Summary
Carcinoma de células renais metastáticas claras é uma doença sem um modelo animal abrangente para investigação pré-clínica completa. Este protocolo ilustra dois novos modelos animais para a doença: o modelo de camundongo sutópicamente implantado e o modelo de membrana chorioallantoico de frango, ambos demonstram metástase pulmonar semelhante a casos clínicos.
Abstract
Carcinoma de células renais metastáticas (CCCc) é o subtipo mais comum de câncer renal. CcRCC localizado tem um resultado cirúrgico favorável. No entanto, um terço dos pacientes com CCCc desenvolverá metástases no pulmão, o que está relacionado a um desfecho muito ruim para os pacientes. Infelizmente, nenhuma terapia está disponível para este estágio mortal, porque o mecanismo molecular da metástase permanece desconhecido. Sabe-se há 25 anos que a perda de função do gene supressor de tumor von Hippel-Lindau (VHL) é pathognomonic do CCRCC. No entanto, nenhum modelo de camundongo transgênico clinicamente relevante de CCRCC foi gerado. O objetivo deste protocolo é introduzir e comparar dois modelos animais recém-estabelecidos para ccRCC metastático. A primeira é a implantação renal no modelo do mouse. Em nosso laboratório, o sistema de edição de genes CRISPR foi utilizado para derrubar o gene VHL em várias linhas celulares RCC. A implantação ortotópica de populações heterogêneas de CCRCC para a cápsula renal criou novos modelos ccRCC que desenvolvem metástases pulmonares robustos em camundongos imunocompetentes. O segundo modelo é o sistema de membrana chorioallantoico de frango (CAM). Em comparação com o modelo do mouse, este modelo é mais tempo, mão-de-obra e custo-eficiente. Este modelo também suportava formação e intravasão tumoral robustas. Devido ao curto período de 10 dias de crescimento tumoral em CAM, nenhuma metástase foi observada pela imunohistoquímica (IHC) nos tecidos de embriões coletados. No entanto, quando o crescimento do tumor foi estendido por duas semanas no frango eclodido, as lesões de ccRCC micrometastáticos foram observadas pelo IHC nos pulmões. Esses dois novos modelos pré-clínicos serão úteis para estudar melhor o mecanismo molecular por trás da metástase, bem como para estabelecer novos xenoenxertos derivados do paciente (PDXs) para o desenvolvimento de novos tratamentos para ccRCC metastático.
Introduction
O carcinoma de células renais (RCC) é o7º câncer mais comum nos Estados Unidos. Anualmente, estima-se que 74.000 americanos sejam diagnosticados recentemente, representando mais de 14.000 mortes (o subtipo histológico de células claras, ou CCRCC, é o subtipo mais comum, representando aproximadamente 80% dos casos de RCC. Pacientes com malignidade localizada são tratados com nefrectomia e têm uma taxa de sobrevivência favorável de 5 anos de 73%1. No entanto, 25%-30% dos pacientes desenvolvem metástases distantes para órgãos vitais, como os pulmões, resultando em uma baixa sobrevida média de 13 meses e 5 anos de sobrevivência de apenas 11%1,2,3. É necessária uma compreensão adicional do mecanismo metastático para melhorar o resultado mortal para ccRCC metastático.
A perda do gene supressor do tumor VHL é uma lesão genética marcante observada na maioria dos casos de CCRCC humano4,5,6,7. No entanto, o mecanismo oncogênico preciso da perda de VHL no CCRCC é desconhecido. Além disso, o status de expressão VHL não é preditivo do resultado no CCRCC8. Notavelmente, apesar de inúmeras tentativas de nocaute de VHL alvo renal-epitelial, os cientistas falharam em gerar anormalidade renal além das lesões císticas pré-neoplásticas observadas em camundongos9, mesmo quando combinadas com a exclusão de outros supressores tumorais como PTEN e p5310. Esses achados apoiam a ideia de que a perda de VHL por si só é insuficiente para tumorigênese ou a metástase espontânea subsequente.
Recentemente, nosso laboratório criou uma nova linha de células VHL knockout (VHL-KO) usando a exclusão mediada CRISPR/Cas9 do gene VHL na linha de células murine VHL+ ccRCC (RENCA, ou VHL-WT)11,12. Mostramos que vhl-ko não é apenas mesenquimal, mas também promove transição epitelial para mesonquimal (EMT) das células VHL-WT12. A EMT é conhecida por desempenhar um papel importante no processo metastático13. Nosso trabalho mostrou ainda que a metástase pulmonar distante ocorre apenas com a co-implantação de células VHL-KO e VHL-WT no rim, apoiando um mecanismo cooperativo de metástase. É importante ressaltar que nosso modelo VHL-KO e VHL-WT implantados ortotópicos leva a metástases pulmonares robustas, recapitulando os casos clínicos de CCRCC. Este modelo ccRCC metastático espontâneo compensa a falta de um modelo de camundongo metastático transgênico, especialmente no desenvolvimento de novas drogas antimetástas. Este protocolo demonstra a implantação da cápsula renal das populações de células heterogêneas de células RENCA geneticadas.
Os modelos chicken CAM têm uma longa história em pesquisa para angiogênese e biologia tumoral devido às suas inúmeras vantagens, conforme resumido na Tabela114,15,16,17,18. Resumidamente, a janela de tempo para o crescimento do tumor CAM é curta, permitindo um máximo de 11 dias até que a CAM seja destruída após a eclosão do frango16. Apesar do curto tempo de crescimento, o rico fornecimento de nutrição e o estado imunodeficiente do embrião de frango permitem enenxerto tumoral muito eficiente16,19,20,21. Finalmente, o custo de cada óvulo fertilizado é de ~$1, em comparação com mais de US $ 100 para um mouse SCID. Juntos, o modelo CAM pode servir como um valioso modelo animal alternativo na criação de novos PDXs a uma grande economia no tempo e custo em comparação com o mouse. Neste protocolo, avaliamos se o modelo foi capaz de recapitular a biologia do ccRCC metastático observado no modelo ortotópico do camundongo.
| (SCID) Mouse | Cam | Nota | |
| Custo | >$100 cada | ~$1 cada | Viabilidade variando de 50 a 75% |
| Necessidade de moradia de barreiras | Sim | Não | Reduz ainda o custo e simplifica o monitoramento em série dos tumores |
| Tumor diretamente visível | Não | Sim | Figura 3A |
| Hora do primeiro enenxerto (RENCA) | 2 semanas | 2-4 dias | árbitro 14, 15 |
| Ponto final do crescimento (RENCA) | 3-6 semanas | 10 dias | árbitro 14, 15 |
| Metástase (RENCA) observada | Sim | Sim, em pintinhos. | Figura 3D |
| Passagens em série | Sim | Sim | ref 16-18 |
| Passagem para ratos (RENCA) | Sim | Sim | Hu, J., et al. revisão (2019) |
| Manter a heterogeneidade tumoral | Sim | Sim | Hu, J., et al. revisão (2019) |
Tabela 1: Vantagens e limitações dos modelos mouse e CAM. Esta tabela compara os dois modelos por suas vantagens e limitações em termos de tempo, custo, mão-de-obra, bem como a biologia. O modelo CAM tem vantagens em eficiência, mas também tem suas próprias limitações únicas devido à diferente morfologia entre aves e mamíferos. Por isso, é importante confirmar que o modelo pode reter a biologia dos xenoenxertos.
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Protocol
Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC), designado como Comitê de Pesquisa Animal (ARC) (ARC 2002-049-53 e ARC 2017-102-01A). O protocolo 2002-049-53 é otimizado para a implantação de células tumorais ccRCC na cápsula renal de camundongos Nus ou BALB/c. Experimentos de implantação de tumores em ovos de frango fertilizados antes da eclosão não exigem aprovação do IACUC. Para estender o tempo para o estabelecimento da metástase pulmonar, os embriões com tumor CAM são autorizados a eclodir e crescer em galinhas. O protocolo 2017-102-01A abrange esses experimentos animais.
1. Estudos tumorais ortotópicos em camundongos
NOTA: A linha do tempo para este experimento é mostrada na Figura 1A. Esses procedimentos foram adaptados das publicações anteriores11,12.
- Preparando suspensão celular única para enxerto
- Desconecte as células RENCA VHL-WT e VHL-KO dos pratos culturais usando trippsina/EDTA.
- Conte as células com hemocímetro e resuspenda em uma mistura pré-refrigerada 1:1 de PBS e solução de matriz extracelular a uma concentração de 1 x 105 células/μL.
NOTA: Use uma proporção 1:4 de células VHL-WT:VHL-KO para implantes heterogêneos e VHL-WT sozinho para implantes homogêneos. - Transfira as células resuspensas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e mantenha o gelo até a implantação.
- Implantação para cápsula renal
- Anestesia: Pré-aqueça uma almofada quente a 37 °C e cubra-a com um pedaço de cortina estéril grossa. Anestesiar o mouse por inalação de isoflurano através de uma câmara de indução ou injeção intraperitoneal (IP) de 1% de sódio pentobarbital na dosagem de 10 mL/kg.
- Raspe o cabelo do local cirúrgico. Este passo pode ser ignorado para ratos nus.
- Desinfecção e draping cirúrgica: Desinfete a parte de trás do camundongo inteiramente com povido-iodo 3x seguido de 70% de etanol 1x e limpe-o com cotonetes de algodão estéreis. Em seguida, aplique três curativos médicos estéreis sequencialmente, cobrindo toda a parte traseira, a fim de criar um campo cirúrgico, bem como imobilizar o camundongo.
- Incisão e exteriorização renal: Antes da operação, desinfete os dedos do operador com povido-iodo ou use um par de luvas estéreis. Coloque o mouse na posição propensa e use os dedos para localizar o rim esquerdo bem debaixo do flanco esquerdo. Use um par de fórceps e tesouras sem cortes para cortar a pele aberta e a camada muscular o local especificado. Use cotonetes e fórceps de algodão estéreis para externar parcialmente o rim esquerdo do abdômen.
- Implantação de células tumorais: Carregue a suspensão celular preparada na etapa 1.1 em seringas de insulina ou seringas Hamilton personalizadas (consulte Tabela de Materiais para especificações). Injete 20 μL de células resuspensas a cápsula renal.
NOTA: A injeção bem sucedida é determinada pela formação de uma protuberância translúcida na superfície do rim. A injeção acidental no parenchyma renal resulta em sangramento e uma taxa de mortalidade pós-operatória de até 90% devido à hemorragia fatal no local da injeção. - Retire lentamente a agulha para permitir que a solução de matriz extracelular se solidifique e evite hemorragia ou vazamento de células tumorais. Então, usando um cotonete de algodão estéril, empurre o rim de volta para o abdômen.
- Costura da ferida: Use uma sutura VICTRYL revestida 5-0 para costurar a camada muscular. Desinfete a pele com povido-iodo uma vez e feche a pele com autoclipes de ferida.
- Recuperação: Coloque o mouse na almofada quente até acordar. Se o rato foi anestesiado por inalação, retire o isoflurano e mantenha o mouse na almofada quente até que esteja acordado.
- Imagens de bioluminescência (BLI) e coleta de tecidos
- Seis semanas após a implantação do tumor, tire imagens bli baseadas em vagalume-luciferase. Em seguida, eutanize camundongos com inalação isoflurano seguido de luxação cervical.
- Coletar sangue para detecção de células tumorais circulantes (CTC) por citometria de fluxo.
- Colher tumor e órgãos de interesse (rins, pulmões, fígado, intestinos e baço) usando uma técnica de colheita de tecido estéril22. Fixá-los em 4% paraformaldeído durante a noite para incorporação de cera de parafina.
2. Modelo de xenoenxerto tumor cam
NOTA: Esses procedimentos foram adaptados e modificados dos protocolos publicados anteriormente23,24. A linha do tempo para este procedimento é mostrada na Figura 1B. Este artigo apresenta apenas o protocolo simplificado. Para protocolos detalhados, consulte outro artigo da JoVE publicado pelo nosso grupo25.
- Preincubação: Incubar ovos de frango recém-colocados e fertilizados em uma incubadora de ovos rotativos a 37 °C e 55-65% de umidade por 7 dias.
- Solte o CAM e abra a janela (dia 7 de desenvolvimento):
- Localize e marque o saco de ar e veias.
NOTA: Geralmente 10-15% dos ovos são removidos porque são inférteis ou morrem dentro de 7 dias após a fertilização. - Crie um novo saco de ar em cima de uma veia marcada.
- Delineie o novo saco de ar, aplique fita adesiva e coloque os ovos de volta na incubadora.
NOTA: O procedimento pode ser pausado aqui. Recomenda-se retomar os procedimentos no mesmo dia porque o saco de ar pode se mover. - Abra uma janela: Usando um par de tesouras de microdissetamento curva e um par de fórceps de ponta de agulha, corte uma janela circular de 1,5 x 1,5 cm na concha.
NOTA: A interrupção da CAM é indicada pelo sangue e um pedaço de CAM presente na peça de casca cortada. - Sele o orifício com curativo médico transparente e coloque os ovos em uma incubadora estacionária a 37 °C e 55%-65% de umidade.
NOTA: Use a mesma incubadora de ovos da etapa 2.1. Desligue o rotator para torná-lo parado.
- Localize e marque o saco de ar e veias.
- Verificação de saúde (dia 9 de desenvolvimento): Remova ovos mortos e, em seguida, agrupar aleatoriamente o resto dos óvulos para implantação celular tumoral.
NOTA: Idealmente, a taxa de sobrevivência neste momento é de aproximadamente 80% do dia 0 do desenvolvimento. - Enxertando as células tumorais na CAM recém-exposta (dia 10 de desenvolvimento)
- Diluir a solução de matriz extracelular em dobro do volume de RPMI pré-refrigerado 1640 (com L-glutamina). Desajuste as células RENCA e resuspenda na solução acima para alcançar uma concentração de 2 x 104 células/μL.
NOTA: Use uma proporção 1:1 de células VHL-WT:VHL-KO para implantes heterogêneos e VHL-WT sozinho para implantação homogênea. - Para pré-solidificar a suspensão celular, preencha 100 μL de cada mistura de célulaem 200 μL e coloque-as em uma incubadora celular por 15 min.
- Implante 100 μL de suspensão celular para cada ovo na superfície CAM através da janela.
NOTA: Alguns protocolos requerem arranhar a CAM antes da implantação23. Isso não é necessário para as células RENCA, porque elas crescem muito rapidamente.
- Diluir a solução de matriz extracelular em dobro do volume de RPMI pré-refrigerado 1640 (com L-glutamina). Desajuste as células RENCA e resuspenda na solução acima para alcançar uma concentração de 2 x 104 células/μL.
- Cresça células na CAM por 10 dias e fotografe a cada 2 dias.
- Eutanizar e colher o tumor, sangue e órgãos.
- No dia 20 (dia 10 do tumor), coleto sangue através da veia chorioallantoic com uma seringa heparinizada de 10 mL.
- Eutanize os embriões colocando-os no gelo por 15 min.
- Colher e pesar tumores. Disseceu pulmões e fígados usando uma técnica de colheita de tecido estéril semelhante à usada para camundongos22.
NOTA: Fígados de galinhas têm dois lóbulos, que são os primeiros órgãos vistos na cavidade abdominal. Não confunda isso com os pulmões. Os pulmões de frango estão localizados o coração e o septo26. A coleção bem sucedida dos pulmões pode ser confirmada por costelas expostas. - Conserte os tumores e os órgãos dissecados em 4% paraformaldeído durante a noite para incorporação de cera de parafina.
- Ecloda magalhada as galinhas.
- Para permitir um longo período de crescimento tumoral, continue a incubação até o dia 21 e deixe as galinhas eclodirem a 37 °C e pelo menos 60% de umidade.
NOTA: As galinhas naturalmente eclodem após o dia 21 durante um período de 24 horas, mas ocasionalmente têm problemas para eclodir sozinhos. Neste caso, quebrar as cascas de ovos alguns ajuda. É importante que as galinhas completem o processo de eclosão dentro de 24 h porque morrerão por falta de nutrientes depois disso. - Cultivar as galinhas em uma instalação animal (2017-102-01A) por 2 semanas.
- No dia 34 (dia 24 do tumor), eutaniza os filhotes com inalação de isoflurano seguido de luxação cervical.
- Disseceu os pulmões usando uma técnica de colheita de tecido estéril semelhante às usadas para camundongos22. Em seguida, fixá-los em 4% paraformaldeído durante a noite para incorporação de cera de parafina.
- Para permitir um longo período de crescimento tumoral, continue a incubação até o dia 21 e deixe as galinhas eclodirem a 37 °C e pelo menos 60% de umidade.
3. Imunohistoquímica
NOTA: Toda secção de tecidos e coloração de H&E foi feita pelo Laboratório de Patologia Translacional (TPCL) da Universidade da Califórnia, Los Angeles.
- Asse slides a 65 °C por 20 min e deparafina 3x usando xileno e reidrate em série de 100% de etanol para água.
- Recupere os antígenos em um tampão de ceítra fervido em um vapor vegetal por 25 min.
- Aplique 1% de BSA para bloqueio. Em seguida, aplique os anticorpos primários (anti-VHL, anti-HA, anti-bandeira) preparados a uma razão de diluição de 1:200 em PBS. Incubar durante a noite a 4°C.
- Depois de lavar 3x com TBST (7 min cada), incuba slides com o anticorpo secundário às 1:200 diluição. Lave 3x com TBST (7 min cada) e aplique reagentes DAB seguidos de contracoloração de hematoxylin.
4. Citometria de fluxo
- Processe o mouse ou o sangue do frango com tampão de lise de glóbulo vermelho (RBC) de acordo com o protocolo do fabricante.
NOTA: A lise rbc suficiente é especialmente importante ao analisar o sangue CAM porque os RBCs de frango são nucleados e não podem ser facilmente distinguidos em citometria de fluxo usando a dispersão para frente e lateral. - Execute a citometria do fluxo no lysato sanguíneo e analise os dados para expressão de mStrawberry e EGFP.
- Coloque os portões primários baseados na dispersão dianteira e lateral, excluindo detritos, células mortas e RBCs insacidos.
- Coloque os portões de fluorescência baseados nas amostras não manchadas e controles manchados únicos. Use lysate de sangue preparado com vhl-WT, VHL-KO ou células RENCA não rotuladas como controles manchados únicos e controles não manchados, respectivamente.
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Representative Results
Cada experimento foi realizado pelo menos 3x, a menos que seja declarado de outra forma. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (DP). O significado foi determinado por um teste T do aluno quando havia dois grupos ou por uma ANOVA unidirecional quando havia três ou mais grupos. Um corte de valor P de 0,05 foi usado para estabelecer significado.
As células RENCA implantadas com ortotópico cresceram com sucesso nos rins dos camundongos, como confirmado pela bli e lcoloração H&E(Figura 2A-B). Embora não houvesse diferença no crescimento primário, apenas o tumor heterogêneo e metastático tinha metástase robusta no pulmão, como indicado pelo sinal BLI muito forte e nódulos metastáticos na coloração de H&E. Por outro lado, tumores homogêneos e não metastáticos não metástases para órgãos distantes. As contagem de CTC foram maiores nos camundongos com tumores metastáticos do que aqueles que têm tumores não metastáticos (Figura 2C-D).
Em concordância com o modelo do camundongo, o sistema CAM reteve com sucesso o crescimento e o comportamento metastático dos tumores RENCA. Embora não houvesse diferença de crescimento entre tumores metastáticos e não metastáticos, as contagem de CTC foram significativamente maiores nos ovos com tumores metastáticos do que aqueles com contrapartes não metastáticas (Figura 3A-C). Eclodir os ovos com tumores CAM e permitir que os filhotes cresçam mais duas semanas estendeu o período para células cancerígenas metastáticas estabelecerem metástases histologicamente detectáveis no pulmão de filhotes, como mostrado na mancha de H&E e HA de seções de tecido pulmonar de frango(Figura 3D). A maioria dos nódulos metastáticos consistia em células VHL-WT marcadas por HA, enquanto vhl-KO marcado por bandeira raramente eram vistos, como observamos em camundongos.
Figura 1: Visão geral dos dois modelos animais para xenoenxertos ccRCC metastáticos. (A)Representação esquemática do modelo ortotópico do mouse. Camundongos de 3 ou 4 semanas de idade são ortotópicos implantados com tumores não metastáticos ou metastáticos. Seis semanas após a implantação, o crescimento do tumor e a metástase foram visualizados com o BLI. Em seguida, tumores, sangue e órgãos foram coletados para análises a jusante. (B) Representação esquemática do modelo CAM mostrando as seguintes etapas: Preincubação, abertura de janela, implantação celular e eutanásia antes ou depois de eclodir. As mesmas análises do modelo do camundongo são realizadas para as amostras coletadas. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Crescimento tumoral e metástase em camundongos ortotópicos implantados. (A)BLI de camundongos e órgãos extraídos (rim, pulmão, fígado, intestino e baço) 6 semanas após a implantação ortotópica das células RENCA. Esquerda: não metastática (não atendida), direita: metastática. (B) Visão bruta e aumento da ampliação da coloração de H&E para o rim e pulmão (20x e 100x). Esquerda: não metastática (não atendida), direita: metastática. (C) Análise representativa de fluxo para detectar células mStraw+ e EGFP+ que circulam no sangue. (D) Percentual de gráfico populacional das células circulantes mStraw+ e EGFP+. Não-atendido: não metastático. O Painel A foi adaptado de Hu et al.27. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 3: Crescimento tumoral e metástase no modelo CAM. (A)tumores RENCA cultivados em CAM. Houve 7 repetições para cada grupo. Não-atendido: não metastático. (B) Análise representativa de fluxo para detectar células mStraw+ e EGFP+ que circulam no sangue. (C) Percentual populacional de células circulantes mStraw+ e EGFP+. **p < 0,01. (D)A coloração do IHC do pulmão de uma garota de 2 semanas com um tumor metastático durante seu estágio embrionário. Da esquerda, as seções mostram H&E, HA e manchas de bandeira. #: artéria pulmonar de frango; ponta da flecha: nódulos metastáticos. Este número foi adaptado de Hu J et al.27. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
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Discussion
Para muitos pacientes com malignidades epiteliais, a metástase a órgãos vitais é a principal causa de mortalidade. Portanto, é essencial encontrar o mecanismo subjacente e uma nova via de terapia para doenças metastáticas. Infelizmente, há falta de modelos animais ccRCC metastáticos relevantes. O desafio em grande parte deve-se à incapacidade de recriar ccRCC em camundongos, apesar da geração de numerosos modelos de mouse nocaute VHL alvo transgênicos9,10. Aqui, demonstramos os métodos para estabelecer um tumor de ccRCC metastático implantável em dois sistemas animais, o rato e o CAM de frango. Esses achados validaram o comportamento metastático dos tumores em dois ambientes diferentes e, assim, oferecem oportunidades únicas para investigar ainda mais o mecanismo molecular da metástase. No primeiro modelo, a população heterogênea renca foi implantada em camundongos imunocompetentes ortotópicos à sua cápsula renal. Após 6 semanas, esses ratos mostraram metástase pulmonar desenfreada. Em concordância com o modelo do camundongo, a implantação de células RENCA heterogêneas na CAM cresceu com sucesso e intrava no sangue dos embriões filhotes. Ao estender o período de crescimento do tumor para 2 semanas após a eclosão, metástases pulmonares semelhantes às vistas no camundongo foram observadas nos filhotes.
Para ambos os modelos, a atenção cuidadosa aos detalhes técnicos de cada etapa e prática para melhorar as habilidades técnicas são essenciais para aumentar a sobrevivência animal e o bem sucedido enenxerto tumoral e metástase. Para o modelo do camundongo, a escolha cuidadosa do equipamento e a injeção precisa das células tumorais na cápsula renal maximizam a taxa de sucesso diminuindo a mortalidade pós-operatória e aumentando a chance de o tumor obter um suprimento de sangue adequado para crescer e Metástase. O modelo CAM requer mais otimização na configuração e na técnica. Em nossos estudos, a viabilidade do embrião ficou abaixo de 30% no início. É importante manter a temperatura e a umidade no nível desejado o tempo todo, tendo bons equipamentos, monitoramento frequente e conclusão mais rápida dos procedimentos. Mesmo após a otimização, a sobrevivência varia de 50 a 75%, dependendo do experimentador e do lote individual de ovos. Recomenda-se sempre pedir ovos extras para backup. Em nossa experiência, dominar as técnicas cam requer mais de 1 ano. Deixar cair a membrana CAM e abrir a janela é o passo crítico onde ocorrem danos fatais e acidentais ao embrião. A viabilidade do embrião filhote pode ser melhorada evitando danos à CAM.
Existem várias limitações ao modelo de tumor CAM. Em primeiro lugar, a aplicabilidade do modelo a todos os tipos de células tumorais. Tivemos uma taxa de sucesso de 100% enenxerto de diferentes linhas de células tumorais estabelecidas na CAM, incluindo linhas de células tumorais de rim, bexiga e próstata (RENCA, ACHN, T24, HT1376, CWR22Rv1, C4-2, Myc-CaP) e linhas de células cancerígenas de ovário (ID8 e SKOV3). Dois estudos adicionais do nosso grupo fornecem mais informações sobre esses tumores CAM25,27. No entanto, o crescimento de algumas células cancerígenas ovarianas na CAM é aprimorado pela suplementação do fator de crescimento ou células associadas ao tumor25. A otimização do número celular ou fator de crescimento essencial para cada linha ou tipo celular é importante. Também incorporamos genes de repórter ou marcador, como luciferase, etiquetas proteicas (por exemplo, HA ou bandeira), ou etiquetas de fluorescência (por exemplo, mStrawberry ou EGFP), para facilitar o monitoramento do crescimento e metástase do tumor nos animais25,27. Com base em nossa experiência, a grande maioria das linhas celulares cancerosas proliferadas pode ser estabelecida no CAM. Uma limitação chave para o enenxerto pode ser a janela curta de 10 dias permitida para o crescimento do tumor, o que poderia ser especialmente desafiador para uma linha celular de crescimento lento para estabelecer massa suficiente em um período tão curto de tempo.
Outra deficiência do modelo CAM é a diferença na fisiologia entre o embrião aviário e os mamíferos. Metástase do tumor CAM para órgãos principais, como fígado ou pulmões do embrião, foi detectada predominantemente por técnicas sensíveis de PCR28. O curto período de crescimento na CAM seria insuficiente para estabelecer grandes lesões metastáticas que podem ser verificadas por análises histológicas. Além disso, a redução da perfusão vascular do pulmão embrião não inflado não é favorável para estabelecer ou apoiar o crescimento das metástases pulmonares. Para superar essas limitações, foi obtida uma aprovação do nosso comitê institucional de uso de animais (IACUC) para chocar galinhas do tumor CAM que carregam embriões e abrigá-los mais 2 semanas após o eclosão. Estender o tempo de crescimento tumoral dessa forma nos permitiu detectar metástases pulmonares distantes pelo IHC. Embora os estudos de frango eclosão exijam a aprovação adicional do IACUC de que os estudos tumorais CAM não, essa abordagem oferece uma oportunidade valiosa para estudar a cascata metastática em galinhas como feito anteriormente em camundongos. O sistema imunológico do frango foi relatado para desenvolver a partir do dia 12 após a fertilização20. Dada a alta eficiência de enenxerto de tumores RENCA derivados da murina relatados aqui e muitas outras linhas de células cancerígenas humanas e PDXs na CAM no dia 10 após a fertilização24,25,27, poderíamos deduzir que o sistema imunológico no embrião não está totalmente desenvolvido neste momento. A interação do sistema imunológico do frango e do tumor CAM claramente justifica novas investigações.
Nosso trabalho fornece fortes evidências de apoio de que o modelo de tumor CAM poderia ser uma simples inicial no modelo vivo para estudar biologia do câncer, incluindo metástase. Devido às limitações observadas acima, o modelo CAM não deve substituir o modelo do mouse, mas complementá-lo. Nossa pesquisa em andamento sugere que o sinal entre populações de células heterogêneas no CCCc é fundamental para governar a progressão metastática11,12. O uso dos modelos CAM e mouse pode ser um meio valioso para validar o crosstalk metastático em jogo no CCRCC. Acreditamos que as inúmeras vantagens do modelo CAM aqui apresentadas poderiam acelerar o ritmo de descoberta de novos mecanismos metastáticos e tratamentos eficazes para remediar esse estágio mortal do câncer.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela concessão de sementes UCLA JCCC, concessão ucla 3R, UCLA CTSI e UC TRDRP (LW). Agradecemos ao Centro de Imagens Pré-Clínicas do Instituto Crump, ao TPCL e ao Departamento de Medicina Animal Laboratorial (DLAM) da UCLA por sua ajuda com métodos experimentais. A citometria de fluxo foi realizada no Centro abrangente de Câncer (JCCC) da UCLA Johnson e no Centro de Citometria de Fluxo de Pesquisa da AIDS da UCLA, que é apoiado pelos prêmios P30 CA016042 e 5P30 AI028697, e pelo JCCC, o Instituto de Aids da UCLA, a Escola de Medicina David Geffen da UCLA, o Escritório do Chanceler da UCLA e o Escritório de Pesquisa do Vice-Chanceler da UCLA. Os serviços de consultoria estatística e análise de dados foram fornecidos pelo Programa de Bioestatística, Epidemiologia e Design de Pesquisa (BERD) da UCLA, que é apoiado pelo NIH/National Center for Advanceing Translational Science UCLA CTSI Grant Number UL1TR001881.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | 25053CI | |
| 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | |
| anti-VHL antibody | Abcam | ab135576 | |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD Biosciences | 14-826-79 | |
| BD Pharm Lyse | BD Biosciences | 555899 | |
| BDGeneral Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| DAB Chromogen Kit | Biocare Medical | DB801R | |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Gibco | LS14190250 | |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | eBioscience | 14-6681-82 | |
| Ethanol 200 Proof | Cylinders Management | 43196-11 | Prepare 70% in water |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Fisher Scientific | 10-437-028 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | |
| FisherbrandHigh Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| FisherbrandPremium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Formaldehyde Soln., 4%, Buffered, pH 6.9 (approx. 10% Formalin soln.), For Histology | MilliporeSigma | 1.00496.5000 | |
| Hamilton customized syringe | Hamilton | 80408 | 25 µL, Model 702 SN, Gauge: 30, Point Style: 4, Angle: 30, Needle Length: 17 mm |
| HA-probe Antibody (Y-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc805 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D | |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein Animal Health | 1169567762 | |
| IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | C354230 | |
| Medline Surgical Instrument Drape, Clear Adhesive, 24" x 18" | Medex Supply | MED-DYNJSD2158 | |
| OmniPur BSA, Fraction V [Bovine Serum Albumin] Heat Shock Isolation | MilliporeSigma | 2910-25GM | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution, 100X, 10,000 IU Penicillin, 10,000ug/mL Streptomycin | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Pentobarbital Sodium | Sigma Aldrich | 57-33-0 | Prepare 1% in saline |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-062 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) Available Iodine, for Laboratory Use | Ricca Chemical | 395516 | |
| pSicoR | Addgene | 11579 | |
| Puromycin dihydrochloride hydrate, 99%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC227420500 | |
| Renca | ATCC | CRL-2947 | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine | Corning | 10040CV | |
| Scientific 96-Well Non-Skirted Plates, Low Profile | Fisher Scientific | AB-0700 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-200, 200 µl, 960 (10 racks of 96) | Thomas Scientific | 1159M40 | |
| Shipping Tape, Multipurpose, 1.89" x 109.4 Yd., Tan, Pack Of 6 Rolls | Office Depot | 220717 | |
| Suture | Ethicon | J385H | |
| Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 1634 | |
| Thermo-Chicken Heated Pad | K&H manufacturing | 1000 | |
| Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | |
| VHL-KO | CRISPR/Cas9-mediated knockout of VHL, then lentivirally labeled with flag-tagged EGFP & firefly luciferase | ||
| VHL-WT | Lentivirally labeled with HA-tagged mStrawberry fluorescent protein & firefly luciferase | ||
| World Precision Instrument FORCEPS IRIS 10CM CVD SERR | Fisher Scientific | 50-822-331 | |
| Wound autoclips kit | Braintree scientific, inc. | ACS KIT | |
| Xylenes (Histological), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X3S-4 |
References
- Cohen, H. T., McGovern, F. J.
- Bianchi, M., et al. Distribution of metastatic sites in renal cell carcinoma: a population-based analysis. Annals of Oncology. 23 (4), 973-980 (2012).
- Hsieh, J. J., et al.
- Foster, K., et al. Somatic mutations of the von Hippel-Lindau disease tumour suppressor gene in non-familial clear cell renal carcinoma. Human Molecular Genetics. 3, (1994).
- Young, A. C., et al. Analysis of VHL Gene Alterations and their Relationship to Clinical Parameters in Sporadic Conventional Renal Cell Carcinoma. Clinical Cancer Research. 15 (24), 7582-7592 (2009).
- Gossage, L., Eisen, T., Maher, E. R. VHL, the story of a tumour suppressor gene. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 55-64 (2015).
- Sato, Y., et al. Integrated molecular analysis of clear-cell renal cell carcinoma. Nature Genetics. 45 (8), 860-867 (2013).
- Choueiri, T. K., et al. The role of aberrant VHL/HIF pathway elements in predicting clinical outcome to pazopanib therapy in patients with metastatic clear-cell renal cell carcinoma. Clinical Cancer Research. 19 (18), 5218-5226 (2013).
- Hsu, T. Complex cellular functions of the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene: insights from model organisms. Oncogene. 31 (18), 2247-2257 (2012).
- Albers, J., et al. Combined mutation of Vhl and Trp53 causes renal cysts and tumours in mice. EMBO Molecular Medicine. 5 (6), 949-964 (2013).
- Schokrpur, S., et al. CRISPR-Mediated VHL Knockout Generates an Improved Model for Metastatic Renal Cell Carcinoma. Scientific Reports. 6, 29032 (2016).
- Hu, J., et al. A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 9, 203-210 (2018).
- Heerboth, S., et al.
- DeBord, L. C., et al. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as a versatile patient-derived xenograft (PDX) platform for precision medicine and preclinical research. American Journal of Cancer Research. 8 (8), 1642-1660 (2018).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Experimental Cell Research. 328 (2), 314-324 (2014).
- Ismail, M. S., et al. Photodynamic Therapy of Malignant Ovarian Tumours Cultivated on CAM. Lasers in Medical Science. 14 (2), 91-96 (1999).
- Kaufman, N., Kinney, T. D., Mason, E. J., Prieto, L. C. Maintenance of human neoplasm on the chick chorioallantoic membrane. The American Journal of Pathology. 32 (2), 271-285 (1956).
- Janse, E. M., Jeurissen, S. H. Ontogeny and function of two non-lymphoid cell populations in the chicken embryo. Immunobiology. 182 (5), 472-481 (1991).
- Leene, W., Duyzings, M. J., van Steeg, C. Lymphoid stem cell identification in the developing thymus and bursa of Fabricius of the chick. Zeitschrift fur Zellforschung und Mikroskopische Anatomie. 136 (4), 521-533 (1973).
- Solomon, J. B. Foetal and neonatal immunology (Frontiers of biology). 20, North-Holland Pub. Co. (1971).
- JoVE Science Education Database.
- Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model. Journal of Visualized Experiments. (51), e2815 (2011).
- Fergelot, P., et al. The experimental renal cell carcinoma model in the chick embryo. Angiogenesis. 16 (1), 181-194 (2013).
- Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers. Journal of Visualized Experiments. , In Press (2019).
- Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 265-324 (2016).
- Hu, J., Ishihara, M., Chin, A. I., Wu, L. Establishment of xenografts of urological cancers on chicken chorioallantoic membrane (CAM) to study metastasis. Precision Clinical Medicine. 2 (3), 140-151 (2019).
- Casar, B., et al. In vivo cleaved CDCP1 promotes early tumor dissemination via complexing with activated beta1 integrin and induction of FAK/PI3K/Akt motility signaling. Oncogene. 33 (2), 255-268 (2014).
