Summary
Metastatisk klart celle nyrecellekarsinom er en sykdom uten en omfattende dyremodell for grundig preklinisk undersøkelse. Denne protokollen illustrerer to nye dyremodeller for sykdommen: den ortotopisk implanterte musemodellen og kyllingkorioallantoisk membranmodell, som begge viser lungemetastase som ligner kliniske tilfeller.
Abstract
Metastatisk klart celle nyrecellekarsinom (ccRCC) er den vanligste undertypen av nyrekreft. Lokalisert ccRCC har et gunstig kirurgisk utfall. En tredjedel av ccRCC-pasientene vil imidlertid utvikle metastaser til lungene, noe som er relatert til et svært dårlig resultat for pasientene. Dessverre er ingen terapi tilgjengelig for dette dødelige stadiet, fordi den molekylære mekanismen for metastase forblir ukjent. Det har vært kjent i 25 år at tap av funksjon av von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor genet er patogene av ccRCC. Imidlertid har ingen klinisk relevant transgen musmodell av ccRCC blitt generert. Formålet med denne protokollen er å introdusere og sammenligne to nyetablerte dyremodeller for metastatisk ccRCC. Den første er nyreimplantasjon i musemodellen. I vårt laboratorium ble CRISPR genredigeringssystem benyttet til å slå ut VHL-genet i flere RCC-cellelinjer. Ortotopisk implantasjon av heterogene ccRCC populasjoner til nyrekapselen skapte nye ccRCC-modeller som utvikler robuste lungemetastaser hos immunkompetente mus. Den andre modellen er kylling korioallantoisk membran (CAM) system. I forhold til musemodellen er denne modellen mer tid, arbeidskraft og kostnadseffektiv. Denne modellen støttet også robust tumordannelse og intravasation. På grunn av den korte 10 dagers perioden med tumorvekst i CAM ble ingen overt metastase observert ved immunhistokjemi (IHC) i det innsamlede embryovevet. Men når tumorveksten ble utvidet med to uker i den klekkede kyllingen, ble mikrometastatiske ccRCC-lesjoner observert av IHC i lungene. Disse to nye prekliniske modellene vil være nyttige for å studere den molekylære mekanismen bak metastase, samt å etablere nye, pasientavledede xenografts (PDXs) mot utviklingen av nye behandlinger for metastatisk ccRCC.
Introduction
Nyrecellekarsinom (RCC) er den7. Årlig er 74.000 amerikanere anslått å være nylig diagnostisert, og står for mer enn 14.000 dødsfall (Clear-cell histologisk undertype, eller ccRCC, er den vanligste undertypen, som står for ca 80% av RCC tilfeller. Pasienter med lokalisert malignitet behandles med nephrectomy og har en gunstig 5-års overlevelsesrate på 73%1. Imidlertid utvikler 25% -30% av pasientene fjerne metastaser til vitale organer som lungene, noe som resulterer i en dårlig gjennomsnittlig overlevelse på 13 måneder og 5-års overlevelse på bare 11%1,2,3. Ytterligere forståelse av den metastatiske mekanismen er nødvendig for å forbedre det dødelige utfallet for metastatisk ccRCC.
Tapet av VHL tumor suppressor genet er et kjennetegn genetisk lesjon observert i et flertall av menneskelige ccRCC tilfeller4,5,6,7. Den nøyaktige onkogene mekanismen for VHL-tap i ccRCC er imidlertid ukjent. VHL-uttrykksstatusen er heller ikke prediktiv for utfallet i ccRCC8. Spesielt, til tross for mange forsøk på nyreepitelrettet VHL knockout, har forskere ikke klart å generere nyreabnormitet utover preneoplastiske cystiske lesjoner observert hos mus9, selv når de kombineres med sletting av andre tumorsuppressorer som PTEN og p5310. Disse funnene støtter ideen om at VHL-tap alene er utilstrekkelig for tumorigenese eller den påfølgende spontane metastase.
Nylig opprettet laboratoriet vårt en ny VHL knockout (VHL-KO) cellelinje ved hjelp av CRISPR/Cas9 mediert sletting av VHL-genet i murine VHL+ ccRCC-cellelinjen (RENCA, eller VHL-WT)11,12. Vi viste at VHL-KO er ikke bare mesenchymal, men fremmer også epitel til mesenchymal overgang (EMT) av VHL-WT celler12. EMT er kjent for å spille en viktig rolle i den metastatiske prosessen13. Vårt arbeid viste videre at fjern lungemetastase bare oppstår med samtidig implantasjon av VHL-KO- og VHL-WT-celler i nyrene, som støtter en samarbeidsmekanisme for metastase. Viktigere, vår ortotopically implantert VHL-KO og VHL-WT modell fører til robuste lungemetastaser, rekapitulere kliniskccRCC tilfeller. Denne spontane metastatiske ccRCC-modellen kompenserer for mangelen på en transgen metastatisk musemodell, spesielt i utviklingen av nye antimetastaser. Denne protokollen demonstrerer renal kapsel implantasjon av heterogene cellepopulasjoner av genetisk konstruerte RENCA-celler.
Kylling CAM modeller har en lang historie i forskning for angiogenese og tumorbiologi på grunn av deres mange fordeler, som oppsummert i tabell 114,15,16,17,18. Kort tidsvinduet for CAM tumorvekst er kort, slik at maksimalt 11 dager til CAM er ødelagt ved klekking av kylling16. Til tross for den korte veksttiden, gjør den rike ernæringsforsyningen og immundeficient tilstanden til kyllingembryoet svært effektiv tumorengraftment16,19,20,21. Til slutt, kostnaden for hvert befruktet egg er ~ $ 1, sammenlignet med over $ 100 for en SCID mus. Sammen kan CAM-modellen tjene som en verdifull alternativ dyremodell i å etablere nye PDXs til en god besparelse i tid og kostnadi forhold til musen. I denne protokollen vurderte vi om modellen var i stand til å rekapitulere biologien til metastatisk ccRCC observert i musen ortotopisk modell.
| -Jeg har ikke noe å si. Mus | Cam | Merk | |
| Kostnad | >$100 hver | ~$1 hver | Levedyktighet fra 50-75% |
| Behov for barriereboliger | ja | nei | Ytterligere reduserer kostnader og forenkler serieovervåking av svulstene |
| Tumor direkte synlig | nei | ja | Figur 3A |
| Tid til første engraftment (RENCA) | 2 uker | 2-4 dager | Ref 14, 15 |
| Endepunktet for vekst (RENCA) | 3-6 uker | 10 dager | Ref 14, 15 |
| Metastase (RENCA) observert | ja | Ja i jenter | Figur 3D |
| Serieavsnitt | ja | ja | ref 16-18 |
| Passasje til mus (RENCA) | ja | ja | Hu, J., et al. under gjennomgang (2019) |
| Opprettholde tumorheterogenitet | ja | ja | Hu, J., et al. under gjennomgang (2019) |
Tabell 1: Fordeler og begrensninger i musen og CAM-modellene. Denne tabellen sammenligner de to modellene for sine fordeler og begrensninger når det gjelder nødvendig tid, kostnad, arbeidskraft, samt biologi. CAM-modellen har fordeler i effektivitet, men den har også sine egne unike begrensninger på grunn av den forskjellige morfologien mellom fugler og pattedyr. Derfor er det viktig å bekrefte at modellen kan beholde biologien til xenografts.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder som er beskrevet her, er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), utpekt som UCLA Chancellor's Animal Research Committee (ARC) (ARC 2002-049-53 og ARC 2017-102-01A). 2002-049-53-protokollen er optimalisert for implantasjon av ccRCC tumorceller i nyrekapselen til Nude eller BALB/c mus. Tumorimplantasjonseksperimenter i befruktede kyllingegg før klekking krever ikke IACUC-godkjenning. For å forlenge tiden for etablering av lungemetastase, kan embryoene med CAM-svulst klekkes og vokse til kyllinger. 2017-102-01A-protokollen dekker disse dyreforsøkene.
1. Ortotopisk tumorstudier hos mus
MERK: Tidslinjen for dette eksperimentet vises i figur 1A. Disse prosedyrene ble tilpasset fra tidligere publikasjoner11,12.
- Klargjøre enkeltcellesuspensjon for pode
- Koble RENCA VHL-WT- og VHL-KO-cellene fra kulturrettene ved hjelp av trypsin/EDTA.
- Tell cellene med hemocytometer og resuspender i en forhåndskjølt 1:1 blanding av PBS og ekstracellulær matriseløsning ved en konsentrasjon på 1 x 105 celler/μL.
MERK: Bruk et 1:4-forhold mellom VHL-WT:VHL-KO-celler for heterogene implantater og VHL-WT alene for homogene implantater. - Overfør de resuspenderte cellene til et 1,5 ml mikrocentrifugerør og hold på is til implantasjon.
- Implantasjon til nyrekapsel
- Anestesi: Forvarm en varm pute til 37 °C og dekk den med et stykke tykk steril drapering. Bedøve musen ved enten isofluran inhalasjon via induksjonskammer eller intraperitoneal (IP) injeksjon av 1% pentobarbital natrium ved dosering av 10 ml/kg.
- Barber håret fra operasjonsstedet. Dette trinnet kan hoppes over for nakne mus.
- Desinfeksjon og kirurgisk drapering: Desinfiser baksiden av musen helt med povidon-jod 3x etterfulgt av 70% etanol 1x og tørk den tørr med sterile bomullspinner. Deretter påfør tre sterile medisinske dressinger sekvensielt, dekker hele ryggen for å skape et kirurgisk felt samt å immobilisere musen.
- Snitt og nyre eksteriør: Før operasjonen, desinfisere brukerens fingre med povidone-jod eller bruk et par sterile hansker. Plasser musen i utsatt stilling og bruk fingrene til å finne venstre nyre rett under venstre flanke. Bruk et par stumpe tang og saks for å kutte huden åpen og muskellaget under det angitte stedet. Bruk sterile bomullspinner og tang for å delvis eksteriere venstre nyre ut av magen.
- Tumorcelleimplantasjon: Last cellesuspensjonen utarbeidet i trinn 1.1 i enten insulinsprøyter eller tilpassede Hamilton-sprøyter (se Materialtabell for spesifikasjoner). Injiser 20 μL resuspenderte celler under nyrekapselen.
MERK: Vellykket injeksjon bestemmes av dannelsen av en gjennomskinnelig bule på overflaten av nyrene. Utilsiktet injeksjon i nyreparenchyma resulterer i blødning og en postoperativ dødelighet så høyt som 90% på grunn av dødelig blødning på injeksjonsstedet. - Trekk langsomt ut nålen for å la den ekstracellulære matriseløsningen stivne og forhindre blødning eller tumorcellelekkasje. Deretter, ved hjelp av en steril bomullspinne, skyv nyrene tilbake i magen.
- Sårsøm: Bruk en 5-0 belagt VICTRYL-sutur for å sy muskellaget. Desinfiser huden med povidon-jod en gang og lukk huden med sårautoklipp.
- Gjenoppretting: Plasser musen på den varme puten til den våkner. Hvis musen ble bedøvet ved innånding, trekke isoflurane og holde musen på den varme puten til den er våken.
- Bioluminescence imaging (BLI) og vev samling
- Seks uker etter tumorimplantasjon, ta firefly-luciferase-baserte BLI-bilder. Deretter euthanize mus med isoflurane innånding etterfulgt av cervical dislokasjon.
- Samle blod for sirkulerende tumorcelle (CTC) deteksjon ved flyt cytometri.
- Harvest tumor og organer av interesse (nyrer, lunger, lever, tarm, og milt) ved hjelp av en steril vev høsting teknikk22. Fest dem i 4% paraformaldehyd over natten for parafinvoks innebygging.
2. CAM tumor xenograft modell
MERK: Disse prosedyrene ble tilpasset og endret fra tidligere publiserte protokoller23,24. Tidslinjen for denne prosedyren vises i figur 1B. Denne artikkelen presenterer bare den strømlinjeformede protokollen. For detaljerte protokoller, vennligst se en annen JoVE artikkel publisert av vår gruppe25.
- Preinkubasjon: Inkuber nylagte, befruktede kyllingegg i en roterende egginkubator ved 37 °C og 55-65 % fuktighet i 7 dager.
- Slipp CAM og åpent vindu (utviklingsdag 7):
- Finn og merk luftsekken og venene.
MERK: Vanligvis fjernes 10-15% av eggene fordi de enten er ubefruktede eller dør innen 7 dager etter befruktning. - Lag en ny luftsekk på toppen av en markert vene.
- Avgrense den nye luftsekken, påfør pakketape og legg eggene tilbake til inkubatoren.
MERK: Prosedyren kan settes på pause her. Det anbefales å gjenoppta prosedyrene innen samme dag fordi luftsekken kan bevege seg. - Åpne et vindu: Bruk et par buede mikrodissecting saks og et par nål-nese tang, kutt et 1,5 x 1,5 cm sirkulært vindu i skallet.
MERK: Forstyrrelse av CAM er indikert av blodet og et stykke CAM tilstede på kuttet skallstykke. - Forsegle hullet med gjennomsiktig medisinsk dressing og legg eggene i en stasjonær inkubator ved 37 °C og 55%-65% fuktighet.
MERK: Bruk samme egginkubator som i trinn 2.1. Slå av rotatoren for å gjøre den stasjonær.
- Finn og merk luftsekken og venene.
- Helsesjekk (utviklingsdag 9): Fjern døde egg og grupper deretter tilfeldig resten av eggene for tumorcelleimplantasjon.
MERK: Ideelt sett er overlevelsesraten på dette punktet ca. 80 % av utviklingsdagen 0. - Pode tumorcellene på den nylig eksponerte CAM (utviklingsdag 10)
- Fortynn den ekstracellulære matriseoppløsningen i dobbelt så stort volum av forhåndskjølt RPMI 1640 (med L-glutamin). Løsne RENCA-cellene og resuspender i den ovennevnte løsningen for å nå en konsentrasjon på 2 x 104 celler/μL.
MERK: Bruk et 1:1-forhold mellom VHL-WT:VHL-KO-celler for heterogene implantater og VHL-WT alene for homogen implantasjon. - For å forhåndssolidifisere cellesuspensjonen, fyll 100 μL av hver celleblanding i 200 μL pipettetips og legg dem i en celleinkubator i 15 minutter.
- Implantat 100 μL cellesuspensjon for hvert egg på CAM-overflaten gjennom vinduet.
MERK: Noen protokoller krever riper cam før implantasjon23. Dette er ikke nødvendig for RENCA-celler, fordi de vokser veldig raskt.
- Fortynn den ekstracellulære matriseoppløsningen i dobbelt så stort volum av forhåndskjølt RPMI 1640 (med L-glutamin). Løsne RENCA-cellene og resuspender i den ovennevnte løsningen for å nå en konsentrasjon på 2 x 104 celler/μL.
- Vokse celler på CAM i 10 dager og fotografi annenhver dag.
- Euthanize og høste svulst, blod og organer.
- På utviklingsdag 20 (tumordag 10) samler du blod via korioallantoisk vene med en heparinisert 10 ml sprøyte.
- Euthanize embryoene ved å sette dem på is i 15 min.
- Høst og vei svulster. Dissekere lunger og lever ved hjelp av en steril vevshøstingsteknikk som ligner den som brukes til mus22.
MERK: Kyllinglever har to fliker, som er de første organene sett i bukhulen. Ikke forveksle disse med lungene. Kyllinglungene ligger under hjertet og septum26. Den vellykkede samlingen av lungene kan bekreftes av eksponerte ribbein. - Fest svulstene og de dissekerte organene i 4% paraformaldehyd over natten for parafinvoksinnbygging.
- Klekke kyllingene.
- For å tillate en lengre periode med tumorvekst, fortsett inkubasjonen gjennom dag 21 og la kyllingene klekke ved 37 °C og minst 60 % fuktighet.
MERK: Kyllinger naturlig luke etter dag 21 over en 24 timer periode, men noen ganger har problemer klekking av seg selv. I dette tilfellet, sprengning eggeskall noen hjelper. Det er viktig for kyllinger å fullføre klekkingsprosessen innen 24 timer fordi de vil dø av mangel på næringsstoffer etter da. - Dyrke kyllinger i et dyreanlegg (2017-102-01A) i 2 uker.
- På utviklingsdag 34 (tumordag 24) er de euthanize ungene med isofluran innånding etterfulgt av cervical dislokasjon.
- Dissekerlungene ved hjelp av en steril vevshøstingsteknikk som ligner de som brukes til mus22. Deretter fikse dem i 4% paraformaldehyd over natten for parafin-voks innebygging.
- For å tillate en lengre periode med tumorvekst, fortsett inkubasjonen gjennom dag 21 og la kyllingene klekke ved 37 °C og minst 60 % fuktighet.
3. Immunhistokjemi
MERK: All vevssnitting og H&E-farging ble gjort av Translational Pathology Core Laboratory (TPCL) ved University of California, Los Angeles.
- Bake lysbilder ved 65 °C i 20 min og deparaffiniser 3x ved hjelp av xylen og rehydrere serielt fra 100% etanol til vann.
- Hent antigenene i en sitratbuffer kokt i en vegetabilsk dampbåt i 25 min.
- Påfør 1% BSA for blokkering. Bruk deretter de primære antistoffene (anti-VHL, anti-HA, anti-flagg) utarbeidet ved et fortynningsforhold på 1:200 i PBS. Inkuber over natten ved 4 °C.
- Etter vask 3x med TBST (7 min hver), ruger med det sekundære antistoffet på 1:200 fortynning. Vask 3x med TBST (7 min hver) og påfør DAB reagenser etterfulgt av hematoksyslin motfarging.
4. Flyt Cytometri
- Behandle mus eller kyllingblod med røde blodlegemer (RBC) lysisbuffer i henhold til produsentens protokoll.
MERK: Tilstrekkelig RBC lysis er spesielt viktig når du analyserer CAM-blod fordi kylling-RBC-er er kjerner og ikke lett kan skilles i flytcytometri ved hjelp av for- og sidespredningen. - Kjør flyt cytometri på blodlysate og analysere dataene for mStrawberry og EGFP uttrykk.
- Angi primærportene basert på for- og sidespredningen unntatt rusk, døde celler og ulyserte RBC-er.
- Angi fluorescensportene basert på de ufargede prøvene og enkeltfargede kontrollene. Bruk blodlysat primet med VHL-WT, VHL-KO, eller umerkede RENCA-celler som de enkeltfargede kontrollene og ufargede kontrollene, henholdsvis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hvert eksperiment ble utført minst 3x med mindre annet er oppgitt. Data presenteres som gjennomsnittlig ± standardavvik (SD). Betydningen ble bestemt av en paret, Student's T-test når det var to grupper eller ved en enveis ANOVA når det var tre eller flere grupper. En p-verdi cutoff på 0,05 ble brukt til å etablere betydning.
Ortotopically implantert RENCA celler vellykket vokste på mus nyrene, som bekreftet av BLI og H & E farging (Figur 2A-B). Selv om det ikke var noen forskjell i primærveksten, hadde bare den heterogene, metastatiske svulsten robust metastase til lungene som indikert av det meget sterke BLI-signalet og metastatiske knuter i H&E-farmen. På den annen side metastaserte ikke homogene, ikke-metastatiske svulster til fjerne organer. CTC-tellinger var høyere i musene som bærer metastatiske svulster enn de som bærer ikke-metastatiske svulster (figur 2C-D).
I samsvar med musemodellen beholdt CAM-systemet vellykket veksten og metastatisk oppførsel av RENCA svulster. Mens det ikke var noen vekstforskjell mellom metastatiske og ikke-metastatiske svulster, var CTC-tellingene signifikant høyere i eggene med metastatiske svulster enn de med ikke-metastatiske kolleger (figur 3A-C). Kle eggene med CAM-svulster og la kyllingene vokse ytterligere to uker forlenget perioden for metastatiske kreftceller for å etablere histologisk påviselige metastaser i kyllingens lunge, som vist i H&E- og HA-flekken av kyllinglungevevseksjoner (figur 3D). Et flertall av de metastatiske knutene besto av HA-merkede VHL-WT-celler, mens flaggkodede VHL-KO sjelden ble sett, som vi har observert hos mus.
Figur 1: Oversikt over de to dyremodellene for metastatiskccRCC xenografts. (A) Skjematisk representasjon av musen ortotopiske modellen. 3- eller 4-ukers gamle mus er ortotopisk implantert med enten ikke-metastatiske eller metastatiske svulster. Seks uker etter implantasjon ble tumorvekst og metastase visualisert med BLI. Deretter ble tumor, blod og organer samlet inn for nedstrømsanalyser. (B) Skjematisk representasjon av CAM-modellen som viser følgende trinn: Preinkubasjon, vindusåpning, celleimplantasjon og eutanasi før eller etter klekking. De samme analysene som musemodellen utføres for de innsamlede prøvene. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Tumorvekst og metastase hos ortotopically implanterte mus. (A) BLI av mus og ekstraherte organer (nyre, lunge, lever, tarm og milt) 6 uker etter ortopisk implantasjon av RENCA-celler. Venstre: ikke-metastatisk (ikke-oppfylt), høyre: metastatisk. (B) Bruttovisning og økende forstørrelse av H&E-farging for nyre og lunge (20x og 100x). Venstre: ikke-metastatisk (ikke-oppfylt), høyre: metastatisk. (C) Representativ strømningsanalyse for å oppdage mStraw+ og EGFP+ celler som sirkulerer i blodet. (D) Prosent populasjonsgraf av sirkulerende mStraw + og EGFP + celler. Ikke-møtt: ikke-metastatisk. Panel A ble tilpasset fra Hu et al.27. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Tumorvekst og metastase i CAM-modellen. (A) RENCA svulster dyrket i CAM. Det var 7 repetisjoner for hver gruppe. Ikke-møtt: ikke-metastatisk. (B) Representativ strømningsanalyse for å oppdage mStraw+ og EGFP+ celler som sirkulerer i blodet. (C) Prosent populasjonsgraf av sirkulerende mStraw + og EGFP + celler. **p < 0,01. (D) IHC farging av lungene fra en 2 uker gammel kylling bærer en metastatisk svulst under embryonale stadium. Fra venstre viser seksjonene H&E, HA og flaggfarging. #: kylling lungearterie; arrowhead: metastatiske knuter. Dette tallet ble tilpasset fra Hu J et al.27. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For mange pasienter med epitelmaligniteter er metastase til vitale organer den primære årsaken til dødelighet. Derfor er det viktig å finne den underliggende mekanismen og en ny behandlingsvei for metastatisk sykdom. Dessverre er det mangel på relevante metastatiske ccRCC dyremodeller. Utfordringen i stor grad skyldes manglende evne til å gjenskape ccRCC hos mus til tross for generering av mange transgene nyreepitelmålrettede VHL knockout musemodeller9,10. Her demonstrerer vi metodene for å etablere en implanterbar metastatisk ccRCC-svulst i to dyresystemer, musen og kylling-CAM. Disse funnene validerte den metastatiske oppførselen til svulstene i to ulike miljøer, og gir dermed unike muligheter til å undersøke metastases molekylære mekanisme ytterligere. I den første modellen ble den heterogene RENCA-populasjonen implantert til immunkompetente mus ortotoppisk til nyrekapselen. Etter 6 uker viste disse musene frodig lungemetastase. I samsvar med musemodellen vokste implantasjon av heterogene RENCA-celler på CAM vellykket og intravasated inn i blodet av kyllingembryoene. Ved å utvide tumorvekstperioden til 2 uker etter klekking ble lungemetastaser som ligner de som er sett i musen observert hos kyllingene.
For begge modellene er nøye oppmerksomhet til de tekniske detaljene i hvert trinn og praksis for å forbedre tekniske ferdigheter avgjørende for å øke dyrs overlevelse og vellykket tumorengraftment og metastase. For musemodellen maksimerer nøye valg av utstyr og nøyaktig injeksjon av tumorcellene til nyrekapselen suksessraten ved å redusere den postoperative dødeligheten og øke sjansen for at svulsten får tilstrekkelig blodtilførsel til å vokse og metastasere. CAM-modellen krever mer optimalisering i oppsettet og teknikken. I våre studier var embryolevedyktigheten under 30% i begynnelsen. Det er viktig å holde både temperatur og fuktighet til ønsket nivå til enhver tid ved å ha godt utstyr, hyppig overvåking og raskere gjennomføring av prosedyrene. Selv etter optimalisering varierer overlevelsesevnen fra 50-75% avhengig av eksperimentereren og den individuelle batchen av egg. Det anbefales å alltid bestille ekstra egg for backup. Etter vår erfaring krever det å mestre CAM-teknikkene over 1 år. Slippe CAM membran og åpne vinduet er det kritiske trinnet der utilsiktet, dødelig skade på embryoet oftest oppstår. Levedyktigheten til kyllingembryoet kan forbedres ved å forhindre skade på CAM.
Det er flere begrensninger i CAM-tumormodellen. Først er anvendelsen av modellen til alle tumorcelletyper. Vi har hatt en 100% suksessrate engrafting ulike etablerte tumor cellelinjer på CAM, inkludert nyre, blære, og prostata tumor cellelinjer (RENCA, ACHN, T24, HT1376, CWR22Rv1, C4-2, Myc-CaP) og eggstokkreft cellelinjer (ID8 og SKOV3). To tilleggsstudier fra vår gruppe gir ytterligere informasjon om disse CAM svulster25,27. Men, veksten av noen eggstokkreft celler på CAM er forbedret ved tilskudd av vekstfaktor eller tumor-assosierte celler25. Optimalisering av cellenummer eller essensielle vekstfaktorer for hver cellelinje eller type er viktig. Vi inkorporerer også reporter- eller markørgener, som luciferase, proteinkoder (f.eks. HA eller flagg), eller fluorescenskoder (f.eks. mStrawberry eller EGFP), for å lette overvåkingen av svulstens vekst og metastase hos dyrene25,27. Basert på vår erfaring kan et stort flertall av sprekreftcellelinjer etableres på CAM. En viktig begrensning for engraftment kan være det korte 10 dagers vinduet som er tillatt for tumorvekst, noe som kan være spesielt utfordrende for en langsom voksende cellelinje for å etablere tilstrekkelig masse på så kort tid.
En annen mangel på CAM-modellen er forskjellen i fysiologi mellom fugleembryoet og pattedyrene. Metastase fra CAM-svulsten til store organer som leveren eller lungene til embryoet har blitt oppdaget hovedsakelig av følsomme PCR-teknikker28. Den korte perioden med vekst i CAM ville være utilstrekkelig til å etablere store metastatiske lesjoner som kan verifiseres av histologiske analyser. Videre er redusert vaskulær perfusjon av den uoppblåste embryolungen ikke gunstig for å etablere eller støtte veksten av lungemetastaser. For å overvinne disse begrensningene ble det oppnådd en godkjenning fra vår institusjonelle dyrebrukskomité (IACUC) for å klekke kyllinger fra CAM-svulsten som bærer embryoer og huse dem ytterligere 2 uker etter klekking. Utvide tiden for tumorvekst på denne måten gjorde oss i stand til å oppdage fjerne lungemetastaser av IHC. Selv om de klekkede kyllingstudiene krever den ekstra IACUC-godkjenningen som CAM-tumorstudier ikke gjør det, gir denne tilnærmingen en verdifull mulighet til å studere den metastatiske kaskade hos kyllinger som tidligere gjort hos mus. Kyllingimmunsystemet har blitt rapportert å utvikle seg fra dag 12 etter befruktning20. Gitt den høye effektiviteten av engrafting murine avledet RENCA svulster rapportert her og mange andre menneskelige kreft cellelinjer og PDXs i CAM på dag 10 etter befruktning24,25,27, vi kunne utlede at immunsystemet i embryoet ikke er fullt utviklet på dette punktet. Samspillet mellom kyllingens immunsystem og CAM-svulsten garanterer tydelig videre undersøkelse.
Vårt arbeid gir sterke støttende bevis på at CAM-tumormodellen kan være en enkel innledende in vivo-modell for å studere kreftbiologi, inkludert metastase. På grunn av begrensningene nevnt ovenfor, bør CAM-modellen ikke erstatte musemodellen, men utfylle den. Vår pågående forskning tyder på at signalkryssbehandling mellom heterogene cellepopulasjoner i ccRCC er medvirkende til å styre metastatisk progresjon11,12. Bruken av både CAM- og musemodeller kan være et verdifullt middel for å validere den metastatiske kryssforløpet ved spill i ccRCC. Vi tror de mange fordelene med CAM-modellen som presenteres her, kan akselerere tempoet i oppdagelsen av nye metastatiske mekanismer og effektive behandlinger for å bøte på dette dødelige stadiet av kreft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av UCLA JCCC frø tilskudd, UCLA 3R stipend, UCLA CTSI, og UC TRDRP (LW). Vi takker Crump Institute's Preclinical Imaging Facility, TPCL og UCLAs Department of Laboratory Animal Medicine (DLAM) for deres hjelp med eksperimentelle metoder. Flow cytometri ble utført i UCLA Johnson Comprehensive Cancer Center (JCCC) og Center for AIDS Research Flow Cytometry Core Facility som støttes av National Institutes of Health awards P30 CA016042 og 5P30 AI028697, og av JCCC, UCLA AIDS Institute, David Geffen School of Medicine ved UCLA, UCLA Chancellor's Office, og UCLA Vice Chancellor's Office of Research. Statistikk rådgivning og dataanalyse tjenester ble levert av UCLA CTSI Biostatistics, Epidemiology, og Research Design (BERD) Program som støttes av NIH / National Center for Fremme Translational Science UCLA CTSI Grant Number UL1TR001881.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | 25053CI | |
| 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | |
| anti-VHL antibody | Abcam | ab135576 | |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD Biosciences | 14-826-79 | |
| BD Pharm Lyse | BD Biosciences | 555899 | |
| BDGeneral Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| DAB Chromogen Kit | Biocare Medical | DB801R | |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Gibco | LS14190250 | |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | eBioscience | 14-6681-82 | |
| Ethanol 200 Proof | Cylinders Management | 43196-11 | Prepare 70% in water |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Fisher Scientific | 10-437-028 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | |
| FisherbrandHigh Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| FisherbrandPremium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Formaldehyde Soln., 4%, Buffered, pH 6.9 (approx. 10% Formalin soln.), For Histology | MilliporeSigma | 1.00496.5000 | |
| Hamilton customized syringe | Hamilton | 80408 | 25 µL, Model 702 SN, Gauge: 30, Point Style: 4, Angle: 30, Needle Length: 17 mm |
| HA-probe Antibody (Y-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc805 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D | |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein Animal Health | 1169567762 | |
| IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | C354230 | |
| Medline Surgical Instrument Drape, Clear Adhesive, 24" x 18" | Medex Supply | MED-DYNJSD2158 | |
| OmniPur BSA, Fraction V [Bovine Serum Albumin] Heat Shock Isolation | MilliporeSigma | 2910-25GM | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution, 100X, 10,000 IU Penicillin, 10,000ug/mL Streptomycin | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Pentobarbital Sodium | Sigma Aldrich | 57-33-0 | Prepare 1% in saline |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-062 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) Available Iodine, for Laboratory Use | Ricca Chemical | 395516 | |
| pSicoR | Addgene | 11579 | |
| Puromycin dihydrochloride hydrate, 99%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC227420500 | |
| Renca | ATCC | CRL-2947 | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine | Corning | 10040CV | |
| Scientific 96-Well Non-Skirted Plates, Low Profile | Fisher Scientific | AB-0700 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-200, 200 µl, 960 (10 racks of 96) | Thomas Scientific | 1159M40 | |
| Shipping Tape, Multipurpose, 1.89" x 109.4 Yd., Tan, Pack Of 6 Rolls | Office Depot | 220717 | |
| Suture | Ethicon | J385H | |
| Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 1634 | |
| Thermo-Chicken Heated Pad | K&H manufacturing | 1000 | |
| Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | |
| VHL-KO | CRISPR/Cas9-mediated knockout of VHL, then lentivirally labeled with flag-tagged EGFP & firefly luciferase | ||
| VHL-WT | Lentivirally labeled with HA-tagged mStrawberry fluorescent protein & firefly luciferase | ||
| World Precision Instrument FORCEPS IRIS 10CM CVD SERR | Fisher Scientific | 50-822-331 | |
| Wound autoclips kit | Braintree scientific, inc. | ACS KIT | |
| Xylenes (Histological), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X3S-4 |
References
- Cohen, H. T., McGovern, F. J. Renal-cell carcinoma. The New England Journal of Medicine. 353 (23), 2477-2490 (2005).
- Bianchi, M., et al. Distribution of metastatic sites in renal cell carcinoma: a population-based analysis. Annals of Oncology. 23 (4), 973-980 (2012).
- Hsieh, J. J., et al. Renal cell carcinoma. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17009 (2017).
- Foster, K., et al. Somatic mutations of the von Hippel-Lindau disease tumour suppressor gene in non-familial clear cell renal carcinoma. Human Molecular Genetics. 3, (1994).
- Young, A. C., et al. Analysis of VHL Gene Alterations and their Relationship to Clinical Parameters in Sporadic Conventional Renal Cell Carcinoma. Clinical Cancer Research. 15 (24), 7582-7592 (2009).
- Gossage, L., Eisen, T., Maher, E. R. VHL, the story of a tumour suppressor gene. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 55-64 (2015).
- Sato, Y., et al. Integrated molecular analysis of clear-cell renal cell carcinoma. Nature Genetics. 45 (8), 860-867 (2013).
- Choueiri, T. K., et al. The role of aberrant VHL/HIF pathway elements in predicting clinical outcome to pazopanib therapy in patients with metastatic clear-cell renal cell carcinoma. Clinical Cancer Research. 19 (18), 5218-5226 (2013).
- Hsu, T. Complex cellular functions of the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene: insights from model organisms. Oncogene. 31 (18), 2247-2257 (2012).
- Albers, J., et al. Combined mutation of Vhl and Trp53 causes renal cysts and tumours in mice. EMBO Molecular Medicine. 5 (6), 949-964 (2013).
- Schokrpur, S., et al. CRISPR-Mediated VHL Knockout Generates an Improved Model for Metastatic Renal Cell Carcinoma. Scientific Reports. 6, 29032 (2016).
- Hu, J., et al. A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 9, 203-210 (2018).
- Heerboth, S., et al. EMT and tumor metastasis. Clinical and Translational Medicine. 4, 6 (2015).
- DeBord, L. C., et al. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as a versatile patient-derived xenograft (PDX) platform for precision medicine and preclinical research. American Journal of Cancer Research. 8 (8), 1642-1660 (2018).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Experimental Cell Research. 328 (2), 314-324 (2014).
- Ismail, M. S., et al. Photodynamic Therapy of Malignant Ovarian Tumours Cultivated on CAM. Lasers in Medical Science. 14 (2), 91-96 (1999).
- Kaufman, N., Kinney, T. D., Mason, E. J., Prieto, L. C. Maintenance of human neoplasm on the chick chorioallantoic membrane. The American Journal of Pathology. 32 (2), 271-285 (1956).
- Janse, E. M., Jeurissen, S. H. Ontogeny and function of two non-lymphoid cell populations in the chicken embryo. Immunobiology. 182 (5), 472-481 (1991).
- Leene, W., Duyzings, M. J., van Steeg, C. Lymphoid stem cell identification in the developing thymus and bursa of Fabricius of the chick. Zeitschrift fur Zellforschung und Mikroskopische Anatomie. 136 (4), 521-533 (1973).
- Solomon, J. B. Foetal and neonatal immunology (Frontiers of biology). 20, North-Holland Pub. Co. (1971).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Sterile Tissue Harvest. , Journal of Visualized Experiments. Cambridge, MA. (2019).
- Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model. Journal of Visualized Experiments. (51), e2815 (2011).
- Fergelot, P., et al. The experimental renal cell carcinoma model in the chick embryo. Angiogenesis. 16 (1), 181-194 (2013).
- Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers. Journal of Visualized Experiments. , In Press (2019).
- Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 265-324 (2016).
- Hu, J., Ishihara, M., Chin, A. I., Wu, L. Establishment of xenografts of urological cancers on chicken chorioallantoic membrane (CAM) to study metastasis. Precision Clinical Medicine. 2 (3), 140-151 (2019).
- Casar, B., et al. In vivo cleaved CDCP1 promotes early tumor dissemination via complexing with activated beta1 integrin and induction of FAK/PI3K/Akt motility signaling. Oncogene. 33 (2), 255-268 (2014).
