Summary
Здесь мы описываем простой и воспроизводимый протокол мышиной модели инфекции для оценки затухания генетически модифицированных штаммов Pseudomonas aeruginosa по сравнению с Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) утвержденных Escherichia coli для коммерческого применения.
Abstract
Микроорганизмы генетически универсальны и разнообразны и стали основным источником многих коммерческих продуктов и биофармацевтических препаратов. Хотя некоторые из этих продуктов естественным образом производятся организмами, другие продукты требуют генной инженерии организма для увеличения урожайности продукции. Авирулентные штаммы кишечной палочки традиционно являются предпочтительными бактериальными видами для производства биофармацевтических препаратов; однако, некоторые продукты трудны для e. coli для того чтобы произвести. Таким образом, авиационные штаммы других видов бактерий могут служить полезной альтернативой для производства некоторых коммерческих продуктов. Pseudomonas aeruginosa является общей и хорошо изученной грам-негативной бактерией, которая может стать подходящей альтернативой кишечной палочке. Тем не менее, P. aeruginosa является оппортунистическим человеческим патогеном. Здесь мы подробно процедуры, которые могут быть использованы для генерации непатогенных штаммов P. aeruginosa через последовательные геномные удаления с помощью pEX100T-NotI плазмиды. Основным преимуществом этого метода является производство деформации без маркера. Этот метод может быть использован для создания высоко ослабленных штаммов P. aeruginosa для производства коммерческих продуктов или для разработки штаммов для других конкретных целей. Мы также описываем простую и воспроизводимую модель мыши бактериальной системной инфекции с помощью интраперитонеальной инъекции проверенных тестовых штаммов для проверки затухания генно-инженерного штамма по сравнению с одобренным FDA штаммом BL21 e. coli.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa является оппортунистическим бактериальным патогеном, который может вызвать опасные для жизни заболевания у людей, особенно в ослабленном иммунитете. Патогенность P. aeruginosa обусловлена выражением многих факторов вирулентности, включая протеазы и липополисахарид, а также его способностью образовывать защитную биопленку1. Из-за своей способности производить вирулентность факторов и вызвать болезни у людей, используя P. aeruginosa, чтобы сделать коммерческие продукты представляет проблемы безопасности. Непатогенные штаммы кишечной палочки традиционно используются для биоинженерных медицинских и коммерческих продуктов для использования человеком. Тем не менее, некоторые продукты трудно для кишечной палочки, чтобы сделать, и многие из них упакованы в включение органов, что делает добычу трудоемкой. Инженерные бактериальные штаммы с возможностью делать и выделять конкретные продукты очень желательно, так как секреция, скорее всего, увеличит урожайность и облегчит процессы очистки. Таким образом, непатогенные штаммы других видов бактерий (например, виды, которые используют более секреционные пути) могут обеспечить полезную альтернативу кишечной палочке. Недавно мы сообщили о разработке штамма P. aeruginosa, PGN5, в котором патогенность и токсичность организма сильно ослаблены2. Важно отметить, что этот штамм по-прежнему производит большое количество полисахаридного альгината, коммерчески интересного компонента биопленки P. aeruginosa.
Штамм PGN5 был создан с помощью двухступенчатой процедуры аллелистического обмена с плазмидом pEX100T-NotI, чтобы последовательно удалить пять генов(toxA, plcH, phzM, wapR, aroA), как известно, способствуют патогенности организма. pEX100T-NotI был создан путем изменения SmaI на место распознавания ферментов ограничения NotI в пределах участка многократного клонирования плазмидного pEX100T, который был разработан в лаборатории Герберта Швайзера3,4. Место распознавания фермента NotI является более редкой последовательностью ДНК по сравнению с SmaI и менее вероятно, чтобы присутствовать в последовательностях, клонированных, таким образом, это более удобно для целей клонирования. Плазмида несет гены, которые позволяют для выбора, в том числе ген бла, который кодирует й-лактамазы и придает устойчивость к карбенициллин, и b. subtilissacB ген, который придает чувствительность сахарозы (Рисунок 1A). Плазмида также несет в себе происхождение репликации(ори)совместимы с кишечной палочкой,и происхождение передачи(oriT), что позволяет плазмидпередачи от кишечной палочки к Псевдомонас видов через спряжение. Тем не менее, плазмида не имеет происхождения репликации совместимы с Pseudomonas, и, таким образом, не может размножаться в Псевдомонас видов (т.е., это вектор самоубийства Pseudomonas). Эти характеристики делают pEX100T-NotI идеальным для таргетирования генетических удаляний из хромосомы Pseudomonas. Шаги клонирования плазмида выполняются с помощью кишечной палочки, и резучная плазмида передается в Псевдомонас путем трансформации или спряжения. Затем, через гомологичные события рекомбинации и селективные шаги, целенаправленное удаление в кадре генерируется, без маркеров. Этот метод последовательного удалять геномные области от хромосомы P. aeruginosa смог быть использован для того чтобы произвести высоки ослабленные штаммы Pseudomonas, как PGN5, или конструировать напряжения для других специфических польз (например, напряжения deficient в эндонуклизировании для плазмидного размножения или strains defic.
На общую вирулентность штаммов бактерий влияют условия роста и фазы, во время которых мутации происходят часто. Таким образом, измерение безопасности генетически-инженерных штаммов может быть сложной задачей. Для оценки бактериальных изолятов для системной вирулентности, мы адаптировали ранее опубликованный протокол инфекции путем интраперитонеальной инъекции c57BL/6 мышей5. Мы изменили эту процедуру, чтобы использовать замороженные бактериальные запасы для инъекций, что позволило для точного дозирования и легкой проверки используемых штаммов. В этой модели, штамм кишечной палочки BL21, который был одобрен FDA для производства биофармацевтических препаратов, был использован в качестве стандарта безопасности контроля для определения относительного патогенеза штамма6,7,8. Основным преимуществом использования этого метода является то, что он воспроизводим и сводит к минимуму источники вариаций, так как заражение штаммов проверяются на количество бактериальных клеток, фенотип и генетические маркеры как до, так и после заражения. С помощью этих контролируемых шагов, количество животных требуется уменьшается. В этой модели, P. aeruginosa штаммов, которые приводят к C57BL/6 коэффициенты смертности, равные или меньше, чем E. coli BL21 при инъекциях интраперитоно может рассматриваться с ослабленным. Эта простая модель мыши инфекции также может быть использована для оценки ослабленной патогенности генетически модифицированных штаммов от других видов, используя FDA утвержденных E. coli штамма в качестве ссылки. Шаги 1-7 подробно поколения последовательных геномных делетций в P. aeruginosa (Рисунок 1) и шаги 8-12 подробно использование мыши модели для проверки патогенности штаммов P. aeruginosa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Перед началом экспериментов на животных протокол, который должен быть использован, должен быть одобрен Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC). Утверждение описанного протокола было получено через IACUC в Университете Маршалла (Huntington, WV, США).
1. Плазмид Дизайн
- Для создания генетического удаления с помощью плазмиды pEX100T-NotI клонируют области ДНК, наклоняющие желаемую последовательность удаления, и вставляйте в место ограничения NotI плазмида. Плазмидная вставка должна содержать около 500 нуклеотидов вверх по течению целевой последовательности, непосредственно примыкающей к примерно 500 нуклеотидам вниз по течению последовательности целевого удаления. Кроме того, вставка должна содержать последовательность распознавания NotI (GCGGCCGC) на его 5' и 3' концах(рисунок 1B).
2. Плазмид Подготовка
- Вариант 1: Используйте традиционные процедуры клонирования. Используйте ПЦР для усиления геномных регионов вверх и вниз по течению гена интереса, а затем кроссовер PCR9,10 присоединиться к генерируемых фрагментов, ограничение эндонуклеазы пищеварения продукта ПЦР и плазмиды, и перевязка11 (Рисунок 1B, C).
- Вариант 2: После проектирования последовательности удаления в силико, контракт компании, которая de novo синтезирует его, чтобы вставить в плазмид pEX100T-NotI. Многие компании упростили процесс клонирования, чтобы быстро и эффективно генерировать плазмида интереса. Кроме того, последовательность проверяет плазмиды на наличие мутаций до родов.
3. Преобразование кишечной палочки
- Преобразуйте электрокомпетентную кишечную палочку с плазмидом в соответствии с рекомендациями производителя. Используя стерильную инокуляционную петлю, полоса 10 qL реакции преобразования для изолированных колоний на предварительно разогретой Лурии Бульон (LB) агар пластины дополнены 100 мкг/мл карбенициллин и инкубировать ночь при 37 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все оборудование и средства массовой информации, используемые для культуры бактерий должны рассматриваться в соответствии с правилами безопасности учреждения. - Проход дважды.
- Выньте пластину из инкубатора и определите изолированную колонию. Используя стерильную инокуляционную петлю, подберите колонию и прогремите предварительно разогретую агарную пластину LB, дополненную 100 мкг/мл карбенииллина для изолированных колоний. Инкубировать на ночь при 37 градусах Цельсия. Повторите этот шаг еще раз, чтобы создать чистую культуру.
- Используя стерильную инокуляционную петлю, прививай 5 мл ЛБ с одной колонией из конечной агаровой пластины. Поместите культуру в встряхивая инкубатор на ночь на 37 градусов по Цельсию. На следующий день, смешать 1 мл этой культуры с 1 мл 5% в кривиной и хранить при -80 градусов по Цельсию для создания замороженных запасов штамма.
4. Препарат бактериального штамма и трехродительское спряжение
- Используйте одну изолированную колонию от агаровых пластин следующих штаммов, чтобы привить культуры бульона и поместить в дрожащий инкубатор на ночь при 37 градусах Цельсия.
- Добавьте E. coli pEX100T-NotI в 5 мл LB, дополненный 100 мкг/мл карбеничиллина.
- Добавить P. aeruginosa штамм АО1 в 5 мл Pseudomonas изоляционный бульон (PIB).
- Добавьте E. coli prk2013 в 5 мл LB, дополненный 50 мкг/мл канамицина.
ПРИМЕЧАНИЕ: prk2013 плазмида является помощником плазмида, которая реплицирует в кишечной палочке, но не P. aeruginosa; он несет транс-действующих передачи генов, которые мобилизуют pEX100T-NotI плазмид от e. coli донора P. aeruginosa получателя12. P. aeruginosa является патогеном уровня биобезопасности 2 (BSL-2). Пожалуйста, следуйте рекомендациям учреждения по безопасности при работе с организмами BSL-2.
- На следующий день удалите ночные культуры из инкубатора и добавьте 0,5 мл каждой культуры в микроцентрифугную трубку мощностью 1,5 мл. Центрифуга при 6000 х г в течение 5 мин. Отбросьте супернатант и приостановите клеточные гранулы в 50-100 ЛБ.
- Pipette всей подвески клетки в одной капли на предварительно разогретой пластины LB агар. Дайте капельке высохнуть. Затем инвертировать тарелку и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 4-6 ч.
- После инкубации используйте стерильную петлю прививок для сбора клеток в 1 мл LB в микроцентрифуговой трубке. Пипетка вверх и вниз, чтобы смешать клетки.
- Используя клеточный распределитель, полосы клеток равномерно на сухой предварительно разогретой Pseudomonas Изоляция Агар (PIA) пластины дополнены 300 мкг /мл карбеничиллина. Полоса нескольких пластин с увеличением объемов клеточной смеси (например, 10 л, 100 л, 500 л). Инкубировать на ночь при 37 градусах Цельсия.
5. Обнаружение однокроссоверных рекомбинцев P. aeruginosa
- Удалите пластины из инкубатора и проинспектировать изолированные карбеницилин-устойчивые колонии. Поскольку плазмида pEX100T-NotI не может размножаться в P. aeruginosa, колонии, которые росли на карбениллин-дополненных пластин должны были возникнуть из клеток, в которых плазмида была интегрирована в хромосому.
- Выберите по крайней мере 4 из этих колоний и полосы для изоляции на предварительно разогретых пластин PIA дополнены 300 мкг /мл карбеничиллина. Инкубировать тарелки на ночь при 37 градусах Цельсия.
- Снимите пластины с инкубатора и проверь на рост. Карбенициллин-устойчивые колонии должны быть рекомбинантами с одним кроссовером (т.е. они включили плазмид в хромосому через событие рекомбинации между гомологичной областью плазмидной вставки и хромосомой P. aeruginosa).
- Патч 8 или более колоний со стерильными зубочистками на предварительно разогретые пластины: 1) PIA дополнен 300 мкг/мл карбеничиллина и 2) PIA дополнены 300 мкг/мл карбеничиллина и 10% сахарозы (без глицерола).
- Если не было получено колоний с шага 5.1, повторите спряжение и увеличьте объем клеточной смеси, пронизанный в шаге 4.5. Если слишком большой рост произошел, повторите спряжение и уменьшите объем полос.
- Если спряжение неоднократно выходит из строя, подготовьте электрокомпетентные клетки штамма P. aeruginosa и преобразуйте непосредственно с плазмидом pEX100T-NotI. Подробные протоколы для подготовки электрокомпетентных P. aeruginosa и преобразования доступны в другом месте13,14.
- Инкубировать пластины при 37 градусах Цельсия на ночь.
- Снимите пластины с инкубатора и проверь на рост. Истинные рекомбинанты одного кроссовера будут резить карбеницина и сахарозы (т.е. колонии, которые росли на PIA дополнены карбенициллин, но не растут на PIA дополнены карбенициллин и сахарозы).
- Выберите 4 или более истинных рекомбинаторов с одним кроссовером и привить каждый в 5 мл LB без выбора. Инкубировать в трясущейся инкубаторе при 37 градусах Цельсия за ночь.
- Если не было обнаружено рекомбинантов одного кроссовера, повторите спряжение.
6. Обнаружение двухкроссоверных рекомбинцев P. aeruginosa
- Для каждой культуры бульона привить 10 л культуры на предварительно разогретую тарелку PIA дополнен10% сахарозой (без глицерола) и полосой для изолированных колоний. Инкубировать тарелки на ночь при 37 градусах Цельсия.
- На следующий день снимите пластины с инкубатора и проинспектируем их на рост. Сахароза устойчивые колонии должны быть двухкроссоверные рекомбинанты (т.е. удалили плазмида из хромосомы через событие рекомбинации между другой гомологичной областью плазмидной вставки и хромосомой P. aeruginosa).
- Патч по крайней мере 20 колоний со стерильными зубочистками на предварительно разогретые пластины: 1) PIA, 2) PIA дополнен 10% сахарозы (без глицерола), и 3) PIA дополнен30 мкг/мл карбенициллина.
- Инкубировать тарелки на ночь при 37 градусах Цельсия.
- Выньте пластины из инкубатора и изучить их на рост. Истинные рекомбинанты двойного кроссовера будут чувствительны к карбеницину и сахарозе устойчивыми (т.е. колонии, которые росли на PIA и PIA, дополненные сахарозой, но не росли на PIA, дополненном карбенициленом).
7. Подтверждение удаления гена через колонию PCR
- Подготовьте 10-20 колоний для удаления экрана с ПЦР.
- Возьмите рост от подозреваемого двойного кроссовера рекомбинантных с стерильной зубочисткой и приостановить клетки в 50 Зл 1x фосфат буферного солей (PBS). Отварить подвеску при температуре 100 градусов по Цельсию в течение 10 мин, центрифугу в течение 3 мин при 13 000 х г,а затем поставить на лед.
- Выполните ПЦР для проверки колоний для целевого удаления.
- Используйте 1 зл супернатанта в качестве шаблона в 25 ПЦР реакции, чтобы подтвердить удаление гена интереса.
- Используйте геноспецифические грунтовки, которые усиливают область геномного удаления. Используйте грунтовки, которые усиливают область геномного удаления плюс 100-200 bp фланговых вверх по течению и вниз по течению последовательностей.
- Подготовьте отдельную контрольную реакцию ПЦР с родительским штаммом (например, PAO1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Условия термоциклора будут варьироваться в зависимости от оптимальной температуры для грунтовых пар, используемого коктейля-полимераза и длины региона, который будет усилен.
- Выполните электрофорус агарозного геля на продуктах ПЦР. Колонии, в которых регион интересов был удален выход меньших продуктов усиления, чем колонии, которые не имеют удаления (Рисунок 2).
- Выберите одну или несколько колоний с подтвержденным ПЦР удалением. Полоса для изолированных колоний на предварительно разогретую пластину PIA (ы) и инкубировать при 37 градусах Цельсия на ночь.
- Проход по крайней мере еще раз. Удалить пластины (ы) из инкубатора и определить изолированную колонию. Используя стерильную иокуляционную петлю, подберите колонию и прогремите предварительно разогретую агарную пластину PIA для изолированных колоний. Инкубировать на ночь при 37 градусах Цельсия.
- Выберите колонию из каждой окончательной пластины и использовать для привить 5 мл PIB. Поместите в встряхивая инкубатор на ночь на 37 градусов по Цельсию.
- Смешайте 1 мл этой культуры с 1 мл 5% обезжиренного молока в кривой и хранить при -80 градусов по Цельсию, чтобы создать запас штамма.
- Используя эту культуру, приготовьте геномную ДНК из штамма (например, с помощью комплекта для очистки ДНК). Усиль область геномного удаления с помощью ПЦР и грунтовок, характерных для интересуемого региона.
- Очистите эти продукты ПЦР (например, с набором для очистки ДНК, или экстракцией фенола-хлороформа) и либо последовательность непосредственно с генно-специфических грунтовки или ligated в вектор для последовательности с плазмид-специфических праймеров.
- После того, как удаление гена подтверждается путем секвенирования, повторите эту процедуру с новым штаммом удаления, чтобы последовательно генерировать многочисленные геномные удаления без маркеров. При возникновении желаемого штамма используйте секвенирование всего генома для проверки целевых удаляний и обнаружения других изменений в геноме (по сравнению с эталонным штаммом, например, PAO1), которые происходили на протяжении всего процесса. После аннотирования генов, депозит последовательности GenBank и запись присоединения номера.
8. Подготовка бактериального штамма для тестирования на животных
- Для проверки на ослабленную патогенность штаммов P. aeruginosa сначала подготовьте проверенные культуры и запасы. Подготовка P. aeruginosa штаммов интерес, дикого типа штамма P. aeruginosa (вирулентный), и FDA утвержденных штамм e. coli (например, BL21) в качестве непатогенного контроля безопасности.
- Полоса штаммов бактерий, тестируемых на селективный агар из секвенированных и проверенных замороженных запасов. Инкубировать при 37 градусах Цельсия на ночь.
- С стерильной икроуляционной петлей, подобрать одну колонию от каждого штамма и полоса для изолированных колоний на селективных средств массовой информации снова. Инкубировать при 37 градусах Цельсия на ночь.
- Удалите пластины из инкубатора. Для каждого штамма выберите одну колонию и полосу для изоляции на пластины LB.
- После 24 ч роста при 37 градусах Цельсия, привить 500 мл колбу, содержащую 250 мл LB с одной колонии изолировать от каждого штамма.
- Шаг проверки: использование остатков той же колонии, проверить штамм с помощью ПЦР и деформации конкретных грунтовки, и / или праймеры для проверки наличия генетических модификаций, внесенных в штамм. Используйте праймеры ниже для проверки штаммов в представленном примере:
E. coli BL21:
T7 полимераза F:TGGCTATCGCTAATGGTCTTACG
T7 полимераза R:TTACGCGAGCGAAGTCC
VE2 и PGN5:
aroA F: GCGAACGACAACAGGATAAAGC
aroA R: ATCTGGCTCGCGATGCGTCTCC
- Шаг проверки: использование остатков той же колонии, проверить штамм с помощью ПЦР и деформации конкретных грунтовки, и / или праймеры для проверки наличия генетических модификаций, внесенных в штамм. Используйте праймеры ниже для проверки штаммов в представленном примере:
- Инкубировать культуры в трясущихся инкубатора при 160 об/мин и 37 градусов по Цельсию, пока они не достигнут роста фазы журнала (т.е. OD600 измерения 0,4-0,6 на спектрофотометре).
- Используя значение OD600, полученное при фазе журнала, вычислите объем бульона, необходимый для получения 2,5 х 109 колоний, образующих единицы (CFU) на мл. Пелле объем бульона рассчитывается в 50 мл труб при 4500 х г за 10 мин.
- Откажитесь от супернатанта и resuspend гранулы в одной трубке с помощью 50 мл 1x PBS для мытья клеток. Центрифуга снова на 4500 х г в течение 10 мин.
- Откажитесь от супернатанта и resuspend гранулы в 25 мл 5% обезжиренного молока в 1x PBS.
- Шаг проверки: Используйте образец 25 мл отсрочки для выполнения жизнеспособных подсчетов пластин для определения количества CFU/mL.
- Aliquot 25 мл обезжиренного молока культуры повторного в 2 мл культуры запасов в 2 мл криовials. Вспышка заморозить в жидком азоте и хранить при -80 градусов по Крайней мере на ночь перед использованием.
9. Проверка роста и штамма запасов, хранящихся для тестирования на животных.
- Для каждого штамма, которые будут протестированы, удалите по крайней мере 3 криовиала замороженных запасов из -80 градусов по Цельсию хранения и оттаивания при 4 градусах по Цельсию в течение 2-4 ч. Если какой-либо замороженный бульон остается, кратко тепло при 37 градусах Цельсия.
- Возьмите небольшие образцы из каждого кривиного для проверки каждого штамма.
- Выполните жизнеспособные подсчеты пластин для определения количества CFU/mL. Это нормально иметь меньше CFU / мл после замораживания, из-за смерти некоторых бактериальных клеток.
- Используйте ПЦР и специфические грунтовки для проверки каждого штамма.
- Полоса каждого деформации на селективных средств массовой информации для проверки фенотипа.
- После подтверждения того, что штаммы имеют правильный генотип и фенотип, и проверки CFU /mL, приступить к тестированию на животных.
10. Прививка животных бактериальными штаммами путем инъекций
- На утро инъекций, удалить криовиалы бактериальных штаммов тестируется и оттаивания при 4 градусах по 3-4 ч. Оттепель 0,5 мл для каждой мыши, которые будут введены. Держите флаконы на льду после оттаивания и вводить мышей в течение 2 ч.
- После оттаивания, передача каждого кривиной на новую трубку 2 мл и центрифугу на 4500 х г в течение 10 минут, отбросить супернатант, и resuspend клеточной гранулы в 1 мл 1x PBS.
- Центрифуга снова на 4500 х г на 10 м. Отбросьте супернатант и переприостановите гранулы в 1x PBS до конечной концентрации 2,5 х 109 CFU/mL. Чтобы определить количество 1x PBS, необходимое для повторной приостановки, используйте данные CFU/mL, полученные из жизнеспособной пластины рассчитывает на замороженные запасы в шаге 2.2.1. Точное количество 1x PBS используется будет незначительно отличаться между штаммами.
- Возьмите 3 образца из окончательной подвески каждого штамма для проверки CFU/mL, генотипа и фенотипа, как описано выше.
- Для каждого штамма, aliquot 1,5 мл PBS / клеточной подвески в один 2 мл трубки на 5 мышей, чтобы ограничить количество раз трубки вводится. Кроме того, подготовить трубки 1x PBS для контроля инъекций.
- Соберите мышей (10 мужчин и 10 женщин C57BL/6 в группу для этого эксперимента) и материалы, необходимые для инъекций (шприцы, иглы, острые контейнеры, маркеры, ручка и бумага, и т.д.. .. Перейдите в стерильные животные хирургической комнате. Протрите все поверхности с дезинфекции салфетки.
- Чтобы устранить дистресс и риск получения травмы экспериментатору, принесите в хирургическое отделение только один пол и экспериментальную группу мышей (например, группу из 10 мышей мужского пола, инфицированных определенным штаммом). Носите две пары латексных перчаток для устранения прокола перчаток, если укусил. Носите лабораторное пальто, защитные очки и маску для лица, чтобы избежать загрязнения.
- Начните инъекции контрольной группы с 1x PBS. Это позволит установить, являются ли какие-либо побочные эффекты в результате инъекции в одиночку.
- Удалите мышь из клетки. Удалите только одну мышь за один раз.
- Взвесить мышь и пометить ее хвост с постоянным маркером для отслеживания потери веса после инъекции.
- Откройте новый шприц 1 мл и 27 G иглу (используйте новый шприц и иглу для каждой мыши для устранения загрязнения) и введите 200 л стерильных 1x PBS.
- Захватите мышь за ушами, используя большой палец и указательный палец. Pinch для создания кожи сложить на затылке, чтобы держаться - более жесткие раз уменьшает движение шеи и риск укуса во время инъекции. Безопасный хвост в ладонь, используя мизинец провести мышь плоский с небольшим движением.
- Переверните мышь и вставьте иглу под углом 30 градусов в полость перитонеальной полости в левую или правую сторону средней линии. Поднимите иглу слегка после вставки, чтобы убедиться, что она была вставлена в интраперитонеальной области, а не в органы. Медленно впрысните PBS, а затем снять иглу.
- Поместите использованную иглу в назначенный контейнер для резкости биоопасности. Не используйте шприц или иглу. Обычно йой в месте инъекции.
- После инъекции переместите мышь в отдельную клетку.
- Повторите процедуру со следующей мышью. После того, как все мыши одной клетки вводят, вернуть их в исходную клетку немедленно.
- После введения контрольной группы, начать инъекционные суспензии штаммов для тестирования после той же процедуры.
- Вводят 200 л клеточной суспензии. При начале с клеточной подвески 2,5 х 109 CFU/mL, каждая мышь получает 5 х 108 CFU.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти концентрации были оптимизированы с предварительными исследованиями на животных, чтобы определить смертельные дозы каждого штамма. Дозировка, возможно, потребуется скорректировать для других штаммов / видов.
- Вводят 200 л клеточной суспензии. При начале с клеточной подвески 2,5 х 109 CFU/mL, каждая мышь получает 5 х 108 CFU.
- После того, как все инъекции завершены, вернуть мышей в жилой комнате, чтобы облегчить бедствия. Чистая рабочая зона с дезинфекцией салфетки.
- Мониторинг животных на смертность после инъекции, проверяя клетки для мертвых мышей каждые 3 ч в течение 72 ч и каждые 12 ч в течение 10 дней. Запись вес мышей каждые 12 ч, чтобы определить потерю веса из-за болезни.
- Запись неблагоприятного поведения в течение нескольких часов после инъекции, таких как разница в осанке, отсутствие ухода или норы, неподвижность, или изменения в дыхании. Мыши, которые умерли от травмы, связанной с инъекцией будет проявлять неблагоприятное поведение и умереть быстро после инъекции. С другой стороны, мыши, которые умер от инфекции не начнет проявлять неблагоприятное поведение или смерть до тех пор, пока после 18 ч. Любые мыши, которые проявляют неблагоприятное поведение или обширные признаки заболеваемости, включая быстрое или трудились дыхание, неподвижность, сгорбленная осанка, затонувшие глаза, сильное обезвоживание, или другие должны быть усыплены, чтобы уменьшить ненужные страдания (как совместимые в нашей утвержденные протоколы МАКУК). Однако, в наших экспериментах, эвтаназия не требуется для любых мышей во время эксперимента. Выживших мышей усыпили через 10 дней после завершения испытаний.
- После 10-дневного периода мониторинга, позволяют оставшимся животным полностью восстановиться и очиститься от любой инфекции, введенной во время тестирования. Эвтаназия животных после процедуры IACUC.
11. Статистический анализ смертности животных
- Выполняйте статистический анализ с помощью графического программного обеспечения. Подходит любое программное обеспечение, способное производить графики и проводить статистический анализ.
- Чтобы спланировать данные о смертности, используйте столбец X для представления времени (h) и Y-столбеца для представления проверенных групп.
- Представляйте каждую мышь или предмет в исследовании, используя код No 0 (ноль) или код No 1, указывающий на выживание или смерть, соответственно.
- Для каждого животного, которое умирает, поместите 1 в колонке Y этой группы во время смерти на x колонке. Если в группе происходит несколько смертей в один момент времени, копия этой временной точки может быть помещена в столбец X. Например, если три объекта в группе умирают при 3 ч, точка времени 3 ч будет отображаться три раза в столбце X.
- Для всех выживших животных в группе поместите ноль в колонке Y в окончательную измеряемую точку времени. Например, если четыре мыши выживают, поместите четыре конечные точки времени в столбце X, отмеченном четырьмя нулями в столбце Y.
- После ввода данных о животных для всех групп используйте шаблон графика выживания для получения графика выживания.
- Оставьте кодирование по умолчанию как 0 и 1.
- Установите параметры для графика в процентах.
- Как только параметры кривой выживания выбраны, выполните статистический анализ с помощью теста Mantel-Cox (ранг журнала).
- Формат Каплан-Мейер участков с использованием статистических данных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Штаммы, которые демонстрируют показатели смертности, которые меньше или равны родительскому штамму, и одобренный FDA штамм (например, E. coli BL21) могут считаться ослабленными.
12. Визуализация инфекции с биолюминесценцией
- Чтобы визуализировать прогресс инфекции, вставьте хромосомный биолюминесцентный оперон(luxCDABE) в pGN5 и VE2 штамм испытания. Плазмиды и протокол, используемый для обозначения этих штаммов, были разработаны в лаборатории Швейцера и не могут быть совместимы со всеми видами/штаммами бактерий13. Важно отметить, что визуализация инфекции является факультативной; таким образом, геномная вставка этого оперона не является необходимой для выполнения описанного выше исследования смертности.
- Подготовка и проверка штаммов с использованием метода, описанного выше. Кроме того, проверьте биолюминесценцию в маркированных штаммах на каждом этапе проверки.
- После того, как штаммы подготовлены, вводят животных в группах по 10 с биолюминесцентными штаммами после вышеуказанных шагов.
- Изображение животных каждые 3 ч в течение 24 ч с помощью системы визуализации животных, способной биолюминесценции.
- Сначала подготовьте изображение, установив параметры камеры и обогрев сцены для животных. Также установите поток кислорода до 1,5 л на мин (или следуя рекомендациям производителя).
- После того, как изображение и этап стабилизируются, поместите одну мышь в анестезию камеры сразу после инъекции и ввести 3,5% изофлуран в камеру с Потоком O2 около 4 мин. Методы анестезии могут варьироваться в зависимости от используемого камеры и/или анестезиологического агента; следовать рекомендациям производителя. Определить надлежащую анестезию с помощью рефлекторного теста.
- Переместите мышь на стабилизированную температуру стадии. Расположите мышь на спине с протянутыми руками и поместите мышь с конусом носа для введения 2,5% изофруран на протяжении всей процедуры визуализации.
- Закройте дверь и возьмите биолюминесцентные изображения и рентгеновские лучи мыши.
- Когда изображение будет завершено, верните мышь в клетку и следите за ней. Мышь должна прийти в сознание в течение 3-5 мин.
- Продолжайте изображение мышей каждые 3 ч в течение 24 ч, каждый раз, используя различные мыши из каждой группы. Не повторное изображение мыши в течение 24 ч из-за возможности неблагоприятных последствий из-за повторного воздействия анестезии. Одна мышь должна получать только одну дозу анестезии каждые 24-36 ч. Очистите платформу изображений после того, как каждая мышь изображена. Выключите изображение между точками времени изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Биолюминесценция будет исчезать, независимо от штамма вводят. Интенсивность и долговечность биолюминесценции будет варьироваться в зависимости от многих факторов, в том числе количество бактерий, вводимых, штамм мыши, бактериальный штамм и т.д.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Как показано на рисунке 2, целевое геномное удаление может быть подтверждено с помощью колонии ПЦР с конкретными грунтовки, которые усиливают область интереса. Колонии, которые несут геномное удаление даст более короткий размер полосы ПЦР по сравнению с дикими колониями типа. ПЦР-экран 10-12 колоний, как правило, достаточно, чтобы обнаружить по крайней мере одну колонию, которая несет целевое удаление. Если после нескольких раундов экранов не обнаруживаются удаления, повторите процедуру, начинающаяся с спряжения. Если удаление все еще не удается, плазмидная вставка может потребоваться подтвердить путем секвенирования, переработан, или удаление может быть смертельным. При проверке удаления гена через ПЦР, подтвердить удаление путем секвенирования. Полученный штамм может быть подвергнут процедуре неоднократно для создания последовательных геномных изменений.
Как показано на рисунке 3, смертность, связанная с интраперитонеальной инъекцией ослабленного штамма P. aeruginosa PGN5 («мукЕ»), составила 0%, что было эквивалентно смертности, наблюдаемой с E. coli BL21. С другой стороны, интраперитонеальная инъекция родительского штамма (VE2) была смертельной для 80% мышей. Эти результаты были получены с обширными шагами для проверки впрыскиваемых штаммов. Хотя точная причина смерти у этих мышей неизвестна, она может по крайней мере частично быть отнесена к выражению факторов вирулентности в родительском штамме, которые были удалены из ослабленного штамма PGN5. Различия в прогрессии инфекции отслеживались с использованием родителей, отмеченных биолюминесценцией, и ослабленных штаммов. Ослабленный штамм оставался локализованным в месте инъекции до тех пор, пока биолюминесценция не исчезла(рисунок 4). Очистка инфекции, скорее всего, совпала с исчезновением биолюминесценции. Биолюминесценция не была обнаружена 24 ч после инъекции и мыши жили в течение нескольких недель после инъекции до жертвоприношения, без каких-либо побочных эффектов наблюдается.
Рисунок 1: Генерация генных удаляний в P. aeruginosa с pEX100T-NotI. (A) Карта pEX100T-NotI плазмиды. (B) Поколение конструкции, состоящей из регионов непосредственно вверх по течению (желтый) и вниз по течению (синий) региона, представляющих интерес (ROI), в окружении сайтов распознавания ферментов ограничения NotI. Во-первых, ПЦР-усилить вверх по течению и вниз по течению регионов независимо с конкретными грунтовки, которые добавляют 5' NotI сайты пищеварения (например, NotI-aroA F CGCGGCCTGAAGGTGTCCTGGGGGCGCGCCTATCCGAAAGCGGTGTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTИGAAAGCGGCTи и NotI-aroA R GCGGGCAGTTGGGTGTGTGCCGCCCCAGGAGG CA) и 3' перекрывающихся гомологичных регионов, как показано (например, aroA-кроссоверF CTCCAGGCGCTGGGCAAGGTGTGTGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCATACTGAGGCGCCGCGCGCGGTGGAGGGAGGGCGGTGGGGGGGGGGGGGGGTGGGGGGGGTGGGGGGTGGGGGGTGGTGGGGCGGTGGGGGGGGGGGTGGGGGGTGGGGTGGGTGGGGGGGGTGGGGGGGGGGGTGGGGGGGTGGGGG CA и aroA-кроссоверR TGTCTCCACGGCGCGCGCGTGACCTACCTCAGTCAGTCATCATGCGCGCACCTGCCCCGCCTGGAG. Затем используйте ПЦР с ноти-содержащими грунтовки, чтобы соединить продукты, созданные в первой реакции ПЦР. (C) pEX100T-NotI плазмид, вооруженный и готовый. Ligate NotI-переваренный кросс-над Продуктом PCR в NotI-переваренной плазмид. (D) Диаграмма потока процесса для того чтобы уничтожить геномные зоны от хромосомы P. aeruginosa используя плазмид pEX100T-NotI. После того, как желаемое удаление было подтверждено и очищено, результирующее напряжение может быть принято через процедуру неоднократно, чтобы удалить другие геномные области из хромосомы. Когда желаемый штамм получен, последовательность весь геном, чтобы подтвердить удаления и другие изменения в хромосоме. Патогенность штамма может быть проверена на мышах с использованием процедуры, изложенной в части II Протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Гель электрофорус колонии ПЦР продуктов с экрана для удаления aroA для создания ослабленного штамма P. aeruginosa, PGN5. Продукция колонии ПЦР, работая в полосах 2-5 и 8-11, указывает на колонии с диким типом aroA. Продукты Колонии ПЦР работают в полосах 6 и 7, несут удаление гена aroA, указанное меньшим продуктом ПЦР (желтые звездочки). Праймеры, используемые специально усиливается геномная область, содержащая ген aroA: aroA-F:GCGAACGCCACAGGATAAAGC, и aroA-R:ATCTGGCTCGCGCGGTGTGTCCCCCC. Ожидаемый размер продукта ПЦР в колониях дикого типа составил 2548 нуклеотидов (нт). Ожидаемый размер продукта ПЦР в колониях с удалением aroA составил 307 nt. Лестница ДНК была запущена в полосах 1 и 12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Общая смертность мышей, впрыснутых с патогенным штаммом P. aeruginosa (VE2), ослабленным штаммом P. aeruginosa (PGN5-mucE) и FDA control E. coli штамм (BL21). Только мыши, вводимые с патогенным родительским штаммом, продемонстрировали смертность на уровне 80%. Ослабленный штамм P. aeruginosa и FDA контроль E. coli штамм показал 0% смертности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Изображение мыши 3 ч после инъекции ослабленного штамма P. aeruginosa PGN5-mucE с биолюминесцентным маркером. Биолюминесцентные бактерии были обнаружены до 18-24 ч после инъекции. В течение этого периода биолюминесценция оставалась в месте инъекции, что указывает на то, что бактерии оставались локализованными в месте инъекции. Эта мышь полностью восстановилась без каких-либо побочных эффектов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Плазмида pEX100T-Not1 является эффективным посредником последовательных геномных делетций, которые свободны от маркеров и находятся в кадре. При инженерных бактериальных штаммах для ослабленной вирулентности удаление целых генных последовательностей, а не генерация точечных мутаций снижает вероятность возврата к вирулентному фенотипу. Кроме того, каждое удаление гена патогенности еще больше утихает патоген, укрепляя стабильность затухания.
Этот метод также может быть использован для генерации геномных изменений, помимо удаления, таких как точечные мутации и вставки, просто изменив дизайн плазмидной вставки. Эти типы модификаций могут быть более полезными, чем все удаления генов для инженерных бактерий с измененным метаболизмом, например. Последовательная геномная модификация обладает значительным потенциалом для генерации дизайнерских бактериальных штаммов в соответствии с конкретными целями в научных исследованиях и промышленности. Другие методы генерации желаемых маркеров без геномных изменений в бактериях были описаны15,16,17,18. Как и во всех методах редактирования генома, попытки модификации основных геномных областей могут быть смертельными и, следовательно, безуспешными. В этих случаях для генерации бактериального штамма, интересующего бактериальный штамм, требуется выявление различных генетических модификаций или других генов-кандидатов.
Учитывая многочисленные события репликации и проходы каждой колонии в рамках этого протокола, непреднамеренные изменения в геноме произойдут в генерируемом штамме. Точные геномные изменения могут быть определены с помощью секвенирования всего генома. Однако последствия этих изменений определить сложнее. При проектировании бактерий для конкретной цели, геномные изменения, которые не оказывают негативного влияния на рост организма или целевой путь (ы) являются терпимыми. В зависимости от создаваемого штамма, возможно, можно определить "чтение", чтобы убедиться, что штамм по-прежнему полезен по назначению. Например, с PGN5, цель состояла в том, чтобы создать ослабленный штамм, который сохранил способность производить большое количество альгината. После удаления пяти генов патогенности количество и состав альгината, производимого PGN5, были измерены и определены как сопоставимые с другими штаммами, производящими альгинаты. Таким образом, выработка альгината не была затронута ни пятью генными удалениями, ни непреднамеренными геномными изменениями, которые произошли во время разработки PGN5.
Модель интраперитонеальной инъекции мыши была использована для определения того, инженерии штамм был ослаблен по сравнению с родительским штаммом и E. coli BL21, штамм одобрен FDA для производства биофармацевтических препаратов. Наиболее важными шагами, предпринятыми в ходе этой процедуры тестирования на животных, были подготовка и проверка замороженных бактериальных запасов. Подготовка и использование замороженных бактериальных культур для инъекций мышей предпочтительнее использования непрерывной культуры, так как это уменьшает количество мутаций, которые естественным образом происходят в бактериальных популяциях19. Кроме того, замороженные культуры должны оставаться жизнеспособными в течение многих лет. Количество жизнеспособных пластин не выявило существенной разницы между CFU/mL непосредственно после подготовки запасов и через три месяца после подготовки. Использование нескольких шагов проверки на протяжении всей этой процедуры гарантирует, что метод был воспроизводимым, и результаты не были искажены загрязняющих бактерий. Кроме того, с числом мер предосторожности, принятых для обеспечения воспроизводимости, требуется меньше животных. Использование бактериального штамма, который FDA утвержденных для производства биофармацевтических как контроль (например, штамм кишечной палочки BL21), этот метод может быть использован для проверки затухания других генетически модифицированных штаммов P. aeruginosa, или других видов бактерий.
Использование биолюминесценции в качестве маркера обеспечивает дополнительную проверку вводимых бактериальных штаммов, так как маркер может быть визуализирован в месте инъекции. Введение маркера биолюминесценции в бактериальную хромосому требуется для визуализации биолюминесценции, но может быть невозможно при работе с несовместимыми штаммами/видами. Однако маркировка штаммов с биолюминесценцией не требуется для проверки на затухание. Штаммы, протестированные в этом исследовании, были отмечены биолюминесценцией, что позволило визуализировать различия в локализации между штаммами на протяжении всего течения инфекции. Мы заметили, что патогенный штамм распространяется через тело мыши, но непатогенный штамм остался в месте инъекции. Хотя этот эксперимент только испытания двух очень тесно связанных штаммов P. aeruginosa, это предполагает, что бактериальное распространение связано с вирулентностью, по крайней мере в P. aeruginosa. Таким образом, эта процедура маркировки с биолюминесценцией для визуализации прогрессирования инфекции может быть использована в будущем для быстрой оценки замягения инженерных штаммов бактерий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Автор Hongwei D. Yu является главным научным сотрудником и соучредителем Progenesis Technologies, LLC.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (NIH) гранты R44GM113545 и P20GM103434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL tubes with flat caps | ThermoScientific | AB-0620 | via Fisher Scientific |
| 1 mL Syringe | BD | 22-253-260 | via Fisher Scientific |
| 1.5 mL disposable polystyrene cuvette | Fisher Scientific | 14955127 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| 27G needle | BD | 14-821-13B | via Fisher Scientific |
| 50 mL tubes | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Benchtop Centrifuge 5804R | Eppendorf | 04-987-372 | via Fisher Scientific |
| Benchtop Microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Carbenicillin disodium salt | Fisher Scientific | BP2648250 | |
| Culture Test Tube, Polystyrene | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| Dneasy UltraClean Microbial Kit (50) | Qiagen | 12224-50 | or preferred method/vendor |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50) | Omega bio-tek | D6493-01 | or preferred method/vendor |
| EcoRI-HF, restriction endonuclease | New England BioLabs | R3101L | |
| Electroporation Cuvettes | Bulldog Bio | NC0492929 | via Fisher Scientific |
| FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| GoTaq G2 Colorless Master Mix | Promega | M7833 | via Fisher Scientific |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
| IVIS Lumina XRMS Series III In Vivo Imaging System | Perkins and Elmer | CLS136340 | |
| Kanamycin monosulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| MicroPulser Electroporator | BioRad | 1652100 | |
| Noble agar, ultrapure | Affymetris/USB | AAJ10907A1 | via Fisher Scientific |
| NotI-HF, restriction endonuclease | New England BioLabs | R3189 | |
| One Shot TOP10 Electrocomp E. coli | Invitrogen | C404052 | via Fisher Scientific |
| Phosphate buffered saline powder | Sigma | P3813-10PAK | Sigma-Aldrich |
| Prism 7 | GraphPad | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ | |
| Pseudomonas isolation agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas isolation broth | Alpha Biosciences | P16-115 | Custom made batch |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | or preferred method/vendor |
| Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | shake at 200 rpm |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A24811 | |
| Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
| Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | or preferred method/vendor |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Toothpicks, round | Diamond | Any brand of toothpicks, autoclaved | |
| TOPO TA Cloning Kit, for seqeuncing | Invitrogen | 45-0030 | |
| XAF-8 Anesthesia System Filters | Perkins and Elmer | 118999 | |
| XGI 8 Gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences/Xenogen |
References
- Gellatly, S. L., Hancock, R. E. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67 (3), 159-173 (2013).
- Valentine, M. E., et al. Generation of a highly attenuated strain of Pseudomonas aeruginosa for commercial production of alginate. Microbial Biotechnology. , (2019).
- Schweizer, H. P., Hoang, T. T. An improved system for gene replacement and xylE fusion analysis in Pseudomonas aeruginosa. Gene. 158 (1), 15-22 (1995).
- Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis. Journal of Bacteriology. 191 (7), 2285-2295 (2009).
- Yu, H., Boucher, J. C., Hibler, N. S., Deretic, V. Virulence properties of Pseudomonas aeruginosa lacking the extreme-stress sigma factor AlgU (sigmaE). Infection and Immunity. 64 (7), 2774-2781 (1996).
- Baeshen, M. N., et al. Production of Biopharmaceuticals in E. coli: Current Scenario and Future Perspectives. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (7), 953-962 (2015).
- Marisch, K., Bayer, K., Cserjan-Puschmann, M., Luchner, M., Striedner, G. Evaluation of three industrial Escherichia coli strains in fed-batch cultivations during high-level SOD protein production. Microbial Cell Factories. 12, 58 (2013).
- Ferrer-Miralles, N., Domingo-Espin, J., Corchero, J. L., Vazquez, E., Villaverde, A. Microbial factories for recombinant pharmaceuticals. Microbial Cell Factories. 8, 17 (2009).
- Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 8 (5), 528-535 (1990).
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
- Figurski, D. H., Helinski, D. R. Replication of an origin-containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (4), 1648-1652 (1979).
- Choi, K. H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nature Protocols. 1 (1), 153-161 (2006).
- Choi, K. H., Kumar, A., Schweizer, H. P. A 10-min method for preparation of highly electrocompetent Pseudomonas aeruginosa cells: application for DNA fragment transfer between chromosomes and plasmid transformation. Journal of Microbiological Methods. 64 (3), 391-397 (2006).
- Liang, R., Liu, J. Scarless and sequential gene modification in Pseudomonas using PCR product flanked by short homology regions. BMC Microbiology. 10, 209 (2010).
- Martinez-Garcia, E., de Lorenzo, V. Engineering multiple genomic deletions in Gram-negative bacteria: analysis of the multi-resistant antibiotic profile of Pseudomonas putida KT2440. Environmental Microbiology. 13 (10), 2702-2716 (2011).
- Song, C. W., Lee, S. Y. Rapid one-step inactivation of single or multiple genes in Escherichia coli. Biotechnology Journal. 8 (7), 776-784 (2013).
- Yan, M. Y., et al. CRISPR-Cas12a-Assisted Recombineering in Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 83 (17), (2017).
- Prakash, O., Nimonkar, Y., Shouche, Y. S. Practice and prospects of microbial preservation. FEMS Microbiology Letters. 339 (1), 1-9 (2013).
