Summary
전이성 맑은 세포 신장 세포 암은 철저한 전임상 조사를 위한 포괄적인 동물 모델이 없는 질병이다. 이 프로토콜은 질병에 대한 두 가지 새로운 동물 모델을 보여줍니다: 정형 이식 마우스 모델과 닭 융모난토막 모델, 둘 다 임상 사례를 닮은 폐 전이를 보여줍니다.
Abstract
전이성 명확한 세포 신장 세포 암 (ccRCC)는 신장암의 일반적인 특수형입니다. 국한 된 ccRCC는 유리한 수술 결과를 가지고 있습니다. 그러나, ccRCC 환자의 1/3은 환자를 위한 아주 나쁜 결과와 관련있는 폐에 전이를 개발할 것입니다. 불행히도, 전이의 분자 기전이 알려지지 않기 때문에 이 치명적인 단계에는 치료법이 없습니다. 폰 히펠-린다우(VHL) 종양 억제 유전자의 기능 상실이 ccRCC의 병리학적인 것으로 25년 동안 알려져 왔다. 그러나, ccRCC의 임상적으로 관련있는 형질전환 마우스 모델은 생성되지 않았다. 이 프로토콜의 목적은 전이성 ccRCC에 대해 새로 설립된 두 개의 동물 모델을 소개하고 비교하는 것입니다. 첫 번째는 마우스 모델의 신장 이식입니다. 우리의 실험실에서, CRISPR 유전자 편집 시스템은 몇몇 RCC 세포주에서 VHL 유전자를 노크하기 위하여 이용되었습니다. 신장 캡슐에 이질적인 ccRCC 인구의 정형외 이식은 면역 적격 마우스에서 강력한 폐 전이를 개발하는 새로운 ccRCC 모델을 만들었습니다. 두 번째 모델은 닭 융모알구막 (CAM) 시스템입니다. 마우스 모델에 비해 이 모델은 더 많은 시간, 노동 및 비용 효율적입니다. 이 모형은 또한 강력한 종양 대형 및 intravasation를 지원했습니다. CAM에서 종양 성장의 짧은 10 일 기간 으로 인해, 수집 된 배아 조직에서 면역 조직 화학 (IHC)에 의해 더 과도한 전이가 관찰되지 않았다. 그러나, 부화된 닭에서 종양 성장이 2주 연장되었을 때, 미세전이성 ccRCC 병변은 폐에서 IHC에 의해 관찰되었다. 이 2개의 새로운 전임상 모형은 전이성 ccRCC를 위한 새로운 처리의 발달을 향해 새로운, 환자 파생된 이종이식 (PDXs)를 확립하기 위하여 전이의 뒤에 분자 기계장치를 추가연구하기 위하여 유용할 것입니다.
Introduction
신장 세포 암 (RCC)는 미국에서 7번째로 가장 흔한 암입니다. 매년, 74,000명의 미국인은 14,000명 이상의 죽음을 차지하는 새로 진단될 것으로 추정됩니다 (명확한 세포 조직학 특수형, 또는 ccRCC는, RCC 케이스의 대략 80%를 차지하는 일반적인 특수형입니다. 국소화 된 악성 종양 환자는 신장 절제술로 치료되며 73 %1의유리한 5 년 생존율을 가지고 있습니다. 그러나, 환자의 25%-30%는 폐와 같은 중요한 기관에 먼 전이를 개발하고, 13 개월의 가난한 평균 생존율과 11 %1,2,3의5 년 생존율을 초래합니다. 전이성 ccRCC에 대한 치명적인 결과를 개선하기 위해서는 전이성 메커니즘에 대한 추가 이해가 필요합니다.
VHL 종양 억제유전자의 손실은 대부분의 인간 ccRCC케이스4, 5,6,7에서관찰되는 특징적인 유전병변이다. 그러나, ccRCC에 있는 VHL 손실의 정확한 oncogenic 기계장치는 불명합니다. 또한 VHL 발현 상태는 ccRCC8에서결과를 예측하지 않습니다. 특히, 신장 상피 표적 VHL 녹아웃에 있는 수많은 시도에도 불구하고, 과학자는 PTEN 과 p5310와같은 그밖 종양 억제제의 삭제와 결합되더라도 마우스9에서관찰된 preneoplastic 낭포성 병변을 넘어 신장 이상을 생성하는 것을 실패했습니다. 이 사실 인정은 혼자 VHL 손실이 종양 발생 또는 후속 자발적인 전이를 위해 불충분하다는 아이디어를 지원합니다.
최근, 우리 연구소는 뮤린 VHL+ ccRCC 세포주(RENCA, 또는 VHL-WT)에서 VHL 유전자의 CRISPR/Cas9 매개 결실을 이용한 새로운 VHL 녹아웃(VHL-KO) 세포주11,12를생성하였다. 우리는 VHL-KO가 중간엽일 뿐만 아니라 VHL-WT세포(12)의중간엽 전이(EMT)에 상피를 촉진한다는 것을 보여주었다. EMT는 전이성프로세스(13)에서중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 우리의 일은 더 멀리 폐 전이는 신장에 있는 VHL-KO 와 VHL-WT 세포의 공동 이식으로만 발생한다는 것을 보여주었습니다, 전이의 협력 기계장치를 지원하. 중요한 것은, 우리의 정형 간 이식 VHL-KO 및 VHL-WT 모델은 강력한 폐 전이를 유도, 임상 ccRCC 케이스를 재입증. 이러한 자발적전이성 전이성 ccRCC 모델은 특히 새로운 항 전이약물의 개발에서 형질전환마우스 모델의 부족을 보상한다. 이 프로토콜은 유전자 조작 RENCA 세포의 이기종 세포 집단의 신장 캡슐 이식을 보여줍니다.
치킨 CAM 모델은표 114, 15,16,17,18에요약된 바와 같이 그들의 수많은 이점으로 인해 혈관신생 및 종양 생물학에 대한 연구에서 오랜 역사를 가지고 있다. 간략하게, CAM 종양 성장을 위한 시간 창은 짧고,닭(16)의부화 시 CAM이 파괴될 때까지 최대 11일을 허용한다. 짧은 성장 시간에도 불구하고, 닭 배아의 풍부한 영양 공급 및 면역 결핍 상태는 매우 효율적인 종양 생착16,19,20,21을가능하게 한다. 마지막으로, 각 수정란의 비용은 SCID 마우스의 경우 $100 이상과 비교하여 ~$1입니다. 함께, CAM 모델은 마우스에 비해 시간과 비용을 크게 절약에 새로운 PDX를 확립에 가치있는 대체 동물 모델역할을 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 우리는 모델이 마우스 정형외 모델에서 관찰된 전이성 ccRCC의 생물학을 재현할 수 있었는지 여부를 평가했다.
| (SCID) 마우스 | 캠 | 참고 | |
| 비용 | >$100 각 | ~ $ 1 각 | 50-75%에 이르는 생존율 |
| 배리어 하우징의 필요성 | 예 | 아니요 | 추가 비용 절감 및 종양의 직렬 모니터링 단순화 |
| 직접 보이는 종양 | 아니요 | 예 | 그림 3A |
| 첫 번째 생착에 시간 (RENCA) | 2주일 | 2-4 일 | 참조 14, 15 |
| 성장의 종점 (RENCA) | 3-6주일 | 10일 | 참조 14, 15 |
| 전이 (RENCA) 관찰 | 예 | 예 에 병아리 | 그림 3D |
| 직렬 구절 | 예 | 예 | 참조 16-18 |
| 마우스로 통로 (RENCA) | 예 | 예 | Hu, J., 외. 검토 중 (2019) |
| 종양 이질성 유지 | 예 | 예 | Hu, J., 외. 검토 중 (2019) |
표 1: 마우스 및 CAM 모델의 장점과 제한 사항. 이 표는 필요한 시간, 비용, 노동 및 생물학의 측면에서 장점과 한계에 대한 두 모델을 비교합니다. CAM 모델은 효율성에 장점이 있지만 조류와 포유류 간의 다른 형태로 인해 고유 한 한계가 있습니다. 따라서 모델이 이종이식의 생물학을 유지할 수 있는지 확인하는 것이 중요합니다.
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Protocol
여기에 설명된 모든 방법은 UCLA 총리의 동물 연구 위원회(ARC)(ARC 2002-049-53 및 ARC 2017-102-01A)로 지정된 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 의해 승인되었습니다. 2002-049-53 프로토콜은 누드 또는 BALB/c 마우스의 신장 캡슐내로 ccRCC 종양 세포를 이식하는 데 최적화되어 있다. 부화하기 전에 수정된 닭 알에서종양 이식 실험은 IACUC 승인을 필요로 하지 않는다. 폐 전이의 설립 시간을 연장하기 위해 CAM 종양이있는 배아는 부화하고 닭으로 자랄 수 있습니다. 2017-102-01A 프로토콜은 이러한 동물 실험을 다룹니다.
1. 마우스에 있는 정형외 종양 연구 결과
참고: 이 실험의 타임라인은 그림 1A에표시됩니다. 이러한 절차는 이전 간행물11,12에서적용되었습니다.
- 접목을 위한 단일 셀 현탁액 준비
- 트립신/EDTA를 사용하여 배양 요리에서 RENCA VHL-WT 및 VHL-KO 세포를 분리합니다.
- 혈세포계로 세포를 계산하고 1 x 105 세포 / μL의 농도에서 PBS 및 세포 외 매트릭스 용액의 미리 냉각 된 1 : 1 혼합물에서 다시 중단하십시오.
참고: 이질적인 임플란트에는 VHL-WT:VHL-KO 세포의 1:4 비율을 사용하고 균일한 임플란트에는 VHL-WT만 사용하십시오. - 다시 매달린 세포를 1.5 mL 미세 원심 분리튜브로 옮기고 이식될 때까지 얼음을 유지합니다.
- 신장 캡슐에 이식
- 마취: 따뜻한 패드를 37°C로 예열하고 두꺼운 멸균 드레이프로 덮습니다. 유도 챔버 또는 복강 내 (IP) 1% 펜토바르비탈 나트륨을 10 mL/kg의 투여량으로 주입하여 마우스를 마취시.
- 수술 부위에서 머리카락을 면도하십시오. 이 단계는 누드 마우스에 대해 건너뛸 수 있습니다.
- 소독 및 수술 드레이프: 마우스 뒷면을 포비동 요오드 3x로 완전히 소독한 다음 70% 에탄올 1x를 소독하고 멸균 면봉으로 건조시닦습니다. 그런 다음 세 개의 멸균 의료 용 드레싱을 순차적으로 적용하여 수술 장을 만들고 마우스를 고정시키기 위해 뒤쪽 전체를 덮습니다.
- 절개 및 신장 외장: 수술 전에 작업자의 손가락을 포비도 요오드로 소독하거나 멸균 장갑을 사용하십시오. 마우스를 경향이 있는 위치에 놓고 손가락을 사용하여 왼쪽 측면 바로 아래 왼쪽 신장을 찾습니다. 무딘 집게와 가위를 사용하여 피부를 열고 지정된 위치 아래근육 층을 잘라냅니다. 멸균 면봉과 집게를 사용하여 왼쪽 신장을 복부에서 부분적으로 외부화하십시오.
- 종양 세포 이식: 인슐린 주사기 또는 맞춤형 해밀턴 주사기에서 1.1단계에서 제조된 세포 현탁액을 로드합니다(사양에 대한 재료 표 참조). 신장 캡슐 아래에 20 μL의 재부유 세포를 주입하십시오.
참고 : 성공적인 주사는 신장 표면에 반투명 한 팽창의 형성에 의해 결정됩니다. 신장 실치종에 우발적인 주사는 주사 부위에 치명적인 출혈로 인해 출혈과 수술 후 사망률이 90 %로 높아지습니다. - 세포외 매트릭스 용액이 고형화되고 출혈이나 종양 세포 누출을 예방하기 위해 바늘을 천천히 당깁니다. 그런 다음 멸균 면봉을 사용하여 신장을 복부로 다시 밀어 넣습니다.
- 상처 스티치: 5-0 코팅 된 VICTRYL 봉합사를 사용하여 근육 층을 스티치하십시오. 포비돈 요오드로 피부를 한 번 소독하고 상처 가까스로 피부를 닫습니다.
- 복구: 마우스가 깨어날 때까지 따뜻한 패드에 놓습니다. 마우스가 흡입에 의해 마취된 경우, 이소플루란을 철회하고 깨어날 때까지 따뜻한 패드에 마우스를 보관하십시오.
- 생물 발광 이미징 (BLI) 및 조직 수집
- 종양 이식 후 6 주, 반딧불 - 루시 퍼라제 기반의 BLI 이미지를 가져 가라. 그런 다음 이소플루란 흡입으로 마우스를 안락사시키고 자궁 경부 탈구를 수행합니다.
- 순환 종양 세포 (CTC) 유세포 측정에 의해 검출을위한 혈액을 수집합니다.
- 멸균 조직 채취 기술22를이용하여 종양 및 관심 기관(신장, 폐, 간, 내장 및 비장)을 수확한다. 파라핀 왁스 를 포함하기 위해 하룻밤 동안 4 % 파라 포름 알데히드에 고정하십시오.
2. CAM 종양 이종이식 모델
참고: 이러한 절차는 이전에 게시된 프로토콜23,24에서조정 및 수정되었습니다. 이 절차의 타임라인은 그림 1B에표시됩니다. 이 문서에서는 간소화된 프로토콜만 제공합니다. 자세한 프로토콜은 그룹25에의해 게시 된 다른 JoVE 기사를 참조하십시오.
- 미리 인큐베이션: 37°C에서 회전하는 계란 인큐베이터에 갓 낳은 수정된 닭고기 계란을 7일 동안 55-65% 습도로 배양합니다.
- CAM을 놓고 창을 엽니다 (발달 일 7):
- 공기 주머니와 정맥을 찾아 표시합니다.
참고 : 일반적으로 계란의 10-15 %는 수정되지 않거나 수정 후 7 일 이내에 죽기 때문에 제거됩니다. - 표시된 정맥 위에 새 공기 주머니를 만듭니다.
- 새로운 공기 주머니를 묘사하고, 포장 테이프를 적용하고, 계란을 인큐베이터에 다시 넣습니다.
참고: 절차는 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 공기 주머니가 움직일 수 있기 때문에 같은 날 에 절차를 재개하는 것이 좋습니다. - 창 열기: 구부러진 미세 제해 가위 한 쌍과 바늘 코 집게 한 쌍을 사용하여 껍질에 1.5 x 1.5 cm 원형 창을 자른다.
참고 : CAM의 중단은 절단 쉘 조각에 존재하는 혈액과 CAM 조각으로 표시됩니다. - 투명한 의료 용 드레싱으로 구멍을 밀봉하고 37 °C와 55 % - 65 % 습도에서 고정 인큐베이터에 계란을 놓습니다.
참고: 2.1단계에서와 동일한 계란 인큐베이터를 사용하십시오. 회전을 끄면 고정되도록 합니다.
- 공기 주머니와 정맥을 찾아 표시합니다.
- 건강 검사 (발달 일 9): 죽은 계란을 제거 하 고 종양 세포 이식에 대 한 계란의 나머지 를 무작위로 그룹화.
참고: 이상적으로, 이 시점에서 생존율은 발달 일 0의 대략 80%입니다. - 종양 세포를 새로 노출된 CAM에 이식(발달일 10일)
- 세포외 매트릭스 용액을 미리 냉각된 RPMI 1640의 부피의 두 배로 희석합니다(L-글루타민 사용). RENCA 세포를 분리하고 위의 용액에 다시 일시 중단하여 2 x 104 세포/μL의 농도에 도달합니다.
참고: 이질적인 임플란트에는 VHL-WT:VHL-KO 세포의 1:1 비율을 사용하고 균일한 이식에는 VHL-WT만 사용하십시오. - 세포 현탁액을 고형화하기 위해 각 세포 혼합물의 100 μL을 200 μL 파이펫 팁에 채우고 15 분 동안 세포 인큐베이터에 놓습니다.
- 창을 통해 CAM 표면에 각 계란에 대한 세포 현탁액의 100 μL을 임플란트.
참고 : 일부 프로토콜은 이식23전에 CAM을 긁는 것이 필요합니다. 이것은 RENCA 세포에 필요하지 않습니다, 그들은 매우 빠르게 성장하기 때문에.
- 세포외 매트릭스 용액을 미리 냉각된 RPMI 1640의 부피의 두 배로 희석합니다(L-글루타민 사용). RENCA 세포를 분리하고 위의 용액에 다시 일시 중단하여 2 x 104 세포/μL의 농도에 도달합니다.
- CAM에서 세포를 10 일 동안 성장시키고 2 일마다 사진을 찍습니다.
- 종양, 혈액 및 장기를 안락사시키고 수확하십시오.
- 발달일 20일(종양의 날 10일)에, 10 mL 주사기로 융모알란토충정맥을 통해 혈액을 채취한다.
- 배아를 15분 동안 얼음위에 올려 놓음으로써 안락사시한다.
- 종양을 수확하고 계량합니다. 마우스(22)에사용되는 것과 유사한 멸균 조직 채취 기술을 사용하여 폐 및 간을 해부한다.
참고 : 닭 간은 복강에서 본 첫 번째 장기인 두 개의 엽을 가지고 있습니다. 폐와 혼동하지 마십시오. 닭 폐는 심장과 중격(26)아래에 위치하고 있습니다. 폐의 성공적인 수집은 노출 된 갈비뼈로 확인할 수 있습니다. - 파라핀 왁스 임베딩을 위해 종양과 해부 된 장기를 4 % 파라 포름 알데히드에서 하룻밤 동안 고정하십시오.
- 닭을 부화.
- 종양 성장의 연장된 기간을 허용하기 위하여는, 21일까지 배양을 계속하고 닭이 37°C 및 적어도 60% 습도에서 부화하게 하십시오.
참고: 닭은 24시간 동안 21일 이후에 자연스럽게 부화하지만 때로는 스스로 부화하는 데 어려움을 겪습니다. 이 경우, 달걀 껍질을 깨는 것은 몇 가지 도움이됩니다. 닭은 그 후 영양분의 부족으로 죽을 것이기 때문에 24 시간 이내에 부화 과정을 완료하는 것이 중요합니다. - 2 주 동안 동물 시설 (2017-102-01A)에서 닭을 키입니다.
- 발달 일 34 (종양 일 24)에, 자궁 경부 탈구 에 이어 이소플루란 흡입으로 병아리를 안락사시.
- 마우스(22)에사용되는 것과 유사한 멸균 조직 수확 기술을 사용하여 폐를 해부한다. 그런 다음 파라핀 왁스 임베딩을 위해 밤새 4 % 파라 포름 알데히드에 고정하십시오.
- 종양 성장의 연장된 기간을 허용하기 위하여는, 21일까지 배양을 계속하고 닭이 37°C 및 적어도 60% 습도에서 부화하게 하십시오.
3. 면역화학
참고: 모든 조직 절제 및 H&E 염색은 로스앤젤레스 캘리포니아 대학의 번역 병리학 코어 연구소(TPCL)에 의해 이루어졌습니다.
- 65°C에서 20분간 슬라이드를 굽고 자일렌을 사용하여 3배의 탈파를 하고 100% 에탄올에서 물로 연속적으로 수분을 공급합니다.
- 25 분 동안 야채 증기선에서 삶은 구연산염 완충액에서 항원을 검색합니다.
- 차단을 위해 1% BSA를 적용합니다. 이어서 PBS에서 1:200 희석비로 제조된 1차 항체(anti-VHL, anti-HA, anti-flag)를 적용한다. 4 °C에서 밤새 배양.
- TBST (각각 7 분)로 3 x를 세척 한 후, 1 :200 희석에서 이차 항체로 슬라이드를 배양합니다. TBST(각 7분)로 3x세척하고 DAB 시약을 적용한 다음 헤마톡실린 카운터스테인을 적용합니다.
4. 유세포분석
- 적혈구 (RBC) 리시온 완충제와 마우스 또는 닭 혈액을 처리 제조 업체의 프로토콜에 따라.
참고: 닭 RBC는 핵화되고 전방 및 측 산란을 사용하여 유세포 측정에서 쉽게 구별될 수 없기 때문에 CAM 혈액을 분석할 때 충분한 RBC 용해가 특히 중요합니다. - 혈액 용해에 유동 세포 분석을 실행하고 mStrawberry 및 EGFP 발현에 대한 데이터를 분석합니다.
- 파편, 죽은 셀 및 비풀린 RBC를 제외한 전방 및 측면 분산을 기반으로 기본 게이트를 설정합니다.
- 스테인드되지 않은 샘플과 단일 스테인드 컨트롤을 기반으로 형광 게이트를 설정합니다. VHL-WT, VHL-KO 또는 라벨이 부착되지 않은 RENCA 세포를 단일 염색 대조군 및 얼룩지지 않은 대조군으로 각각 프라이밍된 혈액 용해액을 사용하십시오.
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Representative Results
각 실험은 달리 명시되지 않는 한 적어도 3회 이상 수행하였다. 데이터는 평균 ± 표준 편차(SD)로 표시됩니다. 유의는 두 그룹이 있을 때 또는 3개 이상의 그룹이 있을 때 단방향 ANOVA에 의해 쌍을 이루는 학생의 T-시험에 의해 결정되었다. 0.05의 p-값 컷오프는 유의를 확립하는 데 사용되었다.
직교 이식 RENCA 세포는 성공적으로 쥐 신장에 성장, BLI와 H&E 염색에 의해 확인(그림 2A-B). 1차 성장에는 차이가 없었지만, H&E 염색에서 매우 강한 BLI 신호 및 전이성 결절에 의해 나타난 바와 같이, 이질성, 전이성 종양만이 폐에 강력한 전이를 가졌다. 한편, 균일성, 비전이성 종양은 먼 장기로 전이되지 않았다. CTC 카운트는 전이성 종양을 낳는 쥐보다 전이성 종양을 베어링하는 마우스에서 더높았다(도 2C-D).
마우스 모델과 일치하여, CAM 시스템은 RENCA 종양의 성장 및 전이성 거동을 성공적으로 유지시켰다. 전이성 종양과 비전이성 종양 사이의 성장 차이는 없었지만, CTC 수는 전이성 종양을 가진 난자에서 전이성 대조물보다 상당히 높았습니다(그림 3A-C). CAM 종양으로 계란을 부화하고 병아리가 추가로 2 주 성장하도록 허용하면 닭 폐 조직 섹션의 H&E 및 HA 얼룩에 나타난 바와 같이 병아리의 폐에서 조직학적으로 검출 가능한 전이를 확립하기 위해 전이성 암세포의 기간을 연장했습니다(그림 3D). 전이성 결절의 대다수는 HA 태그VHL-WT 세포로 이루어져, 반면 깃발 태그 VHL-KO는 우리가 마우스에서 관찰한 것과 같이 거의 보이지 않았습니다.
도 1: 전이성 ccRCC 이종이식에 대한 두 동물 모델의 개요. (A)마우스 정형파 모델의 개략적 표현. 3- 또는 4 주 된 마우스는 정형 전이성 또는 전이성 종양중 하나를 정형 이식. 이식 후 6주, 종양 성장 및 전이를 BLI로 가시화시켰다. 그 후, 종양, 혈액 및 장기를 하류 분석을 위해 수집했습니다. (B)다음 단계를 나타내는 CAM 모델의 개략적 표현: 부화 전후의 사전 인큐베이션, 창 개구부, 세포 이식 및 안락사. 수집된 샘플에 대해 마우스 모델과 동일한 분석이 수행됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 정형이식 마우스에서 종양 성장 및 전이. (A)RENCA 세포의 정형외 이식 후 6주 후 생쥐 및 추출된 장기(신장, 폐, 간, 장 및 비장)의 BLI. 왼쪽: 비전이성(비충족), 오른쪽: 전이성. (B)신장및폐에 대한 H&E 염색의 총시야 및 증가배율(20배 및 100배). 왼쪽: 비전이성(비충족), 오른쪽: 전이성. (C)혈액에서 순환하는 mStraw+ 및 EGFP+ 세포를 검출하기 위한 대표적인 유동 분석. (D)순환 mStraw + 및 EGFP + 세포의 백분율 인구 그래프. 충족되지 않은: 전이성. 패널 A는 Hu et al.27에서적응되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: CAM 모델에서 종양 성장 및 전이. (A)CAM에서 자란 RENCA 종양. 각 그룹에 대해 7번의 반복이 있었습니다. 충족되지 않은: 전이성. (B)혈액에서 순환하는 mStraw+ 및 EGFP+ 세포를 검출하기 위한 대표적인 유동 분석. (C)순환 mStraw + 및 EGFP + 세포의 백분율 인구 그래프. ** p & 0.01. (D)IHC는 배아 단계에서 전이성 종양을 낳은 2주령 병아리로부터 폐의 염색을 한다. 왼쪽부터 H&E, HA 및 플래그 얼룩이 표시됩니다. #: 닭 폐 동맥; 화살촉: 전이성 작은혹. 이 그림은 Hu J 외27에서적응되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
상피 악성 종양을 가진 많은 환자를 위해, 중요한 기관에 전이는 사망의 주요 원인입니다. 그러므로, 전이성 질병을 위한 근본적인 기계장치 그리고 치료의 새로운 길을 찾아내기 위하여 필수적입니다. 불행히도, 관련 전이성 ccRCC 동물 모델의 부족이 있다. 큰 부분에서 도전은 수많은 형질전환 신장 상피 표적 VHL 녹아웃 마우스 모델9,10의생성에도 불구하고 마우스에서 ccRCC를 재현할 수 없기 때문이다. 여기서, 우리는 두 동물 시스템에서 이식형 전이성 ccRCC 종양을 확립하는 방법, 즉 마우스와 닭 CAM을 입증한다. 이 사실 인정은 2개의 이질적인 환경에서 종양의 전이성 행동을 유효하게 하고, 따라서 전이의 분자 기계장치를 추가조사하기 위하여 유일한 기회를 제공합니다. 첫 번째 모델에서, 이기종 RENCA 집단은 그들의 신장 캡슐에 정형학적으로 면역 적격 마우스에 이식되었다. 6주 후, 이들 마우스는 만연한 폐 전이를 보였다. 마우스 모델과 일치하여 CAM에 이질성 RENCA 세포를 이식하는 것이 성공적으로 성장하여 병아리 배아의 혈액으로 intotravased. 종양 성장 기간을 부화 후 2주로 연장시킴으로써, 마우스에서 보이는 것과 유사한 폐 전이를 병아리에서 관찰하였습니다.
두 모델 모두, 각 단계의 기술적 세부 사항과 기술적 능력을 향상시키기 위한 연습에 주의를 기울이는 것은 동물의 생존과 성공적인 종양 생착 및 전이를 증가시키는 데 필수적입니다. 마우스 모델의 경우, 장비의 신중한 선택과 신장 캡슐에 종양 세포를 정확하게 주사하는 것은 수술 후 사망률을 감소시키고 종양이 성장할 적절한 혈액 공급을 얻을 확률을 증가시킴으로써 성공률을 극대화하고 전이. CAM 모델은 설정 및 기술에 더 많은 최적화가 필요합니다. 우리의 연구 결과에서는, 태아 생존은 처음에 30% 이하이었습니다. 좋은 장비, 잦은 모니터링 및 절차의 빠른 완료를 통해 항상 온도와 습도를 원하는 수준으로 유지하는 것이 중요합니다. 최적화 후에도 생존가능성은 실험자와 계란의 개별 배치에 따라 50-75%에 달합니다. 항상 백업을 위해 여분의 계란을 주문하는 것이 좋습니다. 우리의 경험에서 CAM 기술을 마스터하려면 1 년 이상이 필요합니다. CAM 멤브레인을 떨어뜨리고 창을 여는 것은 태아에 우발적이고 치명적인 손상이 가장 자주 발생하는 중요한 단계입니다. 병아리 배아의 생존능력은 CAM의 손상을 방지함으로써 개선될 수 있다.
CAM 종양 모형에는 몇몇 제한이 있습니다. 첫 번째는 모든 종양 세포 유형에 대한 모델의 적용성입니다. 우리는 신장, 방광 및 전립선 종양 세포주 (RENCA, ACHN, T24, HT1376, CWR22Rv1, C4-2, Myc-CaP) 및 난소 암 세포주 (ID8 및 SKOV3)를 포함하여 CAM에 다른 확립 된 종양 세포주를 생생시키는 100 % 성공률을 보였습니다. 우리 그룹에서 2개의 추가 연구 결과는 이 CAM종양25,27에추가 정보를 제공합니다. 그러나, CAM상에서 일부 난소암세포의 성장은 성장인자 또는 종양 관련 세포의 보충에 의해강화된다(25). 각 세포주 또는 유형에 대한 세포 수 또는 필수 성장 인자의 최적화가 중요하다. 우리는 또한 동물25,27에서종양의 성장 및 전이의 모니터링을 용이하게 하기 위해 luciferase, 단백질 태그(예를 들어, HA 또는 플래그) 또는 형광 태그(예를 들어, mStrawberry 또는 EGFP)와 같은 리포터 또는 마커 유전자를 통합한다. 우리의 경험에 근거하여, 증식하는 암 세포주의 대다수는 CAM에 설치될 수 있습니다. 생착에 대한 주요 제한은 종양 성장을 허용하는 짧은 10 일 창일 수 있으며, 이는 이러한 짧은 시간 프레임에서 충분한 질량을 확립하기 위해 느린 성장 세포주에게 특히 어려울 수 있습니다.
CAM 모델의 또 다른 단점은 조류 배아와 포유류 사이의 생리학의 차이입니다. CAM 종양으로부터 배아의 간 또는 폐와 같은 주요 장기로의 전이는 민감한 PCR 기술28에의해 우세하게 검출되었다. CAM에 있는 성장의 짧은 기간은 조직학 분석에 의해 확인될 수 있는 큰 전이성 병변을 설치하기에 불충분할 것입니다. 더욱이, 팽창되지 않은 배아 폐의 감소된 혈관 관류는 폐 전이의 성장을 확립 또는 지지하는 데 유리하지 않다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리의 기관 동물 사용위원회 (IACUC)의 승인을 얻어 CAM 종양 베어링 배아에서 닭을 부화하고 부화 후 추가 2 주를 집에. 이 방법으로 종양 성장의 시간을 연장하는 것은 우리가 IHC에 의해 먼 폐 전이를 검출하는 것을 가능하게 했습니다. 부화 한 닭 연구는 CAM 종양 연구가하지 않는 추가 IACUC 승인을 필요로하지만,이 방법은 이전에 마우스에서 수행 된 바와 같이 닭의 전이성 폭포를 연구 할 수있는 귀중한 기회를 제공합니다. 닭면역계는 12일 이후 수정후20일째부터발병하는 것으로 보고되고 있다. 유린 유래 RENCA 종양의 고효율을 감안할 때, 수정 후 10일째에 CAM에서 다른 많은 인간 암 세포주 및 PDXs가보고되었고, 24,25,27,우리는 배아의 면역체계가 이 시점에서 완전히 개발되지 않는다는 것을 추론할 수 있었다. 닭의 면역 체계와 CAM 종양의 상호 작용은 명확하게 추가 조사를 보증합니다.
우리의 일은 CAM 종양 모형이 전이를 포함하여 암 생물학을 공부하기 위하여 간단한 초기 생체 내 모형일 수 있었다는 강한 지지 증거를 제공합니다. 위에서 언급한 제한 사항으로 인해 CAM 모델은 마우스 모델을 교체하지 말고 보완해야 합니다. 우리의 지속적인 연구는 ccRCC에 있는 이기종 세포 인구 사이 신호 크로스토크가 전이성 진행을 지배에 있는 중요한 역할을 한다는 것을 건의합니다11,12. CAM 및 마우스 모델을 모두 사용하는 것은 ccRCC에서 재생 시 전이성 누토크를 검증하는 귀중한 수단이 될 수 있습니다. 우리는 여기에 제시된 CAM 모형의 수많은 이점이 암의 이 치명적인 단계를 치료하기 위하여 새로운 전이성 기계장치 및 효과적인 처리의 발견의 속도를 가속화할 수 있었다는 것을 믿습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 UCLA JCCC 종자 교부금, UCLA 3R 교부금, UCLA CTSI 및 UC TRDRP (LW)에 의해 지원되었습니다. 우리는 크럼프 연구소의 전임상 이미징 시설, TPCL 및 UCLA의 실험실 동물 의학부 (DLAM)에게 실험 방법에 대한 도움을 주셔서 감사합니다. 유세포 측정은 UCLA 존슨 종합 암 센터 (JCCC) 및 에이즈 연구 유동 세포 측정 코어 시설에서 수행되었으며, 국립 보건원에서 지원하는 P30 CA016042 및 5P30 AI028697, JCCC, UCLA 에이즈 연구소, UCLA 의과 대학, UCLA 의학부, UCLA 장관 의학과 UCLA 의학부, UCLA 장관 의학부 통계 컨설팅 및 데이터 분석 서비스는 UCLA CTSI 생물 통계학, 역학 및 연구 디자인 (BERD) 프로그램에 의해 제공되었으며, 이는 NIH / 국립 번역 과학 UCLA CTSI 교부금 번호 UL1TR001881에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | 25053CI | |
| 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | |
| anti-VHL antibody | Abcam | ab135576 | |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD Biosciences | 14-826-79 | |
| BD Pharm Lyse | BD Biosciences | 555899 | |
| BDGeneral Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| DAB Chromogen Kit | Biocare Medical | DB801R | |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Gibco | LS14190250 | |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | eBioscience | 14-6681-82 | |
| Ethanol 200 Proof | Cylinders Management | 43196-11 | Prepare 70% in water |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Fisher Scientific | 10-437-028 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | |
| FisherbrandHigh Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| FisherbrandPremium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Formaldehyde Soln., 4%, Buffered, pH 6.9 (approx. 10% Formalin soln.), For Histology | MilliporeSigma | 1.00496.5000 | |
| Hamilton customized syringe | Hamilton | 80408 | 25 µL, Model 702 SN, Gauge: 30, Point Style: 4, Angle: 30, Needle Length: 17 mm |
| HA-probe Antibody (Y-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc805 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D | |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein Animal Health | 1169567762 | |
| IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | C354230 | |
| Medline Surgical Instrument Drape, Clear Adhesive, 24" x 18" | Medex Supply | MED-DYNJSD2158 | |
| OmniPur BSA, Fraction V [Bovine Serum Albumin] Heat Shock Isolation | MilliporeSigma | 2910-25GM | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution, 100X, 10,000 IU Penicillin, 10,000ug/mL Streptomycin | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Pentobarbital Sodium | Sigma Aldrich | 57-33-0 | Prepare 1% in saline |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-062 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) Available Iodine, for Laboratory Use | Ricca Chemical | 395516 | |
| pSicoR | Addgene | 11579 | |
| Puromycin dihydrochloride hydrate, 99%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC227420500 | |
| Renca | ATCC | CRL-2947 | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine | Corning | 10040CV | |
| Scientific 96-Well Non-Skirted Plates, Low Profile | Fisher Scientific | AB-0700 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-200, 200 µl, 960 (10 racks of 96) | Thomas Scientific | 1159M40 | |
| Shipping Tape, Multipurpose, 1.89" x 109.4 Yd., Tan, Pack Of 6 Rolls | Office Depot | 220717 | |
| Suture | Ethicon | J385H | |
| Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 1634 | |
| Thermo-Chicken Heated Pad | K&H manufacturing | 1000 | |
| Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | |
| VHL-KO | CRISPR/Cas9-mediated knockout of VHL, then lentivirally labeled with flag-tagged EGFP & firefly luciferase | ||
| VHL-WT | Lentivirally labeled with HA-tagged mStrawberry fluorescent protein & firefly luciferase | ||
| World Precision Instrument FORCEPS IRIS 10CM CVD SERR | Fisher Scientific | 50-822-331 | |
| Wound autoclips kit | Braintree scientific, inc. | ACS KIT | |
| Xylenes (Histological), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X3S-4 |
References
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