
Planer om at begynde at analysere sager med exome sekventering og Omics teknikker, såsom proteomics og transskriptionomics, er i bevægelse. Vores alternative prøveudtagningsmetode vil gøre det muligt at udføre omics-undersøgelser på histologisk veldefinerede væv fra begge halvkugler. Gennem denne tilgang vil det være muligt at sammenligne mønstret for genaktivering i forskellige hjerneområder på samme halvkugle og i de tilsvarende områder af den anden halvkugle og være i stand til at korrelere genaktivering med histopatologi. På dette område vil deep learning applikationer være af stor interesse, herunder edb-analyse af histologiske dias og banebrydende korrelation af kliniske, histologiske og omics data. Andre korrelationer mellem mange forskellige variabler kan identificeres samt andre mulige teknologiske anvendelser. Tilgængeligheden af frosset materiale fra begge halvkugler vil give mulighed for en nøjagtig topografi af genaktivering og proteindistribution. Dette vil være af særlig interesse, selv i raske forsøgspersoner, i betragtning af at både hjernefunktioner og nogle sygdomme er asymmetriske.
Desuden kan vi få cellekulturer fra vel karakteriserede hjernedonorer. Faktisk cellekulturer fra leptomeninges af høstede hjerner levere levende celler, der kan bruges til yderligere undersøgelse af sygdom eller aldringsmekanismer, ved hjælp af den inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) teknologi, som indebærer omprogrammering leptomeningeal fibroblaster og differentiere dem i neurale celler i avancerede modeller90.
Som hjerner alder, forskellige profiler af forandring kan forekomme på det molekylære, cellulære og væv niveau. Hver hjerne er unik. Hver har sin egen måde at reagere på interne og eksterne stressfaktorer; nogle modstår, mens andre bukke under og vise forskellige patologier. Uoverensstemmelser mellem den kliniske præsentation og det neuropatologiske billede eksisterer ofte, fordi læsionens topografi snarere end deres molekylære karakter bestemmer den kliniske præsentation. Den korrekte og konkrete diagnose kan kun opnås ved at kombinere det kliniske syndrom med de neuropatologiske fund, som ofte tilføjer vigtige æologiske spor, der er nødvendige for at optrævle sygdomssogenese. I Europa gøres der en indsats for at skabe en standardtilgang til neuropatologisk diagnose. Vores diagnostiske protokol følger næsten helt de nyligt offentliggjorte retningslinjer for neuropatologisk diagnose for hjernebank91. Dette vil give os mulighed for at indsamle og dele veldokumenterede hjernevæv, med det fremadrettede mål at etablere den første italienske Brain Bank. Faktisk er der i Italien hjernelagre, men ikke hjernebanker baseret på kohorteundersøgelser. Vores mål er at udvikle en metode til hjernevævshøstning, der kan gennemføres bredt i hele Italien, for at etablere et netværk, der bruger en fælles protokol og deler sammenligneligt materiale. For at gøre dette, inddragelse af andre forskningscentre og oprettelsen af en bestemt hjemmeside er blandt de vigtigste mål for fremtiden.
Innovative teknologier anvendes konstant til analyse af neurodegenerative sygdommes molekylære karakter og til identifikation af biomarkører. I denne sammenhæng vil der være et stigende behov for hjerner ledsaget af oplysninger om kognitive og aldrende baner opnået gennem langsgående undersøgelser, understreger betydningen af en neuropatologisk verificeret epidemiologisk tilgang92.
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker at dedikere dette arbejde til Dr.ssa Michela Mangieri. Før hun døde for tidligt, hun undfanget og startede Abbiategrasso Brain Bank Project.
Vi er taknemmelige for vores hjernedonorer, som generøst bidrager til forskning, der donerer det ædleste organ i deres krop; uden dem ville denne forskning ikke være mulig.
Vi er Valeria Marzagalli taknemmelige for hendes dyrebare arbejde i ABB-projektet.
Forfatterne takker prof. Johannes Attems, Dr. Paolo Fociani og Dr. Giorgio Giaccone for deres dyrebare vejledning og kloge råd.
Vi vil gerne takke Dr.ssa Alice Cirrincione og Miss Giulia Bortone for deres dyrebare hjælp gennem hele projektet.
Mange tak til Fru Tere Cassani for hendes støtte og til “Federazione Alzheimer Italia” for sit samarbejde.
Forfatterne er taknemmelige for Dr. Matteo Moretti og prof. Antonio Marco Maria Osculati, Institut for Folkesundhed, Eksperimentel og Retsmedicin, University of Pavia.
50ml polypropilene conical tube 30x115mm | BD | 405253 | |
Anti-GFAP | Dako | Z0334 | policlonal primary antibody (anti-rabbit); dilution = 1:1000 |
Anti-NeuN (A60) | Chemicon | MAB377 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000 |
Anti-phospho TAU (AT8) | ThermoScientific | MN1020 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:200 |
Anti-phospho TDP-43 (pS409/410-2) | CosmoBio | TIP-PTD-P02 | policlonal primary antibody (anti-rabbit) ; dilution = 1:4000; pretreatment : Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6 |
Anti-α-SYN (KM51) | Novocastra | NCL-L-ASYN | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:500; pretreatment: 1) Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6 ; 2) 70% formic acid in H2O for 10 min |
Anti-βamyloid (4G8) | BioLegend | 800703 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000; pretreatment : 70% formic acid in H2O for 10 min |
Cutting board | BD | 352070 | |
DMEM High Glucose | Carlo Erba | FA30WL0101500 | medium |
Electrical saw with 5d blade | CEA | 06.06.14/06.00.16 | |
Electrode pH measure surface 12mm | CEA | 70064.250 HHH | |
Electrode pH needle | Fisher Scientific | 11796338 | |
EnVision+System-HRP | Dako | K4001 | secondary antibody (anti-mouse); dilution 1:2 |
EnVision+System-HRP | Dako | K4003 | secondary antibody (anti-rabbit); dilution 1:2 |
Ethylether | SMI | 8401530 | |
Feather safety trimming knife blade 14cm | Fisher Scientific | 11749798 | |
Fetal Bovine Serum | Carlo Erba | FA30WS1810500 | medium supplement; dilution = 20% |
Forceps 15cm surgical or anatomical | Uvex | 500XG | |
Gloves | CEA | 01.28.14 | |
Glue | Arcobaleno | 2624000800002 | |
Head supporter | Lacor | 60456 | |
L-Glutamine (100X) | Carlo Erba | FA30WX0550100 | medium supplement; dilution = 1% |
Measuring tape | CEABIS | CEATA34 | |
Non adsorbable monofilament black polyamide | UHU Bostik | 8000053131470 | |
Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140050 | medium supplement; dilution = 1% |
Pen/Strept Solution (100X) | Carlo Erba | FA30WL0022100 | medium supplement; dilution = 1% |
Spinal needle quincke tipe point 20GA 3.50IN 0.9x90mm | CEA | 03.06.16 | |
Sterile scalpel with n°21 blade | |||
Surgical basin | Olcelli Farmaceutica | A930857255 | |
Surgical mallet and surgical cisel | CEA | 79.68.88 | |
Surgical scissor | CEA | 27.08.45/79.68.64 | |
Feather | M130RC |