Generation af in-frame-Gensletnings mutanter i Pseudomonas aeruginosa og testning for virulens dæmpning i en simpel muse model af infektion

Summary

Her beskriver vi en enkel og reproducerbar protokol af musemodel af infektion til at evaluere dæmpning af de genetisk modificerede stammer af Pseudomonas aeruginosa i forhold til USA Food and Drug Administration (FDA)-godkendt Escherichia coli til kommercielle applikationer.

Abstract

Mikroorganismer er genetisk alsidige og forskelligartede og er blevet en vigtig kilde til mange kommercielle produkter og Biopharmaceuticals. Selv om nogle af disse produkter produceres naturligt af organismer, andre produkter kræver genteknologi af organismen til at øge udbyttet af produktionen. Avirulente stammer af Escherichia coli har traditionelt været de foretrukne bakteriearter til fremstilling af biofarmaceutiske; Men, nogle produkter er vanskelige for E. coli til at producere. Således kan Avirulente stammer af andre bakteriearter give nyttige alternativer til produktion af nogle kommercielle produkter. Pseudomonas aeruginosa er en almindelig og velstuderet gram-negativ bakterie, der kan udgøre et egnet alternativ til E. coli. P. aeruginosa er imidlertid et opportunistisk humant patogen. Her, vi detaljeret en procedure, der kan bruges til at generere ikke-patogene stammer af P. aeruginosa gennem sekventielle genomer sletninger ved hjælp af PEX100T-noti plasmid. Den største fordel ved denne metode er at producere en markør-fri stamme. Denne metode kan anvendes til at generere stærkt svækkede P. aeruginosa -stammer til fremstilling af kommercielle produkter eller til at designe stammer til andre specifikke anvendelser. Vi beskriver også en enkel og reproducerbar musemodel af bakteriel systemisk infektion via intraperitoneal injektion af validerede test stammer for at teste dæmpningen af den genetisk fremstillede stamme i forhold til den FDA-godkendte BL21 stamme af E. coli.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa er et opportunistisk bakterie patogen, der kan forårsage livstruende sygdomme hos mennesker, især i immunkompromitterede. Patogeniciteten af P. aeruginosa skyldes ekspression af mange virulensfaktorer, herunder proteaser og lipopolysaccharid, samt dets evne til at danne en beskyttende biofilm¹. På grund af sin evne til at producere virulensfaktorer og forårsage sygdom hos mennesker, ved hjælp af P. aeruginosa at gøre kommercielle produkter præsenterer sikkerhedsmæssige betænkeligheder. Ikke-patogene stammer af E. coli har traditionelt været anvendt til bioingeniør medicinske og kommercielle produkter til human brug. Men, nogle produkter er vanskelige for E. coli at gøre, og mange er pakket i inklusion organer, hvilket gør udvinding besværlig. Manipuleret bakteriestammer med evnen til at foretage og udskiller specifikke produkter er meget ønskværdigt, da sekretionen sandsynligvis ville øge udbyttet og lette rensnings processerne. Således, ikke-patogene stammer af andre arter af bakterier (f. eks arter, der udnytter flere sekretions veje) kan give nyttige alternativer til e. coli. Vi rapporterede for nylig om udviklingen af en stamme af P. aeruginosa, PGN5, hvor patogeniciteten og toksiciteten af organismen er stærkt svækket². Det er vigtigt, at denne stamme stadig producerer store mængder polysaccharidalginat, en kommercielt interessant bestanddel af P. aeruginosa biofilm.

Den PGN5 stamme blev genereret ved hjælp af en to-trins allelisk udveksling procedure med pEX100T-NotI plasmid til sekventielt slette fem gener (Toxa, plch, phzm, wapr, Aroa) kendt for at bidrage til patogenicitet af organismen. pEX100T-noti blev genereret ved at ændre SMAI til en noti restriktion enzym anerkendelse site inden for multiple kloning site af plasmid pEX100T, som blev udviklet i Herbert Schweizer Lab^3,4. Anerkendelses stedet for restriktions enzymet NotI er en sjældnere DNA-sekvens sammenlignet med SmaI og mindre tilbøjelige til at være til stede i sekvenser, der klones, således at det er mere bekvemt for kloning formål. Plasmid bærer gener, der giver mulighed for udvælgelse, herunder bla genet, som koder ß-lactamase og giver resistens over for carbenicillin, og B. subtilissacB genet, som giver følsomhed over for saccharose (figur 1A). Plasmid har også en oprindelse af replikation (ori) kompatibel med E. coli, og en oprindelse af overførsel (Orit), der giver mulighed for plasmid overførsel fra E. coli til Pseudomonas arter via konjugering. Plasmid mangler imidlertid en replikation, der er kompatibel med Pseudomonas, og kan derfor ikke replikere inden for Pseudomonas arter (dvs. det er en Pseudomonas selvmords vektor). Disse egenskaber gør pEX100T-NotI ideel til målretning af genetiske sletninger fra Pseudomonas kromosom. Plasmid klonings trin udføres ved hjælp af E. coli , og den resulterende plasmid overføres til Pseudomonas ved omdannelse eller konjugering. Derefter, gennem homologe rekombination begivenheder og selektive trin, den målrettede i-frame sletning genereres, markør-fri. Denne metode til sekventielt sletning af genomområder fra kromosom af P. aeruginosa kunne anvendes til at generere stærkt svækkede Pseudomonas stammer, som PGN5, eller til at designe stammer til andre specifikke anvendelser (f. eks. stammer mangelfuld i endonukleaser til plasmid formering eller stammer mangelfuld i proteaser til produktion af proteiner af interesse).

Den samlede virulens af bakteriestammer påvirkes af vækstbetingelser og-faser, hvor mutationer forekommer hyppigt. Derfor kan det være en udfordring at måle sikkerheden ved genetisk fremstillede stammer. For at evaluere bakterielle isolater til systemisk virulens tilpassede vi en tidligere offentliggjort infektions protokol ved intraperitoneal injektion af C57BL/6-mus⁵. Vi har ændret denne procedure for at bruge frosne bakterielle lagre til injektion, som tillod præcis dosering og nem validering af de anvendte stammer. I denne model, E. coli Strain BL21, som er blevet FDA-godkendt til produktion af biofarmaceutiske, blev brugt som en kontrol sikkerhedsstandard til bestemmelse af den relative patogenesen af stammen^6,7,8. Den største fordel ved at bruge denne metode er, at det er reproducerbare og minimerer kilder til variation, som inficerende stammer er valideret for bakteriecelle nummer, fænotype, og genetiske markører både før og efter infektion. Med disse kontrollerede trin reduceres antallet af dyr, der kræves. I denne model er P. aeruginosa -stammerne, der resulterer i C57BL/6 murine dødelighed lig med eller mindre end E. coli BL21, når de injiceres intraperitonealt, kan betragtes som svækket. Denne simple musemodel af infektion kan også anvendes til at vurdere den svækkede patogenicitet af genetisk manipulerede stammer fra andre arter ved hjælp af FDA-godkendt E. coli stamme som reference. Trin 1-7 detaljeret generering af sekventielle sletninger i p. aeruginosa (figur 1) og trin 8-12 detaljeret brug af en musemodel til at teste patogeniciteten af p. aeruginosa -stammerne.

Protocol

Før dyreforsøg påbegyndes, skal den protokol, der skal anvendes, godkendes af Udvalget for institutionel dyrepasning og-anvendelse (IACUC). Godkendelsen af den beskrevne protokol blev indhentet gennem IACUC på Marshall University (Huntington, WV, USA).

1. plasmid design

1. For at generere en genetisk sletning ved hjælp af pEX100T-noti plasmid, klon regionerne i DNA ledsage den ønskede sletning sekvens og indsætte i noti restriktion site af plasmid. Plasmid-indsatsen skal indeholde omkring 500 nukleotider opstrøms for målsekvensen direkte støder op til omkring 500 nucleotider nedstrøms for målet sletning sekvens. Derudover skal skæret indeholde NotI-genkendelses sekvensen (GCGGCCGC) ved dets 5 ' og 3 ' ender (figur 1B).

2. plasmid præparat

1. Løsningsmodel 1: Udnyt traditionelle klonings procedurer. Brug PCR til at forstærke genomområderne opstrøms og nedstrøms for det geniske gen, efterfulgt af crossover PCR^9,10 for at tilslutte sig de genererede fragmenter, begrænsnings endonukleasefordøjelsen af PCR-produktet og plasmid og ligering¹¹ (figur 1B, C).
2. Mulighed 2: efter at have designet sletnings sekvensen i silico, kontrakt en virksomhed, at de Novo syntetiserer det at indsætte i plasmid pEX100T-NotI. Mange virksomheder har strømlinet processen med kloning til hurtigt og effektivt at generere plasmid af interesse. Derudover kontrollerer sekvens plasmiderne for at være Mutations frie før levering.

3. E. coli -transformation

1. Transformér elektro kompetent E. coli med plasmid i henhold til producentens anbefalinger. Ved hjælp af en steril inokulerende løkke, stribe 10 μL af Transformations reaktionen for isolerede kolonier på en præ-opvarmet Luria bouillon (LB) agar plade suppleret med 100 μg/mL carbenicillin og Inkubér natten over ved 37 °C.
   Bemærk: alt udstyr og alle medier, der anvendes til dyrkning af bakterier, bør behandles i henhold til instituttets retningslinjer for sikkerhed.
2. Passage to gange.
   1. Fjern pladen fra inkubator og identificere en isoleret koloni. Ved hjælp af en steril inokulerende løkke, afhente kolonien og streak en præ-varmet LB agar plade suppleret med 100 μg/mL carbenicillin for isolerede kolonier. Inkuber natten over ved 37 °C. Gentag dette trin endnu en gang for at generere en ren kultur.
3. Ved hjælp af en steril inokulerende løkke, podes 5 ml lb med en enkelt koloni fra den endelige agar plade. Placer kulturen i en ryste inkubator ved 37 °C natten over. Den næste dag blandes 1 mL af denne kultur med 1 mL 5% i en cryovial og opbevares ved-80 °C for at generere et frossen lager af stammen.

4. klargøring af bakteriestammen og Triparental konjugering

1. Brug en enkelt isoleret koloni fra agar plader af følgende stammer til at inokulere bouillon kulturer og sted i en ryste inkubator natten over ved 37 °C.
   1. Tilsæt E. coli PEX100T-noti i 5 ml lb suppleret med 100 μg/ml carbenicillin.
   2. Tilsæt P. aeruginosa -stammen PAO1 i 5 ml Pseudomonas -isolations bouillon (PIB).
   3. Tilsæt E. coli prk2013 i 5 ml lb suppleret med 50 μg/ml kanamycin.
      Bemærk: prk2013 plasmid er en hjælper plasmid, der replikater i E. coli , men ikke P. aeruginosa; det bærer Trans-virkende overførsels gener, der mobiliserer pEX100T-NotI plasmid fra E. coli donor til P. aeruginosa modtager¹². P. aeruginosa er et biosikkerhedsniveau 2 (BSL-2) patogen. Følg instituttets retningslinjer for sikkerhed, når du arbejder med BSL-2-organismer.
2. Næste dag, fjerne overnight kulturer fra inkubator og tilsæt 0,5 mL af hver kultur til en 1,5 mL mikrocentrifuge tube. Centrifugeres ved 6.000 x g i 5 min. kassér supernatanten, og stop celle pellet i 50-100 μl lb.
3. Hele cellesuspensionen afpipetteres i én dråbe på en præ-opvarmet LB-agar plade. Lad dråbe tørre. Vend derefter pladen og Inkuber ved 37 °C i 4-6 h.
4. Efter inkubationen anvendes en steril inokulationsløkke til opsamling af cellerne i 1 mL LB i et mikrocentrifuge glas. Pipetten op og ned for at blande cellerne.
5. Ved hjælp af en celle spreder, streak celler jævnt på en tør præ-varmet Pseudomonas isolation agar (Pia) plade suppleret med 300 μg/ml carbenicillin. Streak flere plader med stigende mængder af celle blandingen (f. eks 10 μL, 100 μL, 500 μL). Inkuber natten over ved 37 °C.

5. påvisning af enkelt-crossover-Rekombinanter af P. aeruginosa

1. Fjern pladerne fra inkubator og Undersøg for isolerede carbenicillin-resistente kolonier. Fordi pEX100T-NotI plasmid ikke kan replikere i P. aeruginosa, kolonier, der voksede på carbenicillin-suppleret plader skulle være opstået fra celler, hvor plasmid blev integreret i kromosom.
   1. Vælg mindst 4 af disse kolonier og stribe for isolation på præ-varmede plader af PIA suppleret med 300 μg/mL carbenicillin. Inkuber pladerne natten over ved 37 °C.
2. Fjern pladerne fra inkubator og Undersøg for vækst. Carbenicillin-resistente kolonier bør være enkelt-crossover-rekombinanter (dvs. de har indarbejdet plasmid i kromosom via en rekombinationhændelse mellem en homologe region af plasmid-skæret og kromosom af P. aeruginosa).
   1. Patch 8 eller flere kolonier med sterile tandstikker på forvarmede plader af: 1) PIA suppleret med 300 μg/mL carbenicillin og 2) PIA suppleret med 300 μg/mL carbenicillin og 10% saccharose (uden glycerol).
   2. Hvis ingen koloni vækst blev opnået fra trin 5,1, gentages konjugering og øge mængden af celle blandingen strippet i trin 4,5. Hvis der er for meget vækst, gentages konjugering og Nedsænk lydstyrken.
   3. Hvis konjugering gentagne gange mislykkes, forberede elektro kompetente celler af P. aeruginosa stamme og omdanne direkte med PEX100T-noti plasmid. Detaljerede protokoller til fremstilling af elektro kompetente P. aeruginosa og transformation er tilgængelige andetsteds^13,14.
3. Inkuber pladerne ved 37 °C natten over.
4. Fjern pladerne fra inkubator og Undersøg for vækst. Ægte enkelt-crossover rekombinanter vil være carbenicillin-resistente og saccharose-følsomme (dvs. kolonier, der voksede på PIA suppleret med carbenicillin, men ikke vokse på PIA suppleret med carbenicillin og saccharose).
   1. Vælg 4 eller flere ægte enkelt-crossover rekombinanter og inokulere hver i 5 mL LB uden valg. Inkubér i en ryste kubator ved 37 °C natten over.
   2. Hvis der ikke blev detekteret enkelt-crossover-rekombinanter, gentages konjugering.

6. påvisning af dobbelt-crossover-Rekombinanter af P. aeruginosa

1. For hver bouillon kultur, inokulere 10 μL af kulturen på en præ-opvarmet plade af PIA suppleret med 10% saccharose (uden glycerol) og streak for isolerede kolonier. Inkuber pladerne natten over ved 37 °C.
2. Den næste dag, fjerne plader fra inkubator og inspicere dem for vækst. Saccharoseresistente kolonier skal være dobbelt-crossover-rekombinanter (dvs. have fjernet plasmid fra kromosom via en rekombinationhændelse mellem den anden homologe region af plasmid-skæret og P. aeruginosa -kromosom).
   1. Patch mindst 20 kolonier med sterile tandstikker på forvarmede plader af: 1) PIA, 2) PIA suppleret med 10% saccharose (uden glycerol), og 3) PIA suppleret med 300 μg/mL carbenicillin.
3. Inkuber pladerne natten over ved 37 °C.
4. Fjern pladerne fra inkubator og Undersøg dem for vækst. Ægte dobbelt-crossover rekombinanter vil være carbenicillin-følsomme og saccharose-resistente (dvs. kolonier, der voksede på PIA og PIA suppleret med saccharose, men ikke vokser på PIA suppleret med carbenicillin).

7. bekræftelse af gensletning via koloni PCR

1. Forbered 10-20 kolonier til en sletnings skærm med PCR.
   1. Pick up væksten fra en mistænkt dobbelt-crossover rekombinant med en steril tandstikker og suspendere celler i 50 μL af 1x fosfat bufferet saltvand (PBS). Kog suspensionen ved 100 °C i 10 min., centrifuge i 3 min ved 13.000 x g, og Placer derefter på is.
2. Udfør PCR til Screen kolonier for målrettet sletning.
   1. Brug 1 μL af supernatanten som skabelon i en PCR-reaktion på 25 μL for at bekræfte sletningen af det interessante gen.
   2. Brug gen-specifikke primere, der forstærker regionen af genomslettelsen. Brug primere, der forstærker regionen af genomsletning plus 100-200 BP af ledsage upstream og downstream sekvenser.
   3. Forbered en separat kontrol PCR-reaktion med Stam stammen (f. eks. PAO1).
      Bemærk: termocycler forholdene vil variere afhængigt af den optimale udglødnings temperatur for primer-par, den anvendte polymerase-cocktail og længden af den region, der skal forstærkes.
3. Udfør agrose gel elektroforese på PCR-produkterne. Kolonier, hvor interesseområdet er blevet slettet, giver mindre amplifikationprodukter end kolonier, der mangler sletningen (figur 2).
4. Vælg en eller flere kolonier med PCR-bekræftet sletning. Streak for isolerede kolonier på en præ-opvarmet PIA plade (r) og Inkuber ved 37 °C natten over.
5. Passage mindst én gang mere. Fjern pladen (erne) fra inkubator og Identificer en isoleret koloni. Ved hjælp af en steril inokulerende løkke, afhente kolonien og streak en præ-varmet PIA agar plade til isolerede kolonier. Inkuber natten over ved 37 °C.
6. Vælg en koloni fra hver sidste plade og brug den til at inokulere 5 mL PIB. Placer i en ryste inkubator ved 37 °C natten over.
   1. 1 mL af denne kultur blandes med 1 mL 5% skummetmælk i en cryovial og opbevares ved-80 °C for at generere en bestand af stammen.
   2. Ved hjælp af denne kultur, forberede genomisk DNA fra stammen (f. eks ved hjælp af en DNA rensning Kit). Amplificere genomsletnings regionen ved hjælp af PCR og primere, som er specifikke for den pågældende region.
      1. Disse PCR-produkter (f. eks. med et DNA-rensningssæt eller phenol-chloroform ekstraktion) og enten sekvens direkte med de gen-specifikke primere eller ligeret i en vektor til sekvensering med plasmid-specifikke primere.
7. Når gensletningen er bekræftet gennem sekvensering, gentages denne procedure med den nye sletnings stamme for sekventielt at generere mange markør frie genomsletninger. Når den ønskede stamme genereres, skal du bruge hele genomsekvensering til at verificere de målrettede sletninger og til at registrere andre ændringer af genomet (sammenlignet med reference stammen, f. eks. PAO1), der opstod under hele processen. Når du har kommenteret generne, skal du deponere sekvensen i generbank og registrere tiltrædelses numrene.

8. fremstilling af bakteriestamme til dyreforsøg

1. For at teste for svækket patogenicitet af P. aeruginosa stammer, først forberede validerede kulturer og bestande. Forbered p. aeruginosa stammer af interesse, en vild-type stamme af p. aeruginosa (virulent), og en FDA-godkendt stamme af E. coli (f. eks, BL21) til at fungere som en ikke-patogene sikkerhedskontrol.
2. Stribe stammer af bakterier, der testes på selektiv agar fra sekvenserede og validerede frosne bestande. Inkuber ved 37 °C natten over.
3. Med en steril inokulerende løkke, afhente en enkelt koloni fra hver stamme og stribe for isolerede kolonier på selektive medier igen. Inkuber ved 37 °C natten over.
4. Fjern pladerne fra inkubator. For hver stamme, Vælg en enkelt koloni og stribe for isolation på LB plader.
5. Efter 24 timers vækst ved 37 °C inokulerer en 500 mL kolbe indeholdende 250 mL LB med et enkelt koloni isolat fra hver stamme.
   1. Valideringstrin: ved hjælp af resterne af den samme koloni, validere stammen ved hjælp af PCR og stamme-specifikke primere, og/eller primere til at kontrollere tilstedeværelsen af genetiske modifikationer foretaget til stammen. Brug primere nedenfor til verifikation af stammer i eksemplet præsenteret:
      E. coli BL21:
      T7 polymerase F:TGGCTATCGCTAATGGTCTTACG
      T7 polymerase R:TTACGCGAACGCGAAGTCC
      
      VE2 og PGN5:
      Aroa F: GCGAACGCCAACAGCCGATAAAGC
      Aroa R: ATCTGGCTCGCGATGCCGGTCC
6. Der Inkubér kulturerne i en ryste inkubator ved 160 rpm og 37 °C, indtil de når væksten i logfasen (dvs. OD₆₀₀ -måling på 0,4-0,6 på et spektrofotometer).
7. Ved hjælp af OD₆₀₀ -værdien, der blev opnået, da logfasen blev opnået, beregnes den mængde bouillon, som kræves for at give 2,5 x 10⁹ KOLONIDANNENDE enheder (CFU) pr. ml. Pellet mængden af bouillon beregnet i 50 mL rør ved 4.500 x g i 10 min.
8. Supernatanten kasseres, og pelleten opslæmmes i et rør med 50 mL 1x PBS til vask af cellerne. Centrifugeres igen ved 4.500 x g i 10 minutter.
9. Supernatanten kasseres, og pelleten opslæmmes i 25 mL 5% skummetmælk i 1x PBS.
   1. Valideringstrin: Brug en prøve af 25 ml opblanding til at udføre levedygtige kimtal for at bestemme antallet af CFU/ml.
10. Alikvot 25 ml skummetmælks kultur opblanding i 2 ml kultur bestande i 2 ml kryovialer. Flash fryse i flydende nitrogen og opbevares ved-80 °C mindst natten før brug.

9. validering af vækst og stamme af bestande oplagret til dyreforsøg.

1. For hver stamme, der skal testes, fjernes mindst 3 kryovialer af frosne bestande fra-80 °C-opbevaring og tø ved 4 °C i 2-4 h. Hvis en frosset bestand forbliver, kort varm ved 37 °C.
2. Tag små prøver fra hver cryovial for at validere hver stamme.
   1. Udfør levedygtige kimtal for at bestemme antallet af CFU/mL. Det er normalt at have færre CFU/mL efter frysning, på grund af døden af nogle bakterieceller.
   2. Brug PCR-og stamme specifikke primere til at validere hver stamme.
   3. Streak hver stamme på selektive medier for at verificere fænotype.
3. Efter at have bekræftet, at stammerne er af den korrekte genotype og fænotype, og validere CFU/mL, skal du fortsætte til dyreforsøg.

10. inokulering af dyr med bakteriestammer ved injektion

1. Om morgenen af injektioner, fjerne cryovials af bakteriestammer testes og tø ved 4 °C for 3-4 h. tø 0,5 mL for hver mus, der vil blive injiceret. Opbevar hætteglassene på is efter optøning og injektion af mus inden for 2 timer.
2. Efter optøning overføres hver cryovial til et nyt 2 mL rør og centrifugeres ved 4.500 x g i 10 min., kassér supernatanten, og resuspension af celle pellet i 1 ml 1x PBS.
3. Centrifugeres igen ved 4.500 x g i 10 m. kassér supernatanten, og opstop pellet i 1x PBS til en endelig koncentration 2,5 x 10⁹ CFU/ml. For at bestemme mængden af 1x PBS, der er nødvendig for resuspension, skal der anvendes CFU/mL-data fra levedygtige kimtal på frosne bestande i trin 2.2.1. Den nøjagtige mængde 1x PBS anvendes vil variere lidt mellem stammer.
   1. Tag 3 prøver fra den endelige suspension af hver stamme for at validere CFU/mL, genotype og fænotype som beskrevet ovenfor.
4. For hver stamme, alikvot 1,5 ml PBS/cellesuspension i et 2 ml rør pr 5 mus for at begrænse antallet af gange røret er indtastet. Også forberede rør af 1x PBS til kontrol injektioner.
5. Saml mus (10 mandlige og 10 kvindelige C57BL/6 per gruppe for dette eksperiment) og nødvendige materialer til injektioner (sprøjter, nåle, skarpe beholdere, markører, pen og papir osv.). Flytte til det sterile dyr kirurgisk rum. Tør alle overflader med rensnings servietter.
   1. For at eliminere angst og risiko for skade på experimenter, kun bringe et køn og eksperimentel gruppe af mus til operationsstuen på et tidspunkt (f. eks en gruppe af 10 mandlige mus til at være inficeret med en bestemt stamme). Bær to par latex handsker for at eliminere punktering af handsker, hvis det er bidt. Bær Lab Coat, sikkerhedsbriller, og ansigtsmaske for at undgå kontaminering.
6. Start injektioner af kontrolgruppen med 1x PBS. Dette vil fastslå, om eventuelle negative virkninger skyldes injektion alene.
   1. Fjern en mus fra buret. Fjern kun én mus ad gangen.
   2. Veje musen og markere sin hale med permanent markør til at spore for vægttab efter injektion.
   3. Åbn en ny 1 mL sprøjte og 27 G nål (brug en ny sprøjte og nål til hver mus for at eliminere kontaminering) og Injicer 200 μL steril 1x PBS.
      1. Grib musen bag ørerne ved hjælp af tommel-og pegefinger. Knib for at skabe hudfold på nakken for at holde på-en strammere fold reducerer nakke bevægelsen og risikoen for at blive bidt under injektionen. Fastgør halen i håndfladen ved hjælp af Pinky at holde musen fladt med lidt bevægelse.
      2. Drej musen over og Indsæt nålen ved 30 ° vinkel i peritonealhulen til venstre eller højre side af midterlinjen. Løft nålen en smule, når den er indsat for at sikre, at den blev indsat i intraperitoneal området og ikke i organer. Injicer langsomt PBS og træk derefter nålen tilbage.
      3. Anbring den brugte nål i en udpeget beholder til fare for Biohazard-skarpe genstande. Du må ikke genbruge sprøjten eller nålen. En bold på injektionsstedet er typisk.
   4. Flyt musen til et separat bur efter injektionen.
   5. Gentag proceduren med den næste mus. Efter alle mus i et bur injiceres, returnere dem til deres oprindelige bur straks.
7. Efter injektion af kontrolgruppen, begynde at injicere suspensioner af stammer, der skal testes efter samme procedure.
   1. Injicer 200 μL af cellesuspensionen. Når du begynder med celle suspensioner af 2,5 x 10⁹ CFU/ml, hver mus modtager 5 x 10⁸ CFU.
      Bemærk: disse koncentrationer blev optimeret med foreløbig dyreforskning for at bestemme dødelige doser af hver stamme. Det kan være nødvendigt at justere doseringen for andre stammer/arter.
8. Når alle injektioner er afsluttet, returnere mus til huset plads til at lindre angst. Rengør arbejdsområde med sanitære klude.
9. Overvåge dyrene for dødelighed efter injektion ved at kontrollere bure for døde mus hver 3 h for 72 h og hver 12 h i 10 dage. Optag vægten af mus hver 12 h til at bestemme vægttab på grund af sygdom.
10. Optag negativ adfærd i timer efter injektion, såsom forskel i kropsholdning, mangel på grooming eller burroning, immobilitet, eller ændringer i vejrtrækningen. Mus, der dødsfaldet fra skade forbundet med injektion vil udvise negativ adfærd og dø hurtigt efter injektion. På den anden side, mus, der dødsfaldet fra infektion vil ikke begynde at udvise negativ adfærd eller død indtil efter 18 h. Alle mus, der udviser uønsket adfærd eller omfattende tegn på sygelighed, herunder hurtig eller besværet respiration, immobilitet, jagtet kropsholdning, sunkne øjne, svær dehydrering eller andre, bør aflives for at reducere unødvendig lidelse (som kompatibel i vores godkendte IACUC-protokoller). Men i vores eksperimenter, euthanization var ikke nødvendig for nogen mus under forsøget. Overlevende mus blev aflives 10 dage efter afslutningen af testen.
11. Efter den 10-dages overvågningsperiode tillader dyrene at forblive fuldt ud og bliver klar over enhver infektion, som indgives under testen. Euthanize dyr efter IACUC procedure.

11. statistisk analyse af dyre dødelighed

1. Udføre statistisk analyse ved hjælp af graftegning software. Enhver software, der kan producere grafer og udføre statistisk analyse er egnet.
2. Hvis du vil afbilde dødeligheds dataene, skal du bruge kolonnen X til at repræsentere time (h) og Y-kolonnen til at repræsentere de testede grupper.
3. Repræsentere hver mus eller emne i studiet ved hjælp af kode = 0 (nul) eller kode = 1, der angiver overlevelse eller død, hhv.
   1. For hvert dyr, der dør, Placer en 1 i Y kolonne af denne gruppe på tidspunktet for døden på X kolonne. Hvis der er flere dødsfald på et enkelt tidspunkt i en gruppe, kan en kopi af dette tidspunkt placeres i X-kolonnen. For eksempel, hvis tre i en gruppe dør på 3 h, 3 h tidspunkt vises tre gange i X kolonne.
   2. For alle overlevende dyr i en gruppe, Placer et nul i Y-kolonnen på det sidste tidspunkt målt. For eksempel, hvis fire mus overlever, Placer fire sluttidspunkt punkter i X kolonne markeret med fire nuller i Y kolonne.
4. Når der er indtastet data for dyr for alle grupper, skal du bruge en overlevelses graf skabelon til at producere en overlevelses graf.
   1. Lad standardkodning være 0 og 1.
   2. Angiv parametrene for grafen som procent.
5. Når parametre for overlevelse kurve er valgt, udføre statistisk analyse ved hjælp af en Mantel-Cox (log Rank) test.
6. Formatér Kaplan-Meier-plots ved hjælp af statistiske data.
   Bemærk: stammer, der udviser dødelighedsrater, der er mindre end eller lig med Stam stammen og den FDA-godkendte stamme (f. eks. e. coli BL21), kan betragtes som svækket.

12. visualisering af infektionen med bioluminescens

1. At visualisere forløbet af infektionen, indsætte en kromosomal bioluminescerende operon (Luxcdabe) i PGN5 og VE2 stamme testet. Plasmider og protokollen bruges til at mærke disse stammer blev udviklet i Schweizer Lab og kan ikke være kompatibel med alle arter/stammer af bakterier¹³. Vigtigere, visualisering af infektionen er valgfri; Genomisk indsættelse af denne operon er således ikke nødvendig for at udføre den ovenfor beskrevne dødeligheds undersøgelse.
2. Forbered og Valider stammer ved hjælp af den ovenfor beskrevne metode. Kontroller desuden for bioluminescens i mærkede stammer ved hvert valideringstrin.
3. Når stammerne er tilberedt, indsprøjtes dyrene i grupper på 10 med de bioluminescerende stammer efter trinene ovenfor.
4. Billede dyrene hver 3 h for 24 h ved hjælp af et animalsk billedsystem stand til bioluminescens.
   1. Først forberede Imager ved at indstille kameraets parametre og opvarmning scenen for dyrene. Indstil også ilttilførslen til 1,5 L pr. minut (eller efter producentens anbefalinger).
   2. Når Imager og Stage er stabiliseret, Placer en mus i anæstesi kammeret umiddelbart efter injektion og administrere 3,5% isofluran ind i kammeret med O₂ flow i ca 4 min. Anæstesi metoderne kan variere afhængigt af kammeret og/eller bedøvelsesmidlet, der anvendes; Følg producentens anbefalinger. Bestem korrekt anæstesi via tilbagetræknings refleks test.
   3. Flyt musen til den temperatur stabiliserede fase. Placer musen på ryggen med armene strakt og passer til musen med en næse kegle til administration af 2,5% isofluran gennem hele billedbehandlings proceduren.
   4. Luk døren og tage bioluminescerende billeder og røntgenstråler af mus.
   5. Når billedbehandlingsprogrammet er færdigt, skal du returnere musen til buret og overvåge den. Musen skal genvinde bevidstheden inden for 3-5 min.
   6. Fortsæt til billede mus hver 3 h for 24 h, hver gang ved hjælp af en anden mus fra hver gruppe. Må ikke Reimage en mus inden for 24 h på grund af muligheden for bivirkninger på grund af re-udsættelse for anæstesi. En enkelt mus bør kun modtage en dosis af anæstesi hver 24-36 h. Rengør billedbehandlings platformen efter hver mus er afbildet. Deaktiver Imager mellem billedtids punkter.
      Bemærk: bioluminescens vil falme, uanset stammen injiceres. Intensiteten og levetiden af bioluminescens vil variere afhængigt af mange faktorer, herunder antallet af injicerede bakterier, musestamme, bakteriel stamme, etc.

Representative Results

Som vist i figur 2kan den målrettede genomsletning bekræftes ved hjælp af koloni PCR med specifikke primere, der forstærker regionen af interesse. Kolonier, der bærer en genomisk sletning, vil give en kortere PCR-bånd størrelse i forhold til vilde kolonier. En PCR-Screen på 10-12 kolonier er normalt tilstrækkelig til at detektere mindst én koloni, der bærer den målrettede sletning. Hvis der ikke registreres sletninger efter flere skærm runder, skal du gentage den procedure, der begynder med konjugering. Hvis sletningen stadig mislykkes, plasmid INSERT kan være nødvendigt at blive bekræftet gennem sekvensering, redesignet, eller sletningen kan være dødelig. Efter verifikation af en gensletning via PCR, Bekræft sletningen gennem sekvensering. Den resulterende stamme kan underkastes proceduren gentagne gange for at generere sekventielle genomiske modifikationer.

Som vist i figur 3var dødeligheden associeret med intraperitoneal injektion af den svækkede stamme af P. aeruginosa PGN5 (+ muce) 0%, hvilket svarede til dødelighed observeret med E. coli -BL21. På den anden side var intraperitoneal injektion af Stam stammen (VE2) dødelig for 80% af musene. Disse resultater blev opnået med omfattende trin til validering af de injicerede stammer. Selv om den nøjagtige dødsårsag i disse mus er ukendt, kan den i det mindste delvist tilskrives ekspression af virulensfaktorer i Stam stammen, der blev slettet fra den svækkede PGN5 stamme. Forskelle i infektions progression blev sporet ved hjælp af bioluminescens-mærkede overordnede og svækkede stammer. Den svækkede stamme forblev lokaliseret på injektionsstedet, indtil bioluminescens falmede (figur 4). Clearance af infektionen sandsynligvis faldt sammen med falmede af bioluminescens. Der blev ikke påvist bioluminescens 24 timer efter injektionen, og musene levede i uger efter injektionen, indtil de blev ofret, uden bivirkninger observeret.

Figur 1: generering af gensletninger i P. aeruginosa med PEX100T-noti. A) kort over PEX100T-noti plasmid. B) generering af en konstruktion, der består af regioner direkte opstrøms (gule) og nedstrøms (blå) i den region, der er interesse for (ROI), flankeret med noti begrænsnings enzym anerkendelses steder. For det første PCR-amplificere upstream-og downstream-regioner uafhængigt med specifikke primere, der tilføjer 5 ' NotI fordøjelsessteder (f. eks. NotI-Aroa F CGCGGCCGCTGAAGGTCCTGGGCTCCTATCCGAAAGCGGTGCTCT og noti-AROA R GCGGCCGCAGTTGGGTTGTTCTGCGATGGCGCCAGGCA) og 3 ' overlappende homologe regioner som vist (f. eks. Aroa-crossover F CTCCAGGCGCTGGGCAAGGTGCTGGCGCATGACTGAGGTCACGCCGGTCGCCGTGGAGAACA og Aroa-crossover R TGTTCTCCACGGCGACCGGCGTGACCTCAGTCATGCGCCAGCACCTTGCCCAGCGCCTGGAG. Brug derefter PCR withNotI-holdige primere til at slutte sig til upstream-og downstream-produkterne genereret i den første PCR-reaktion. C) PEX100T-noti plasmid, bevæbnet og klar. Ligate det NotI-fordøjet cross-over PCR produkt i den NotI-fordøjet plasmid. (D) flow diagram af processen til at slette genomiske regioner fra P. aeruginosa kromosom ved hjælp af pEX100T-noti plasmid. Efter den ønskede sletning er blevet bekræftet og renset, den resulterende stamme kan tages gennem proceduren gentagne gange for at slette andre genomiske regioner fra kromosom. Når den ønskede stamme er opnået, sekvens hele genomet for at bekræfte sletninger og andre ændringer i kromosom. Stammens patogenicitet kan derefter testes i mus ved hjælp af den procedure, der er skitseret i protokollens del II. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: gel elektroforese af koloni PCR produkter fra en skærm for Aroa sletning at generere den svækkede P. aeruginosa stamme, PGN5. Colony PCR-produkter kører i Lanes 2-5 og 8-11 indikerer kolonier med vildtype Aroa. Colony PCR-produkter, som kører i Lanes 6 og 7, bærer Aroa -gensletningen, indikeret af det mindre PCR-produkt (gule asterisker). Primers anvendes specifikt forstærket genomområdet indeholdende Aroa genet: Aroa-F: GCGAACGCCAACAGCCGATAAAGC, og AROA-R: ATCTGGCTCGCGATGCCGGTCC. Forventet PCR produktstørrelse i vildtype kolonier var 2.548 nukleotider (NT). Forventet PCR produktstørrelse i kolonier med Aroa sletning var 307 NT. En DNA-stigen blev kørt i Lanes 1 og 12. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: samlet dødelighed hos mus injiceret med patogene p. aeruginosa stamme (VE2), svækket p. AERUGINOSA stamme (PGN5 + muce), og FDA Control E. coli stamme (BL21). Kun mus injiceret med patogene Stam stamme udstillet dødelighed på 80%. Svækket P. aeruginosa stamme og FDA Control E. coli stamme udstillet 0% dødelighed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: billede af mus 3 h efter injektion af svækket stamme af P. aeruginosa PGN5 + muce, der bærer en bioluminescerende markør. De bioluminescerende bakterier blev detekterbare indtil 18-24 h efter injektion. I denne periode forblev bioluminescens på injektionsstedet, hvilket indikerer, at bakterierne forblev lokaliseret til injektionsstedet. Denne mus fuldt genvundet med ingen negative virkninger. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Den pEX100T-Not1 plasmid er en effektiv mægler af sekventielle genomsletninger, der er markør frie og in-frame. Når tekniske bakteriestammer for svækket virulens, sletning af hele gensekvenser i stedet for at generere punktmutationer nedsætter sandsynligheden for tilbagevenden til en virulente fænotype. Derudover dæmper hver gensletning af patogenicitet yderligere det patogen, hvilket forstærker dæmpnings stabiliteten.

Denne metode kan også bruges til at generere genomændringer andre end sletninger, såsom punktmutationer og indsættelser, blot ved at ændre udformningen af plasmid skær. Disse typer af modifikationer kan være mere nyttigt end hele gen sletninger for ingeniør bakterier med modificeret metabolisme, for eksempel. Sekventiel genommodifikation har betydelige muligheder for at generere designer bakteriestammer, som passer til specifikke formål inden for forskning og industri. Andre metoder til generering af de ønskede markør frie genomændringer i bakterier er blevet beskrevet^15,16,17,18. Som med alle genomredigeringsmetoder kan forsøg på ændringer af essentielle genomområder være dødbringende og dermed forgæves. I disse tilfælde er det nødvendigt at identificere forskellige genetiske modifikationer eller andre kandidat gener for at generere den bakterielle stamme af interesse.

I betragtning af de talrige replikation begivenheder og passager i hver koloni i hele denne protokol, utilsigtede ændringer af genomet vil ske til den genererede stamme. De nøjagtige genomændringer kan identificeres gennem hel-genomsekvensering. Virkningen af disse ændringer er imidlertid sværere at afgøre. Når tekniske bakterier til et bestemt formål, genomiske ændringer, der ikke negativt påvirker væksten af organismen eller den målrettede pathway (r) er acceptable. Afhængigt af den stamme, der genereres, kan det være muligt at identificere en "udlæser" for at sikre, at stammen stadig er nyttig til dens tilsigtede formål. For eksempel, med PGN5, var målet at skabe en svækket stamme, der bevarede evnen til at producere store mængder af alginat. Efter sletning af fem patogenicitetsgener blev mængden og sammensætningen af alginat produceret af PGN5 målt og fastlagt til at være sammenlignelig med andre alginatproducerende stammer. Alginat-produktionen var således upåvirket af de fem gensletninger eller af de utilsigtede genomændringer, der fandt sted under udviklingen af PGN5.

En model af intraperitoneal mus injektion blev brugt til at afgøre, om en manipuleret stamme blev svækket i forhold til den overordnede stamme og E. coli BL21, en stamme godkendt af FDA til produktion af biofarmaceutiske. De vigtigste skridt, der blev taget under denne dyreforsøgs procedure, var forberedelse og validering af frosne bakterie bestande. Forberedelse og brug af frosne bakteriekulturer til injektion af mus er at foretrække frem for at bruge kontinuerlig kultur, da det reducerer antallet af mutationer, der naturligt forekommer i bakterie populationer¹⁹. Desuden bør frosne kulturer forblive levedygtige i årevis. Levedygtige kimtal viste ingen signifikant forskel mellem CFU/mL umiddelbart efter, at lagrene var tilberedt og tre måneder efter tilberedningen. Brugen af flere valideringstrin i denne procedure sikrede, at metoden var reproducerbar, og resultaterne blev ikke skæv gjort af kontaminerende bakterier. Desuden var der behov for færre dyr med det antal forsigtighedsforanstaltninger, der blev truffet for at sikre reproducerbarhed. Ved hjælp af en bakteriel stamme, der er FDA-godkendt til biofarmaceutiske produktion som kontrol (såsom E. coli stamme BL21), denne metode kan anvendes til at teste dæmpning af andre genetisk manipulerede stammer af P. aeruginosa, eller andre arter af bakterier.

Anvendelse af bioluminescens som markør giver yderligere validering af de injicerede bakteriestammer, da markøren kan visualiseres på injektionsstedet. Indsættelse af bioluminescens markør i bakteriernes kromosom er nødvendig for bioluminescens billeddannelse, men det er måske ikke muligt, hvis der arbejdes med uforenelige stammer/arter. Det er dog ikke nødvendigt at afmærke stammer med bioluminescens for at teste for dæmpning. De stammer, der blev testet i dette studie, var mærket med bioluminescens, som tillod visualisering af lokaliserings forskelle mellem stammer under hele infektionsforløbet. Vi bemærkede, at den patogene stamme spredes gennem kroppen af musen, men den ikke-sygdomsfremkaldende stamme forblev på injektionsstedet. Mens dette eksperiment kun testet to meget nært beslægtede stammer af p. aeruginosa, det tyder på, at bakteriel udbredelse er knyttet til virulens, i det mindste i P. aeruginosa. Således, denne procedure for mærkning med bioluminescens at visualisere progression af infektionen kunne anvendes i fremtiden til hurtigt at evaluere dæmpning af manipuleret stammer af bakterier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL tubes with flat caps	ThermoScientific	AB-0620	via Fisher Scientific
1 mL Syringe	BD	22-253-260	via Fisher Scientific
1.5 mL disposable polystyrene cuvette	Fisher Scientific	14955127
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	05-408-129
2.0 mL Cryogenic Vials	Corning	430659	via Fisher Scientific
27G needle	BD	14-821-13B	via Fisher Scientific
50 mL tubes	Fisher Scientific	05-539-13	via Fisher Scientific
Accu block Digital Dry Bath	Labnet	NC0205808	via Fisher Scientific
Benchtop Centrifuge 5804R	Eppendorf	04-987-372	via Fisher Scientific
Benchtop Microcentrifuge	Sorvall	75-003-287	via Fisher Scientific
Cabinet Incubator	VWR	1540
Carbenicillin disodium salt	Fisher Scientific	BP2648250
Culture Test Tube, Polystyrene	Fisher Scientific	14-956-6D	via Fisher Scientific
Diposable Inoculation Loops	Fisher Scientific	22-363-597
Dneasy UltraClean Microbial Kit (50)	Qiagen	12224-50	or preferred method/vendor
E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50)	Omega bio-tek	D6493-01	or preferred method/vendor
EcoRI-HF, restriction endonuclease	New England BioLabs	R3101L
Electroporation Cuvettes	Bulldog Bio	NC0492929	via Fisher Scientific
FastLink II DNA Ligation Kit	Epicentre Technologies	LK6201H	via Fisher Scientific
Gentamycin Sulfate	Fisher Scientific	BP918-1
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-4
GoTaq G2 Colorless Master Mix	Promega	M7833	via Fisher Scientific
Isothesia Isoflurane	Henry Schein Animal Health	29405
IVIS Lumina XRMS Series III In Vivo Imaging System	Perkins and Elmer	CLS136340
Kanamycin monosulfate	Fisher Scientific	BP906-5
LE agarose	Genemate	3120-500	via Fisher Scientific
Luria Broth	Difco	240230	via Fisher Scientific
MicroPulser Electroporator	BioRad	1652100
Noble agar, ultrapure	Affymetris/USB	AAJ10907A1	via Fisher Scientific
NotI-HF, restriction endonuclease	New England BioLabs	R3189
One Shot TOP10 Electrocomp E. coli	Invitrogen	C404052	via Fisher Scientific
Phosphate buffered saline powder	Sigma	P3813-10PAK	Sigma-Aldrich
Prism 7	GraphPad		https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
Pseudomonas isolation agar	Difco	292710	via Fisher Scientific
Pseudomonas isolation broth	Alpha Biosciences	P16-115	Custom made batch
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	Qiagen	27106	or preferred method/vendor
Shaking Incubator	New Brunswick Scientific	Innova 4080	shake at 200 rpm
SimpliAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems	A24811
Skim Milk	Difco	DF0032-17-3	via Fisher Scientific
Small Plates (100 O.D. x 10 mm)	Fisher Scientific	FB0875713
SmartSpec Plus Spectrophotometer	Bio-Rad	170-2525	or preferred method/vendor
Sucrose	Fisher Scientific	S5-500
Toothpicks, round	Diamond		Any brand of toothpicks, autoclaved
TOPO TA Cloning Kit, for seqeuncing	Invitrogen	45-0030
XAF-8 Anesthesia System Filters	Perkins and Elmer	118999
XGI 8 Gas Anesthesia System	Caliper Life Sciences/Xenogen